JPS6361960B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6361960B2 JPS6361960B2 JP56103123A JP10312381A JPS6361960B2 JP S6361960 B2 JPS6361960 B2 JP S6361960B2 JP 56103123 A JP56103123 A JP 56103123A JP 10312381 A JP10312381 A JP 10312381A JP S6361960 B2 JPS6361960 B2 JP S6361960B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- leif
- interferon
- fragment
- dna
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換えDNA技術の分野に関する。
つまり、組換えDNA技術に用いられる方法およ
びそれらの方法により得られる生成物に関する。 より詳細には、本発明は、ポリペプチド、具体
的には、成熟ヒト白血球インタフエロン、それら
を含有する医薬組成物に関する。 さらに特定的には、本発明は、ヒト白血球由来
の遺伝子の発現により得ることができる成熟ヒト
白血球インタフエロンであつて、165−166個のア
ミノ酸を有し、部分アミノ酸配列Cys−Ala−
Trp−Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−
Met−Arg−Serを含み、かつ114位にアミノ酸
Asp、GluまたはValの一つを有し、このインタ
フエロンの第一番目のアミノ酸のＮ末端にメチオ
ニンが結合している場合は、166−167個のアミノ
酸を有し、かつ115位にアミノ酸Asp、Gluまたは
Valの一つを有することを特徴とする成熟ヒト白
血球インタフエロンならびにヒト白血球インタフ
エロンＡ（LeIF Ａ）を含有する抗ウイルス組成
物に関する。 本発明の成熟ヒト白血球インタフエロンの特定
例としては成熟ヒト白血球インタフエロン
（LeIF）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪが
あげられる。これらの成熟ヒト白血球インタフエ
ロンのアミノ酸配列は24頁表３および27頁表５に
示すとおりである。すなわち、表３における
LeIF Ａ、LeIF Ｂ、LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF
ＦおよびLeIF Ｈならびに表５におけるＩおよび
Ｊの各アミノ酸配列からＳを付した番号で示され
るシグナルペプチドを除いた165個または166個の
アミノ酸からなるポリペプチドおよびこれらのポ
リペプチドの第１番目のアミノ酸のＮ末端にさら
にメチオニンが結合して166個または167個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドが本発明の成熟ヒト白
血球インタフエロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ
およびＪである。 本発明の背景についてまず記載する。ヒト白血
球インタフエロン（LeIF）は、最初、Isaacsお
よびLindenmannにより、きわめて粗な沈殿物と
して、発見されそして調製された（Proc.R.Soc.
B147，258−267〔1957〕；U.S.P.3699222）。それ
を精製し特徴づける努力は長く続けられ、正常ま
たは白血病の提供者から得た白血球に由来する比
較的均一な白血球インタフエロンの調製にみちび
いた（ドイツ特許公報No.2947134）。これらのイン
タフエロンは、それらの標的細胞にウイルス抵抗
性の状態を付与する能力を有することの知られて
いる一群の蛋白質である。さらに、インタフエロ
ンは、細胞の増殖を阻止しそして免疫反応を調節
するように作用しうる。これらの性質から、ウイ
ルスの感染および悪性腫瘍の治療に白血球インタ
フエロンを臨床的に用いることが促進された。 白血球インタフエロンは、本質的に均一な状態
に精製され（Rubinstein等、Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.76，640−644〔1979〕；Zoon等、同上、
76，5601−5605〔1979〕）約17500から約21000の範
囲の分子量を有すると報告された。これらの調製
物の比活性は、きわめて高く、２×108から１×
109単位／mg蛋白質であるが、細胞培養法よりの
収量はおそろしく低い。しかし、蛋白質の配列を
きめる技術の進歩で、部分的アミノ酸配列が決定
された〔Zoon等、Science207，527〔1980〕；
Levy等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，5102−
5104〔1980〕）。種々の白血球インタフエロンのグ
リコシル化は、現在完全には明らかでないが、種
類間におけるグリコシル化の差のみでは、観察さ
れている分子量の分布を説明しえない。その代わ
りに、白血球インタフエロンは、種類に従いアミ
ノ酸組成および配列において著しく差があり、ア
ミノ酸の相同性は、場合により80％より低い。 提供者の白血球よりの分離で部分的な特徴付け
および限定された臨床的研究のための十分な量
の、均一な白血球インタフエロンを与えたけれど
も、それだけでは、大規模な臨床試験および広範
な予防的および（または）治療的使用に必要であ
るインタフエロンを提供するにはまつたく不十分
である。まさに、ヒト白血球由来のインタフエロ
ンを抗腫瘍および抗ウイルスに用いる現在の臨床
試験では、粗（１％より低い）調整物を用いてお
り、実際的でない価格においてすら十分な量を生
産するに至らず、広範な領域での研究を遅らせて
来た。 しかし、組換えDNA技術の出現にともなつて、
有用なポリペプチドのきわめて多様な種類を、微
生物により調節生産することが可能になつた。す
でに、この技術により修飾をうけて、ソマトスタ
チン、ヒトインシユリンのＡおよびＢ鎖およびヒ
ト生長ホルモンのようなポリペプチド鎖を生産す
ることが可能となつた細菌が存在するに至つてい
る。 （Itakura等、Science198，1056−1063
〔1977〕；Goeddel等、Nature281，544−548
〔1979〕）。より最近になつて、組換えDNA技術
が、プロインシユリンおよびチモシンアルフアー
１の生産を可能とし、さらに、なん人かの著者
は、ヒト白血球インタフエロンをコードする
DNAの採取および、その結果得られる、白血球
インタフエロン活性を有する蛋白質の生成につい
て報告している（Nagata等、Nature284，316−
320〔1980〕；Nantei等、Gene10，１−10
〔1980〕；Taniguchi等、Nature285，547−549
〔1980〕）。 組換えDNA技術の工作室は、細菌および他の
微生物に存在し、しばしば、細胞中に多数のコピ
ーとして存在する。２重鎖DNAの非染色体性の
ループである、プラスミドである。プラスミド
DNA中にコードされる情報には、娘細胞中にプ
ラスミドを再生産するに必要な情報（つまり、
“レプリコン”）および、そして、ふつうは、１種
または１種より多くの選択特性、たとえば、細菌
の場合では、抗生物質に対する抵抗性の情報があ
る。この情報により、対象とするプラスミドを含
有する宿主細胞のクローンを認識し、選択用の培
地中に優先的に発育さすことが可能となる。プラ
スミドが有用なのは、プラスミドDNA上の異な
る部位をそれぞれに認識する、ある種類または別
の種類の制限エンドヌクレアーゼまたは“制限酸
素”により、プラスミドが特異的に切断されうる
ということである。そのあとで、切断部位の両端
か、切断部位に接して再構築した末端をむすびあ
わすことにより、異質の遺伝子または遺伝子断片
をプラスミド中に挿入しうる。DNAの組換えは、
細胞の外部で実施しうるが、生成する“組換え”
プラスミドは、形質転換と称される方法により細
胞内に導入され、その転換細胞を発育さすことに
より、異質の遺伝子を含有する組換えプラスミド
を大量に生産しうる。さらに、その異質遺伝子
が、プラスミド内のコードされるDNA情報の転
写および翻訳を支配する部分に関して正しく挿入
されるならば、生成する発現ビヒクルは、挿入さ
れた遺伝子のコードするポリペプチド配列を実際
の生成つまり発現と称されるプロセスに実際に使
用されうる。 発現は、RNAポリメラーゼにより認識されそ
れが結合する、プロモーターとして知られる領域
において開始される。ある場合には、たとえば、
本発明の実施において有利とされるトリプトフア
ンまたは“trp”プロモーターのような場合には、
プロモーター領域には、“オペレーター”領域が
重なり、結合された、プロモーター−オペレータ
ーとなつている。オペレーターは、特定のプロモ
ーターにおける転写開始の瀕度を調節する役割を
する、いわゆるリプレツサー蛋白質により認識さ
れるDNA配列である。RNAポリメラーゼは、
DNAに沿つて移動し、コード配列に含まれる情
報をその5′、末端から3′末端へと、メツセンジヤ
ーRNAに転写し、ついでそれは、DNAのコード
するアミノ酸配列を有するポリペプチドへと翻訳
される。それぞれのアミノ酸は、ヌクレオチドト
リプレツトまたは“コドン”によりコードされ
る。これらは、本発明の目的に関連して“構造遺
伝子”と称される部分、つまり、発現される生成
物のアミノ酸配列をコードする部分に存在する。
プロモーターに結合したあと、RNAポリメラー
ゼは、まず、リボゾーム結合部位をコードするヌ
クレオチドを転写し、ついで、翻訳開始または
“開始シグナル”（ふつうはATGで、得られるメ
ツセンジヤRNAではAUGとなる）を、ついで、
構造遺伝子自体に存在するヌクレオチドコドンを
転写する。構造遺伝子の端においていわゆる停止
コドンが転写される。そのあとは、ポリメラーゼ
が、メツセンジヤーRNAの付加配列を形成する
ことがあつても、停止シグナルが存在するので、
リボゾームにより翻訳されないままとなる。リボ
ゾームは、ふつう、mRNAが形成されつつある
細菌においてはメツセンジヤーRNA上にある特
定の接合部位に結合する。そして、翻訳の開始シ
グナルに始まり、前記した停止したシグナルで終
了する、コードされたポリペプチドを生ずる。リ
ボゾーム結合部位をコードする配列が、AUG開
始コドンに関して適切に位置し、そして、残りの
コドンのすべてが、インフエース（in phase）に
開始コドンに従うならば、所望の生成物が生産さ
れる。得られた生成物は、宿主細胞を融解させ、
適当な精製法により他の細菌蛋白質より生成物を
採取することによりうることができる。 我々は、組換えDNA技術（つまり、インタフ
エロン遺伝子を微生物発現ビヒクルに挿入し、微
生物遺伝子調節要素の制御下にそれらを発現させ
ること）の利用が、大量の白血球インタフエロン
を提供するもつとも有効な方法と考えた。それ
は、ヒト由来の材料に特徴的なグリコシル化の特
性を欠如するけれども、広範囲に及びウイルスお
よび新生物による病気の治療に用いられるであろ
う。 本発明の第１の白血球遺伝子を採取する方法は
次の各段階からなる。 (1) 均一な状態に精製されたヒト白血球インタフ
エロンの部分アミノ酸配列を用いて、部分アミ
ノ酸配列をコードしうる、可能なヌクレオチド
の組合わせのすべてを表わす、集合体としての
コドンを含む、合成DNAプローブのセツトを
構成する。 (2) 誘導されたメツセンジヤーRNAから相補
DNA（cDNA）を含有する細菌コロニーバンク
を調製する。放射ラベルされた別の誘導
mRNAを、このバンクからのプラスミド
CDNAとハイブリドとする。ハイブリドとし
たmRNAを溶出し、卵母細胞分析でインタフ
エロンへの翻訳について試験する。このように
して、インタフエロン活性をを誘導することが
示されたコロニーよりのプラスミドDNAを、
上記(1)のように製造したプローブに対するハイ
ブリド形成について試験する。 (3) 上記(2)の工程と平行して、プラスミド中の誘
導されたmRNAに由来するcDNAを用いて、
別の形質転換コロニーバンクを用意する。(1)の
プローブをハイブリド化プローブとして用いる
ための放射ラベル１本鎖cDNAの合成を誘起す
るのに用いた。合成プローブは鋳型としての誘
導mRNAとハイブリドを形成し、逆転写によ
り拡大されて、誘導された、放射ラベルcDNA
を形成する。このようにして得られた放射ラベ
ルcDNAに対してハイブリド化されたコロニー
バンクよりのクローンについてさらに調べて、
完全長のインタフエロンコード遺伝子の存在を
確かめる。(1)または(2)で得られる部分長の推定
される遺伝子断片も、それら自体、完全長遺伝
子のプローブに用いうる。 (4) 上記に得られた完全長遺伝子は、成熟ポリペ
プチドの微生物による発現を妨げるかも知れな
いリーダ（leader）配列があれば、それを除
き、そして、微生物プロモーターの開始シグナ
ルおよびリボゾーム結合部位に関して、発現ビ
ヒクル中に適当に位置することを可能とするよ
うに、合成、DNAを用いて、仕立上げられた。
発現されたインタフエロンは精製して、その特
性を確認し、活性を測定する。 (5) 上記の方法で調製したインタフエロン遺伝子
断片それ自体は、他の部分的に相同な白血球イ
ンタフエロン種の、ハイブリド化によるプロー
ブに用いられる。 上記に概要を示した組換えDNA技術を応用す
ることにより、相当する先行配列またはその一部
分を本質的にともなわない、成熟ポリペプチドと
しての１群の相同的な白血球インタフエロン（グ
リコシル化されていない）を、高収量、高純度
で、微生物的に生産することが可能となつた。こ
れらのインタフエロンは、動物およびヒトのウイ
ルスおよび悪性腫瘍疾患に用いるに適当なレベル
まで、直接発現させ、採取し、そして精製するこ
とができる。このように発現された、１群のイン
タフエロンはイン ビトロ試験で有効であること
が示され、そして、微生物的に生産された最初の
白血球インタフエロンとして、イン ビボの試験
でも、始めて、有効なことが示されたのである。 本明細書中で用いられる“成熟白血球インタフ
エロン”の用語はグリコシル基を欠如する、微生
物的（たとえば、細菌的に）生産されるインタフ
エロンを意味する。本発明の成熟白血球インタフ
エロンは天然生成物の第１のアミノ酸コドンのす
ぐ前にある翻訳開始シグナル（ATG）より直ち
に発現される。従つて、この“成熟”ポリペプチ
ドはその配列中に第１のアミノ酸としてメチオニ
ン（ATGがコードする）を含有するが、本質的
にその特性は影響されない。他方、微生物宿主中
では得られた翻訳生成物がアミノペプチダーゼの
作用を受けて第１のアミノ酸としてのメチオニン
が開裂除去されることもある。成熟白血球インタ
フエロンは、通常のリーダー以外の接合蛋白質と
一緒に発現されうるが、この接合物は、細胞外ま
たは細胞内の環境において特異的に除去しうる
（英国特許公報No.2007676Aをみよ）。最後に、成
熟インタフエロンは、接合物を細胞壁まで輸送す
る、微生物“シグナル”ペプチドとの接合物とし
て生産されうる。細胞壁においてシグナルは処理
してはづされ、成熟ポリペプチドが分泌される。
成熟白血球インタフエロンの“発現”とは、ヒト
白血球インタフエロンゲノムのmRNA翻訳に直
接に結果する、グリコシル基または先行配列を含
有しないインタフエロン分子の細菌または他の微
生物による生産を意味する。 特定の白血球インタフエロン蛋白質は、ここで
は、決定されたDNA遺伝子（表２および表４）
および演繹的に定められるアミノ酸配列（表３お
よび表５）により定義される。これらの特定のイ
ンタフエロン、実際ここに含まれるすべての群の
白血球インタフエロンタンパク質に対して、天然
の対立遺伝子変異（allelic variation）が存在
し、個体間にもおこりうる。これらの変異は、配
列全体におけるアミノ酸の相異または、配列中の
アミノ酸の欠落、置き代え、挿入、反転または追
加として表われる。本明細書で対象とする各イン
タフエロン、標示されたLeIF ＡからLeIF Ｊに
ついて、そのような、対立遺伝子変異は、標示の
範囲内または、その定義内に含まれ、従つて、本
発明の範囲内に含まれるとする。 つぎに、表および図について説明する。
表１は、Ｔ−１およびＴ−13と称される、ヒト
白血球より分離されそして均一に精製された、す
べての種類のインタフエロンに共通の２つのアミ
ノ酸配列を示す。これらのペプチドをコードする
可能なmRNA配列のすべておよび対応するDNA
配列を示す。Ａ，Ｔ，Ｇ，ＣおよびＵの文字は、
それぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシ
ンおよびウラシルの塩基を含有するヌクレオチド
を示す。文字Ｎは、ヌクレオチドＡ，Ｇ，Ｃおよ
びＵのいずれかを示す。ポリヌクレオチドは、
５′（左側）から３′（右側）の方向に読むように
記載されている。そして、２重鎖（“d.s”）DNA
を示す時には、下側または非コード鎖について
は、順序は逆となる。第１図は、可能性のある
LeIFプラスミドと32p−ラベル合成デオキシオリ
ゴヌクレオチドとのハイブリド化を示すオートラ
ジオグラムである。 第２表は、それぞれ、“Ａ”から“Ｈ”までの
記号を付されている、白血球インタフエロンの発
現のために候補として分離された８個の遺伝子断
片のヌクレオチド配列（コード鎖）を示す。それ
ぞれのLeIFについて、ATGの翻訳開始コドンお
よび終止トリプレツトが下線で示されている。停
止コドンまたは終止コドンに続いて３′の未翻訳
領域が示されている。含まれているLeIF Ａの全
遺伝子長には、表２の第３列Ａラインに示される
ように、他のコドンには存在するひとつのコドン
が欠如している。５′非翻訳域がリーダー配列に
先行している。分離したままの断片Ｅには、リー
ダーの完全な先行配列は存在しない。しかし、仮
定される成熟LeIF Ｅに対する全遺伝子を含有す
る。分離されたままの断片Ｇは、コード配列が完
全でない。 表３では、ヌクレオチド配列より示される８個
のLeIF蛋白質配列を比較している。IUPAC−
LUB Commission on、Biochemical
Nomenclatureの提案による１文字省略が用いら
れている。つまり、アラニンはＡで、システイン
はＣで、アスパラギン酸はＤで、グルタミン酸は
Ｅで、フエニルアラニンはＦで、グリシンはＧ
で、ヒスチジンはＨで、イソロイシンはＩで、リ
ジンはＫで、ロイシンはＬで、メチオニンはＭ
で、イスパラギンはＮで、プロリンはＰで、グル
タミンはＱで、アルギニンはＲで、セリンはＳ、
スレオニンはＴで、バリンはＶで、トリプトフア
ンはＷで、チロシンはＹで表わす。数はアミノ酸
の位置を示す。Ｓはシグナルペプチドを示す。
165個のアミノ酸配列であるLeIF Ａ配列中の44
位のダツシユは、このLeIF Ａ配列を他のLeIFの
166個のアミノ酸配列と一列にそろえるために入
れてある。LeIF Ｅの配列は、そのコード領域の
他のLeIF配列にはないヌクレオチド（表２の位
置187）を除外して定められている。星印（表３）
は翻訳の読枠に正しくあてはまつている終止コド
ンを示す。すべてのLeIFに共通のアミノ酸（プ
ソイド遺伝子LeIF Ｅを除く）もまた示されてい
る。アンダーラインした残基は、ヒト線維芽イン
タフエロンにも存在するアミノ酸である。 第２図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型
（ＡからＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図
を示す。ハイブリドプラスミドは、dC：dGテー
リング法（GoeddeI，D.V.等、Nature287，411
−416〔1980〕により構築された。それで、cDNA
挿入物は、Pst を用いて切断しうる。各
cDNA挿入物の末端のラインは、側面に接するホ
モ重合dC：dGテールを示す。Pvu，EcoRお
よびBgl の制限部位も示してある。濃い領域
は成熟LeIFのコード配列を示す。斜線の部分は
シグナルペプチドコード配列である。白い部分は
３′および５′非コード配列である。 第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成を
コードする遺伝子の構築を示す。制限部位および
残部が示されている。（“Pst ”等）。“b.p.”
は塩基対を示す。 第４図および第５図は、LeIF Ｂ成熟白血球イ
ンタフエロンを発現するに用いられる２つの遺伝
子断片の制限地図を示す。示したコドン配列は、
示した２つの場合について制限酵素Sau ３ ａ
で消化することで生成するコード鎖末端である。 表４および表５は、タイプＩおよびＪを含め
た、５個のLeIF蛋白質の配列のDNAおよびアミ
ノ酸（省略符号については、第３表に同じ）を示
す。第５表において、星印は対応するDNA配列
における終止コドンを示し、ハイフエンは配列に
おける欠落またはギヤツプを示す。 つぎに、本発明を実施するための有利な具体例
を示す。 Ａ 使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つま
り、U.S.P.4.190.495記載のE.coli×1776およびE.
coliK−12 294株（エンドＡ，thi-，hsr-＋hsm
ｋ＋，英国特許公報No.2055382に記載）を用いてい
る。それぞれ、the American Type Culture
Collectionに寄託され、ATCCNo.31537および
31446（ブタペスト条約による国際寄託に基づく受
託番号31446）が付されている。組換えDNAの実
験のすべては、National Institute of Healthの
該当するガイドラインに従つて実施された。 本発明のもつとも有利な具体例は、上記定義の
菌株E.coli×1776およびE.coli Ｋ−12菌株294の
みならず、他の既知のE.coli株たとえばE.coli Ｂ
を含めたE.coliおよび他の微生物株に関連して記
載してゆくが、これらの多くは、the American
Type Culture Collection（ATCC）のような、
知られている微生物寄託施設に寄託されており入
手可能ある。ドイツ特許2644432もみられたい。
これらの他の微生物には、Bacillusたとえば
Bacillus Subtilisおよび他の腸内細菌たとえば
Salmonella typhimuriumおよびSerratia
marcescensがあり、異質遺伝子配列を発現しう
る、複製しうるプラスミドを使用する。酵母たと
えばSaccharomyces cerevisiaeもまた、酵母プ
ロモーターの制御下に、インタフエロンをコード
する遺伝子を発現させることによるインタフエロ
ン蛋白質の製造に用いて有利でありうる。 Ｂ LeIF mRNAの原料および精製 LeIF mRNAは、ヒト白血球より採取しうる。
ふつうは、ドイツ特許No.2947134に記載のように、
SendaiウイルスまたはNewcastle病ウイルスで
インタフエロンを生産するように誘導した慢性骨
ずい性白血病患者の白血球より得たものを使用す
る。特に有利な、本明細書の仕事に用いられる原
料は、急性骨ずい性白血病の１患者に由来する
KG−１と称するセルラインである。このセルラ
インは、Koeffler，H.P.およびGolde，D.W.，
Science200，1153（1978）に記載されているよう
に、RPMI（Rosewall Park Memorial
Institute）1640プラス10％熱不活化FCS（牛胎児
血清）、25 mM HEPES 緩衝液（Ｎ−２−ヒド
ロキシエチル−ピペラジン−N′−２−エタンス
ルホン酸）および50μg／mlのゲルタマイシン含
有培地に容易に発育し、１週間に２度、継代培養
（１から３スプリツト）しうる。上記の発育培地
に10％ジメチルスルホキサイドを加えて、細胞は
凍結させうる。KG−１は、the American
Type Culture Collection（ATCCNo.CRL8031）
に寄託されている。 KG−１細胞は、Rubinstein等記載の方法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，640−644〔1979〕
により、SendaiまたはNewcastle病ウイルスを
用い、白血球インタフエロン mRNAを生産す
るように誘導された。細胞は、誘導後５時間に採
取しRNAを、グアニジンチオシアネート−グア
ニジン塩酸塩法（Chirgwin等、Biochemistry18，
5294−5299〔1979〕により調製した。誘導しない
細胞からのRNAも同様に調製した。オリゴデオ
キシチミジン（dT）−セルローズクロマトグラフ
イーおよびスクロースグラジエント超遠心を用い
て、ポリ（Ａ） mRNAの12S分画を得た。方法
は、Green等（Arch.Biochem.Biophys.172，74
−89〔1976〕）およびOkuyuma等（Arch.
