JPH03205402A - リグニン配糖体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業］二の利用分野〕 本発明は新規なリグニン配糖体およびその用途に関する
。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題］現有の抗癌
剤の殆どは、ＤＮＡ合戒あるいは細胞分裂を抑制する作
用を持つが、これは正常細胞に対しても同等な作用を示
す。わずかに癌細胞は細胞分裂が速く、正常細胞は遅い
と言う差を利川して、癌細胞に、より多くの障害を与え
ることで治療が或り立っている。正常細胞が受けた障害
＋ｆ、副作用として表現され、生体がその副作用にどこ
まで耐えられるかが、癌治療の上で重要なポイントとな
っている。

以上の様に、本来の癌治療は癌細胞の生物学、生化学な
どに根ざすべきものであるが、現実に｛．よその様な癌
治療法にまで結びついていない。

さて、癌の原因と言うと発癌物質、放射線およびウイル
スの３つが古くより言われてきた。その内、癌ウイルス
の持つ遺伝情報により細胞が癌化することが明らかにな
り、ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　（癌遺伝子）なる言葉が生ま
れた。その後、癌遺伝子は正常細胞にも存在し、それが
ある時スイッチオンされて、細胞が癌化すると言う仮説
が立てられたのである。

これは、時の流れど共に発展し、今日その大筋は正しか
ったことを誰しも認めるところである。

一方、高等動物のゲノムには癌遺伝子となり得るｐｒｏ
ｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅは５０種以上存在し、それらは
正常細胞の増殖や分化に重要な生理機能を果たしている
。それ故、細胞増殖や癌の制御の遺伝子のレベルもしく
は遺伝子産物のレベルでのコントロールの可能性が生ま
れて来た。本発明は癌遺伝子発現の段階を、特異的阻害
剤で抑制する癌治療剤を開発することにある。挿入され
たマウス乳癌ウイルス（ｉｉ）ＩＴＶ）遺伝子の発現が
コルチコイドにより制御されているマウス乳癌細胞を用
い、ＭＭＴＶ遺伝子発現にはクロマチンタンパク質での
脱ポリＡＤＰ−リボース反応が引金となっていることが
見出されている。即ち、ポリＡＤＰ−リボースが分解さ
れることにより、その部分のクロマチン構造の局所変化
が、最終的にはＲＮＡボリメラーゼのプロモーターへの
結合と転写促進につながると考えられている。（ジャー
ナル・バイオロジカルケもストリー、２５８：１５３７
１　　（１９８３）］。

そこで、発明者はポリＡＤＰ−リボースの分解を阻止す
れば、癌遺伝子が活性化されなくなることが予想された
ため、ＡＤＰ−リボースの分解に関与する酵素であるポ
リ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼをヒト胎盤
より分離精製し、本酵素に対し阻害作用をもつ化合物を
検討した結果、幾つかの天然化合物に強い阻害活性を見
出した。

また、この化合物にはｌｌｆ！瘍壊死因子（ＴＮＦ）の
もつ細胞殺傷作用と細胞分化誘導作用を増強する全く新
しい活性があることを見出し、この増強効果がＴＮＦ受
容体への”ＦＮＦの結合親和性を高めることに起因する
ことも突き止めた。さらに、この化合物にはマクロファ
ージからのＴＮＦ、インターロイキンｌの産生を誘導ず
る作用があることを見出した。そして、さらに検討を進
め、ポリ（ＡＤＰ−リホース）グリコヒトロラーゼ明害
、及びＴＮＦをはしめとするサイトカインの誘導および
それらの作用増強効果に基づく抗癌作用を有する医薬と
して、使用に耐え得る新規化合物を見出し、本発明を完
威した。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は次の要旨を有するものである。

■　以下に示す性質を有するリグニン配糖体（ｉ）リグ
ニンおよび多糖類が結合 （ｉ］）分子量は６００００−１４００００（山）リグ
ニンと多ｗＭ類の結合比は１：１〜２０１（分子比） （ｉｖ）多糖類はウロン酸６０〜７０％、中性１！３０
〜４０％で構或されている。

■　リグニン配糖体を主成分とするポリ　（ＡＤＰ−−
リボース）グリコヒドロラーゼ阻害剤。

■　リグニン配糖体を主成分とするサイト力イン、すな
わち腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）作用増強剤。