Biochem.Biophys.188，98−104〔1978〕）の方法
を用いた。この mRNAは、アフリカツメガエ
ル卵母細胞分析（Cavalieri等、Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.74，3287−3291〔1977〕）で8000−
10000単位／マイクログラムのインタフエロンタ
イターを示す。 Ｃ LeIF cDNA配列を含有するコロニーバンク
の調製 5μgのmRNAを用い、標準方法（Wickens等、
J.Biol.Chem.253，2483−2495〔1978〕および
Goeddel等、Nature281，544−548〔1979〕によ
り、２重鎖cDNAを調製した。cDNAは６％ポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動により、大き
さに従つて分画し、500から1500b.p.の大きさの
材料230ngを、電気溶出により得た。このcDNA
の100ng分を、デオキシシチジン（dC）残基でテ
ーリングし（Chang等、Nature275，617−624
（1978）、Pst 部位においてデオキシグアノシ
ン（dG）残基でテーリング（tailing）した470ng
のプラスミドpBR322とアニーリングし
（Bolivar等、Gene２，95−113〔1977〕）、これを
用いて、E.coli×1776を形質転換した。cDNAng
について約130個のテトラサイクリン抵抗性で、
アンピシリン感受性の形質転換株を得た。 第２の同様の実験では、cDNAngについて、
約1000個のテトラサイクリン抵抗性で、アンピシ
リン感受性のE.coli Ｋ−12株294の転換株を得
た。この場合、600から1300b.p.の範囲の、サイ
ズにより分画したcDNA材料を、電気溶出により
採取し、dCでテーリングするのに用いた。 Ｄ 合成オリゴヌクレオチドの調製およびその使
用 ヒト白血球インタフエロンのいくつかのトリプ
シン分解断片のアミノ酸配列についての知見は、
LeIF mRNAの種々の領域に対して相補的な合
成デオキシオリゴヌクレオチドのデザインを可能
とした。２つのトリプシンペプチドT1および
T13を選んだ。その理由は、それらのアミノ酸配
列は、すべての可能なコード配列（表１）を説明
するのに、12個および４個のウンデカマーを合成
するだけですむからである。それぞれの配列につ
いて、４組のデオキシオリゴヌクレオチドプロー
ブを合成した。つまり各々三つ（Ｔ−1A，Ｂ，
Ｃ，Ｄ）または一つ（Ｔ−13A，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の
オリゴヌクレオチドを含有する。示した相補的デ
オキシオリゴヌクレオチド11塩基鎖長は、ホスホ
トリエステル法で化学的に合成した（Crea等、
Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.75，5765−5769
〔1978〕）。Ｔ−13シリーズでは、４個の個々のプ
ローブを調製した。表１に示すように、３個のプ
ローブの４プールとして、12個のＴ−１プローブ
を調製した。 Ｔ−13シリーズの４個のそれぞれのプローブお
よび各３個のプライマーの４プールとして調製し
た12個のＴ−１プローブを、ハイブリド化プロー
ブに用いるための放射ラベル１重鎖cDNAの合成
を誘導するために用いた。鋳型 mRNAは、セ
ンダイ誘導KG−１細胞（8000単位IF活性／μg）
からの12s RNAまたは非誘導白血球（＜10単
位／μg）に由来する全ポリ（Ａ） mRNAであ
る。32p−ラベル cDNAを、既知の反応条件
（Noyes 等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，
1770−1774〔1979〕）を用いて、これらのプライマ
ーより調製した。20mM Tris−HCI（PH8.3）、
20mM KCI，8mM MgCI2，30mM β−メルカ
プトエタノール中で60μl容量の反応をおこなつ
た。この反応は、各プライマーの1μg（つまり、
Ｔ−１シリーズについては、全部で12μg、Ｔ−
13シリーズについては全部で4μg）、2μgの“誘
導”された12S分画 mRNA（または、非誘導ポ
リ（Ａ） mRNAの10μg）、0.5 mM のdATP，
dCTP，dTTP，200μCi（α 32p）dCTP
（Amersham，２−3000Ci／ｍ mole）および60
単位逆転写酵素（Bethesda Research
Laboratories）である。生成物は、10mlSehadex
Ｇ−50カラム上のゲル濾過により、結合されな
かつたラベルより分け、70℃で30分間0.3N
NaOHで処理し、RNAを分解し、HClで中和し
た。ハイブリド化は、Kafatos等、Nucleic Acid
Res.７，1541−1552（1979）記載に準じて実施し
た。 Ｅ クローンpL1−pL30の同定 500個のE.coli Ｋ−12株294形質転換株（Ｃ項
参照）のそれぞれより、プラスミドDNAの1μg
を調製するのに、Birnboim等、Nucleic Acids
Res.７，1513−1523（1979）の迅速プラスミド分
離操作を用いた。各DNA試料を変成させ、
Kafatos等の上記引用の方法に従い、３反復でニ
トロセルローズフイルター上につけた。 500個のプラスミド試料を含有するニトロセル
ロースフイルターの３組は、 ａ プライマーのＴ−１のセツトでプライムされ
た誘導 cDNA， ｂ Ｔ−13でプライムされた誘導 cDNAおよび ｃ プライマーの両方のセツトを用いて調製され
た非誘導 cDNAとハイブリダイズした。非誘
導プローブの全体に対するよりも誘導された。 cDNAプローブの一方または両方に対してより
強くハイブリド化するならば、クローンは陽性と
考えた。500個より30個の“陽性”クローン
（pL1−pL30）を選択し、さらに分析した。F.ク
ローンpL31−pL39の同定、LeIF遺伝子断片を含
有するプラスミド（No.104）の分離。 KG−１細胞をセンダイウイルスまたはニユー
カツスル病ウイルスで誘導して白血球インタフエ
ロンmRNAを生成せしめ、同細胞を採取し、
mRNAを調製し、これを常法によりラベルして
32pラベル誘導mRNAを得た。プローブとして
32p−ラベル誘導 mRNA（Lillenhaug等、
Biochemistry，15，1858−1865〔1976〕）を用い
て、GrunsteinおよびHognessのコロニーハイブ
リド化法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72，3961
−3965〔1975〕）によりE.coli×1776の形質転換株
をスクリーニングした。非誘導細胞よりの非ラベ
ル mRNAを 32p−ラベル調製物中に存在する
非誘導 mRNAと競合さすために、プローブに
対して200対１に混合した。ラベルされた
mRNAのハイブリド化は、誘導された配列を含
有するコロニーに選択的に起るはづである。３つ
の群の形質転換株が得られた。 (1) コロニーの２から３％が 32p−mRNAに非
常に強くハイブリド化した。 (2) 10％は、ハイブリド化の程度が、上記(1)群よ
り著しく低かつた。 (3) 残りは、検出しうる程度のハイブリド化のシ
グナルを示さなつた。 陽性のコロニー（第(1)および第(2)群）について
は、インタフエロン mRNAがプラスミドDNA
に特異的にハイブリド化することによる分析で、
インタフエロンに特異的な配列の存在について調
べた。まず、テトラサイクリン（20μg／ml）、ジ
アミノピメリン酸（100μg／ml）、チミジン
（20μg／ml）およびｄ−ビオチン（1μg／ml）を
加えたM9培地の100mlに、60個の強陽性コロニー
（第１群）のそれぞれを個別的に発育させた。M9
培地は、１リツトルについて、Na2HPO4（６
ｇ）、KH2PO4（３ｇ）、NaCl（0.5ｇ）および
NH4Cl（１ｇ）を含有し、オートクレープしたあ
と、無菌1M MgSO4の１mlおよび無菌0.01M
CaCl2の10mlを添加する。10個の培養物はプール
し、Clewell等、Biochemistry９，4428−440
〔1970〕記載のように、６個のプールよりプラス
ミドDNAを分離した。各プラスミドDNAプール
の10μgは、Hindlllで切断し、変性し、DBM
（diazobenzyloxymethyl）紙に共有結合させた。
誘導細胞よりの精製の mRNAの1μgをそれぞれ
の濾紙にハイブリドさせた。ハイブリドしない
mRNAは洗つて除去した。特異的にハイブリド
された mRNAは溶出し、アフリカツメガエル
の卵母細胞中で翻訳させた。この分析で、６個の
プールはすべて陰性であつた。弱陽性のコロニー
（第２群）の59個より、各10コロニーの５プール
と９コロニーの１プールを調製し、それらのプー
ルよりプラスミドを調製し、上記のように調べ
た。試験した６個のプールのうち、１個（K10）
は、試験の度に、バツクグラウンドレベルを著し
く超えるレベルで、インタフエロン mRNAに
ハイブリドした。特異的インタフエロン cDNA
クローンを同定するために、プールK10の９コロ
ニーよりプラスミドDNAを調製し、個別的に調
べた。９個のプラスミドのうちの２個（No.101お
よびNo.104）がインタフエロン mRNAと、バツ
クグラウンドレベルを十分に超えて結合した。プ
ラスミドNo.104をBgl制限酵素で切断し、得ら
れた260b.p.断片をゲル電気泳動により分離して
260b.p.含有Bgl制限断片を得た。これを、
Taylor等、Biochim.Biophys.Acta 442，324−
330（1976）の方法により 32pでラベルし、その場
でのコロニースクリーニング法（Grunsteinおよ
びHogness，Proc.Natl.Sci.U.S.A.72，3961−
3965〔1975〕）によりE.coli294転換株の400個を、
個別的にスクリーニングするためのプローブに用
いた。このプローブと種々の程度にハイブリド化
する、９個のコロニー（pL31−pL39）を同定し
た。 さらに、ラベルされた260b.p.断片を用いて、
同様にして、4000個のE.coli294転換株を個別的
にスクリーニングした。このプローブと種種の程
度にハイブリドする50個のコロニーを同定した。
ひとつは、LeIF Ｇ断片を、ひとつは、LeIF Ｈ
断片を、ひとつはLeIF Hlと称する断片（みかけ
上、LeIF Ｈの対立遺伝子である）を含有した。
生ずるハイブリドプラスミドは、“pLeIF Ｈ”等
と称した。 Ｇ 最初の完全長LeIF遺伝子の分離および配列
の決定 全体で39個の可能性のあるLeIF ｃ DNAク
ローンよりプラスミドDNAを調製した。そして、
Kafatos等（上記引用）のハイブリド化操作によ
り、同じ260b.p.DNAプローブを用い再スクリー
ニングした。このプローブと３個のプラスミド
（PL4，pL31，pL34）は非常に強いハイブリド化
シグナルを与え、４個（pL13，pL30.pL32，
pL36）は中程度にハイブリド化し、３個（pL6，
pL8，pL14）は、弱くハイブリド化した。 39個の可能性のあるLeIF cDNA組換えプラス
ミドは、また、 32p−ラベル合成ウンデカマー
各々３種のプライマーからなるＴ−１プライマー
プールのそれぞれまたはＴ−13プライマーのそれ
ぞれ）をじかにハイブリド化のプローブに用いて
検索した。検出しうるハイブリド化のシグナルを
与えるのに完全な塩基間の対が必要であるよう
に、ハイブリド化の条件を選んだ（Wallace等、
Nucleic Acid Res.６，3543−3557〔1979〕）。つ
まり、39個のクローンよりプラスミドDNAを、
標準上澄溶液法（プラスミドを有する細胞を界面
活性剤等を用いて溶菌させ、遠心分離後、プラス
ミドを含む上澄みを回収し、この上澄みからプラ
スミドを単離する方法である。上澄みからの単離
にはエタノール沈殿法が利用される。）（cleared
lysate procedure，Clewell等、上記）で調製し、
Biorad Agarose Ａ−50（Bio−Rad社製のゲル
濾過用アガロースゲル）カラムクロマトグラフイ
ーで精製した。各調製物の試料（3μg）は、
EcoRで処理して開環し、アルカリで変性させ、
２枚の別々のニトロセルロースフイルターにスポ
ツトした。１スポツトについて1.5μgとする。上
記引用のKafatos等の文献をみよ。合成デオキシ
オリゴヌクレオチドＴ−13プライマーおよびＴ−
１プライマープールのそれぞれは、（γ32P）ATP
でつぎのようにリン酸化した。50pmoleのオリゴ
ヌクレオチドおよび100pmoleの（γ 32P）ATP
（New England Nuclear，2500Ci／ｍ mole）
を、50mMのTris−HCl，10mMのMgCl2および
15mMのβ−メルカプトエタノールの混合物の
30μl中で合併した。２単位のT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを添加し、37℃で30分後 32p−ラベル
プライマーは、10mlSephadex Ｇ−50カラム上
でのクロマトグラフイーで精製した。106cpmの
プライマーＴ−13Cまたは３×166cpmのプライマ
ープールＴ−1Cを用いてハイブリド化した。ハ
イブリド化は、Wallace等の上記引用の方法に従
つて、６×SSC〔１×SSC＝0.15 MNaCl，
0.015Mくえん酸ナトリウム、PH7.2）、10×
Denhardts〔0.2％牛血清アルブミン、0.2％ポリビ
ニルピロリドン、0.2％Ficoll〕溶液中で、15℃で
14時間ハイブリド化した。フイルターは６×SSC
中０℃で５分間宛３度洗つた。乾燥し、Ｘ−線フ
イルムにさらした。結果は、第１図に、 32p−プ
ライマーＴ−13CおよびプライマープールＴ−1C
の場合について示してある。 クローン104からのプラスミドDNAは、プライ
マープールＴ−1CおよびプライマーＴ−13Cと顕
著にハイブリド化した。しかし、他のウンデカマ
ーとは、検出しうる程のハイブリド化は示さなか
つた。第１図に示すように、39個の可能性のある
LeIFプラスミドのうちのいくらか（pL2，４，
13，17，20，30，31，34）はこれらのプローブの
両方とハイブリド化した。しかし、制限分析か
ら、これらのプラスミドのうちのひとつだけ、
pL31が260b.p.内部Bgl 断片をも含有した。
pL31をPst で消化した結果、 cDNA挿入物
の大きさは約1000b.p.であつた。 pL31のPst 挿入物全体の配列を、Maxam
−Gilbert化学法（Methods Enzymol.65，499−
560〔1980〕）およびジデオキシ鎖末端化方法
（Smith，Methods Enzymol.65，560−580
〔1980〕）で決定した。その際、Sau3 ａ断片をＭ
13ベクター中にサブクローン化しておいた。
DNA配列は表２の“Ａ”に示してある。入手し
うる蛋白質配列についての情報、既知のLeIF分
子量の範囲、３個の可能な読み枠における停止ト
リプレツトの相対的な存在より適当な翻訳読み枠
が示唆された。それから、プレーまたはシグナル
ペプチドを含めてLeIFアミノ酸全配列が示され
た。第１のATG翻訳開始コドンは、配列の5′末
端より60番目のヌクレオチドに存在し、188コド
ンあとに、TGA終止トリプレツトが存在する。
3′末端には342個の非翻訳ヌクレオチドがあり、
ついでポリ(A)配列がつづく。仮定されるシグナル
ペプチド（おそらく、白血球よりの成熟LeIFの
分泌にあづかるのであろう）は23アミノ酸長であ
る。成熟LeIFを構成する165アミノ酸の分子量の
計算値は、19，390である。我々は、このpL31に
よりコードされたLeIFを“LeIF Ａ”と称した。
表３の配列データ（“Ａ”）よりトリプシンペプチ
ドT1およびT13は、LeIF Ａの146−150および58
−62にそれぞれ相当することが分る。これらの２
つの領域に見出される実際のDNAコード配列は、
プライマープールT1−ＣおよびプライマーT13
−Ｃに表されるものである（表４をみよ）。 Ｈ 成熟白血球インタフエロンＡ（LeIFA）の直
接発現 １ 一般的既述 LeIF Ａを成熟インタフエロンポリペブチドと
して直接に発現させるための操作は、合成（Ｎ−
末端）および相補的DNAの組合せを包含する点
でヒト生長ホルモンに用いられた方法（Goeddl
等、Nature281，544−548〔1979〕の一変形であ
る。 第３図に示すように、Sau 3a制限エンドヌク
レアーゼ部位は、便宜なことに、LeIF Ａのコド
ン１および３とのあいだに存在する。ATG翻訳
開始コドンを含有し、アミノ酸１（システイン）
に対するコドンを修復し、EcoR粘着末端を新
しく作製することを包含する、２つの合成デオキ
シオリゴヌクレオチドをデザインした。これらの
オリゴマーは、pL31の34b.p.Sau 3a−Ava
断片に連結した。生ずる45b.p.生成物は２つの追
加のDNA断片に連結させ、865b.p.合成−天然雑
種遺伝子とした。これは、LeIF Ａをコードし、
EcoRおよびPst 制限部位によりはさまれて
いる。この遺伝子は、EcoRおよびPst 部位
のあいだにおいて、PBR322に挿入し、プラスミ
ドPLeIF Alとした。 ２ トリプトフアン調節要素（E.coli trpプロモ
ーター、オペレーターおよびtrpリーダーリボ
ゾーム結合部位を含有するが翻訳開始のための
ATG配列を欠如する）の構築 プラスミドpGMI（ATCC 31622）は、欠失
ΔLE 1413を含有するE.coliトリプトフアンオペ
ロンを担う（Miozzari等、J.Bacteriology133，
1457−1466〔1978〕）。それゆえに、trpリーダーの
最初の６個のアミノ酸そしてtrp Ｅポリペプチド
のおよそ最後の1/3（以降、あわせてLE′と称す
る）ならびにtrp Ｄポリペプチドの全体を含有す
る融合蛋白質を発現する。これはすべてtrpプロ
モーター−オペレーターシステムの調節下にあ
る。プラスミドPGM1の代りに容易に入手可能な
その他の同等のtrpプロモーター（たとえば、
Bennett，J.Mol.Biol.（1978）121，113−137の
135頁Fig.１０参照）を用いてもよい。このプラ
スミド20μgを制限酵素Pvuで消化した。これ
は、プラスミドを５個の部位において切断する。
この遺伝子断片はついでEcoRリンカー
（pCATGAATTCATGの自己相補性のオリゴヌ
クレオチドより成立つ）と結合させ、あとから、
EcoR部位含有プラスミド中にクローン化する
ためのEcoR切断部位とする。pGM1より得ら
れるDNA断片の20μgを、200Pmoleの5′−リン酸
化合成オリゴヌクレオチドpCATGAATCATG
の存在で、20μlT4DNAリガーゼ緩衝液（20mM
Tris PH7.6，0.5mM ATP，10mM MgCl2，
5mMジチオスレイトール）中で10単位T4DNA
リガーゼで４℃一夜処理した。溶液はついで70℃
で10分間加熱し、連結を停止させた。リンカーは
EcoR消化で切断し、EcoR末端を有する断片
を５パーセントポリアクリルアミドゲル電気泳動
（以降PAGEと称する）を用いて分け、大きい方
の３個の断片を、エチジウムブロマイドでまず染
色し、紫外線で断片の位置を定め、ゲルより対象
となる部分を切り取る方法で分離した。各ゲル断
片（300μl0.1×TBE）を透析バツグに入れ、そし
て、0.1×TBE緩衝液（TBE緩衝液は10.8ｇの
Tris塩基、5.5ｇのホウ酸、0.09ｇのNa2EDTAを
１リツトルのH2O中に含有）中で100V1時間電気
泳動した。透析バツグより水溶液を採取し、フエ
ノール抽出、クロロホルム抽出、0.2M塩化ナト
リウム濃度とし、エタノール沈殿後水中にDNA
を採取した。EcoR粘着末端を有するtrpプロモ
ーター−オペレーター含有遺伝子は、つぎに記載
する操作で同定した。つまり、テトラサイクリン
感受性プラスミドに断片を挿入し、これは、プロ
モーター−オペレーターの挿入で、テトラサイク
リン抵抗性とした。 プラスミドpBRHI（Rodriguez等、Nucleic
Acids Res.６，3267−3287〔1979〕）は、アンピ
シリン抵抗性を発現しそして、テトラサイクリン
抵抗性遺伝子を含有する。しかし、それに組合わ
されたプロモーターが存在しないので、その抵抗
性を発現しない。このプラスミドは従つてテトラ
サイクリン感受性である。このEcoR部位にプ
ロモーター−オペレーターシステムを導入するこ
とにより、プラスミドをテトラサイクリン抵抗性
となしうる。 pBRHIをEcoRで消化し、酵素はフエノール
抽出クロロホルム抽出で除去し、エタノール沈殿
させて水中にうる。別々の反応混合物中に存在す
る生成DNA分子は、上記に得られた３個のDNA
断片のそれぞれと合併し、そして、前記のよう
に、T4DNAリガーゼで連結させた。反応混合物
中に存在するDNAを用いて、標準方法
（Hershfield等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71，
3455−3459〔1974〕）によりDNAとり込み能のあ
るE.coli Ｋ−12株294を形質転換し、この細菌
を、20μg／mlのアンピシリンおよび5μg／mlのテ
トラサイクリンを含有するLB（Luria−Bertani）
プレートに接種した。いくつかのテトラサイクリ
ン抵抗性コロニーを選び、プラスミドDNAを分
離しそして、望む断片の存在を制限酵素分析で確
かめた。生ずるプラスミドをpBRH trpと称す
る。 肝炎ＢのウイルスゲノムのEcoRおよび
BamH消化生成物を常法により採取し、プラ
スミドpGH6（ATCC 31539）のEcoRおよび
BamH部位にクローン化し（このプラスミド
pGH6は、GoeddelらのNature281，544（1979）
に示されているように、プラスミドpKB268から
単離された285塩基対のEcoR断片（同断片は、
95塩基対の異種DNA断片を介在させた２つの
UV−５ lacプロモータからなり、その構築方
法は、JohnsrudのProc.Natl.Acad.Sci.USA，75
(11)5314−5318（1978）に記載されている）を、プ
ラスミドpBR322のEcoR部位に挿入すること
により構築される。なお、UV−５ lacプロモ
ータの塩基配列は、DicksonらのScience187，27
−35（1975）、SimpsonらのCell18，277−285
（1979），SiebenlistらのCell 20，269−281
（1980）等に記載されており、公知である。〕、プ
ラスミドpHS32とする。プラスミドpHS32を
Xba で切断し、フエノール抽出し、クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈殿させた。沈殿は、
0.1mM dTTPおよび0.1mM dCTPを含有する
30μlポリメラーゼ緩衝液（50mMリン酸カリウム
PH7.4、7mM MgCl2，1mM β−メルカプトエタ
ノール）中で、1μlE.coli DNAポリメラーゼ、
Klenow断片（Boehringer−Mannheim）で、０
℃で30分、ついで37℃で２時間処理した。この処
理でXba 切断部位の5′突出末端に相補的な４
個のヌクレオチドのうちの２個がみたされる。 5′CTAGA− 5′CTAGA− 3′Ｔ− TCT− ２つのヌクレオチドdCおよびdTが組込まれて
２つの突出する5′ヌクレオチドを有する末端を与
える。プラスミドpHS32（フエノールおよびクロ
ロホルム抽出後エタノール沈殿させて水に取る）
のこの直鎖残基を、EcoRで切断した。大型プ
ラスミド断片を、PAGEで、より小さいEcoR
−Xba 断片より分け、電気溶出により分離し
た。pHS32（0.2μg）よりのこのDNA断片は、上
記に類似の条件で、pBRH trpに由来するトリプ
トフアンオペロン（約0.01μg）のEcoR−Taq
Ｉ断片に連結した。 上記のpHS32の断片をEcoR−Taq 断片
に連結するこの方法において、完全なワトソン−
クリツク塩基対ではないけれども、Taq の突
出する末端をXba の残存する突出末端に連結
する。 −Ｔ −AGC＋CTAGA− TCT−→−TCTAGA −AGCTCT− − この連結反応混合物の１部はE.coli294細胞の
変換に用い、熱処理し、アンピシリン含有LBプ
レート中に塗布した。24個のコロニーを選択し、
３mlLB（Luria−Bertani）中で発育させ、プラ
スミドを分離した。これらのコロニーのうちの６
個が、E.coliによるDNA修復および複製により
再生されたXba 部位を有することが分つた。 −TCTAGA −AGCTCT− −→−TCTAGA −AGATCT− − これらのプラスミドは、EcoRおよびHpa
の両方で切断されて、期待される制限断片を与
えることも分つた。pTrp14と称するひとつのプ
ラスミドを、つぎに論議するように異質のポリペ
プチドを発現さすのに用いた。 プラスミドpHGH107（ATCC 31538）（このプ
ラスミドpHGH107は、GoeddelらのNature
281，544（1979）に記載の方法（例えば同文献の
Fig.4参照）により、前述のpGH6のlacプロモー
タの下流にヒト成長ホルモンをコードするDNA
断片を挿入して構築される。〕は、合成DNA断片
より生成された23個のアミノ酸コドンおよびヒト
生長ホルモンメツセンジヤーRNAの逆転写で生
成される相補的DNAより得られる163個のアミノ
酸コドンより成立つヒト生長ホルモンに対する遺
伝子を含んでいる。この遺伝子は、ヒト生長ホル
モンの“先行”配列のコドンを欠如するけれど
も、ATG翻訳開始コドンを含有する。この遺伝
子は、10μpHGH107より、EcoR処理、それに
続く、上記のようなE.coli DNAポリメラーゼ
Klenow断片およびdTTPおよびdATP処理を
経て分離した。フエノールおよびクロロホルム抽
出のあとエタノール沈殿させたプラスミドを
BamHで処理した。 ヒト生長ホルモン（HGH）遺伝子含有断片
は、PAGE、つづいて電気溶出により分離した。
生ずるDNA断片は、テトラサイクリンプロモー
ター−オペレーターシステムを欠如するが、テト
ラサイクリン抵抗性構造遺伝子の最初の350個の
ヌクレオチドをも含有するので、引きつづき発現
プラスミド中にクローン化したときに、その挿入
物を含有するプラスミドは、テトラサイクリン抵
抗性の回復により見定め得る。断片のEcoR未
端は、Klenowポリメラーゼ法でみたされてあ
るので、この断片は、ひとつの平滑末端（blunt
end）およびひとつの粘着末端を有する。それ
で、あとから発現プラスミドに挿入されても正し
い配向が確実になる。 発現プラスミドpTrp14を、ついで、上記調整
のHGH遺伝子含有断片を受け入れるように調整
した。すなわち、pTrp14をXba 消化し、生
ずる粘着性末端を、dATP、dTTP、dGTPおよ
びdCTPを用いるKlenowポリメラーゼ法でみ
たした。フエノールおよびクロロホルム抽出およ
びエタノール沈殿のあと、生ずるDNAはBam
Ｈで処理し、生ずる大型プラスミド断片を
PAGEおよび電気溶出で分離した。pTrp14由来
の断片は１個の平滑末端および１個の粘着末端を
有し、前記したHGH遺伝子含有断片と正しい配
向で再結合することを可能とした。 HGH遺伝子断片とpTrp14ΔXba−Bam Ｈ
断片とは、上記と類似の条件で、合併し相互に連
結した。みたされたXba およびEcoR末端
は、平滑末端による連結で、Xba 部位および
EcoR部位の両方を再構成した。 【表】 この構築はまたテトラサイクリン抵抗性遺伝子
をも創出する。プラスミドpHGH107は、HGH
遺伝子より上流に存在するプロモーター（lacプ
ロモーター）よりテトラサイクリン抵抗性を発現
するので、pHGH207と称するこの構築は、トリ
プトフアンプロモーター−オペレーターの調節下
でのテトラサイクリン抵抗性遺伝子の発現を可能
とする。ついで、連結混合物でE.coli294を転換
し、5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するLB
プレート上でコロニーを選択した。 プラスミドpHGH207はEcoR消化し、trpプ
ロモーター−オペレーターおよびtrpリーダーリ
ボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始のための
ATG配列を欠如する300b.P.断片を、PAGEそれ
につづく電気溶出で採取した。このDNA断片は
pLeIF ＡのEcoR部位にクローン化した。上記
の変型trpレギユロン（regulon）（発現レベルを
高めるように調節するためにアテニユエータ配列
を欠失させたE.coli trpオペロン）を含有する発
現プラスミドは、プロモーター−オペレーターシ
ステムを抑制するに十分量のトリプトフアン添加
培地にあらかじめ定めたレベルまで発育させう
る。ついで、トリプトフアンを除去しシステムの
抑制を除けば、目的とする生成物が発現されう
る。 より具体的に示すと、第３図を参照して、
250μｇのプラスミドpL31をPst で消化し、
1000b.P.の挿入物を６％ポリアクリルアミドゲル
上のゲル電気泳動で分離した。約40μｇの挿入物
をゲルより電気溶出し、３つに分けて、つぎのよ
うにさらに消化した。ａこの断片の16μｇ試料
を、37℃で45分間Bgl の40単位で部分的に消
化し、反応混合物は６％ポリアクリルアミドゲル
上で精製した。望む670b.P.の断片約2μｇを採取
した。b1000b.p，Pst 挿入物の別の試料（8μ
ｇ）をAva およびBgl で消化した。ゲル
電気泳動のあとに、上記の150b.p.の断片1μｇを
得た。c1000b.p.片の16μｇをSau3aおよびAva
で処理した。10％ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動したあと、約0.25μｇ（10pmole）の34b.