■　リグニン配糖体を主或分とするサイトカイン（ＴＮ
Ｆ，ＩＬ−１）の産生誘導剤。

■　リグニン配糖体を主或分とする（ＴＮＦなどのサイ
ト力インとの併用による）癌免疫療法剤。

本発明のリグニン配糖体は、リグニンとＩｌｔ　（多ｍ
ｌ）との結合体である。リグニンと糖（多ｖＭｉｌＱ）
との結合はエーテル結合による。その結合比は、リグニ
ン：構或糖の重量比で１：３〜５程度が例示される。ま
た、リグニンと多糖体との分子比で１〜２０：１程度が
例示される。

リグニン配糖体の糖部分はウロン酸および中性糖より構
戒される。その組威としてはウロン酸６０〜７０％、中
性＃Ｍ３０〜４０％程度が例示される。

中性糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノー
ス、アラビノースが挙げられる。その糺ｙ戊としてはグ
ルコース１５〜２０１１０１　％、ガラクトース２５〜
３０ｍｏｌ　％、マンノース３５〜５０ｍｏｌ　％、ア
ラビノース１０＝１５ｍｏｌ％程度が例示される。

これらの構成糖は全体としてＩ！鎖構造を取っており、
多糖類を形或する。

リグニン配糖体の分子量はｓｏｏｏｏ〜１４００００程
度であり、多糖類部分の分子量は４万〜１０万程度であ
る。またリグニン部分は分子ｆｆｉ１０００〜１０００
０程度を有する。

本発明リグニン配糖体は、元素的にはＣ原子３５〜４５
重量％、Ｈ原子１〜１０重量％、０原子４５〜６４重量
％程度が例示される。

本発明のリグニン配糖体は以下のように調製される。

出発原料としては茶（葉・枝）、紫根、三豆根、朝鮮人
参、松（かさ・葉）、草みつき（幹）等が挙げられる。

原料を各種溶媒（例えば、熱水、エタノール、アセ１・
ン等）で処理する。処理時間は１〜１５時間程度である
。処理済み原料をアルカリ性溶液（０．１〜ＩＮ水酸化
ナトリウム、アンモニウム等）で抽出する。抽出液をｐ
Ｈ４〜６に調整し、１５倍量のエタノールを添加して沈
澱画分を回収する。沈澱画分をゲル濾過で精製して活性
部分を回収する。

こうして得られたリグニン配糖体は透析、遠心分離、凍
結乾燥等を施すことができる。

本発明のリグニン配糖体は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）
グリコヒドロラーゼ阻害作用、及びＴＮＦの産生誘導お
よびその作用の増強効果を有し、ヒトを含む啼乳動物（
ヒト、ウマ、イヌ、マウス、モルモノｌ・、ラット等）
に対してポリ　（ＡＤＰリボース）グリコヒドロラーゼ
阻害活性、及び゛ＰＮＦの産生誘導およびその作用の増
強活性を有し、ボリ（ＡＤＰ−リボース〉グリコヒド０
ラーゼ阻害剤、及びＴＮＦの産生誘導およびその作用増
強活性剤として悪性腫瘍、ウイルス性感染症の治療、予
防に有用なものである。

本発明のリグニン配糖体は、経口的または非経口的に投
与される。

リグニン配糖体は、それ自体または製薬］二許容される
キャリアどの塾薬製剤の形で投与される。

当該製剤は、自体既知の方法によって調製される。

剤型どしては、錠剤、カプセル剤、散剤、坐剤、注射剤
等が例示される。

リグニン配糖体は、例えば、経口投与の場合、通常０．
　１　〜］．　Ｏ　Ｏ　ｍｇ／ｋｇ体重程度を］　ＩＥ
Ｉ　Ｉ　ｆｆｊ＋または数回にわたって投与されるが、
年齢、体重、および／または処置すべき病状の重度や治
療に対する反応によりその投与量は変わりうる。

毒性実験 本発明のリグニン配糖体のマウスに対する毒性は、いず
れも経口投与でＬＤ５ｏ値が１００■／ｋｇ以上であり
、投与量にくらべてＬＤ，。値が極めて大きく、安全域
の広い化合物である。