p.断片を得た。２つの示したデオキシオリゴヌク
レオチド、5′−dAATTCATGTGT（断片１）お
よび5′−dGATCACACATG（断片２）はホスホ
トリエステル法で合成した。断片２はつぎのよう
にリン酸化した。200μl（約40pmole）の（γ
32P）ATP（Amersham，5000Ci／mmole）を乾
燥し、60mMのTris−HCl（PH８）、10mMの
MgCl2、15mMβ−メルカプトエタノールより成
立つ、100pmoleのDNA断片および２単位のT4
ポリヌクレオチドキナーゼ含有溶液30μlに再懸濁
した。37℃で15分後、1μlの10mMのATPを添加
し、反応はさらに15分進行させた。混合物はつい
で70℃で15分加熱し、100pmoleの5′−OH断片１
および10pmoleの34b.p.Sau 3a Ava 断片と
合併した。20mM Tris−HCl（PH7.5）、
10mMMgCl2、10mMジチオスレイトール、
0.5mMATPおよび10単位T4DNAリガーゼの
50μl中で５時間４℃で連結させた。混合物は６％
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、45b.p.
生成物を電気溶出で採取した。45b.p.生成物の
30ng（1pmole）を、150b.p.Ava −Bgl 断
片の0.5μｇ（5pmole）および670b.p.Bgl −
Pst 断片の1μｇ（2pmole）と合併した。20単
位のT4DNAリガーゼを用いて20℃16時間連結処
理した。65℃で10分間加熱してリガーゼを不活化
した。混合物はEcoRおよびPst で消化して
遺伝子の重合体を除去した。混合物は６％PAGE
で精製した。約20ng（0.04pmole）の865b.p.生成
物を分離した。これの半分（10ng）を、pBR322
（0.3μｇ）のEcoRおよびPst 部位のあいだ
に挿入した。E.coli294を形質転換すると70個の
テトラサイクリン抵抗性、アンピシリン感受性の
転換株を与えた。これらのうちの18個からプラス
ミドDNAを分離し、EcoRおよびPst で消
化した。18個のプラスミドのうち、16個が865b.
p.長のEcoR−Pst 断片を有した。これらの
うちのひとつPLeIF Alの1μｇをEcoRで消化
し、E.coli trpプロモーターおよびtrpリーダーリ
ボゾーム結合部位を有する、上記製造のような
300b.p.EcoR断片（0.1μｇ）に連結させた。trp
プロモーターを含有する転換物は、Grunstein−
Hognessコロニースクリーニング法と組合わせ
て、プローブとしてtrpプロモーター配列を含有
する 32P−ラベルDNA断片を用いて同定した。
trp断片中の非対称的に位置しているXba 部
位は、trpプロモーターが、LeIF Ａ遺伝子の方
向に配向している、組換え生成物の同定を可能と
した。 LeIF Ａのインビトロおよびインビボ活性 IF分析のための抽出物をつぎのように調製し
た。培養物の１mlを5μｇ／mlのテトラサイクリ
ンを含有するＬブロス中で発育させ、A550値（波
長550mmにおける吸光度）を約1.0とし、ついで、
5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するM9培地
25ml中に希釈した。A550が1.0に達した時に10ml
の試料を遠心採取し、細胞塊を、15％スクロー
ス、50mMTris−HCl（PH8.0）、50mM EDTAの
１ml中に懸濁させた。１mgのリゾチームを添加
し、０℃５分のあと、細胞は超音波処理で破壊し
た。試料は10分間（15000rpm）で遠心し、上清
中のインタフエロン活性を、細胞変性効果
（CPE）の阻止分析により、標準LeIFと比較して
測定した。細胞あたりのIF分子数を測定するた
めには、４×108単位／mgのLeIF比活性を用い
た。 表６に示すように、trpプロモーターを望む配
向に挿入したクローンpLeIF Ａ trp25は高い活
性（2.5×108単位／ｌ）を示した。表７に示すよ
うに、E.coli Ｋ−12株294／pLeIF Ａ trp25の
生成するIFは、ヒトLeIF標品と同様に挙動した。
PH２での処理に対し安定で、ウサギ抗ヒト白血球
抗体により中和される。このインタフエロンの見
かけの分子量は約20000である。クローンpLeIF
Ａ trp25はアメリカンタイプカルチヤーコレク
シヨン（ATCC）に寄託されている。 インタフエロンのインビボでの効果には、マク
ロフアージおよびナチユラルキラー（NK）細胞
が必要である。そしてインビボでの作用は、これ
らの細胞の刺激を含むようにみえる。それで、E.
coli294／pLeIF A25により生産されるインタフ
エロンは、細胞培養の分析では抗ウイルス活性を
有するが、感染動物では無効である可能性があ
る。さらに、細菌より生産された、非グリコシレ
ート化LeIF Ａのインビボ・抗ウイルス作用は、
ヒト“バフイーコート（buffy coat）”白血球に
由来するグリコシレート化LeIFとは異なること
がありうる。それで細菌により合成されたLeIF
Ａ（２％純度）の生物活性を、スクイレルモンキ
ー（リスザル）への致死量の脳心筋炎ウイルス
（EMC）感染において、バフイーコートLeIF（８
％純度）と比較してみた（表８）。 【表】 【表】 ＊表６に記載のE.coli294／pLeIF Ａ trp25の
抽出物mlあたり250000単位を、最小必須培地で
500倍希釈し、500単位／mlの比活性とした。白血
球インタフエロン標準（Wadley Institute）をあ
らかじめNIH白血球インタフエロン標準に対し
て、タイターを求めて、やはり500U／mlの最終
濃度に希釈した。１ml量を1NHClでPH２とし、
４℃で52時間インキユベートし、NaOHを添加
中和し、IF活性を標準CPE阻止分析で測定した。
500単位／ml試料（未処理）の25μl分を25μlのウ
サギ抗−ヒト白血球インタフエロンと37℃で60分
インキユベートし、12000×ｇで５分遠心し、上
清を分析した。 【表】 サルはすべて雄（平均体重713ｇ）で、感染前
には、EMCウイルス抗体は有しない。サルには、
100×LD50EMCウイルス（マウスで測定）を筋
肉内感染させた。対照感染サルは、感染後134，
158，164時間に死亡した。 106単位インタフエロン処理は、感染前４時間、
感染後２，23，29，48，72，168および240時間目
に静脈内投与した。細菌性白血球インタフエロン
は、E.coli294／pLeIF A25の融解物よりのカラ
ムクロマト分画で、比活性7.4×106単位／mg蛋白
質であつた。対照細菌蛋白質は、E.coli294／
pBR322融解物よりの相当するカラム分画で、２
倍の全蛋白質量とした。白血球インタフエロン標
準は、クロマトグラフイーで、32×106単位／mg
蛋白質の比活性に精製した、正常のヒト“バツフ
イーコート”細胞よりのSendaiウイルス誘導イ
ンタフエロンであつた。 対照のサルは、序々に進行する昏睡、バランス
の消失、後肢の弛緩、まひそして死亡前８時間頃
より開始する涙の流出を示した。インタフエロン
処理サルは、これらの異常はまつたく示さず、常
時活動的で、ウイルス血症による症状を示さなか
つた。４日までウイルス血症を示さなかつた対照
中の１頭のサルは、もつとも遅れて死んだ（感染
164時間後）、しかし、死後、心臓および脳に高タ
イターでウイルスを検出した。インタフエロン投
与サルは、感染後14および21日の検査でEMCウ
イルスに対する抗体を生成しなかつた。これらの
結果は、感染動物におけるLeIF調製物の抗ウイ
ルス効果は、インタフエロンのみに帰せられうる
ことを示す。理由は、爽雑する蛋白質は、細菌と
バツフイーコート調製物ではまつたく異なるから
である。さらに、これらの結果は、LeIF Ａのイ
ンビボ抗ウイルス活性にグリコシル化が不要であ
ることを示す。 Ｊ その他の白血球インタフエロンに対する
cDNAの分離 完全に特徴づけられたLeIF Ａ cDNA含有プ
ラスミドよりのDNAをPst で切断し、電気泳
動により分離し、 32pでラベルした。生ずる放射
ラベルDNAをプローブに用い、上記のGrunstein
およびHognessのインジトウーコロニースクリー
ニング法により、宿主微生物としてE.coli294を
用いて上記Ｃ項で得られる白血球インタフエロン
のcDNAを含有する形質転換体のその他のコロニ
ーバンクをスクリーニングにかけた。この結果
種々の程度にプローブにハイブリド化したコロニ
ーを単離した。これらのコロニーからのプラスミ
ドDNAおよび上記Ｇ項に示した10個のハイブリ
ド化コロニーからのプラスミドDNAを、Pst
切断により分離し、３つの方法で特徴づけた。第
１に、これらのPst断片を、酵素Bgl、Pvuお
よびEcoRを用いる制限エンドヌクレアーゼ消
化パターンで特徴づけた。上記コロニーから得ら
れたPst断片の分析は、第２図に示した、少な
くとも８種の異なる型（LeIF Ａ、LeIF Ｂ、
LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF Ｅ、LeIF Ｆ、LeIF
ＧおよびLeIF Ｈ）の分類を可能とした。これ
は、これまでに知られているLeIF Ａの先行配列
およびコード配列に関する、種々の制限切断点の
おおよその位置を示している。これらのうちのひ
とつLeIF Ｄは、Nagata等がNature 284、316
−320（1980）に報告したのと同じと信ぜられる。 第２に、それらDNAのいくつかについて、ポ
リーＡ含有KG−１細胞RNAより、LeIF
mRNAを選択的に除去する能力について、
Cleveland等がCell20、95−105（1980）に記載し
たハイブリツド化選択分析により調べた。LeIF
Ａ、Ｂ、ＣおよびＦのPst断片はこの分析で陽
性であつた。第３に、これらのPst断片を発現プ
ラスミドに挿入し、E.coli 294をそのプラスミド
で形質転換し、断片を発現させた。プレインタフ
エロンと信ぜられる発現生成物は、LeIF Ｆ断片
がかろうじて陽性以外は、インタフエロン活性に
対するCPE分析ですべて陽性であつた。上記に
加えて、上記のLeIF型のすべてについて配列を
定めた。 Ｋ 第２の成熟白血球インタフエロン（LeIF
Ｂ）の直接発現 成熟LeIF Ｂに対する遺伝子を含有する分離断
片の配列は、型ＡおよびＢの最初の14個のヌクレ
オチドが同じであることを示す。それで、trp−
プロモーター−オペレーター、リボゾーム結合部
位およびLeIF Ａ（＝Ｂ）遺伝子の第１コドンを
有する断片を、pLeIF A25より分離し、LeIF Ｂ
の発現プラスミドを構築するためＢ配列の残りの
部分と結合させた。この場合、前記Ｂ配列の残り
の部分はLeIF Ｂの第２のコドンから始まる。
pL4（第２図に示したLeIF Ｂ Pst末端遺伝子を
含有するプラスミド）のPst断片およびpLeIF
A25の１部に対する顕著な制限地図を、第４図お
よび第５図にそれぞれ示す。 第４図の配列によりPst 断片に対しておお
よそ950b.p.のSau ３ ａ−Pst 断片をうるに
は、１個または１個より多くの介在するSau ３
ａ制限部位が存在するので、単にPstとSau
３ ａとを用いて切断する方法は適用できずいく
つかの段階が必要である。つまり、つぎのように
なる。 LeIF Ｂ発現ベクターおよびこれを含む形質転
換体の製造方法を以下に記載する。 １ つぎの断片を分離した。 ａ Sau3 ａからEcoRまでの110bb.p.； ｂ EcoRからXbaまでの132b.p. ｃ XbaからPstまでの＞700b.p. ２ 断片１ａおよび１ｂを連結させXbaおよび
Bglで切断して、Sau ３ ａおよびXba末端
を経由する自己重合を防いだ（関連するSau
３ ａ部位はBgl 部位内にあり；Bgl
切断はSau ３ ａ粘着性末端を残した）。
242b.p.断片を分離した。 ３ ２および１ｃの生成物を連結させ、ふたたび
自己重合を防ぐために、Pst およびBgl
で切断した。Sau ３ ａからPst までの
（第４図）約950b.p.断片を分離した。この断片
は、LeIF Ａに共通していない、LeIF Ｂ遺伝
子の部分を含有した。 ４ LeIF Ａのtrpプロモーター−オペレーター、
リボゾーム結合部位、ATG開始シグナルおよ
びシステインコドンを含有する。 約300b.p.断片（HindからSau ３ ａま
で）を、pLeIF25より分離した。 ５ Pst からHind までの約3600b.p.断片
をpBR322より分離した。レプリコンおよびテ
トラサイクリン抵抗性がコードされているが、
アンピシリン抵抗性は含有しない。 ６ 段階３，４および５で得られた断片をトリプ
ル連結し、生ずるプラスミドでE.coli Ｋ−12
株294を転換した。 転換株はミニスクリーニング（Birnboim等、
Nucleic Acids Rcs.７、1513−1523〔1979〕）に
処し、プラスミド試料はEcoRで消化した。消
化物は３個の断片を与えたが、それらの特徴は、
１ EcoR−EcoR trp プロモーター断
片；２）pL4の内部EcoR−EcoR断片；およ
び３）pL4の蛋白質翻訳開始シグナル−EcoR
断片。 ウイルスの細胞変性効果に基づく慣用の分析方
法であるCPE分析（The Interferon System，
Springer−Verlag，Wien／Austria，1979，
pp17よび18参照）で、上記のように調製したク
ローンより細菌抽出物は、代表的には、A550＝１
で約10×106単位／ｌのインタフエロン活性を与
えた。このように調製されたひとつの代表的なク
ローンは、E.coli294／pLeIF Ｂ trp7である。
このクローンはATCCに寄託されている。 Ｌ さらに別の成熟白血球インタフエロン
（LeIF Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪ）の直接
発現 他のLeIFタイプを含有する追加の完全長遺伝
子断片は、LeIF Ａにおけると同様に、テイラー
し発現のための発現ビヒクル中におきうる。成熟
LeIF Ａの発現のための、上記Ｈ項に記載のよう
なアプローチ、つまり、制限切断により先行配列
を除去し、先行配列除去で失なわれたＮ−末端ア
ミノ酸コドンを合成DNA断片の連結でおき代え
るという、便利な方法がとれるかどうかを決めう
るよう、成熟インタフエロンタイプの第１のアミ
ノ酸コドンに十分に近く制限部位が存在するかど
うかは、従来法による完全な配列決定から分るで
あろう。それがうまくいかなければ、つぎの操作
を用いうる。要するに、成熟ポリペピチドの第１
のアミノ酸に対するコドンの開始する点より正確
に前のところで先行配列含有断片を切断する。つ
まり １ その点をとりまく領域内において２重鎖
DNAを１重鎖DNAに変える； ２ 段階１で生成した１重鎖の領域に目的とする
切断部位と結合するヌクレオチドと反対側にプ
ライマーの5′末端が位置するようにして、１重
鎖DNAの相補的なプライマーをハイブリド化
する。 ３ プライマーより3′の方向にある、段階１で除
かれた第２の鎖の部分を、アデニン、チミン、
グアニンおよびシトシン含有デオキシヌクレオ
チドトリホスフエートの存在でのDNAポリメ
ラーゼを用いる反応で〓復させる。 ４ 切断しようとする点をこえて突出している、
残存する１重鎖DNAを消化する。 翻訳開始シグナルATGを、コード鎖の3′末端
に有する短鎖長合成DNAを、ついで、得られた
成熟インタフエロンのために仕立上げられた遺伝
子に、たとえば平滑末端連結で連結し、そしてこ
の遺伝子を発現プラスミドに挿入し、プロモータ
ーおよびそれに組合わされたリボゾーム結合部位
による調節下におく。 上記のＫ項で用いたのと同様にして、LeIF Ｃ
およびLeIF Ｄをコードする遺伝子断片を、直接
的細菌による発現のために適当に配列した。これ
らの追加の白血球インタフエロンの発現のための
戦略として、それぞれの場合について、pLeIF
A25よりのLeIF Ａのtrpプロモーター−オペレー
ター、リボゾーム結合部位、ATG開始シグナル
およびシステインコドンを含有する、約300b.p.
の断片（HindからSau ３ ａまで）を用い
る。これに対して、すべてに共通である最初のシ
ステインより向うの、それぞれのアミノ酸配列を
コードするその他のインタフエロン遺伝子よりの
遺伝子断片を結合する。得られたそれぞれのプラ
スミドを用いてE.coli Ｋ−12株294を転換した。
それぞれの遺伝子を形成するための結合は次のよ
うである。 LeIF Ｃ pLeIF Ｃより次の断片を分離する： (a) Sau ３ ａからSau 96までの35b.p. (b) Sau 96からPst までの＞900b.p. (c) 上記K4項におけるように、pLeIF Ａ−25よ
り約300b.p.の断片（Hind−San ３ ａ）を
分離する。 (d) 上記K5項の約3600b.p.の断片を分離する。 構 築 (1) (a)および(c)を連結する。Bgl，Hindで切
断し、約335b.p.の生成物を分離する。 (2) (1)＋(b)＋(d)とトリプル連結し、生ずるプラス
ミドでE.coliを転換する。 このように調製された代表的なクローンはE.
coli Ｋ−12 株294／pLeIF Ctrp35である。こ
のクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｄ pLeIF Ｄよりつぎのようは分離する： ａ Sau ３ ａからAva までの35b.p. ｂ Ava よりBgl までの150b.p. ｃ Bgl よりPst まで約700b.p. pLeIF A25より、つぎの断片を分離する： ｄ HindよりSau ３ ａまで300b.p. pBR322よりつぎの断片を分離する： ｅ HindよりPstまで約600b.p. 構 築 (1) (a)＋(b)を連結し、Bgl で切断し、185b.p.
生成物１を精製する。 (2) (1)＋(d)を連結し、Hind、Bgl で切断
し、そして、約500b.p.生成物２を精製する。 (3) (2)＋(c)＋(e)を連結し、生ずるプラスミドでE.
coliを転換する。 このようにして調整された代表的クローンは、
E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF Ｄ trp 11であ
る。このクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｆ LeIF Ｆを含有する断片は、LeIF Ｂおよび
LeIF Ｆの１から13までのアミノ酸が完全に相同
であるとを利用する再構成で直接的に発現するよ
う仕立上げることができる。上記のpHGH207よ
り、Pst およびXba 消化を経由し、つい
で約1050b.p.の断片を分離することにより、適当
な配列末端を有するtrpプロモーター含有断片ａ
をうる。第２の断片ｂは、プラスミドpHKY10
のPst およびBgl 消化より生ずる断片の
大きい方としてうる。（このPst−Bgl断片は
アンピシリン抵抗性遺伝子の一部および組合され
たプロモータ以外のテトラサイクリン抵抗性遺伝
子のすべてを含有している。従つて、プラスミド
pHKY10を用いなくても、その他の入手可能な
プラスミド、たとえば、プラスミドpBR322
（ATCC 31344）からもこの断片を調製すること
ができる。）断片ａはアンピシリン抵抗性をコー
ドする遺伝子の約半分を含有し；断片ｂは、その
遺伝子の残りを含有し、また、組合わされたプロ
モーター以外のテトラサイクリン抵抗性遺伝子の
すべてを含有する。断片ａおよびｂはT4リガー
ゼにより結合し、生成物を、Xba およびBgl
で処理して、二量化がおこらぬようにし、
trpプロモーター−オペレーターおよびテトラサ
イクリンおよびアンピシリン抵抗性の遺伝子を含
有する断片ｃとする。 約580b.p.の断片ｄはpLeIF ＦのAva およ
びBgl の消化で得られる。これは、LeIF Ｆ
の14から166までのアミノ酸に対するコドンを含
有する。 断片ｅ（49b.p.）は、pLeIF ＢのXba およ
びAva 消化で得られる。断片ｅはLeIF Ｆの
アミノ酸１から13をコードする。 断片ｃ、ｄおよびｅは、T4リガーゼの存在で、
トリプル連結する。それぞれ断片の接着末端は、
複合プラスミドが正しく環状となり、テトラサイ
クリン抵抗性遺伝子が成熟LeIF Ｆの遺伝子とあ
わせて、trpプロモーター−オペレーターの調節
下に入るようになつており、それで、望むプラス
ミドで転換した細菌は、テトラサイクリン含有プ
レート上で選択しうる。このように調製された代
表的クローンは、E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF
Ｆ trp1である。このクローンはATCCに寄託さ
れている。 LeIF Ｈ 完全LeIF Ｈ遺伝子を、成熟白血球インタフエ
ロンとして発現さすために、つぎのように配列し
うる。 １ プラスミドpLeIF ＨをHaeおよびRsa
消化に処して、シグナルペプチドアミノ酸10か
ら3′非コード領域までに及ぶ816b.p.断片を分離
する。 ２ この断片を変性し、DNAポリメラーゼの
Klenow断片（Klenow等、ProC、Natl.Acad.
Sci.U.S.A.65、168〔1970〕）により、合成デオ
キシリボオリゴヌクレオチドプライマー5′−
dATG TGT AAT CTG TCTを用いて修復
合成に処する。 ３ 得られた生成物をSau ３ ａで切断し、１
から150のアミノ酸を現わす452b.p.断片を分離
する。 ４ Sau ３ ａおよびPstでpLeIF Ｈを消化
し、得られた500b.p.断片を分離し、150番目の
アミノ酸からコード配列の最後までをコードす
る遺伝子をうる。 ５ 段階３および４で分離した断片を連結して、
断片 １ 166 met cys asp停止 ATG TGT…―｜…GAT TGA−…−Pst
Sau ３ ａ をうる。これはLeIF Ｈの166個のアミノ酸を
コードする。 ６ pLeIF Ａ trp25をXba で消化し、
DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、
生成物をPst で消化する。得られた大型断
片を分離し、段階５の生成物と連結させて発現
プラスミドとしうる。これは、E.coli Ｋ−12
株294または他の宿主細菌の転換に用いて、
成熟LeIF Ｈを発現しうる。 LeIF Ｉ Lawn等により構成されたヒトゲノムのフアー
ジλ Charon 4A組換えライブラリー（Cell，
15，1157（1978））を、上記引用のLawn等の方法
およびManiatis等、Cell 15，687（1978）の方法
により、白血球インタフエロンに関してスクリー
ニングした。cDNAクローンLeIF Ａに由来する
放射性LeIFプローブを用いて、約500000個のプ
ラークをスクリーニングした。６個のLeIFゲノ
ムクローンを選び出した。再スクリーニングおよ
びプラーク精製につづいて、これらのクローンの
うちのひとつλHLeIF2を選びさらに分析した。 上記の方法を用いて、他のプローブも、ヒトゲ
ノムからその他のLeIFクローンを分離するのに
有利に用いうる。ついで、これらは、本発明によ
るその他の白血球インタフエロン蛋白質を製造す
るのに用いうる。 １ クローンλHLeIF2の2000b.p.EcoR断片を、
EcoR部位においてpBR325中へ、サブクロ
ーン化した。得られたプラスミドLeIF Ｉを
EcoRで切断し、2000b.p.断片を分離した。
この2000b.p.EcoR断片にデオキシオリゴヌ
クレオチドdAATTCTGCAG（EcoR−Pst
コンバーター）を連結した。得られた生成物を
Pst で切断し、Pst 末端を有する2000b.
p.断片とした。これをSau96で切断した。ひと
つのPst およびひとつのSau96末端を有す
る1100b.p.断片を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｃ trp35をPst およ
びXba で消化した。大型断片を分離した。 ３ pLeIF Ｃ trp35よりの小型Xba −Pst
断片をXba およびSau96で消化した。
40b.p.Xba−Sau96断片を分離した。 ４ 段階１，２および３より分離した断片を連結
して、pLeIFtrp1発現プラスミドとした。こ
のクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｊ １ プラスミドpLeIF Ｊは先に述べたpLeIF Ｉ
と同様にLawn等により構築されたヒトゲノム
のフアージλCharon4A組換えライブラリー
（全ヒトDNAを消化し、フアージλベクターに
挿入したもの）から得られ、LeIF Ｊ遺伝子配
列を含有するヒトゲノムDNAの3.8キロベース
Hind断片を含有する。このプラスミドから
760b.p.Dde−Rsa断片を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｂ trp7をHindおよび
Dde で切断し、340b.p.Hind−Dde断
片を分離した。 ３ プラスミドpBR322をPst で切断し、
DNAポリメラーゼとインキユベートし、平
滑末端とし、（Klenow断片）、ついでHindで
消化した。大型（約3600b.p.）断片を分離し
た。 ４ 段階１，２および３で分離した断片を連結し
て、発現プラスミドpLeIF Ｊ trp1とした。
このクローンはATCCに寄託されている。 Ｍ 精製 細菌抽出物中の白血球インタフエロン含有量
は、つぎのようにして、増加させうる。 １ ポリエチレン−イミン沈殿。ここで、インタ
フエロンを含めた細胞蛋白質の大部分は上清に
留まる。 ２ 硫酸アンモニウム分画。ここで、インタフエ
ロンは、55％飽和硫酸アンモニウムの溶液中か
ら析出する。 ３ 硫酸アンモニウムペレツトを0.06Mリン酸カ
リウム、10mM Tris−HCl、PH7.2に懸濁さ
せ、25mM Tris−HCl、PH7.9に対して透析す
る。インタフエロン活性は溶液中に残る。 ４ 上記の上清をPH8.5に調整してDEAE−セル
ロースカラムでクロマトグラフイーを行う
（25mM Tris−HCl、PH8.5中０から0.2M
NaClの直線勾配で溶出）。 ５ Cibachrome Ｂ lue−Agaroseまたは
hydroxylapatiteに吸着させ、1.5MKClまたは
0.2Mリン酸塩で溶出する（必要により実施）。 ６ Sephadex Ｇ−75カラムで分子をサイズ分
けする。 ７ PH5.0の25mM酢酸アンモニウム中CM−セル
ローズ上陽イオン交換クロマトグラフイーを行
う。酢酸アンモニウム勾配（0.2M酢酸アンモ
ニウムまで）で展開する。 上記の方法で＞95％純度の生成物を得る。 この物質はまた、サイズ排斥クロマトグラフイ
ー、逆相（RP−８）高圧液体クロマトグラフイ
ー、または固定化抗インタフエロン抗体上のアフ
イニテイクロマトグラフイーで精製しうる。 別法として、上記の段階４よりの物質を
Milstein、Scientific American 243、66（1980）
記載のように調整したモノクロナル抗体カラムに
加え、0.2M酢酸、0.1％Tritonおよび0.15MNaCl
で溶出しうる。 別様の有利な具体例として、上記操作で製造し
た白血球インタフエロンをつぎの段階で精製しう
る。 １ 発現された白血球インタフエロンを含有する
凍結細胞塊を、手作業または適当な粉砕装置で
砕く。部分的にとけた細胞を、PH7.5−8.0に調
整した0.1M Tris、10％（ｗ／ｖ）スクロー
ス、0.2MNaCl、5mMEDTA、0.1mM PMSF
および10−100mM MgCl2含有緩衝液Ａの４容
量中に懸濁させる。懸濁液は約４℃に保つ。 懸濁液は、約6000psiでホモジナイザーを通
し、ついで、1000psi以下で２度目を通す。両
方の通過よりのホモジナイザーからの流出液
は、永浴中で冷却する。 ２ ホモジネートにポリエチレン−イミンをゆつ
くりと添加して、約0.35％濃度とし、約30分放
置する。固型物は遠心または濾過で除去する。
この段階は、温度を調節するかまたは、上清
（濾液）を10℃より低く保つように十分にすみ
やかに実施する。上清（濾液）を限外濾過で濃
縮して、もとの容量の約1/10とする。粒状物ま
たはにごりを認めたら、ミクロポアメンブレン
のような適当なフイルターで除去しうる。 ３ 澄明化溶液は、５−８cm／時間（たとえば、
直径2.6cmのカラムで、25−40m1／時間）でモ
ノクロナル抗体カラムに直接流す。ついでこの
カラムを約10カラム容量の20mM Tris−HCl、
PH1.5−8.5（NaCl（0.5M）およびTriton Ｘ−
100（0.2％）または同等の表面活性剤含有）で
洗う。洗つたあと、このカラムに0.15MNaCl
およびTriton Ｘ−100（0.1％）または同等の表
面活性剤を含有する約10カラム容量の溶液を通
す。このカラムをTriton Ｘ−100（0.1％）また
は同等の表面活性剤を含有する0.2M酢酸で溶
出する。モノクロナル抗体カラムよりの蛋白質
ピーク（UV吸収またはその他の方法で測定）
を集め、1N NaOHまたは1.0M Tris塩基でPH
を約4.5に調整する。 ４ プールされたインタフエロンピークを、適当
な緩衝液たとえば酢酸アンモニウムPH4.5
（50mM）で平衡させたWhatman CM52セル
ロースまたは同等の陽イオン交換体に加える。
加えたあと、カラムを平衡のための緩衝液で洗
い、流出液のUV吸収がたいらとなるに至ら
せ、カラムからはほとんど蛋白質が溶出しない
状態とする。カラムをついで、25mM酢酸アン
モニウム／0.12M塩化ナトリウムまたはインタ
フエロンの回収を最高とする組合わせで溶出
し、満足な外観および溶解性を有する凍結乾燥
ケーキとする。 上記したこの有利な具体例におけるモノクロ
ナル抗体は、Staehelin等がProc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.78，1848−52（1981）に記載した方
法で調製しうる。モノクロナル抗体は、下記す
るように、精製し、Affigel−10に共有結合さ
せる。 腹水液よりのモノクロナル抗体の調製および精製 雌Balb／ｃマウス５頭のそれぞれに、対数増
殖期の中間でとつたハイブリドーマ
（hybridoma）細胞の５−10×106個を接種した。
マウスの生成する腹水液から得た約５×106個の
生育しうる細胞を、10または10頭より多くのマウ
スのそれそれに腹腔内接種した。この腹水液を各
マウスより反復（２から４回）採取した。ひとつ
の群のマウスからつぎの群のマウスに、３回ま
で、移しかえおよび採取を行なつた。それぞれの
移しかえ毎に、採取腹水液をプールした。 低速遠心（500−1000×ｇ）で15分間処理し、
腹水液より細胞および残渣を除いた。ついで
18000rpmで90分遠心した。上清を凍結させマイ
ナス20℃に貯蔵した。融解させてから、
35000rpmで90分間遠心し、さらにフイブリンお
よび粒状物を除いた。各移しかえごとの腹水液の
バツチについて、固体相抗体結合試験
（Staehelin等、上記引用文献）により特異抗体活
性を試験し、満足ならばプールした。 プールされた溶液中の蛋白質濃度は、１mgの蛋
白質が1.0cmの厚さのキユベツトで280nmで1.2の
吸光値を示すという近似法で測定した。高濃度の
抗体を有する腹水液は30−35mg蛋白質／mlを含有
する。これは、４−７mg特異抗体／mlに相当す
る。この液体をPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、
PH7.3、0.15M NaCl）で希釈し、10から12mg／ml
の蛋白質濃度とした。 希釈溶液の各100mlに、室温で飽和した硫酸ア
ンモニウム溶液90mlを、０℃ではげしくかくはん
しながら添加した。懸濁液を40から60分間氷中に
保つた。ついで、４℃で、10000rpmで15分遠心
した。上清をけいしやして除き、十分に液を切つ
た。蛋白質塊を0.02M Tris HCl（PH7.9）／
0.04M NaCl（緩衝液）に溶解した。蛋白質溶
液を、100容量の緩衝液に対して、室温で16か
ら18時間透析した。その間、少なくとも１度緩衝
液を交換した。透析溶液を15000rpmで10分間遠
心し、不溶物を除いた。腹水中の全蛋白質の最初
の量の約30から35％が、280nmの吸光値より概算
して採取された。 次いで、１mlについて30−40mgの蛋白質を含有
する溶液をBufferで平衡させたDEAE−セルロ
ースカラムに加えた。添加する蛋白質１グラムに
ついて少なくとも100mlのカラム床容量とした。
0.02M Tris HCl PH7.9中NaClを0.04Mから
0.5M NaCl濃度に直線状にNaCl濃度を変化させ
て、カラムより抗体を溶出した。0.06から0.1M
NaClのピーク分画をプールし、等容量の硫酸ア
ンモニウム飽和溶液（室温）を加え沈殿遠心し、
濃縮した。蛋白質塊を0.2M NaHCO3（PH約
8.0）／0.3M NaCl（緩衝液）に溶解し、室温
で、同じ緩衝液（３度交換）に対して透析した。
透析した溶液を20000×ｇで15分遠心し、不溶物
を除いた。蛋白質濃度を緩衝液で20から25mg／
mlとした。 免疫吸着剤の調製 Affigel−10（Bio Rad Laboratories、
Richmond、California）をグラスフイルター上
で氷冷イソプロパノールで３度洗い、ついで氷冷
蒸留水で３度洗つた。ゲルスラリー（冷水中約50
％）をプラスチツクチユーブに移し、短時間遠心
して沈降させた。上清をアスピレーターで除き、
パツクされたゲルを等容量の精製抗体溶液と混合
し、４℃で５時間、長軸が円状に廻転するように
回転した。反応後、ゲルを遠心し、緩衝液
（0.1M NaHCO3／0.15M NaCl）で２度洗い、
非結合抗体を除いた。洗液を合併し蛋白質を測定
すると、90％以上の抗体がゲルに結合していた。 未反応の部分をふさぐために、ゲルを等容量の
0.1Mエタノールアミン・HCl（PH８）と混合し、
長軸を円こ状に回転させて室温で60分処理した。
ゲルスラリーよりPBSで洗浄して反応剤を除き、
４℃で0.02％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムの存
在でPBSに貯蔵した。 Ｎ 非経口投与 LeIFは、抗腫瘍または抗ウイルス治療を要す
る患者に非経口投与しうる。また、免疫抑制状態
を示す患者にも投与しうる。投与量および投与割
合は、ヒト由来の物質について現在臨床的に行な
われているのと同様にする。たとえば、約（１−
10）×106単位／日で１％より大の純度の場合に
は、たとえば５×107単位／日に及びうる。 非経口投与用の形態とした本質的に均一な細菌
性LeIFの適当な投与形態では、たとえば、２×
108単位／mgの比活性のLeIF3mgを25mlの5Nヒト
血清アルブミンに溶解し、この溶液を生物学的フ
イルターを通し、濾過溶液を無菌的に100本のび
んに分けて、非経口投与に適当なように、１本が
６×106単位純インタフエロンを含有するように
する。これらのびんは、使用前は冷所（−20℃）
に保つのが望ましい。 本発明の化合物は、医薬として有用な組成物を
調整するための既知の方法に従つて製剤化でき
る。その際、このポリペプチドは、医薬として許
容されうる担体ビヒクルと混合する。適当なビヒ
クルおよびそれらの製剤化については、E.W.
MartinによるRemington's Pharmaceutical
Sciencesに記載されているとおりである。これ
を、本明細書の参考分献として引用する。これら
の組成物では、インタフエロン蛋白質の有効量と
適当な量のビヒクルとをあわせて、宿主に対して
効果的な投与とするに適当な、医薬として許容さ
れうる組成物とする。ひとつの有利な投与形態は
非経口投与である。 本発明の白血球インターフエロンＡ（LeIF Ａ）
に関する急性毒性実験 (A) マウス、ラツト、白イタチおよびウサギにお
ける筋肉内投与急性毒性 (1) 製剤No.１（凍結乾燥物） 【表】 LeIF Ａの凍結乾燥調製物（製剤No.１）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）、ラツト（５匹／各性）お
よび白イタチ（３匹／各性）に30×106単位／Kg
の投与量で筋肉内投与した；この投与容量はマウ
スで５ml／Kg、ラツトで2.0ml／Kgおよび白イタ
チで1.67ml／Kgであつた。対照マウス（10匹／各
性）、ラツト（５匹／各性）および白イタチ（３
匹／各性）には等量および等投与容量の賦形剤を
与えた。 投与処置動物を異常微候および致死について投
与後の31日間観察した。体重を投与日および処置
後の７日目、14日目、21日目および28日目に記録
した。 処置後の７日目にカゴの中で死亡しているのが
見い出された一匹のLeIF Ａで処置した雌のラツ
トを除いて、この実験における全ての動物は31日
間の観察期間、生存した。この雌ラツトの死亡は
LeIF Ａによる処置とは無関係であると考えられ
る。 この実験の期間中、いづれの動物にも異常微候
は見られなかつた。雌の白イタチを除いて、全群
の動物で正常な体重増加が見られた。処置後28日
目の雌の白イタチの平均体重はLeIF Ａ処置群
（−６％）および賦形剤処置群（−12％）で僅か
に減少した。 (2) 製剤No.２（液体） 【表】 LeIF Ａの液体非経口製剤（製剤No.２）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）、ラツト（５匹／各性）お
よびウサギ（２匹／各性）にそれぞれ500×106単
位／Kg、100×106単位／Kgの投与量で筋肉内投与
した；この投与容量はマウス、ラツトおよびウサ
ギについてそれぞれ10ml／Kg、２ml／Kgであつ
た。別群のマウス（10匹／各性）、ラツト（５
匹／各性）およびウサギ（２匹／各性）を対照と
して用い、等量および等投与容量の賦形剤を与え
た。 投与処置動物を致死および異常微候について14
日間観察した。体重は投与日および処置後の７日
目および14日目に記録した。 投与群のいづれにも死亡は生じなかつた。異常
の微候はなく、そして体重増加が試験を通じてみ
られた。 (B) マウスおよびラツトにおける静脈内投与急性
毒性 LeIF Ａの凍結乾燥調製物（製剤No.１）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）およびラツト（５匹／各
性）に３×106単位／Kgの投与量で静脈内投与し
た；5.0ml／Kgおよび2.0ml／Kgの投与容量をマウ
スおよびラツトについてそれぞれ使用した。対照
マウス（10匹／各性）およびラツト（５匹／各
性）には賦形剤を等量および等投与容量で与え
た。 投与処置動物は投与後の14日間、異常微候、静
脈刺激および致死について観察した。体重を投与
日および処置後の７日目および14日目に記録し
た。 全動物が14日間の観察期間中生存していた。い
づれの動物にも異常微候は見られず、そして体重
増加がマウスおよびラツトの全群に見られた。ラ
ツトでは静脈刺激は見られなかつた。マウスで
は、注射部位周辺の暗色化域がLeIF Ａまたは賦
形剤のどちらかの注射後の４時間〜３日に見られ
た。静脈刺激の微候は投与後６〜７日でおさまつ
た。 (C) マウス、ラツトおよび白イタチにおける皮下
投与急性毒性 LeIF Ａの凍結乾燥調製物（製剤No.１）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）、ラツト（５匹／各性）お
よび白イタチ（３匹／各性）に30×106単位／Kg
の投与量で皮下投与した；投与容量はマウス、ラ
ツトおよび白イタチに対してそれぞれ5.0ml／Kg、
2.0ml／Kgおよび2.0ml／Kgである。対照マウス
（10匹／各性）、ラツト（５匹／各性）および白イ
タチ（３匹／各性）には等量および等投与容量で
賦形剤を与えた。 投与処置動物は異常微候および致死について14
日間観察した。体重を投与日および処置後の７日
目および14日目に記録した。 いづれの動物にも致死または処置関連異常微候
は見られなかつた。正常な体重増加が動物の全群
に見られた。 (D) マウスにおける経口、静脈内および筋肉内投
与急性毒性 (3) 製剤No.３（液体） 【表】 【表】 LeIF Ａの液体非経口投与用製剤（製剤No.３）
をマウス（10匹／各性／投与レベル）に経口、静
脈内および筋肉内投与した。対照群のマウス（10
匹／各性）には無菌生理食塩水中の0.5％ヒト血
清アルブミンを等量および等投与容量で各投与経
路により与えた。 ３種の投与経路によるいづれの投与後にも、マ
ウスの致死は生じなかつた。処置群マウスを対照
群マウスと区別できるような異常微候も体重増加
もしくは剖検所見も見られなかつた。 【表】
つまり、組換えDNA技術に用いられる方法およ
びそれらの方法により得られる生成物に関する。 より詳細には、本発明は、ポリペプチド、具体
的には、成熟ヒト白血球インタフエロン、それら
を含有する医薬組成物に関する。 さらに特定的には、本発明は、ヒト白血球由来
の遺伝子の発現により得ることができる成熟ヒト
白血球インタフエロンであつて、165−166個のア
ミノ酸を有し、部分アミノ酸配列Cys−Ala−
Trp−Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−
Met−Arg−Serを含み、かつ114位にアミノ酸
Asp、GluまたはValの一つを有し、このインタ
フエロンの第一番目のアミノ酸のＮ末端にメチオ
ニンが結合している場合は、166−167個のアミノ
酸を有し、かつ115位にアミノ酸Asp、Gluまたは
Valの一つを有することを特徴とする成熟ヒト白
血球インタフエロンならびにヒト白血球インタフ
エロンＡ（LeIF Ａ）を含有する抗ウイルス組成
物に関する。 本発明の成熟ヒト白血球インタフエロンの特定
例としては成熟ヒト白血球インタフエロン
（LeIF）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪが
あげられる。これらの成熟ヒト白血球インタフエ
ロンのアミノ酸配列は24頁表３および27頁表５に
示すとおりである。すなわち、表３における
LeIF Ａ、LeIF Ｂ、LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF
ＦおよびLeIF Ｈならびに表５におけるＩおよび
Ｊの各アミノ酸配列からＳを付した番号で示され
るシグナルペプチドを除いた165個または166個の
アミノ酸からなるポリペプチドおよびこれらのポ
リペプチドの第１番目のアミノ酸のＮ末端にさら
にメチオニンが結合して166個または167個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドが本発明の成熟ヒト白
血球インタフエロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ
およびＪである。 本発明の背景についてまず記載する。ヒト白血
球インタフエロン（LeIF）は、最初、Isaacsお
よびLindenmannにより、きわめて粗な沈殿物と
して、発見されそして調製された（Proc.R.Soc.