〔実施例］ 実施例１ 以下の処理に｛１ずこどによってリグニン配糖体を抽出
した。

例 松かさ ↓去ソＫ抽」旦　　　　煮沸時間吐松かさの量、また？
■８ エタノール抽出した松かさを ？■ユ■ 抽出液に等量のエタノールを ↓遣（Ｉ訟城 透析後の溶液を凍結乾燥にて 実施例２ ？グニン配糖体の糖部分、グリコン（ｇｌｙｃｏｎｅ）
及び非糖部分、アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の構造
の特徴を検討するために、本配糖体をメタノリシス（メ
タノールー塩酸分解）、あるいは亜塩素酸塩（ＮａＣｌ
Ｏ■）法によりグリコンとアグリコンに分離して分析を
行った。その結果は次の通りである。

〔グリコンの分析〕

分子Ｉ：セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４
Ｂゲル濾過法により６００００〜ｉｏｏｏｏｏ 糖組或１　　　　　　　（％）　　　（全重量％）ウロ
ン酸　　　　　６３，４　　　　４８．８中性糖　　　
　　　３６，６　　　　２８．２グリコンの２／３がウ
ロン酸であるという特徴を持つ。

中性糖の組威”　　　　　（ｍｏｌ　％）グルコース　
　　　　　１８２ ガラクトース　　　　　２７．４ マンノース　　　　　　　４０．２ アラビノース　　　　　１３．８ フコース　　　　　　　　　Ｏ 中性糖としてはグルコース、ガラクトース、マンノース
、アラビノースを含むがフコースは含まない。

ａ）ウロン酸はカルバゾール法、中性糖はフェノール硫
酸法で定量した。

ｂ）中性糖の組或はメタノリシスで生威するメチルグリ
コシドをトリメチル化した後ガスクロマトグラフィーで
分析した。

〔アグリコンの分析〕

分子量：セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　Ｃ　
Ｌ　−　６　Ｂゲル濾過法により４０００±２０００ 赤外吸収分析（ＩＲ） ＩＲはＫＢｒディスクにより測定した。

その結果、３５００〜３７００ｃｍ−’範囲に３４００
ｃｒＶ’にピークをもつ吸収が検出された。この吸収は
フェノール性水酸基の存在を示す。１６００ｃｍ付近の
吸収は芳香族二重結合を示す。１７００ｃｍ付近にカル
ポニル基の吸収がないことよりタンニンに見られるよう
なエステル結合はなく、リグニンに見られるようなエー
テル結合で重合している化合物であることを示す。

指紋領域も含めて全体のスベクＩ・ラムはリグニン（ア
ルカリ）と極めて類似している。

以上のＩＲスペクトルの結果から本配糖体のアグリコン
はタンニン様化合物ではなく、リグニン様化合物である
と結論される。

紫外吸収（ＵＶ）分析 ２８０ｎｍに最大吸収値、２６０ｎｍに最小吸収値をも
つ。

２８０／２６０＝１．０２ リグニンも同様のＵＶスペク１・ルをもつ２８０／２６
０＝１．０３ ＵＶスペクトルにより芳香族（おそらくフェノール）の
存在を示す。

電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分析 リグニンと同様にｇ＝２．００４ＥｓＲシグナルが検出
されることより安定なフリーラジカルを有する構造体を
含むことを示す。なお、タンニンにはこの様なシグナル
は見られない。

（リグニン配糖体の分析〕 リグニン配糖体全体どしての特徴 元素分析　　　（ｗｅｉｇｈｔ％） Ｃ　　　　　　　３　９．　８　３ Ｈ　　　　　　　　４．４１ ０　　　　　　５　５．　７　３ Ｎ　　　　　　　　０．　０　３以下 Ｓ　　　　　　　　Ｏ 窒素、硫黄を含有しないことより蛋白、硫酸基を含まず
セフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　Ｃ　Ｉ−−４
　Ｂゲル濾過法による分子量は約１１万である。

リグニンと糖の結合比は重量比で約１＝４である。

従って本配糖体は、糖部分（グリコン）としてウロン酸
を全重量の約５０％も含有するという特徴をもっている
。中性糖どしてはグルコース、ガラク１・−ス、マンノ
ース、アラビノースを含む。

非糖部分（アグリコン）はリグニンより或るという特徴
を有する。

本配糖体は糖の還元末端ラクトール水酸基がリグニンの
アルコール性またはフェノール性水酸基と脱水縮合して
エーテル状に結合した○−配糖体である。また、リグニ
ンと糖の結合比が重量比で約ｌ：４であり、特に、酸性
糖のウロン酸を多く含有する、分子量約ｌ１万のリグニ
ン配糖体（アグリコンの特徴で分類した場合）である。