B147，258−267〔1957〕；U.S.P.3699222）。それ
を精製し特徴づける努力は長く続けられ、正常ま
たは白血病の提供者から得た白血球に由来する比
較的均一な白血球インタフエロンの調製にみちび
いた（ドイツ特許公報No.2947134）。これらのイン
タフエロンは、それらの標的細胞にウイルス抵抗
性の状態を付与する能力を有することの知られて
いる一群の蛋白質である。さらに、インタフエロ
ンは、細胞の増殖を阻止しそして免疫反応を調節
するように作用しうる。これらの性質から、ウイ
ルスの感染および悪性腫瘍の治療に白血球インタ
フエロンを臨床的に用いることが促進された。 白血球インタフエロンは、本質的に均一な状態
に精製され（Rubinstein等、Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.76，640−644〔1979〕；Zoon等、同上、
76，5601−5605〔1979〕）約17500から約21000の範
囲の分子量を有すると報告された。これらの調製
物の比活性は、きわめて高く、２×108から１×
109単位／mg蛋白質であるが、細胞培養法よりの
収量はおそろしく低い。しかし、蛋白質の配列を
きめる技術の進歩で、部分的アミノ酸配列が決定
された〔Zoon等、Science207，527〔1980〕；
Levy等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，5102−
5104〔1980〕）。種々の白血球インタフエロンのグ
リコシル化は、現在完全には明らかでないが、種
類間におけるグリコシル化の差のみでは、観察さ
れている分子量の分布を説明しえない。その代わ
りに、白血球インタフエロンは、種類に従いアミ
ノ酸組成および配列において著しく差があり、ア
ミノ酸の相同性は、場合により80％より低い。 提供者の白血球よりの分離で部分的な特徴付け
および限定された臨床的研究のための十分な量
の、均一な白血球インタフエロンを与えたけれど
も、それだけでは、大規模な臨床試験および広範
な予防的および（または）治療的使用に必要であ
るインタフエロンを提供するにはまつたく不十分
である。まさに、ヒト白血球由来のインタフエロ
ンを抗腫瘍および抗ウイルスに用いる現在の臨床
試験では、粗（１％より低い）調整物を用いてお
り、実際的でない価格においてすら十分な量を生
産するに至らず、広範な領域での研究を遅らせて
来た。 しかし、組換えDNA技術の出現にともなつて、
有用なポリペプチドのきわめて多様な種類を、微
生物により調節生産することが可能になつた。す
でに、この技術により修飾をうけて、ソマトスタ
チン、ヒトインシユリンのＡおよびＢ鎖およびヒ
ト生長ホルモンのようなポリペプチド鎖を生産す
ることが可能となつた細菌が存在するに至つてい
る。 （Itakura等、Science198，1056−1063
〔1977〕；Goeddel等、Nature281，544−548
〔1979〕）。より最近になつて、組換えDNA技術
が、プロインシユリンおよびチモシンアルフアー
１の生産を可能とし、さらに、なん人かの著者
は、ヒト白血球インタフエロンをコードする
DNAの採取および、その結果得られる、白血球
インタフエロン活性を有する蛋白質の生成につい
て報告している（Nagata等、Nature284，316−
320〔1980〕；Nantei等、Gene10，１−10
〔1980〕；Taniguchi等、Nature285，547−549
〔1980〕）。 組換えDNA技術の工作室は、細菌および他の
微生物に存在し、しばしば、細胞中に多数のコピ
ーとして存在する。２重鎖DNAの非染色体性の
ループである、プラスミドである。プラスミド
DNA中にコードされる情報には、娘細胞中にプ
ラスミドを再生産するに必要な情報（つまり、
“レプリコン”）および、そして、ふつうは、１種
または１種より多くの選択特性、たとえば、細菌
の場合では、抗生物質に対する抵抗性の情報があ
る。この情報により、対象とするプラスミドを含
有する宿主細胞のクローンを認識し、選択用の培
地中に優先的に発育さすことが可能となる。プラ
スミドが有用なのは、プラスミドDNA上の異な
る部位をそれぞれに認識する、ある種類または別
の種類の制限エンドヌクレアーゼまたは“制限酸
素”により、プラスミドが特異的に切断されうる
ということである。そのあとで、切断部位の両端
か、切断部位に接して再構築した末端をむすびあ
わすことにより、異質の遺伝子または遺伝子断片
をプラスミド中に挿入しうる。DNAの組換えは、
細胞の外部で実施しうるが、生成する“組換え”
プラスミドは、形質転換と称される方法により細
胞内に導入され、その転換細胞を発育さすことに
より、異質の遺伝子を含有する組換えプラスミド
を大量に生産しうる。さらに、その異質遺伝子
が、プラスミド内のコードされるDNA情報の転
写および翻訳を支配する部分に関して正しく挿入
されるならば、生成する発現ビヒクルは、挿入さ
れた遺伝子のコードするポリペプチド配列を実際
の生成つまり発現と称されるプロセスに実際に使
用されうる。 発現は、RNAポリメラーゼにより認識されそ
れが結合する、プロモーターとして知られる領域
において開始される。ある場合には、たとえば、
本発明の実施において有利とされるトリプトフア
ンまたは“trp”プロモーターのような場合には、
プロモーター領域には、“オペレーター”領域が
重なり、結合された、プロモーター−オペレータ
ーとなつている。オペレーターは、特定のプロモ
ーターにおける転写開始の瀕度を調節する役割を
する、いわゆるリプレツサー蛋白質により認識さ
れるDNA配列である。RNAポリメラーゼは、
DNAに沿つて移動し、コード配列に含まれる情
報をその5′、末端から3′末端へと、メツセンジヤ
ーRNAに転写し、ついでそれは、DNAのコード
するアミノ酸配列を有するポリペプチドへと翻訳
される。それぞれのアミノ酸は、ヌクレオチドト
リプレツトまたは“コドン”によりコードされ
る。これらは、本発明の目的に関連して“構造遺
伝子”と称される部分、つまり、発現される生成
物のアミノ酸配列をコードする部分に存在する。
プロモーターに結合したあと、RNAポリメラー
ゼは、まず、リボゾーム結合部位をコードするヌ
クレオチドを転写し、ついで、翻訳開始または
“開始シグナル”（ふつうはATGで、得られるメ
ツセンジヤRNAではAUGとなる）を、ついで、
構造遺伝子自体に存在するヌクレオチドコドンを
転写する。構造遺伝子の端においていわゆる停止
コドンが転写される。そのあとは、ポリメラーゼ
が、メツセンジヤーRNAの付加配列を形成する
ことがあつても、停止シグナルが存在するので、
リボゾームにより翻訳されないままとなる。リボ
ゾームは、ふつう、mRNAが形成されつつある
細菌においてはメツセンジヤーRNA上にある特
定の接合部位に結合する。そして、翻訳の開始シ
グナルに始まり、前記した停止したシグナルで終
了する、コードされたポリペプチドを生ずる。リ
ボゾーム結合部位をコードする配列が、AUG開
始コドンに関して適切に位置し、そして、残りの
コドンのすべてが、インフエース（in phase）に
開始コドンに従うならば、所望の生成物が生産さ
れる。得られた生成物は、宿主細胞を融解させ、
適当な精製法により他の細菌蛋白質より生成物を
採取することによりうることができる。 我々は、組換えDNA技術（つまり、インタフ
エロン遺伝子を微生物発現ビヒクルに挿入し、微
生物遺伝子調節要素の制御下にそれらを発現させ
ること）の利用が、大量の白血球インタフエロン
を提供するもつとも有効な方法と考えた。それ
は、ヒト由来の材料に特徴的なグリコシル化の特
性を欠如するけれども、広範囲に及びウイルスお
よび新生物による病気の治療に用いられるであろ
う。 本発明の第１の白血球遺伝子を採取する方法は
次の各段階からなる。 (1) 均一な状態に精製されたヒト白血球インタフ
エロンの部分アミノ酸配列を用いて、部分アミ
ノ酸配列をコードしうる、可能なヌクレオチド
の組合わせのすべてを表わす、集合体としての
コドンを含む、合成DNAプローブのセツトを
構成する。 (2) 誘導されたメツセンジヤーRNAから相補
DNA（cDNA）を含有する細菌コロニーバンク
を調製する。放射ラベルされた別の誘導
mRNAを、このバンクからのプラスミド
CDNAとハイブリドとする。ハイブリドとし
たmRNAを溶出し、卵母細胞分析でインタフ
エロンへの翻訳について試験する。このように
して、インタフエロン活性をを誘導することが
示されたコロニーよりのプラスミドDNAを、
上記(1)のように製造したプローブに対するハイ
ブリド形成について試験する。 (3) 上記(2)の工程と平行して、プラスミド中の誘
導されたmRNAに由来するcDNAを用いて、
別の形質転換コロニーバンクを用意する。(1)の
プローブをハイブリド化プローブとして用いる
ための放射ラベル１本鎖cDNAの合成を誘起す
るのに用いた。合成プローブは鋳型としての誘
導mRNAとハイブリドを形成し、逆転写によ
り拡大されて、誘導された、放射ラベルcDNA
を形成する。このようにして得られた放射ラベ
ルcDNAに対してハイブリド化されたコロニー
バンクよりのクローンについてさらに調べて、
完全長のインタフエロンコード遺伝子の存在を
確かめる。(1)または(2)で得られる部分長の推定
される遺伝子断片も、それら自体、完全長遺伝
子のプローブに用いうる。 (4) 上記に得られた完全長遺伝子は、成熟ポリペ
プチドの微生物による発現を妨げるかも知れな
いリーダ（leader）配列があれば、それを除
き、そして、微生物プロモーターの開始シグナ
ルおよびリボゾーム結合部位に関して、発現ビ
ヒクル中に適当に位置することを可能とするよ
うに、合成、DNAを用いて、仕立上げられた。
発現されたインタフエロンは精製して、その特
性を確認し、活性を測定する。 (5) 上記の方法で調製したインタフエロン遺伝子
断片それ自体は、他の部分的に相同な白血球イ
ンタフエロン種の、ハイブリド化によるプロー
ブに用いられる。 上記に概要を示した組換えDNA技術を応用す
ることにより、相当する先行配列またはその一部
分を本質的にともなわない、成熟ポリペプチドと
しての１群の相同的な白血球インタフエロン（グ
リコシル化されていない）を、高収量、高純度
で、微生物的に生産することが可能となつた。こ
れらのインタフエロンは、動物およびヒトのウイ
ルスおよび悪性腫瘍疾患に用いるに適当なレベル
まで、直接発現させ、採取し、そして精製するこ
とができる。このように発現された、１群のイン
タフエロンはイン ビトロ試験で有効であること
が示され、そして、微生物的に生産された最初の
白血球インタフエロンとして、イン ビボの試験
でも、始めて、有効なことが示されたのである。 本明細書中で用いられる“成熟白血球インタフ
エロン”の用語はグリコシル基を欠如する、微生
物的（たとえば、細菌的に）生産されるインタフ
エロンを意味する。本発明の成熟白血球インタフ
エロンは天然生成物の第１のアミノ酸コドンのす
ぐ前にある翻訳開始シグナル（ATG）より直ち
に発現される。従つて、この“成熟”ポリペプチ
ドはその配列中に第１のアミノ酸としてメチオニ
ン（ATGがコードする）を含有するが、本質的
にその特性は影響されない。他方、微生物宿主中
では得られた翻訳生成物がアミノペプチダーゼの
作用を受けて第１のアミノ酸としてのメチオニン
が開裂除去されることもある。成熟白血球インタ
フエロンは、通常のリーダー以外の接合蛋白質と
一緒に発現されうるが、この接合物は、細胞外ま
たは細胞内の環境において特異的に除去しうる
（英国特許公報No.2007676Aをみよ）。最後に、成
熟インタフエロンは、接合物を細胞壁まで輸送す
る、微生物“シグナル”ペプチドとの接合物とし
て生産されうる。細胞壁においてシグナルは処理
してはづされ、成熟ポリペプチドが分泌される。
成熟白血球インタフエロンの“発現”とは、ヒト
白血球インタフエロンゲノムのmRNA翻訳に直
接に結果する、グリコシル基または先行配列を含
有しないインタフエロン分子の細菌または他の微
生物による生産を意味する。 特定の白血球インタフエロン蛋白質は、ここで
は、決定されたDNA遺伝子（表２および表４）
および演繹的に定められるアミノ酸配列（表３お
よび表５）により定義される。これらの特定のイ
ンタフエロン、実際ここに含まれるすべての群の
白血球インタフエロンタンパク質に対して、天然
の対立遺伝子変異（allelic variation）が存在
し、個体間にもおこりうる。これらの変異は、配
列全体におけるアミノ酸の相異または、配列中の
アミノ酸の欠落、置き代え、挿入、反転または追
加として表われる。本明細書で対象とする各イン
タフエロン、標示されたLeIF ＡからLeIF Ｊに
ついて、そのような、対立遺伝子変異は、標示の
範囲内または、その定義内に含まれ、従つて、本
発明の範囲内に含まれるとする。 つぎに、表および図について説明する。
表１は、Ｔ−１およびＴ−13と称される、ヒト
白血球より分離されそして均一に精製された、す
べての種類のインタフエロンに共通の２つのアミ
ノ酸配列を示す。これらのペプチドをコードする
可能なmRNA配列のすべておよび対応するDNA
配列を示す。Ａ，Ｔ，Ｇ，ＣおよびＵの文字は、
それぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシ
ンおよびウラシルの塩基を含有するヌクレオチド
を示す。文字Ｎは、ヌクレオチドＡ，Ｇ，Ｃおよ
びＵのいずれかを示す。ポリヌクレオチドは、
５′（左側）から３′（右側）の方向に読むように
記載されている。そして、２重鎖（“d.s”）DNA
を示す時には、下側または非コード鎖について
は、順序は逆となる。第１図は、可能性のある
LeIFプラスミドと32p−ラベル合成デオキシオリ
ゴヌクレオチドとのハイブリド化を示すオートラ
ジオグラムである。 第２表は、それぞれ、“Ａ”から“Ｈ”までの
記号を付されている、白血球インタフエロンの発
現のために候補として分離された８個の遺伝子断
片のヌクレオチド配列（コード鎖）を示す。それ
ぞれのLeIFについて、ATGの翻訳開始コドンお
よび終止トリプレツトが下線で示されている。停
止コドンまたは終止コドンに続いて３′の未翻訳
領域が示されている。含まれているLeIF Ａの全
遺伝子長には、表２の第３列Ａラインに示される
ように、他のコドンには存在するひとつのコドン
が欠如している。５′非翻訳域がリーダー配列に
先行している。分離したままの断片Ｅには、リー
ダーの完全な先行配列は存在しない。しかし、仮
定される成熟LeIF Ｅに対する全遺伝子を含有す
る。分離されたままの断片Ｇは、コード配列が完
全でない。 表３では、ヌクレオチド配列より示される８個
のLeIF蛋白質配列を比較している。IUPAC−
LUB Commission on、Biochemical
Nomenclatureの提案による１文字省略が用いら
れている。つまり、アラニンはＡで、システイン
はＣで、アスパラギン酸はＤで、グルタミン酸は
Ｅで、フエニルアラニンはＦで、グリシンはＧ
で、ヒスチジンはＨで、イソロイシンはＩで、リ
ジンはＫで、ロイシンはＬで、メチオニンはＭ
で、イスパラギンはＮで、プロリンはＰで、グル
タミンはＱで、アルギニンはＲで、セリンはＳ、
スレオニンはＴで、バリンはＶで、トリプトフア
ンはＷで、チロシンはＹで表わす。数はアミノ酸
の位置を示す。Ｓはシグナルペプチドを示す。
165個のアミノ酸配列であるLeIF Ａ配列中の44
位のダツシユは、このLeIF Ａ配列を他のLeIFの
166個のアミノ酸配列と一列にそろえるために入
れてある。LeIF Ｅの配列は、そのコード領域の
他のLeIF配列にはないヌクレオチド（表２の位
置187）を除外して定められている。星印（表３）
は翻訳の読枠に正しくあてはまつている終止コド
ンを示す。すべてのLeIFに共通のアミノ酸（プ
ソイド遺伝子LeIF Ｅを除く）もまた示されてい
る。アンダーラインした残基は、ヒト線維芽イン
タフエロンにも存在するアミノ酸である。 第２図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型
（ＡからＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図
を示す。ハイブリドプラスミドは、dC：dGテー
リング法（GoeddeI，D.V.等、Nature287，411
−416〔1980〕により構築された。それで、cDNA
挿入物は、Pst を用いて切断しうる。各
cDNA挿入物の末端のラインは、側面に接するホ
モ重合dC：dGテールを示す。Pvu，EcoRお
よびBgl の制限部位も示してある。濃い領域
は成熟LeIFのコード配列を示す。斜線の部分は
シグナルペプチドコード配列である。白い部分は
３′および５′非コード配列である。 第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成を
コードする遺伝子の構築を示す。制限部位および
残部が示されている。（“Pst ”等）。“b.p.”
は塩基対を示す。 第４図および第５図は、LeIF Ｂ成熟白血球イ
ンタフエロンを発現するに用いられる２つの遺伝
子断片の制限地図を示す。示したコドン配列は、
示した２つの場合について制限酵素Sau ３ ａ
で消化することで生成するコード鎖末端である。 表４および表５は、タイプＩおよびＪを含め
た、５個のLeIF蛋白質の配列のDNAおよびアミ
ノ酸（省略符号については、第３表に同じ）を示
す。第５表において、星印は対応するDNA配列
における終止コドンを示し、ハイフエンは配列に
おける欠落またはギヤツプを示す。 つぎに、本発明を実施するための有利な具体例
を示す。 Ａ 使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つま
り、U.S.P.4.190.495記載のE.coli×1776およびE.
coliK−12 294株（エンドＡ，thi-，hsr-＋hsm
ｋ＋，英国特許公報No.2055382に記載）を用いてい
る。それぞれ、the American Type Culture
Collectionに寄託され、ATCCNo.31537および
31446（ブタペスト条約による国際寄託に基づく受
託番号31446）が付されている。組換えDNAの実
験のすべては、National Institute of Healthの
該当するガイドラインに従つて実施された。 本発明のもつとも有利な具体例は、上記定義の
菌株E.coli×1776およびE.coli Ｋ−12菌株294の
みならず、他の既知のE.coli株たとえばE.coli Ｂ
を含めたE.coliおよび他の微生物株に関連して記
載してゆくが、これらの多くは、the American
Type Culture Collection（ATCC）のような、
知られている微生物寄託施設に寄託されており入
手可能ある。ドイツ特許2644432もみられたい。
これらの他の微生物には、Bacillusたとえば
Bacillus Subtilisおよび他の腸内細菌たとえば
Salmonella typhimuriumおよびSerratia
marcescensがあり、異質遺伝子配列を発現しう
る、複製しうるプラスミドを使用する。酵母たと
えばSaccharomyces cerevisiaeもまた、酵母プ
ロモーターの制御下に、インタフエロンをコード
する遺伝子を発現させることによるインタフエロ
ン蛋白質の製造に用いて有利でありうる。 Ｂ LeIF mRNAの原料および精製 LeIF mRNAは、ヒト白血球より採取しうる。
ふつうは、ドイツ特許No.2947134に記載のように、
SendaiウイルスまたはNewcastle病ウイルスで
インタフエロンを生産するように誘導した慢性骨
ずい性白血病患者の白血球より得たものを使用す
る。特に有利な、本明細書の仕事に用いられる原
料は、急性骨ずい性白血病の１患者に由来する
KG−１と称するセルラインである。このセルラ
インは、Koeffler，H.P.およびGolde，D.W.，
Science200，1153（1978）に記載されているよう
に、RPMI（Rosewall Park Memorial
Institute）1640プラス10％熱不活化FCS（牛胎児
血清）、25 mM HEPES 緩衝液（Ｎ−２−ヒド
ロキシエチル−ピペラジン−N′−２−エタンス
ルホン酸）および50μg／mlのゲルタマイシン含
有培地に容易に発育し、１週間に２度、継代培養
（１から３スプリツト）しうる。上記の発育培地
に10％ジメチルスルホキサイドを加えて、細胞は
凍結させうる。KG−１は、the American
Type Culture Collection（ATCCNo.CRL8031）
に寄託されている。 KG−１細胞は、Rubinstein等記載の方法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，640−644〔1979〕
により、SendaiまたはNewcastle病ウイルスを
用い、白血球インタフエロン mRNAを生産す
るように誘導された。細胞は、誘導後５時間に採
取しRNAを、グアニジンチオシアネート−グア
ニジン塩酸塩法（Chirgwin等、Biochemistry18，
5294−5299〔1979〕により調製した。誘導しない
細胞からのRNAも同様に調製した。オリゴデオ
キシチミジン（dT）−セルローズクロマトグラフ
イーおよびスクロースグラジエント超遠心を用い
て、ポリ（Ａ） mRNAの12S分画を得た。方法
は、Green等（Arch.Biochem.Biophys.172，74
−89〔1976〕）およびOkuyuma等（Arch.