木配糖体の推定構造モデルは図面に示す通りである。

試験例ｌ． ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒ１・゛ロラーゼに対
する阻害効果 アンセイ用ハソファ−（０．０１％ウシ血清アルブミン
−１０ｍＭメルカプＩ・エタノール−５　０　ｍＭカリ
ウム・リン酸、ｐ　Ｈ　７．　０　）に、″Ｈ−（ＡＤ
Ｐリボース）　ｎ＋Ｉ５　　を加え、その２７μＣに被
験物貿４−３よびヒト胎盤より調製した核由来、ポリ（
ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼン容液を加えて
全量３０μ℃とした後、３７゜Ｃにて１時間インキユヘ
ーションした。その後、ＤＥ８１濾紙に反応液を吸収さ
せ、水、エタノール、アセ１・ンで濾紙を洗浄した後、
それを乾燥させ、液体ジンチレｌ５ 一ションカウンターにて、未反応基ｔ　３Ｈ−（　ＡＤ
Ｐ−−リボース）を測定し、本酵素に対する試験物質の
阻害作用を検討した。その結果を示したのが表１であり
、用いた被験物質の全てが、用量依存的にポリ（ＡＤＰ
−リボース）グリコヒトロラーゼを阻害した。

表１ リグニン配糖体のポリ（ＡＤＰ−リボース）グルコヒド
ロラーゼ阻害活性 試験例２ 遺伝子発現に対する阻害効果 本試験で用いた遺伝子発現系は、＃ａ質コルチコイＩＪ
感受性遺伝子である、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）
遺伝子を持つ、マウス乳癌細胞である３４１株を使用し
た。本細胞は、糖質コルチコイド存在下において、３５
ＳＲＮＡと、さらにスプライシングを受けた２４ＳＲＮ
Ａの２種類を発現する。この発現はｅｎｖ部分のｃＤＮ
Ａを用いることにより検出することが出来る。そこで、
３４１株に被験物質を３０μｇ／成となる様に加え、３
７゜Ｃ、３０分間インキユベーションし、次に、その系
に１０−’Ｍとなる様にデキサメタゾンを添加し、さら
に１時間インキエヘーションした。その後、３ＩｌＩ細
胞を集め、高分子ＲＮＡをグアニジン−塩酸法で抽出、
６０゜Ｃで５分間処理（　２　０　ｍＭＭｌ）ＰＳ，　
ｐｌｌ７．０．５ｍＭ　　酢酸ナトリウム、１　ｍＭＥ
ＤＴＡ）後、１．２％アガロース・ゲル（同バノファ−
）Ｃこて、電気泳動（４０Ｖ．１６ｈ）を行った。その
後、ニトロセルロースへ１・ランスファーし、３２［）
才−ＴＶ１１Ｎ＾（ｅｎｖに特異的なｃＤＮ八）をハイ
ブリダイズし、Ｘ線フィルムによるオートラジオダラム
を作威した。その後、オートラジオダラムより３５Ｓお
よび２４ＳＲＮＡのバンドの濃度をデンシトメーターで
測定することにより、ＲＮＡ発現量を測定し、被験物質
の無添加の場合と比較して、ＲＮＡ発現抑制割合を算出
した。その結果を示したのが表２であり、用いた被験物
質はＭＭＴＶ遺伝子発現抑制作用を示した。

表２ リグニン配糖体の乳癌ウィルス 発現に対ずる作用 （ＭＭＴＶ）遺伝子 デキサメタゾン　リグニン配糖体 Ｃ１０−７Ｍ）　　　．Ｃ３０ｕｇ／ｍｌ）３５３　　
　２　４Ｓ バンドの感光度 ＋ ＋ 十 ＋ ＋＋十干 ＋ 十 ＋＋ ｌ９ ｌは陽性対照、２．３は陰性対照、４は実験群試験例３
． マウス実験ＩＩＩ瘍に対する制癌効果 マウスの腹腔内に、ザルコーマ１８０腫瘍細胞を１×１
０６個移植し、移植後１〜４日間被験物質を腹腔内に連
続投与した。抗腫瘍活性は、生理食塩液投与群との比較
による延命率より求めた。

腫瘍移植後４５日目にて実験終了とした。その結果を示
したのが表３であり、用いた被験物質は制癌作用を示し
た。

表３ マウス腫瘍ザルコーマ１８０！こ対スるりグニン配糖体
の制癌作用 リグニン配糖体 ４　０×４ ２０×４ １　０×４ ５×４ １　０　８ ２　０　６ １２０ ９１ リグニン配糖体は移植日翌日から４日間連続投与した。

試験例４． マウス線維芽腫細胞Ｌ−９２９に対するＴＮＦ作用の増
強効果 ＴＮＦのもつ細胞殺傷作用はＬ−９　２　９細胞のシャ
ーレへの接着性を利用し、生き残った生細胞を染色して
その染色濃度を測定することにより測定することができ
る。そこでＬ−９　２　９細胞に被験物質を加え、次に
アクチノマイシンＤを４μｇ／ｄになる様に添加し、さ
らにＴＮＦを加え、３７’Ｃ，１８時間インキユベーシ
ョンする。その後、プレートを生理食塩水で洗い死細胞
を除去する。

その後、生細胞を０．１％クリスタルバイオレットで染
色し、染色された生細胞を０．５％ＳＤＳにより溶解し
、その色素濃度を○Ｄ５９０ｎｉで測定し、Ｔ　Ｎ　．
Ｆ作用に対する増強効果を検討した。

その結果を示したものが表４であり、用いた被験物質の
全てが、用量依存的にＴＮＦの細胞殺傷作用を増強した
。

表４ マウス線維芽細胞Ｌ の増強効果 ９２９に対するＴＮＦ作用 リグニン配糖体濃度 （μｇ／一） ＴＮＦのＣＤ，。濃度 Ｃｇ／ｍ支） 増強倍率 （％） ０　　　　　　　　　　０．　０　３　４　　　　　　
　　１　０　０３　　　　　　　　　　０．０１５　　
　　　　　　２２１１　０　　　　　　　　　　０．　
０　０　６　２　　　　　　５　４　Ｂ３　０　　　　
　　　　　　０．　０　０　４　４　　　　　　７　７
　３１００　　　’　　　　　　　　０．００７４　　
　　　　４５８試験例５ マウス実験腫瘍に対するＴＮＦ併用にょる制癌効果マウ
スの皮下にザルコーマ１８０腫瘍細胞をＩＸＩＯ６個移
植し、移植後１〜５日間被験物質およびＴＮＦを連続投
与した。抗腫瘍活性は生理食塩液投与群での比較による
延命率より求めた。

腫瘍移植後、４５日目にて実験終了とした。その結果を
示したのが表５であり、用いた被験物質はＴ”　Ｎ　Ｆ
との併用により強い制癌作用を示した。

表５ マウスＩＩ！ＩＩ瘍ザルコーマ１８０に対ずるリグニン
配糖体どＴＮＦの併用による効果 試料　　　　　　濃度　　　　　Ｔ／Ｃ（■／　ｋｇ　
）　　　　　（％） ０ ′Ｔ’　Ｎ　Ｆ ”ＦＮ　Ｆ　＋ リグニン配糖体 １００ １１８ ４０Ｘ４　　　　　　１９１ ２０Ｘ４　　　　　　２９８ １０Ｘ４　　　　　　２５４ ５ｘ４　　　　　　１８８ リグニン配糖体はＴＮＦとともに移植日翌日から４日間
連日投与した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明リグニン配媚体の准定構造を示す。 ２３ １　： 糖 ２　： リグニン ２４

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の性質を有するリグニン配糖体。 （ｉ）リグニンおよび多糖類が結合 （ｉｉ）分子量は６００００〜１４００００（ｉｉｉ）
   リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２０：１（分子比
   ） （ｉｖ）多糖類はウロン酸６０〜７０％、中性糖３０〜
   ４０％で構成されている。
2. （２）リグニン配糖体を主成分とするポリ（ＡＤＰ−リ
   ボース）グリコヒドロラーゼ阻害剤。
3. （３）リグニン配糖体を主成分とするサイトカイン作用
   の増強剤。
4. （４）リグニン配糖体を主成分とするサイトカイン産生
   の誘発剤。
5. （５）リグニン配糖体を主成分とする癌免疫療法剤。