Biochem.Biophys.188，98−104〔1978〕）の方法
を用いた。この mRNAは、アフリカツメガエ
ル卵母細胞分析（Cavalieri等、Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.74，3287−3291〔1977〕）で8000−
10000単位／マイクログラムのインタフエロンタ
イターを示す。 Ｃ LeIF cDNA配列を含有するコロニーバンク
の調製 5μgのmRNAを用い、標準方法（Wickens等、
J.Biol.Chem.253，2483−2495〔1978〕および
Goeddel等、Nature281，544−548〔1979〕によ
り、２重鎖cDNAを調製した。cDNAは６％ポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動により、大き
さに従つて分画し、500から1500b.p.の大きさの
材料230ngを、電気溶出により得た。このcDNA
の100ng分を、デオキシシチジン（dC）残基でテ
ーリングし（Chang等、Nature275，617−624
（1978）、Pst 部位においてデオキシグアノシ
ン（dG）残基でテーリング（tailing）した470ng
のプラスミドpBR322とアニーリングし
（Bolivar等、Gene２，95−113〔1977〕）、これを
用いて、E.coli×1776を形質転換した。cDNAng
について約130個のテトラサイクリン抵抗性で、
アンピシリン感受性の形質転換株を得た。 第２の同様の実験では、cDNAngについて、
約1000個のテトラサイクリン抵抗性で、アンピシ
リン感受性のE.coli Ｋ−12株294の転換株を得
た。この場合、600から1300b.p.の範囲の、サイ
ズにより分画したcDNA材料を、電気溶出により
採取し、dCでテーリングするのに用いた。 Ｄ 合成オリゴヌクレオチドの調製およびその使
用 ヒト白血球インタフエロンのいくつかのトリプ
シン分解断片のアミノ酸配列についての知見は、
LeIF mRNAの種々の領域に対して相補的な合
成デオキシオリゴヌクレオチドのデザインを可能
とした。２つのトリプシンペプチドT1および
T13を選んだ。その理由は、それらのアミノ酸配
列は、すべての可能なコード配列（表１）を説明
するのに、12個および４個のウンデカマーを合成
するだけですむからである。それぞれの配列につ
いて、４組のデオキシオリゴヌクレオチドプロー
ブを合成した。つまり各々三つ（Ｔ−1A，Ｂ，
Ｃ，Ｄ）または一つ（Ｔ−13A，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の
オリゴヌクレオチドを含有する。示した相補的デ
オキシオリゴヌクレオチド11塩基鎖長は、ホスホ
トリエステル法で化学的に合成した（Crea等、
Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.75，5765−5769
〔1978〕）。Ｔ−13シリーズでは、４個の個々のプ
ローブを調製した。表１に示すように、３個のプ
ローブの４プールとして、12個のＴ−１プローブ
を調製した。 Ｔ−13シリーズの４個のそれぞれのプローブお
よび各３個のプライマーの４プールとして調製し
た12個のＴ−１プローブを、ハイブリド化プロー
ブに用いるための放射ラベル１重鎖cDNAの合成
を誘導するために用いた。鋳型 mRNAは、セ
ンダイ誘導KG−１細胞（8000単位IF活性／μg）
からの12s RNAまたは非誘導白血球（＜10単
位／μg）に由来する全ポリ（Ａ） mRNAであ
る。32p−ラベル cDNAを、既知の反応条件
（Noyes 等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，
1770−1774〔1979〕）を用いて、これらのプライマ
ーより調製した。20mM Tris−HCI（PH8.3）、
20mM KCI，8mM MgCI2，30mM β−メルカ
プトエタノール中で60μl容量の反応をおこなつ
た。この反応は、各プライマーの1μg（つまり、
Ｔ−１シリーズについては、全部で12μg、Ｔ−
13シリーズについては全部で4μg）、2μgの“誘
導”された12S分画 mRNA（または、非誘導ポ
リ（Ａ） mRNAの10μg）、0.5 mM のdATP，
dCTP，dTTP，200μCi（α 32p）dCTP
（Amersham，２−3000Ci／ｍ mole）および60
単位逆転写酵素（Bethesda Research
Laboratories）である。生成物は、10mlSehadex
Ｇ−50カラム上のゲル濾過により、結合されな
かつたラベルより分け、70℃で30分間0.3N
NaOHで処理し、RNAを分解し、HClで中和し
た。ハイブリド化は、Kafatos等、Nucleic Acid
Res.７，1541−1552（1979）記載に準じて実施し
た。 Ｅ クローンpL1−pL30の同定 500個のE.coli Ｋ−12株294形質転換株（Ｃ項
参照）のそれぞれより、プラスミドDNAの1μg
を調製するのに、Birnboim等、Nucleic Acids
Res.７，1513−1523（1979）の迅速プラスミド分
離操作を用いた。各DNA試料を変成させ、
Kafatos等の上記引用の方法に従い、３反復でニ
トロセルローズフイルター上につけた。 500個のプラスミド試料を含有するニトロセル
ロースフイルターの３組は、 ａ プライマーのＴ−１のセツトでプライムされ
た誘導 cDNA， ｂ Ｔ−13でプライムされた誘導 cDNAおよび ｃ プライマーの両方のセツトを用いて調製され
た非誘導 cDNAとハイブリダイズした。非誘
導プローブの全体に対するよりも誘導された。 cDNAプローブの一方または両方に対してより
強くハイブリド化するならば、クローンは陽性と
考えた。500個より30個の“陽性”クローン
（pL1−pL30）を選択し、さらに分析した。F.ク
ローンpL31−pL39の同定、LeIF遺伝子断片を含
有するプラスミド（No.104）の分離。 KG−１細胞をセンダイウイルスまたはニユー
カツスル病ウイルスで誘導して白血球インタフエ
ロンmRNAを生成せしめ、同細胞を採取し、
mRNAを調製し、これを常法によりラベルして
32pラベル誘導mRNAを得た。プローブとして
32p−ラベル誘導 mRNA（Lillenhaug等、
Biochemistry，15，1858−1865〔1976〕）を用い
て、GrunsteinおよびHognessのコロニーハイブ
リド化法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72，3961
−3965〔1975〕）によりE.coli×1776の形質転換株
をスクリーニングした。非誘導細胞よりの非ラベ
ル mRNAを 32p−ラベル調製物中に存在する
非誘導 mRNAと競合さすために、プローブに
対して200対１に混合した。ラベルされた
mRNAのハイブリド化は、誘導された配列を含
有するコロニーに選択的に起るはづである。３つ
の群の形質転換株が得られた。 (1) コロニーの２から３％が 32p−mRNAに非
常に強くハイブリド化した。 (2) 10％は、ハイブリド化の程度が、上記(1)群よ
り著しく低かつた。 (3) 残りは、検出しうる程度のハイブリド化のシ
グナルを示さなつた。 陽性のコロニー（第(1)および第(2)群）について
は、インタフエロン mRNAがプラスミドDNA
に特異的にハイブリド化することによる分析で、
インタフエロンに特異的な配列の存在について調
べた。まず、テトラサイクリン（20μg／ml）、ジ
アミノピメリン酸（100μg／ml）、チミジン
（20μg／ml）およびｄ−ビオチン（1μg／ml）を
加えたM9培地の100mlに、60個の強陽性コロニー
（第１群）のそれぞれを個別的に発育させた。M9
培地は、１リツトルについて、Na2HPO4（６
ｇ）、KH2PO4（３ｇ）、NaCl（0.5ｇ）および
NH4Cl（１ｇ）を含有し、オートクレープしたあ
と、無菌1M MgSO4の１mlおよび無菌0.01M
CaCl2の10mlを添加する。10個の培養物はプール
し、Clewell等、Biochemistry９，4428−440
〔1970〕記載のように、６個のプールよりプラス
ミドDNAを分離した。各プラスミドDNAプール
の10μgは、Hindlllで切断し、変性し、DBM
（diazobenzyloxymethyl）紙に共有結合させた。
誘導細胞よりの精製の mRNAの1μgをそれぞれ
の濾紙にハイブリドさせた。ハイブリドしない
mRNAは洗つて除去した。特異的にハイブリド
された mRNAは溶出し、アフリカツメガエル
の卵母細胞中で翻訳させた。この分析で、６個の
プールはすべて陰性であつた。弱陽性のコロニー
（第２群）の59個より、各10コロニーの５プール
と９コロニーの１プールを調製し、それらのプー
ルよりプラスミドを調製し、上記のように調べ
た。試験した６個のプールのうち、１個（K10）
は、試験の度に、バツクグラウンドレベルを著し
く超えるレベルで、インタフエロン mRNAに
ハイブリドした。特異的インタフエロン cDNA
クローンを同定するために、プールK10の９コロ
ニーよりプラスミドDNAを調製し、個別的に調
べた。９個のプラスミドのうちの２個（No.101お
よびNo.104）がインタフエロン mRNAと、バツ
クグラウンドレベルを十分に超えて結合した。プ
ラスミドNo.104をBgl制限酵素で切断し、得ら
れた260b.p.断片をゲル電気泳動により分離して
260b.p.含有Bgl制限断片を得た。これを、
Taylor等、Biochim.Biophys.Acta 442，324−
330（1976）の方法により 32pでラベルし、その場
でのコロニースクリーニング法（Grunsteinおよ
びHogness，Proc.Natl.Sci.U.S.A.72，3961−
3965〔1975〕）によりE.coli294転換株の400個を、
個別的にスクリーニングするためのプローブに用
いた。このプローブと種々の程度にハイブリド化
する、９個のコロニー（pL31−pL39）を同定し
た。 さらに、ラベルされた260b.p.断片を用いて、
同様にして、4000個のE.coli294転換株を個別的
にスクリーニングした。このプローブと種種の程
度にハイブリドする50個のコロニーを同定した。
ひとつは、LeIF Ｇ断片を、ひとつは、LeIF Ｈ
断片を、ひとつはLeIF Hlと称する断片（みかけ
上、LeIF Ｈの対立遺伝子である）を含有した。
生ずるハイブリドプラスミドは、“pLeIF Ｈ”等
と称した。 Ｇ 最初の完全長LeIF遺伝子の分離および配列
の決定 全体で39個の可能性のあるLeIF ｃ DNAク
ローンよりプラスミドDNAを調製した。そして、
Kafatos等（上記引用）のハイブリド化操作によ
り、同じ260b.p.DNAプローブを用い再スクリー
ニングした。このプローブと３個のプラスミド
（PL4，pL31，pL34）は非常に強いハイブリド化
シグナルを与え、４個（pL13，pL30.pL32，
pL36）は中程度にハイブリド化し、３個（pL6，
pL8，pL14）は、弱くハイブリド化した。 39個の可能性のあるLeIF cDNA組換えプラス
ミドは、また、 32p−ラベル合成ウンデカマー
各々３種のプライマーからなるＴ−１プライマー
プールのそれぞれまたはＴ−13プライマーのそれ
ぞれ）をじかにハイブリド化のプローブに用いて
検索した。検出しうるハイブリド化のシグナルを
与えるのに完全な塩基間の対が必要であるよう
に、ハイブリド化の条件を選んだ（Wallace等、
Nucleic Acid Res.６，3543−3557〔1979〕）。つ
まり、39個のクローンよりプラスミドDNAを、
標準上澄溶液法（プラスミドを有する細胞を界面
活性剤等を用いて溶菌させ、遠心分離後、プラス
ミドを含む上澄みを回収し、この上澄みからプラ
スミドを単離する方法である。上澄みからの単離
にはエタノール沈殿法が利用される。）（cleared
lysate procedure，Clewell等、上記）で調製し、
Biorad Agarose Ａ−50（Bio−Rad社製のゲル
濾過用アガロースゲル）カラムクロマトグラフイ
ーで精製した。各調製物の試料（3μg）は、
EcoRで処理して開環し、アルカリで変性させ、
２枚の別々のニトロセルロースフイルターにスポ
ツトした。１スポツトについて1.5μgとする。上
記引用のKafatos等の文献をみよ。合成デオキシ
オリゴヌクレオチドＴ−13プライマーおよびＴ−
１プライマープールのそれぞれは、（γ32P）ATP
でつぎのようにリン酸化した。50pmoleのオリゴ
ヌクレオチドおよび100pmoleの（γ 32P）ATP
（New England Nuclear，2500Ci／ｍ mole）
を、50mMのTris−HCl，10mMのMgCl2および
15mMのβ−メルカプトエタノールの混合物の
30μl中で合併した。２単位のT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを添加し、37℃で30分後 32p−ラベル
プライマーは、10mlSephadex Ｇ−50カラム上
でのクロマトグラフイーで精製した。106cpmの
プライマーＴ−13Cまたは３×166cpmのプライマ
ープールＴ−1Cを用いてハイブリド化した。ハ
イブリド化は、Wallace等の上記引用の方法に従
つて、６×SSC〔１×SSC＝0.15 MNaCl，
0.015Mくえん酸ナトリウム、PH7.2）、10×
Denhardts〔0.2％牛血清アルブミン、0.2％ポリビ
ニルピロリドン、0.2％Ficoll〕溶液中で、15℃で
14時間ハイブリド化した。フイルターは６×SSC
中０℃で５分間宛３度洗つた。乾燥し、Ｘ−線フ
イルムにさらした。結果は、第１図に、 32p−プ
ライマーＴ−13CおよびプライマープールＴ−1C
の場合について示してある。 クローン104からのプラスミドDNAは、プライ
マープールＴ−1CおよびプライマーＴ−13Cと顕
著にハイブリド化した。しかし、他のウンデカマ
ーとは、検出しうる程のハイブリド化は示さなか
つた。第１図に示すように、39個の可能性のある
LeIFプラスミドのうちのいくらか（pL2，４，
13，17，20，30，31，34）はこれらのプローブの
両方とハイブリド化した。しかし、制限分析か
ら、これらのプラスミドのうちのひとつだけ、
pL31が260b.p.内部Bgl 断片をも含有した。
pL31をPst で消化した結果、 cDNA挿入物
の大きさは約1000b.p.であつた。 pL31のPst 挿入物全体の配列を、Maxam
−Gilbert化学法（Methods Enzymol.65，499−
560〔1980〕）およびジデオキシ鎖末端化方法
（Smith，Methods Enzymol.65，560−580
〔1980〕）で決定した。その際、Sau3 ａ断片をＭ
13ベクター中にサブクローン化しておいた。
DNA配列は表２の“Ａ”に示してある。入手し
うる蛋白質配列についての情報、既知のLeIF分
子量の範囲、３個の可能な読み枠における停止ト
リプレツトの相対的な存在より適当な翻訳読み枠
が示唆された。それから、プレーまたはシグナル
ペプチドを含めてLeIFアミノ酸全配列が示され
た。第１のATG翻訳開始コドンは、配列の5′末
端より60番目のヌクレオチドに存在し、188コド
ンあとに、TGA終止トリプレツトが存在する。
3′末端には342個の非翻訳ヌクレオチドがあり、
ついでポリ(A)配列がつづく。仮定されるシグナル
ペプチド（おそらく、白血球よりの成熟LeIFの
分泌にあづかるのであろう）は23アミノ酸長であ
る。成熟LeIFを構成する165アミノ酸の分子量の
計算値は、19，390である。我々は、このpL31に
よりコードされたLeIFを“LeIF Ａ”と称した。
表３の配列データ（“Ａ”）よりトリプシンペプチ
ドT1およびT13は、LeIF Ａの146−150および58
−62にそれぞれ相当することが分る。これらの２
つの領域に見出される実際のDNAコード配列は、
プライマープールT1−ＣおよびプライマーT13
−Ｃに表されるものである（表４をみよ）。 Ｈ 成熟白血球インタフエロンＡ（LeIFA）の直
接発現 １ 一般的既述 LeIF Ａを成熟インタフエロンポリペブチドと
して直接に発現させるための操作は、合成（Ｎ−
末端）および相補的DNAの組合せを包含する点
でヒト生長ホルモンに用いられた方法（Goeddl
等、Nature281，544−548〔1979〕の一変形であ
る。 第３図に示すように、Sau 3a制限エンドヌク
レアーゼ部位は、便宜なことに、LeIF Ａのコド
ン１および３とのあいだに存在する。ATG翻訳
開始コドンを含有し、アミノ酸１（システイン）
に対するコドンを修復し、EcoR粘着末端を新
しく作製することを包含する、２つの合成デオキ
シオリゴヌクレオチドをデザインした。これらの
オリゴマーは、pL31の34b.p.Sau 3a−Ava
断片に連結した。生ずる45b.p.生成物は２つの追
加のDNA断片に連結させ、865b.p.合成−天然雑
種遺伝子とした。これは、LeIF Ａをコードし、
EcoRおよびPst 制限部位によりはさまれて
いる。この遺伝子は、EcoRおよびPst 部位
のあいだにおいて、PBR322に挿入し、プラスミ
ドPLeIF Alとした。 ２ トリプトフアン調節要素（E.coli trpプロモ
ーター、オペレーターおよびtrpリーダーリボ
ゾーム結合部位を含有するが翻訳開始のための
ATG配列を欠如する）の構築 プラスミドpGMI（ATCC 31622）は、欠失
ΔLE 1413を含有するE.coliトリプトフアンオペ
ロンを担う（Miozzari等、J.Bacteriology133，
1457−1466〔1978〕）。それゆえに、trpリーダーの
最初の６個のアミノ酸そしてtrp Ｅポリペプチド
のおよそ最後の1/3（以降、あわせてLE′と称す
る）ならびにtrp Ｄポリペプチドの全体を含有す
る融合蛋白質を発現する。これはすべてtrpプロ
モーター−オペレーターシステムの調節下にあ
る。プラスミドPGM1の代りに容易に入手可能な
その他の同等のtrpプロモーター（たとえば、
Bennett，J.Mol.Biol.（1978）121，113−137の
135頁Fig.１０参照）を用いてもよい。このプラ
スミド20μgを制限酵素Pvuで消化した。これ
は、プラスミドを５個の部位において切断する。
この遺伝子断片はついでEcoRリンカー
（pCATGAATTCATGの自己相補性のオリゴヌ
クレオチドより成立つ）と結合させ、あとから、
EcoR部位含有プラスミド中にクローン化する
ためのEcoR切断部位とする。pGM1より得ら
れるDNA断片の20μgを、200Pmoleの5′−リン酸
化合成オリゴヌクレオチドpCATGAATCATG
の存在で、20μlT4DNAリガーゼ緩衝液（20mM
Tris PH7.6，0.5mM ATP，10mM MgCl2，
5mMジチオスレイトール）中で10単位T4DNA
リガーゼで４℃一夜処理した。溶液はついで70℃
で10分間加熱し、連結を停止させた。リンカーは
EcoR消化で切断し、EcoR末端を有する断片
を５パーセントポリアクリルアミドゲル電気泳動
（以降PAGEと称する）を用いて分け、大きい方
の３個の断片を、エチジウムブロマイドでまず染
色し、紫外線で断片の位置を定め、ゲルより対象
となる部分を切り取る方法で分離した。各ゲル断
片（300μl0.1×TBE）を透析バツグに入れ、そし
て、0.1×TBE緩衝液（TBE緩衝液は10.8ｇの
Tris塩基、5.5ｇのホウ酸、0.09ｇのNa2EDTAを
１リツトルのH2O中に含有）中で100V1時間電気
泳動した。透析バツグより水溶液を採取し、フエ
ノール抽出、クロロホルム抽出、0.2M塩化ナト
リウム濃度とし、エタノール沈殿後水中にDNA
を採取した。EcoR粘着末端を有するtrpプロモ
ーター−オペレーター含有遺伝子は、つぎに記載
する操作で同定した。つまり、テトラサイクリン
感受性プラスミドに断片を挿入し、これは、プロ
モーター−オペレーターの挿入で、テトラサイク
リン抵抗性とした。 プラスミドpBRHI（Rodriguez等、Nucleic
Acids Res.６，3267−3287〔1979〕）は、アンピ
シリン抵抗性を発現しそして、テトラサイクリン
抵抗性遺伝子を含有する。しかし、それに組合わ
されたプロモーターが存在しないので、その抵抗
性を発現しない。このプラスミドは従つてテトラ
サイクリン感受性である。このEcoR部位にプ
ロモーター−オペレーターシステムを導入するこ
とにより、プラスミドをテトラサイクリン抵抗性
となしうる。 pBRHIをEcoRで消化し、酵素はフエノール
抽出クロロホルム抽出で除去し、エタノール沈殿
させて水中にうる。別々の反応混合物中に存在す
る生成DNA分子は、上記に得られた３個のDNA
断片のそれぞれと合併し、そして、前記のよう
に、T4DNAリガーゼで連結させた。反応混合物
中に存在するDNAを用いて、標準方法
（Hershfield等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71，
3455−3459〔1974〕）によりDNAとり込み能のあ
るE.coli Ｋ−12株294を形質転換し、この細菌
を、20μg／mlのアンピシリンおよび5μg／mlのテ
トラサイクリンを含有するLB（Luria−Bertani）
プレートに接種した。いくつかのテトラサイクリ
ン抵抗性コロニーを選び、プラスミドDNAを分
離しそして、望む断片の存在を制限酵素分析で確
かめた。生ずるプラスミドをpBRH trpと称す
る。 肝炎ＢのウイルスゲノムのEcoRおよび
BamH消化生成物を常法により採取し、プラ
スミドpGH6（ATCC 31539）のEcoRおよび
BamH部位にクローン化し（このプラスミド
pGH6は、GoeddelらのNature281，544（1979）
に示されているように、プラスミドpKB268から
単離された285塩基対のEcoR断片（同断片は、
95塩基対の異種DNA断片を介在させた２つの
UV−５ lacプロモータからなり、その構築方
法は、JohnsrudのProc.Natl.Acad.Sci.USA，75
(11)5314−5318（1978）に記載されている）を、プ
ラスミドpBR322のEcoR部位に挿入すること
により構築される。なお、UV−５ lacプロモ
ータの塩基配列は、DicksonらのScience187，27
−35（1975）、SimpsonらのCell18，277−285
（1979），SiebenlistらのCell 20，269−281
（1980）等に記載されており、公知である。〕、プ
ラスミドpHS32とする。プラスミドpHS32を
Xba で切断し、フエノール抽出し、クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈殿させた。沈殿は、
0.1mM dTTPおよび0.1mM dCTPを含有する
30μlポリメラーゼ緩衝液（50mMリン酸カリウム
PH7.4、7mM MgCl2，1mM β−メルカプトエタ
ノール）中で、1μlE.coli DNAポリメラーゼ、
Klenow断片（Boehringer−Mannheim）で、０
℃で30分、ついで37℃で２時間処理した。この処
理でXba 切断部位の5′突出末端に相補的な４
個のヌクレオチドのうちの２個がみたされる。 5′CTAGA− 5′CTAGA− 3′Ｔ− TCT− ２つのヌクレオチドdCおよびdTが組込まれて
２つの突出する5′ヌクレオチドを有する末端を与
える。プラスミドpHS32（フエノールおよびクロ
ロホルム抽出後エタノール沈殿させて水に取る）
のこの直鎖残基を、EcoRで切断した。大型プ
ラスミド断片を、PAGEで、より小さいEcoR
−Xba 断片より分け、電気溶出により分離し
た。pHS32（0.2μg）よりのこのDNA断片は、上
記に類似の条件で、pBRH trpに由来するトリプ
トフアンオペロン（約0.01μg）のEcoR−Taq
Ｉ断片に連結した。 上記のpHS32の断片をEcoR−Taq 断片
に連結するこの方法において、完全なワトソン−
クリツク塩基対ではないけれども、Taq の突
出する末端をXba の残存する突出末端に連結
する。 −Ｔ −AGC＋CTAGA− TCT−→−TCTAGA −AGCTCT− − この連結反応混合物の１部はE.coli294細胞の
変換に用い、熱処理し、アンピシリン含有LBプ
レート中に塗布した。24個のコロニーを選択し、
３mlLB（Luria−Bertani）中で発育させ、プラ
スミドを分離した。これらのコロニーのうちの６
個が、E.coliによるDNA修復および複製により
再生されたXba 部位を有することが分つた。 −TCTAGA −AGCTCT− −→−TCTAGA −AGATCT− − これらのプラスミドは、EcoRおよびHpa
の両方で切断されて、期待される制限断片を与
えることも分つた。pTrp14と称するひとつのプ
ラスミドを、つぎに論議するように異質のポリペ
プチドを発現さすのに用いた。 プラスミドpHGH107（ATCC 31538）（このプ
ラスミドpHGH107は、GoeddelらのNature
281，544（1979）に記載の方法（例えば同文献の
Fig.4参照）により、前述のpGH6のlacプロモー
タの下流にヒト成長ホルモンをコードするDNA
断片を挿入して構築される。〕は、合成DNA断片
より生成された23個のアミノ酸コドンおよびヒト
生長ホルモンメツセンジヤーRNAの逆転写で生
成される相補的DNAより得られる163個のアミノ
酸コドンより成立つヒト生長ホルモンに対する遺
伝子を含んでいる。この遺伝子は、ヒト生長ホル
モンの“先行”配列のコドンを欠如するけれど
も、ATG翻訳開始コドンを含有する。この遺伝
子は、10μpHGH107より、EcoR処理、それに
続く、上記のようなE.coli DNAポリメラーゼ
Klenow断片およびdTTPおよびdATP処理を
経て分離した。フエノールおよびクロロホルム抽
出のあとエタノール沈殿させたプラスミドを
BamHで処理した。 ヒト生長ホルモン（HGH）遺伝子含有断片
は、PAGE、つづいて電気溶出により分離した。
生ずるDNA断片は、テトラサイクリンプロモー
ター−オペレーターシステムを欠如するが、テト
ラサイクリン抵抗性構造遺伝子の最初の350個の
ヌクレオチドをも含有するので、引きつづき発現
プラスミド中にクローン化したときに、その挿入
物を含有するプラスミドは、テトラサイクリン抵
抗性の回復により見定め得る。断片のEcoR未
端は、Klenowポリメラーゼ法でみたされてあ
るので、この断片は、ひとつの平滑末端（blunt
end）およびひとつの粘着末端を有する。それ
で、あとから発現プラスミドに挿入されても正し
い配向が確実になる。 発現プラスミドpTrp14を、ついで、上記調整
のHGH遺伝子含有断片を受け入れるように調整
した。すなわち、pTrp14をXba 消化し、生
ずる粘着性末端を、dATP、dTTP、dGTPおよ
びdCTPを用いるKlenowポリメラーゼ法でみ
たした。フエノールおよびクロロホルム抽出およ
びエタノール沈殿のあと、生ずるDNAはBam
Ｈで処理し、生ずる大型プラスミド断片を
PAGEおよび電気溶出で分離した。pTrp14由来
の断片は１個の平滑末端および１個の粘着末端を
有し、前記したHGH遺伝子含有断片と正しい配
向で再結合することを可能とした。 HGH遺伝子断片とpTrp14ΔXba−Bam Ｈ
断片とは、上記と類似の条件で、合併し相互に連
結した。みたされたXba およびEcoR末端
は、平滑末端による連結で、Xba 部位および
EcoR部位の両方を再構成した。 【表】 この構築はまたテトラサイクリン抵抗性遺伝子
をも創出する。プラスミドpHGH107は、HGH
遺伝子より上流に存在するプロモーター（lacプ
ロモーター）よりテトラサイクリン抵抗性を発現
するので、pHGH207と称するこの構築は、トリ
プトフアンプロモーター−オペレーターの調節下
でのテトラサイクリン抵抗性遺伝子の発現を可能
とする。ついで、連結混合物でE.coli294を転換
し、5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するLB
プレート上でコロニーを選択した。 プラスミドpHGH207はEcoR消化し、trpプ
ロモーター−オペレーターおよびtrpリーダーリ
ボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始のための
ATG配列を欠如する300b.P.断片を、PAGEそれ
につづく電気溶出で採取した。このDNA断片は
pLeIF ＡのEcoR部位にクローン化した。上記
の変型trpレギユロン（regulon）（発現レベルを
高めるように調節するためにアテニユエータ配列
を欠失させたE.coli trpオペロン）を含有する発
現プラスミドは、プロモーター−オペレーターシ
ステムを抑制するに十分量のトリプトフアン添加
培地にあらかじめ定めたレベルまで発育させう
る。ついで、トリプトフアンを除去しシステムの
抑制を除けば、目的とする生成物が発現されう
る。 より具体的に示すと、第３図を参照して、
250μｇのプラスミドpL31をPst で消化し、
1000b.P.の挿入物を６％ポリアクリルアミドゲル
上のゲル電気泳動で分離した。約40μｇの挿入物
をゲルより電気溶出し、３つに分けて、つぎのよ
うにさらに消化した。ａこの断片の16μｇ試料
を、37℃で45分間Bgl の40単位で部分的に消
化し、反応混合物は６％ポリアクリルアミドゲル
上で精製した。望む670b.P.の断片約2μｇを採取
した。b1000b.p，Pst 挿入物の別の試料（8μ
ｇ）をAva およびBgl で消化した。ゲル
電気泳動のあとに、上記の150b.p.の断片1μｇを
得た。c1000b.p.片の16μｇをSau3aおよびAva
で処理した。10％ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動したあと、約0.25μｇ（10pmole）の34b.
p.断片を得た。２つの示したデオキシオリゴヌク
レオチド、5′−dAATTCATGTGT（断片１）お
よび5′−dGATCACACATG（断片２）はホスホ
トリエステル法で合成した。断片２はつぎのよう
にリン酸化した。200μl（約40pmole）の（γ
32P）ATP（Amersham，5000Ci／mmole）を乾
燥し、60mMのTris−HCl（PH８）、10mMの
MgCl2、15mMβ−メルカプトエタノールより成
立つ、100pmoleのDNA断片および２単位のT4
ポリヌクレオチドキナーゼ含有溶液30μlに再懸濁
した。37℃で15分後、1μlの10mMのATPを添加
し、反応はさらに15分進行させた。混合物はつい
で70℃で15分加熱し、100pmoleの5′−OH断片１
および10pmoleの34b.p.Sau 3a Ava 断片と
合併した。20mM Tris−HCl（PH7.5）、
10mMMgCl2、10mMジチオスレイトール、
0.5mMATPおよび10単位T4DNAリガーゼの
50μl中で５時間４℃で連結させた。混合物は６％
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、45b.p.
生成物を電気溶出で採取した。45b.p.生成物の
30ng（1pmole）を、150b.p.Ava −Bgl 断
片の0.5μｇ（5pmole）および670b.p.Bgl −
Pst 断片の1μｇ（2pmole）と合併した。20単
位のT4DNAリガーゼを用いて20℃16時間連結処
理した。65℃で10分間加熱してリガーゼを不活化
した。混合物はEcoRおよびPst で消化して
遺伝子の重合体を除去した。混合物は６％PAGE
で精製した。約20ng（0.04pmole）の865b.p.生成
物を分離した。これの半分（10ng）を、pBR322
（0.3μｇ）のEcoRおよびPst 部位のあいだ
に挿入した。E.coli294を形質転換すると70個の
テトラサイクリン抵抗性、アンピシリン感受性の
転換株を与えた。これらのうちの18個からプラス
ミドDNAを分離し、EcoRおよびPst で消
化した。18個のプラスミドのうち、16個が865b.
p.長のEcoR−Pst 断片を有した。これらの
うちのひとつPLeIF Alの1μｇをEcoRで消化
し、E.coli trpプロモーターおよびtrpリーダーリ
ボゾーム結合部位を有する、上記製造のような
300b.p.EcoR断片（0.1μｇ）に連結させた。trp
プロモーターを含有する転換物は、Grunstein−
Hognessコロニースクリーニング法と組合わせ
て、プローブとしてtrpプロモーター配列を含有
する 32P−ラベルDNA断片を用いて同定した。
trp断片中の非対称的に位置しているXba 部
位は、trpプロモーターが、LeIF Ａ遺伝子の方
向に配向している、組換え生成物の同定を可能と
した。 LeIF Ａのインビトロおよびインビボ活性 IF分析のための抽出物をつぎのように調製し
た。培養物の１mlを5μｇ／mlのテトラサイクリ
ンを含有するＬブロス中で発育させ、A550値（波
長550mmにおける吸光度）を約1.0とし、ついで、
5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するM9培地
25ml中に希釈した。A550が1.0に達した時に10ml
の試料を遠心採取し、細胞塊を、15％スクロー
ス、50mMTris−HCl（PH8.0）、50mM EDTAの
１ml中に懸濁させた。１mgのリゾチームを添加
し、０℃５分のあと、細胞は超音波処理で破壊し
た。試料は10分間（15000rpm）で遠心し、上清
中のインタフエロン活性を、細胞変性効果
（CPE）の阻止分析により、標準LeIFと比較して
測定した。細胞あたりのIF分子数を測定するた
めには、４×108単位／mgのLeIF比活性を用い
た。 表６に示すように、trpプロモーターを望む配
向に挿入したクローンpLeIF Ａ trp25は高い活
性（2.5×108単位／ｌ）を示した。表７に示すよ
うに、E.coli Ｋ−12株294／pLeIF Ａ trp25の
生成するIFは、ヒトLeIF標品と同様に挙動した。
PH２での処理に対し安定で、ウサギ抗ヒト白血球
抗体により中和される。このインタフエロンの見
かけの分子量は約20000である。クローンpLeIF
Ａ trp25はアメリカンタイプカルチヤーコレク
シヨン（ATCC）に寄託されている。 インタフエロンのインビボでの効果には、マク
ロフアージおよびナチユラルキラー（NK）細胞
が必要である。そしてインビボでの作用は、これ
らの細胞の刺激を含むようにみえる。それで、E.
coli294／pLeIF A25により生産されるインタフ
エロンは、細胞培養の分析では抗ウイルス活性を
有するが、感染動物では無効である可能性があ
る。さらに、細菌より生産された、非グリコシレ
ート化LeIF Ａのインビボ・抗ウイルス作用は、
ヒト“バフイーコート（buffy coat）”白血球に
由来するグリコシレート化LeIFとは異なること
がありうる。それで細菌により合成されたLeIF
Ａ（２％純度）の生物活性を、スクイレルモンキ
ー（リスザル）への致死量の脳心筋炎ウイルス
（EMC）感染において、バフイーコートLeIF（８
％純度）と比較してみた（表８）。 【表】 【表】 ＊表６に記載のE.coli294／pLeIF Ａ trp25の
抽出物mlあたり250000単位を、最小必須培地で
500倍希釈し、500単位／mlの比活性とした。白血
球インタフエロン標準（Wadley Institute）をあ
らかじめNIH白血球インタフエロン標準に対し
て、タイターを求めて、やはり500U／mlの最終
濃度に希釈した。１ml量を1NHClでPH２とし、
４℃で52時間インキユベートし、NaOHを添加
中和し、IF活性を標準CPE阻止分析で測定した。
500単位／ml試料（未処理）の25μl分を25μlのウ
サギ抗−ヒト白血球インタフエロンと37℃で60分
インキユベートし、12000×ｇで５分遠心し、上
清を分析した。 【表】 サルはすべて雄（平均体重713ｇ）で、感染前
には、EMCウイルス抗体は有しない。サルには、
100×LD50EMCウイルス（マウスで測定）を筋
肉内感染させた。対照感染サルは、感染後134，
158，164時間に死亡した。 106単位インタフエロン処理は、感染前４時間、
感染後２，23，29，48，72，168および240時間目
に静脈内投与した。細菌性白血球インタフエロン
は、E.coli294／pLeIF A25の融解物よりのカラ
ムクロマト分画で、比活性7.4×106単位／mg蛋白
質であつた。対照細菌蛋白質は、E.coli294／
pBR322融解物よりの相当するカラム分画で、２
倍の全蛋白質量とした。白血球インタフエロン標
準は、クロマトグラフイーで、32×106単位／mg
蛋白質の比活性に精製した、正常のヒト“バツフ
イーコート”細胞よりのSendaiウイルス誘導イ
ンタフエロンであつた。 対照のサルは、序々に進行する昏睡、バランス
の消失、後肢の弛緩、まひそして死亡前８時間頃
より開始する涙の流出を示した。インタフエロン
処理サルは、これらの異常はまつたく示さず、常
時活動的で、ウイルス血症による症状を示さなか
つた。４日までウイルス血症を示さなかつた対照
中の１頭のサルは、もつとも遅れて死んだ（感染
164時間後）、しかし、死後、心臓および脳に高タ
イターでウイルスを検出した。インタフエロン投
与サルは、感染後14および21日の検査でEMCウ
イルスに対する抗体を生成しなかつた。これらの
結果は、感染動物におけるLeIF調製物の抗ウイ
ルス効果は、インタフエロンのみに帰せられうる
ことを示す。理由は、爽雑する蛋白質は、細菌と
バツフイーコート調製物ではまつたく異なるから
である。さらに、これらの結果は、LeIF Ａのイ
ンビボ抗ウイルス活性にグリコシル化が不要であ
ることを示す。 Ｊ その他の白血球インタフエロンに対する
cDNAの分離 完全に特徴づけられたLeIF Ａ cDNA含有プ
ラスミドよりのDNAをPst で切断し、電気泳
動により分離し、 32pでラベルした。生ずる放射
ラベルDNAをプローブに用い、上記のGrunstein
およびHognessのインジトウーコロニースクリー
ニング法により、宿主微生物としてE.coli294を
用いて上記Ｃ項で得られる白血球インタフエロン
のcDNAを含有する形質転換体のその他のコロニ
ーバンクをスクリーニングにかけた。この結果
種々の程度にプローブにハイブリド化したコロニ
ーを単離した。これらのコロニーからのプラスミ
ドDNAおよび上記Ｇ項に示した10個のハイブリ
ド化コロニーからのプラスミドDNAを、Pst
切断により分離し、３つの方法で特徴づけた。第
１に、これらのPst断片を、酵素Bgl、Pvuお
よびEcoRを用いる制限エンドヌクレアーゼ消
化パターンで特徴づけた。上記コロニーから得ら
れたPst断片の分析は、第２図に示した、少な
くとも８種の異なる型（LeIF Ａ、LeIF Ｂ、
LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF Ｅ、LeIF Ｆ、LeIF
ＧおよびLeIF Ｈ）の分類を可能とした。これ
は、これまでに知られているLeIF Ａの先行配列
およびコード配列に関する、種々の制限切断点の
おおよその位置を示している。これらのうちのひ
とつLeIF Ｄは、Nagata等がNature 284、316
−320（1980）に報告したのと同じと信ぜられる。 第２に、それらDNAのいくつかについて、ポ
リーＡ含有KG−１細胞RNAより、LeIF
mRNAを選択的に除去する能力について、
Cleveland等がCell20、95−105（1980）に記載し
たハイブリツド化選択分析により調べた。LeIF
Ａ、Ｂ、ＣおよびＦのPst断片はこの分析で陽
性であつた。第３に、これらのPst断片を発現プ
ラスミドに挿入し、E.coli 294をそのプラスミド
で形質転換し、断片を発現させた。プレインタフ
エロンと信ぜられる発現生成物は、LeIF Ｆ断片
がかろうじて陽性以外は、インタフエロン活性に
対するCPE分析ですべて陽性であつた。上記に
加えて、上記のLeIF型のすべてについて配列を
定めた。 Ｋ 第２の成熟白血球インタフエロン（LeIF
Ｂ）の直接発現 成熟LeIF Ｂに対する遺伝子を含有する分離断
片の配列は、型ＡおよびＢの最初の14個のヌクレ
オチドが同じであることを示す。それで、trp−
プロモーター−オペレーター、リボゾーム結合部
位およびLeIF Ａ（＝Ｂ）遺伝子の第１コドンを
有する断片を、pLeIF A25より分離し、LeIF Ｂ
の発現プラスミドを構築するためＢ配列の残りの
部分と結合させた。この場合、前記Ｂ配列の残り
の部分はLeIF Ｂの第２のコドンから始まる。
pL4（第２図に示したLeIF Ｂ Pst末端遺伝子を
含有するプラスミド）のPst断片およびpLeIF
A25の１部に対する顕著な制限地図を、第４図お
よび第５図にそれぞれ示す。 第４図の配列によりPst 断片に対しておお
よそ950b.p.のSau ３ ａ−Pst 断片をうるに
は、１個または１個より多くの介在するSau ３
ａ制限部位が存在するので、単にPstとSau
３ ａとを用いて切断する方法は適用できずいく
つかの段階が必要である。つまり、つぎのように
なる。 LeIF Ｂ発現ベクターおよびこれを含む形質転
換体の製造方法を以下に記載する。 １ つぎの断片を分離した。 ａ Sau3 ａからEcoRまでの110bb.p.； ｂ EcoRからXbaまでの132b.p. ｃ XbaからPstまでの＞700b.p. ２ 断片１ａおよび１ｂを連結させXbaおよび
Bglで切断して、Sau ３ ａおよびXba末端
を経由する自己重合を防いだ（関連するSau
３ ａ部位はBgl 部位内にあり；Bgl
切断はSau ３ ａ粘着性末端を残した）。
242b.p.断片を分離した。 ３ ２および１ｃの生成物を連結させ、ふたたび
自己重合を防ぐために、Pst およびBgl
で切断した。Sau ３ ａからPst までの
（第４図）約950b.p.断片を分離した。この断片
は、LeIF Ａに共通していない、LeIF Ｂ遺伝
子の部分を含有した。 ４ LeIF Ａのtrpプロモーター−オペレーター、
リボゾーム結合部位、ATG開始シグナルおよ
びシステインコドンを含有する。 約300b.p.断片（HindからSau ３ ａま
で）を、pLeIF25より分離した。 ５ Pst からHind までの約3600b.p.断片
をpBR322より分離した。レプリコンおよびテ
トラサイクリン抵抗性がコードされているが、
アンピシリン抵抗性は含有しない。 ６ 段階３，４および５で得られた断片をトリプ
ル連結し、生ずるプラスミドでE.coli Ｋ−12
株294を転換した。 転換株はミニスクリーニング（Birnboim等、
Nucleic Acids Rcs.７、1513−1523〔1979〕）に
処し、プラスミド試料はEcoRで消化した。消
化物は３個の断片を与えたが、それらの特徴は、
１ EcoR−EcoR trp プロモーター断
片；２）pL4の内部EcoR−EcoR断片；およ
び３）pL4の蛋白質翻訳開始シグナル−EcoR
断片。 ウイルスの細胞変性効果に基づく慣用の分析方
法であるCPE分析（The Interferon System，
Springer−Verlag，Wien／Austria，1979，
pp17よび18参照）で、上記のように調製したク
ローンより細菌抽出物は、代表的には、A550＝１
で約10×106単位／ｌのインタフエロン活性を与
えた。このように調製されたひとつの代表的なク
ローンは、E.coli294／pLeIF Ｂ trp7である。
このクローンはATCCに寄託されている。 Ｌ さらに別の成熟白血球インタフエロン
（LeIF Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪ）の直接
発現 他のLeIFタイプを含有する追加の完全長遺伝
子断片は、LeIF Ａにおけると同様に、テイラー
し発現のための発現ビヒクル中におきうる。成熟
LeIF Ａの発現のための、上記Ｈ項に記載のよう
なアプローチ、つまり、制限切断により先行配列
を除去し、先行配列除去で失なわれたＮ−末端ア
ミノ酸コドンを合成DNA断片の連結でおき代え
るという、便利な方法がとれるかどうかを決めう
るよう、成熟インタフエロンタイプの第１のアミ
ノ酸コドンに十分に近く制限部位が存在するかど
うかは、従来法による完全な配列決定から分るで
あろう。それがうまくいかなければ、つぎの操作
を用いうる。要するに、成熟ポリペピチドの第１
のアミノ酸に対するコドンの開始する点より正確
に前のところで先行配列含有断片を切断する。つ
まり １ その点をとりまく領域内において２重鎖
DNAを１重鎖DNAに変える； ２ 段階１で生成した１重鎖の領域に目的とする
切断部位と結合するヌクレオチドと反対側にプ
ライマーの5′末端が位置するようにして、１重
鎖DNAの相補的なプライマーをハイブリド化
する。 ３ プライマーより3′の方向にある、段階１で除
かれた第２の鎖の部分を、アデニン、チミン、
グアニンおよびシトシン含有デオキシヌクレオ
チドトリホスフエートの存在でのDNAポリメ
ラーゼを用いる反応で〓復させる。 ４ 切断しようとする点をこえて突出している、
残存する１重鎖DNAを消化する。 翻訳開始シグナルATGを、コード鎖の3′末端
に有する短鎖長合成DNAを、ついで、得られた
成熟インタフエロンのために仕立上げられた遺伝
子に、たとえば平滑末端連結で連結し、そしてこ
の遺伝子を発現プラスミドに挿入し、プロモータ
ーおよびそれに組合わされたリボゾーム結合部位
による調節下におく。 上記のＫ項で用いたのと同様にして、LeIF Ｃ
およびLeIF Ｄをコードする遺伝子断片を、直接
的細菌による発現のために適当に配列した。これ
らの追加の白血球インタフエロンの発現のための
戦略として、それぞれの場合について、pLeIF
A25よりのLeIF Ａのtrpプロモーター−オペレー
ター、リボゾーム結合部位、ATG開始シグナル
およびシステインコドンを含有する、約300b.p.
の断片（HindからSau ３ ａまで）を用い
る。これに対して、すべてに共通である最初のシ
ステインより向うの、それぞれのアミノ酸配列を
コードするその他のインタフエロン遺伝子よりの
遺伝子断片を結合する。得られたそれぞれのプラ
スミドを用いてE.coli Ｋ−12株294を転換した。
それぞれの遺伝子を形成するための結合は次のよ
うである。 LeIF Ｃ pLeIF Ｃより次の断片を分離する： (a) Sau ３ ａからSau 96までの35b.p. (b) Sau 96からPst までの＞900b.p. (c) 上記K4項におけるように、pLeIF Ａ−25よ
り約300b.p.の断片（Hind−San ３ ａ）を
分離する。 (d) 上記K5項の約3600b.p.の断片を分離する。 構 築 (1) (a)および(c)を連結する。Bgl，Hindで切
断し、約335b.p.の生成物を分離する。 (2) (1)＋(b)＋(d)とトリプル連結し、生ずるプラス
ミドでE.coliを転換する。 このように調製された代表的なクローンはE.
coli Ｋ−12 株294／pLeIF Ctrp35である。こ
のクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｄ pLeIF Ｄよりつぎのようは分離する： ａ Sau ３ ａからAva までの35b.p. ｂ Ava よりBgl までの150b.p. ｃ Bgl よりPst まで約700b.p. pLeIF A25より、つぎの断片を分離する： ｄ HindよりSau ３ ａまで300b.p. pBR322よりつぎの断片を分離する： ｅ HindよりPstまで約600b.p. 構 築 (1) (a)＋(b)を連結し、Bgl で切断し、185b.p.
生成物１を精製する。 (2) (1)＋(d)を連結し、Hind、Bgl で切断
し、そして、約500b.p.生成物２を精製する。 (3) (2)＋(c)＋(e)を連結し、生ずるプラスミドでE.
coliを転換する。 このようにして調整された代表的クローンは、
E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF Ｄ trp 11であ
る。このクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｆ LeIF Ｆを含有する断片は、LeIF Ｂおよび
LeIF Ｆの１から13までのアミノ酸が完全に相同
であるとを利用する再構成で直接的に発現するよ
う仕立上げることができる。上記のpHGH207よ
り、Pst およびXba 消化を経由し、つい
で約1050b.p.の断片を分離することにより、適当
な配列末端を有するtrpプロモーター含有断片ａ
をうる。第２の断片ｂは、プラスミドpHKY10
のPst およびBgl 消化より生ずる断片の
大きい方としてうる。（このPst−Bgl断片は
アンピシリン抵抗性遺伝子の一部および組合され
たプロモータ以外のテトラサイクリン抵抗性遺伝
子のすべてを含有している。従つて、プラスミド
pHKY10を用いなくても、その他の入手可能な
プラスミド、たとえば、プラスミドpBR322
（ATCC 31344）からもこの断片を調製すること
ができる。）断片ａはアンピシリン抵抗性をコー
ドする遺伝子の約半分を含有し；断片ｂは、その
遺伝子の残りを含有し、また、組合わされたプロ
モーター以外のテトラサイクリン抵抗性遺伝子の
すべてを含有する。断片ａおよびｂはT4リガー
ゼにより結合し、生成物を、Xba およびBgl
で処理して、二量化がおこらぬようにし、
trpプロモーター−オペレーターおよびテトラサ
イクリンおよびアンピシリン抵抗性の遺伝子を含
有する断片ｃとする。 約580b.p.の断片ｄはpLeIF ＦのAva およ
びBgl の消化で得られる。これは、LeIF Ｆ
の14から166までのアミノ酸に対するコドンを含
有する。 断片ｅ（49b.p.）は、pLeIF ＢのXba およ
びAva 消化で得られる。断片ｅはLeIF Ｆの
アミノ酸１から13をコードする。 断片ｃ、ｄおよびｅは、T4リガーゼの存在で、
トリプル連結する。それぞれ断片の接着末端は、
複合プラスミドが正しく環状となり、テトラサイ
クリン抵抗性遺伝子が成熟LeIF Ｆの遺伝子とあ
わせて、trpプロモーター−オペレーターの調節
下に入るようになつており、それで、望むプラス
ミドで転換した細菌は、テトラサイクリン含有プ
レート上で選択しうる。このように調製された代
表的クローンは、E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF
Ｆ trp1である。このクローンはATCCに寄託さ
れている。 LeIF Ｈ 完全LeIF Ｈ遺伝子を、成熟白血球インタフエ
ロンとして発現さすために、つぎのように配列し
うる。 １ プラスミドpLeIF ＨをHaeおよびRsa
消化に処して、シグナルペプチドアミノ酸10か
ら3′非コード領域までに及ぶ816b.p.断片を分離
する。 ２ この断片を変性し、DNAポリメラーゼの
Klenow断片（Klenow等、ProC、Natl.Acad.
Sci.U.S.A.65、168〔1970〕）により、合成デオ
キシリボオリゴヌクレオチドプライマー5′−
dATG TGT AAT CTG TCTを用いて修復
合成に処する。 ３ 得られた生成物をSau ３ ａで切断し、１
から150のアミノ酸を現わす452b.p.断片を分離
する。 ４ Sau ３ ａおよびPstでpLeIF Ｈを消化
し、得られた500b.p.断片を分離し、150番目の
アミノ酸からコード配列の最後までをコードす
る遺伝子をうる。 ５ 段階３および４で分離した断片を連結して、
断片 １ 166 met cys asp停止 ATG TGT…―｜…GAT TGA−…−Pst
Sau ３ ａ をうる。これはLeIF Ｈの166個のアミノ酸を
コードする。 ６ pLeIF Ａ trp25をXba で消化し、
DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、
生成物をPst で消化する。得られた大型断
片を分離し、段階５の生成物と連結させて発現
プラスミドとしうる。これは、E.coli Ｋ−12
株294または他の宿主細菌の転換に用いて、
成熟LeIF Ｈを発現しうる。 LeIF Ｉ Lawn等により構成されたヒトゲノムのフアー
ジλ Charon 4A組換えライブラリー（Cell，
15，1157（1978））を、上記引用のLawn等の方法
およびManiatis等、Cell 15，687（1978）の方法
により、白血球インタフエロンに関してスクリー
ニングした。cDNAクローンLeIF Ａに由来する
放射性LeIFプローブを用いて、約500000個のプ
ラークをスクリーニングした。６個のLeIFゲノ
ムクローンを選び出した。再スクリーニングおよ
びプラーク精製につづいて、これらのクローンの
うちのひとつλHLeIF2を選びさらに分析した。 上記の方法を用いて、他のプローブも、ヒトゲ
ノムからその他のLeIFクローンを分離するのに
有利に用いうる。ついで、これらは、本発明によ
るその他の白血球インタフエロン蛋白質を製造す
るのに用いうる。 １ クローンλHLeIF2の2000b.p.EcoR断片を、
EcoR部位においてpBR325中へ、サブクロ
ーン化した。得られたプラスミドLeIF Ｉを
EcoRで切断し、2000b.p.断片を分離した。
この2000b.p.EcoR断片にデオキシオリゴヌ
クレオチドdAATTCTGCAG（EcoR−Pst
コンバーター）を連結した。得られた生成物を
Pst で切断し、Pst 末端を有する2000b.
p.断片とした。これをSau96で切断した。ひと
つのPst およびひとつのSau96末端を有す
る1100b.p.断片を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｃ trp35をPst およ
びXba で消化した。大型断片を分離した。 ３ pLeIF Ｃ trp35よりの小型Xba −Pst
断片をXba およびSau96で消化した。
40b.p.Xba−Sau96断片を分離した。 ４ 段階１，２および３より分離した断片を連結
して、pLeIFtrp1発現プラスミドとした。こ
のクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｊ １ プラスミドpLeIF Ｊは先に述べたpLeIF Ｉ
と同様にLawn等により構築されたヒトゲノム
のフアージλCharon4A組換えライブラリー
（全ヒトDNAを消化し、フアージλベクターに
挿入したもの）から得られ、LeIF Ｊ遺伝子配
列を含有するヒトゲノムDNAの3.8キロベース
Hind断片を含有する。このプラスミドから
760b.p.Dde−Rsa断片を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｂ trp7をHindおよび
Dde で切断し、340b.p.Hind−Dde断
片を分離した。 ３ プラスミドpBR322をPst で切断し、
DNAポリメラーゼとインキユベートし、平
滑末端とし、（Klenow断片）、ついでHindで
消化した。大型（約3600b.p.）断片を分離し
た。 ４ 段階１，２および３で分離した断片を連結し
て、発現プラスミドpLeIF Ｊ trp1とした。
このクローンはATCCに寄託されている。 Ｍ 精製 細菌抽出物中の白血球インタフエロン含有量
は、つぎのようにして、増加させうる。 １ ポリエチレン−イミン沈殿。ここで、インタ
フエロンを含めた細胞蛋白質の大部分は上清に
留まる。 ２ 硫酸アンモニウム分画。ここで、インタフエ
ロンは、55％飽和硫酸アンモニウムの溶液中か
ら析出する。 ３ 硫酸アンモニウムペレツトを0.06Mリン酸カ
リウム、10mM Tris−HCl、PH7.2に懸濁さ
せ、25mM Tris−HCl、PH7.9に対して透析す
る。インタフエロン活性は溶液中に残る。 ４ 上記の上清をPH8.5に調整してDEAE−セル
ロースカラムでクロマトグラフイーを行う
（25mM Tris−HCl、PH8.5中０から0.2M
NaClの直線勾配で溶出）。 ５ Cibachrome Ｂ lue−Agaroseまたは
hydroxylapatiteに吸着させ、1.5MKClまたは
0.2Mリン酸塩で溶出する（必要により実施）。 ６ Sephadex Ｇ−75カラムで分子をサイズ分
けする。 ７ PH5.0の25mM酢酸アンモニウム中CM−セル
ローズ上陽イオン交換クロマトグラフイーを行
う。酢酸アンモニウム勾配（0.2M酢酸アンモ
ニウムまで）で展開する。 上記の方法で＞95％純度の生成物を得る。 この物質はまた、サイズ排斥クロマトグラフイ
ー、逆相（RP−８）高圧液体クロマトグラフイ
ー、または固定化抗インタフエロン抗体上のアフ
イニテイクロマトグラフイーで精製しうる。 別法として、上記の段階４よりの物質を
Milstein、Scientific American 243、66（1980）
記載のように調整したモノクロナル抗体カラムに
加え、0.2M酢酸、0.1％Tritonおよび0.15MNaCl
で溶出しうる。 別様の有利な具体例として、上記操作で製造し
た白血球インタフエロンをつぎの段階で精製しう
る。 １ 発現された白血球インタフエロンを含有する
凍結細胞塊を、手作業または適当な粉砕装置で
砕く。部分的にとけた細胞を、PH7.5−8.0に調
整した0.1M Tris、10％（ｗ／ｖ）スクロー
ス、0.2MNaCl、5mMEDTA、0.1mM PMSF
および10−100mM MgCl2含有緩衝液Ａの４容
量中に懸濁させる。懸濁液は約４℃に保つ。 懸濁液は、約6000psiでホモジナイザーを通
し、ついで、1000psi以下で２度目を通す。両
方の通過よりのホモジナイザーからの流出液
は、永浴中で冷却する。 ２ ホモジネートにポリエチレン−イミンをゆつ
くりと添加して、約0.35％濃度とし、約30分放
置する。固型物は遠心または濾過で除去する。
この段階は、温度を調節するかまたは、上清
（濾液）を10℃より低く保つように十分にすみ
やかに実施する。上清（濾液）を限外濾過で濃
縮して、もとの容量の約1/10とする。粒状物ま
たはにごりを認めたら、ミクロポアメンブレン
のような適当なフイルターで除去しうる。 ３ 澄明化溶液は、５−８cm／時間（たとえば、
直径2.6cmのカラムで、25−40m1／時間）でモ
ノクロナル抗体カラムに直接流す。ついでこの
カラムを約10カラム容量の20mM Tris−HCl、
PH1.5−8.5（NaCl（0.5M）およびTriton Ｘ−
100（0.2％）または同等の表面活性剤含有）で
洗う。洗つたあと、このカラムに0.15MNaCl
およびTriton Ｘ−100（0.1％）または同等の表
面活性剤を含有する約10カラム容量の溶液を通
す。このカラムをTriton Ｘ−100（0.1％）また
は同等の表面活性剤を含有する0.2M酢酸で溶
出する。モノクロナル抗体カラムよりの蛋白質
ピーク（UV吸収またはその他の方法で測定）
を集め、1N NaOHまたは1.0M Tris塩基でPH
を約4.5に調整する。 ４ プールされたインタフエロンピークを、適当
な緩衝液たとえば酢酸アンモニウムPH4.5
（50mM）で平衡させたWhatman CM52セル
ロースまたは同等の陽イオン交換体に加える。
加えたあと、カラムを平衡のための緩衝液で洗
い、流出液のUV吸収がたいらとなるに至ら
せ、カラムからはほとんど蛋白質が溶出しない
状態とする。カラムをついで、25mM酢酸アン
モニウム／0.12M塩化ナトリウムまたはインタ
フエロンの回収を最高とする組合わせで溶出
し、満足な外観および溶解性を有する凍結乾燥
ケーキとする。 上記したこの有利な具体例におけるモノクロ
ナル抗体は、Staehelin等がProc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.78，1848−52（1981）に記載した方
法で調製しうる。モノクロナル抗体は、下記す
るように、精製し、Affigel−10に共有結合さ
せる。 腹水液よりのモノクロナル抗体の調製および精製 雌Balb／ｃマウス５頭のそれぞれに、対数増
殖期の中間でとつたハイブリドーマ
（hybridoma）細胞の５−10×106個を接種した。
マウスの生成する腹水液から得た約５×106個の
生育しうる細胞を、10または10頭より多くのマウ
スのそれそれに腹腔内接種した。この腹水液を各
マウスより反復（２から４回）採取した。ひとつ
の群のマウスからつぎの群のマウスに、３回ま
で、移しかえおよび採取を行なつた。それぞれの
移しかえ毎に、採取腹水液をプールした。 低速遠心（500−1000×ｇ）で15分間処理し、
腹水液より細胞および残渣を除いた。ついで
18000rpmで90分遠心した。上清を凍結させマイ
ナス20℃に貯蔵した。融解させてから、
35000rpmで90分間遠心し、さらにフイブリンお
よび粒状物を除いた。各移しかえごとの腹水液の
バツチについて、固体相抗体結合試験
（Staehelin等、上記引用文献）により特異抗体活
性を試験し、満足ならばプールした。 プールされた溶液中の蛋白質濃度は、１mgの蛋
白質が1.0cmの厚さのキユベツトで280nmで1.2の
吸光値を示すという近似法で測定した。高濃度の
抗体を有する腹水液は30−35mg蛋白質／mlを含有
する。これは、４−７mg特異抗体／mlに相当す
る。この液体をPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、
PH7.3、0.15M NaCl）で希釈し、10から12mg／ml
の蛋白質濃度とした。 希釈溶液の各100mlに、室温で飽和した硫酸ア
ンモニウム溶液90mlを、０℃ではげしくかくはん
しながら添加した。懸濁液を40から60分間氷中に
保つた。ついで、４℃で、10000rpmで15分遠心
した。上清をけいしやして除き、十分に液を切つ
た。蛋白質塊を0.02M Tris HCl（PH7.9）／
0.04M NaCl（緩衝液）に溶解した。蛋白質溶
液を、100容量の緩衝液に対して、室温で16か
ら18時間透析した。その間、少なくとも１度緩衝
液を交換した。透析溶液を15000rpmで10分間遠
心し、不溶物を除いた。腹水中の全蛋白質の最初
の量の約30から35％が、280nmの吸光値より概算
して採取された。 次いで、１mlについて30−40mgの蛋白質を含有
する溶液をBufferで平衡させたDEAE−セルロ
ースカラムに加えた。添加する蛋白質１グラムに
ついて少なくとも100mlのカラム床容量とした。
0.02M Tris HCl PH7.9中NaClを0.04Mから
0.5M NaCl濃度に直線状にNaCl濃度を変化させ
て、カラムより抗体を溶出した。0.06から0.1M
NaClのピーク分画をプールし、等容量の硫酸ア
ンモニウム飽和溶液（室温）を加え沈殿遠心し、
濃縮した。蛋白質塊を0.2M NaHCO3（PH約
8.0）／0.3M NaCl（緩衝液）に溶解し、室温
で、同じ緩衝液（３度交換）に対して透析した。
透析した溶液を20000×ｇで15分遠心し、不溶物
を除いた。蛋白質濃度を緩衝液で20から25mg／
mlとした。 免疫吸着剤の調製 Affigel−10（Bio Rad Laboratories、
Richmond、California）をグラスフイルター上
で氷冷イソプロパノールで３度洗い、ついで氷冷
蒸留水で３度洗つた。ゲルスラリー（冷水中約50
％）をプラスチツクチユーブに移し、短時間遠心
して沈降させた。上清をアスピレーターで除き、
パツクされたゲルを等容量の精製抗体溶液と混合
し、４℃で５時間、長軸が円状に廻転するように
回転した。反応後、ゲルを遠心し、緩衝液
（0.1M NaHCO3／0.15M NaCl）で２度洗い、
非結合抗体を除いた。洗液を合併し蛋白質を測定
すると、90％以上の抗体がゲルに結合していた。 未反応の部分をふさぐために、ゲルを等容量の
0.1Mエタノールアミン・HCl（PH８）と混合し、
長軸を円こ状に回転させて室温で60分処理した。
ゲルスラリーよりPBSで洗浄して反応剤を除き、
４℃で0.02％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムの存
在でPBSに貯蔵した。 Ｎ 非経口投与 LeIFは、抗腫瘍または抗ウイルス治療を要す
る患者に非経口投与しうる。また、免疫抑制状態
を示す患者にも投与しうる。投与量および投与割
合は、ヒト由来の物質について現在臨床的に行な
われているのと同様にする。たとえば、約（１−
10）×106単位／日で１％より大の純度の場合に
は、たとえば５×107単位／日に及びうる。 非経口投与用の形態とした本質的に均一な細菌
性LeIFの適当な投与形態では、たとえば、２×
108単位／mgの比活性のLeIF3mgを25mlの5Nヒト
血清アルブミンに溶解し、この溶液を生物学的フ
イルターを通し、濾過溶液を無菌的に100本のび
んに分けて、非経口投与に適当なように、１本が
６×106単位純インタフエロンを含有するように
する。これらのびんは、使用前は冷所（−20℃）
に保つのが望ましい。 本発明の化合物は、医薬として有用な組成物を
調整するための既知の方法に従つて製剤化でき
る。その際、このポリペプチドは、医薬として許
容されうる担体ビヒクルと混合する。適当なビヒ
クルおよびそれらの製剤化については、E.W.
MartinによるRemington's Pharmaceutical
Sciencesに記載されているとおりである。これ
を、本明細書の参考分献として引用する。これら
の組成物では、インタフエロン蛋白質の有効量と
適当な量のビヒクルとをあわせて、宿主に対して
効果的な投与とするに適当な、医薬として許容さ
れうる組成物とする。ひとつの有利な投与形態は
非経口投与である。 本発明の白血球インターフエロンＡ（LeIF Ａ）
に関する急性毒性実験 (A) マウス、ラツト、白イタチおよびウサギにお
ける筋肉内投与急性毒性 (1) 製剤No.１（凍結乾燥物） 【表】 LeIF Ａの凍結乾燥調製物（製剤No.１）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）、ラツト（５匹／各性）お
よび白イタチ（３匹／各性）に30×106単位／Kg
の投与量で筋肉内投与した；この投与容量はマウ
スで５ml／Kg、ラツトで2.0ml／Kgおよび白イタ
チで1.67ml／Kgであつた。対照マウス（10匹／各
性）、ラツト（５匹／各性）および白イタチ（３
匹／各性）には等量および等投与容量の賦形剤を
与えた。 投与処置動物を異常微候および致死について投
与後の31日間観察した。体重を投与日および処置
後の７日目、14日目、21日目および28日目に記録
した。 処置後の７日目にカゴの中で死亡しているのが
見い出された一匹のLeIF Ａで処置した雌のラツ
トを除いて、この実験における全ての動物は31日
間の観察期間、生存した。この雌ラツトの死亡は
LeIF Ａによる処置とは無関係であると考えられ
る。 この実験の期間中、いづれの動物にも異常微候
は見られなかつた。雌の白イタチを除いて、全群
の動物で正常な体重増加が見られた。処置後28日
目の雌の白イタチの平均体重はLeIF Ａ処置群
（−６％）および賦形剤処置群（−12％）で僅か
に減少した。 (2) 製剤No.２（液体） 【表】 LeIF Ａの液体非経口製剤（製剤No.２）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）、ラツト（５匹／各性）お
よびウサギ（２匹／各性）にそれぞれ500×106単
位／Kg、100×106単位／Kgの投与量で筋肉内投与
した；この投与容量はマウス、ラツトおよびウサ
ギについてそれぞれ10ml／Kg、２ml／Kgであつ
た。別群のマウス（10匹／各性）、ラツト（５
匹／各性）およびウサギ（２匹／各性）を対照と
して用い、等量および等投与容量の賦形剤を与え
た。 投与処置動物を致死および異常微候について14
日間観察した。体重は投与日および処置後の７日
目および14日目に記録した。 投与群のいづれにも死亡は生じなかつた。異常
の微候はなく、そして体重増加が試験を通じてみ
られた。 (B) マウスおよびラツトにおける静脈内投与急性
毒性 LeIF Ａの凍結乾燥調製物（製剤No.１）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）およびラツト（５匹／各
性）に３×106単位／Kgの投与量で静脈内投与し
た；5.0ml／Kgおよび2.0ml／Kgの投与容量をマウ
スおよびラツトについてそれぞれ使用した。対照
マウス（10匹／各性）およびラツト（５匹／各
性）には賦形剤を等量および等投与容量で与え
た。 投与処置動物は投与後の14日間、異常微候、静
脈刺激および致死について観察した。体重を投与
日および処置後の７日目および14日目に記録し
た。 全動物が14日間の観察期間中生存していた。い
づれの動物にも異常微候は見られず、そして体重
増加がマウスおよびラツトの全群に見られた。ラ
ツトでは静脈刺激は見られなかつた。マウスで
は、注射部位周辺の暗色化域がLeIF Ａまたは賦
形剤のどちらかの注射後の４時間〜３日に見られ
た。静脈刺激の微候は投与後６〜７日でおさまつ
た。 (C) マウス、ラツトおよび白イタチにおける皮下
投与急性毒性 LeIF Ａの凍結乾燥調製物（製剤No.１）をマウ
ス（10匹／雌雄各性）、ラツト（５匹／各性）お
よび白イタチ（３匹／各性）に30×106単位／Kg
の投与量で皮下投与した；投与容量はマウス、ラ
ツトおよび白イタチに対してそれぞれ5.0ml／Kg、
2.0ml／Kgおよび2.0ml／Kgである。対照マウス
（10匹／各性）、ラツト（５匹／各性）および白イ
タチ（３匹／各性）には等量および等投与容量で
賦形剤を与えた。 投与処置動物は異常微候および致死について14
日間観察した。体重を投与日および処置後の７日
目および14日目に記録した。 いづれの動物にも致死または処置関連異常微候
は見られなかつた。正常な体重増加が動物の全群
に見られた。 (D) マウスにおける経口、静脈内および筋肉内投
与急性毒性 (3) 製剤No.３（液体） 【表】 【表】 LeIF Ａの液体非経口投与用製剤（製剤No.３）
をマウス（10匹／各性／投与レベル）に経口、静
脈内および筋肉内投与した。対照群のマウス（10
匹／各性）には無菌生理食塩水中の0.5％ヒト血
清アルブミンを等量および等投与容量で各投与経
路により与えた。 ３種の投与経路によるいづれの投与後にも、マ
ウスの致死は生じなかつた。処置群マウスを対照
群マウスと区別できるような異常微候も体重増加
もしくは剖検所見も見られなかつた。 【表】
第１図は可能性のあるLeIFプラスミドと 32p
ラベル合成デオキシオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリド化を示すオートラジオグラムである。第２
図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型（Ａか
らＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成
をコードする遺伝子の構築を示す。第４図および
第５図はLeIF Ｂ成熟白血球インターフエロンを
発現するために用いられる２つの遺伝子断片の制
限地図を示す。
ラベル合成デオキシオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリド化を示すオートラジオグラムである。第２
図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型（Ａか
らＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成
をコードする遺伝子の構築を示す。第４図および
第５図はLeIF Ｂ成熟白血球インターフエロンを
発現するために用いられる２つの遺伝子断片の制
限地図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト白血球由来の遺伝子の発現により得るこ
とができる成熟ヒト白血球インタフエロンであつ
て、165−166個のアミノ酸を有し、部分アミノ酸
配列Cys−Ala−Trp−Glu−Val−Val−Arg−
Ala−Glu−Ile−Met−Arg−Serを含み、かつ
114位にアミノ酸Asp、GluまたはValの一つを有
し、このインタフエロンの第一番目のアミノ酸の
Ｎ末端にメチオニンが結合している場合は、166
−167個のアミノ酸を有し、かつ115位にアミノ酸
Asp、GluまたはValの一つを有することを特徴
とする成熟ヒト白血球インタフエロン。 ２ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＡ（LeIF Ａ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ３ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＢ（LeIF Ｂ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ４ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＣ（LeIF Ｃ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ５ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＤ（LeIF Ｄ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ６ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＦ（LeIF Ｆ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ７ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＨ（LeIF Ｈ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ８ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＩ（LeIF Ｉ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 ９ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
血球インタフエロンＪ（LeIF Ｊ）である特許請
求の範囲第１項のインタフエロン。 １０ 活性成分として成熟ヒト白血球インタフエ
ロンＡ（（LeIF Ａ）を含有する抗ウイルス組成
物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16498680A | 1980-07-01 | 1980-07-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5779897A JPS5779897A (en) | 1982-05-19 |
| JPS6361960B2 true JPS6361960B2 (ja) | 1988-11-30 |
Family
ID=22596929
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56103123A Granted JPS5779897A (en) | 1980-07-01 | 1981-07-01 | Polypeptide containing amino acid arrangement of aged human corpuscle interferone |
| JP59253935A Granted JPS60227694A (ja) | 1980-07-01 | 1984-11-30 | ヒト成熟白血球インタフエロンのアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法 |
| JP25393784A Granted JPS60221094A (ja) | 1980-07-01 | 1984-11-30 | 発現ビヒクル |
| JP59253936A Granted JPS60221093A (ja) | 1980-07-01 | 1984-11-30 | Ｄｎａ配列 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59253935A Granted JPS60227694A (ja) | 1980-07-01 | 1984-11-30 | ヒト成熟白血球インタフエロンのアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法 |
| JP25393784A Granted JPS60221094A (ja) | 1980-07-01 | 1984-11-30 | 発現ビヒクル |
| JP59253936A Granted JPS60221093A (ja) | 1980-07-01 | 1984-11-30 | Ｄｎａ配列 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (4) | JPS5779897A (ja) |
| MW (1) | MW2581A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA814375B (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| WO1984001149A1 (fr) * | 1982-09-22 | 1984-03-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Nouveau polypeptide et son utilisation |
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| GB8303383D0 (en) * | 1983-02-08 | 1983-03-16 | Biogen Nv | Sequences recombinant dna molecules |
| ATE89005T1 (de) * | 1985-02-05 | 1993-05-15 | Synergen Biolog Inc | Rekombinantes vektorsystem fuer metalloproteinase- inhibitorsequenz und dessen verwendung und herstellung nach dem rekombinant-dns-verfahren. |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| JPS62100292A (ja) * | 1985-10-28 | 1987-05-09 | Sumitomo Chem Co Ltd | バチラス・チユリンゲンシス・アイザワイｉｐｌ株の殺虫性蛋白遺伝子 |
| JPS63242397A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-07 | Kubota Ltd | 廃水処理方法 |
| JPH0753113B2 (ja) * | 1987-05-21 | 1995-06-07 | 農業生物遺伝子構造解析技術研究組合 | キュウリモザイクウイルスの外被蛋白質をコ−ドする遺伝子 |
| JPH0753114B2 (ja) * | 1987-07-06 | 1995-06-07 | 農業生物遺伝子構造解析技術研究組合 | キユウリモザイクウイルスの３ａ蛋白質をコ−ドする遺伝子 |
| FR2825716B1 (fr) | 2001-06-11 | 2004-09-24 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 7 |
-
1981
- 1981-06-26 ZA ZA814375A patent/ZA814375B/xx unknown
- 1981-06-30 MW MW2581A patent/MW2581A1/xx unknown
- 1981-07-01 JP JP56103123A patent/JPS5779897A/ja active Granted
-
1984
- 1984-11-30 JP JP59253935A patent/JPS60227694A/ja active Granted
- 1984-11-30 JP JP25393784A patent/JPS60221094A/ja active Granted
- 1984-11-30 JP JP59253936A patent/JPS60221093A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MW2581A1 (en) | 1982-10-13 |
| JPS6361920B2 (ja) | 1988-11-30 |
| ZA814375B (en) | 1982-07-28 |
| JPS6363198B2 (ja) | 1988-12-06 |
| JPS60221093A (ja) | 1985-11-05 |
| JPS60227694A (ja) | 1985-11-12 |
| JPS60221094A (ja) | 1985-11-05 |
| JPS5779897A (en) | 1982-05-19 |
| JPS6363199B2 (ja) | 1988-12-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0043980B1 (en) | Mature human leukocyte interferon a, process for its microbial preparation, intermediates therefor and compositions containing it. | |
| KR860001558B1 (ko) | 인터페론의 제조방법 | |
| JP2557053B2 (ja) | 腫瘍壊死因子の精製、製造および使用法 | |
| JP2515308B2 (ja) | ヒト免疫インタ−フエロン | |
| EP0285448B1 (en) | Leukaemia inhibitory factor | |
| KR920007439B1 (ko) | 하이브리드 인간 백혈구 인터페론 | |
| US4801685A (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L | |
| JPH0240080B2 (ja) | ||
| JPS6361920B2 (ja) | ||
| US4810645A (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L | |
| KR870000510B1 (ko) | 형질전환된 미생물의 제조방법 | |
| KR870000511B1 (ko) | 발현 비히클의 제조방법 | |
| FI82713C (fi) | Plasmid, som foermaor expressera humant moget leukocytinterferon, foerfarande foer dess framstaellning samt dess anvaendning vid framstaellning av humant leukocytinterferon. | |
| KR910009901B1 (ko) | 하이브리드 인간 백혈구 인터페론 | |
| IL63197A (en) | Intraferons for mature human oocytes, their preparation and preparations containing them | |
| CS273182B2 (en) | Method of expressive vector production capable to give mature human leucocytic interferon in transformed strain of escherichia coli by means of expression |