JPH03206894A - 新規抗イディオタイプモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）
上のモノクローナル抗体により認識される決定基の内部
像であるマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体、
抗体誘導体、そのような抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系、並びにそのよ
うな抗イディオタイプモノクローナル抗体、それらの誘
導体およびハイブリドーマ細胞系の調製方法に関する。

このマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体は、高
分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ　−ＭＡＡ）に対して
向けられた抗体の決定、ＨＭＷ　−ＭＡＡに対する免疫
応答の調節および黒色腫の治療に有用である。

〔従来技術および発明が解決しようとする課題〕黒色腫
は、皮膚の腫瘍、少頻度には粘膜の腫瘍であり、その中
には良性のものがある。悪性黒色腫は、−船釣にメラニ
ン細胞（色素産生細胞）由来、しばしば粘膜、脈絡膜ま
たは髄膜由来の神経外胚葉起源の癌腫である。位置、拡
がりかたおよび転移の発生において異なる幾つかのタイ
プの悪性黒色腫がある。

黒色腫の従来の処置方法としては、外科療法、放射線療
法または化学療法、および生体応答調節剤の適用が挙げ
られる。しかしながら、それらの方法は病気と戦うのに
、例えばＩＩＩ瘍の再発を防くのに不十分であることが
判っており、そして多数の深刻な副作用により複雑であ
る。従って、それらの欠点を克服し、従来の処置方法に
取って代わるかまたはそれと組合せて使用することがで
きる療法アプローチを開発することが望ましい。

免疫系がこの病気の病因に深く関わっているらしいので
、最適な処置方法は、活性な免疫療法、例えば特異的抗
イディオタイプ抗体の適用に基づく免疫療法であろう。

抗イディオタイプ抗体は、特定の抗体イディオタイプ（
抗体可変領域決定基の全セット）に対して向けられ、そ
して免疫原として抗体を使うことにより生産される。従
って、抗イディオタイプ抗体はしばしばＡｂ２（抗体２
）と称され、一方免疫装置用抗体はＡｂｌ（抗体１）と
称される。近年、種々の抗原に対する抗体に対して惹起
された抗イディオタイプ抗体が、おそらく免疫細胞サブ
セット間の増幅および抑制シグナルを平衡化することに
よって対応抗原に対する免疫応答を操作する有用な試薬
であることが示された。療法適用のために特に着目され
るのは、最初の抗原を模倣しておりそしてそれに代用で
きる内部像タイプの抗イディオタイプ抗体である。腫瘍
の治療のために適当な抗イディオタイプ抗体は、腫瘍に
関連する抗原に特異的な抗体に対して生起されるもので
ある。黒色腫では、抗イディオタイプ抗体の産生および
免疫療法アプローチの開発に適当な標的は、黒色腫関連
抗原（ＭＡＡ）であり、その多くはそれらの分子量によ
り同定され特徴づけられており、例えば＞１，０００，
０００の分子量を有する高分子量−黒色腫関連抗原（Ｈ
ＭＷ−ＭＡＡ）である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の目的は、モノクローナル抗体により認識される
高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）上の決定
基の内部像であるマウス抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体（ＭＡｂ）を提供することである。

そのような抗イディオタイプ抗体すは、ＨＭＷ−ＭＡ八
に対して向けられたモノクローナル抗体、例えば同系の
モノクローナル抗体を免疫処置に用いることにより生産
することができる。免疫処置用抗体の選択は、ＨＭＷ　
−ＭＡＡのエピトープが抗イディオタイプ抗体により模
倣されるように決定する。

本発明の抗イディオタイプモノクローナル抗体は、体液
性免疫および細胞性免疫の刺激といった免疫調節機能を
有する。従って、本発明の抗イディオタイプモノクロー
ナル抗体は、多数の診断および療法目的、例えば黒色腫
の抑制、予防、処置および監視のために使用することが
できる。

〔具体的説明〕

本発明は、ヒト高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡ
Ａ）上のモノクローナル抗体により認識さ、ｊ１６決定
基の内部像であるマウス抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体、それらが誘導されるもとのｉ’ｌ：体の特異性
を保持しているその誘導体に関する。

抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は、別の抗体分子（ｘ
ｂ　１　）の可変領域に対して、即ち特定の抗体イディ
オタイプ（抗体可変領域決定基の全セット）に対して向
けられる。内部像抗イディオタイプ抗体は、抗原と相補
的である免疫処置用抗体上の抗原結合構造と反応性であ
り、即ちそのような抗体は抗原のコンホメーション鏡像
を表わし、それの代替物として使用することができる。

内部像抗体は、試験管内では標的細胞への免疫処置用抗
体の結合を阻害し、そして生体内では抗原に対して向け
られそしてＡｂｌと同じ反応性パターンを有する、Ａｂ
３（抗体３）とも称する抗−抗イディオタイプ抗体を惹
起せしめる。

本発明において、下記に詳述する抗−ＨＭＷ　−ＭＡＡ
モノクローナル抗体に対して生産されるマウス抗イディ
オタイプモノクローナル抗体は、免疫処置用抗体により
認識される！ＩＭＷ−ＭＡＡの決定基を模倣する。それ
らは免疫処置用抗−〇ＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体
Ａｂｌの抗原結合部位内部のイア。イオタイブ抗原決定
基を認識し、従ってＩＩＭＷ−ＭＡＡを発現している黒
色腫細胞へのＡｂｌの結合を阻害し、そしてＨＭＷ　−
ＭＡＡと反応性の抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）
を誘導する。免疫処置用抗ＨＭＷ　−ＭＡＡモノクロー
ナル抗体に対する本発明の抗イディオタイプモノクロー
ナル抗体の特異性は、イムノアッセイ、例えば、担体を
Ａｂｌでコーティングし、標識された、例えば放射能ま
たは酵素標識された本発明の抗イディオタイプモノクロ
ーナル抗体と共にインキュベートし、そして結合した標
識を検出するという結合アンセイにおいてテストされる
。マウス抗イディオタイプモノクローナル抗体が免疫処
置に用いたモノクローナル抗体の抗原結合部位内部のイ
ディオタイプ抗原決定基（イディオトーブ）を認識する
かどうかを８周べるために、ＨＭＷ−Ｍ静を発現してい
る黒色腫細胞へのＡｂｌの結合を阻害するそれらの能力
を、例えばイムノアッセイにおいてテストする。そのよ
　Ｘイムノアッセイは、競合ラジオ−またはエン→、−
イムーイムスアッセイであることができ、この場ば、標
識された、例えば放射能または酵素標識された免疫処置
用抗−ＨＭＷ　−ＭＡＡモノクローナル抗体を、対応す
る本発明の抗イディオタイプモノクローナル抗体と共に
インキュベートし、そしてこの混合物を、！ＩＭＷ−Ｍ
ＡＡを担持している黒色腫細胞、例えば培養された黒色
腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８に添加し、そして更なるインキュ
ベーション後、結合した標識を検出する。本発明の抗イ
ディオタイプモノクローナル抗体が内部像タイプのもの
であることを決定づけるために、そ、れらが、ＨＭＷ　
−ＭＡＡと反応性であり且つＡｂｌと同じ反応性パター
ンを示す抗−抗イディオタイプ抗体を誘導することがで
きるかどうかを調べる。抗−抗イディオタイプ抗体の誘
導は、動物モデル、例えばマウスにおいて実施すること
ができる。生成した抗−抗イディオタイプ抗体は、例え
ばＨＭＷ　−ＭΔＡに対する特異性について、例えばＨ
ＭＷ　−ＭＡＡを担持している黒色腫細胞へのそれらの
結合能力を調べるイムノアッセイ、および該細胞から免
疫沈澱された抗原の電気泳動分析、例えばドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３
−ＰＡＧＥ）においてテストされる。抗−抗イディオタ
イプ抗体は、誘導に使った抗イディオタイプ抗体との反
応性についてもテストされる。

抗イディオタイプ抗体の生産の標的として高分子量−黒
色腫関連抗原（分子量＞　１　、０００．０００）が選
択される。何故かといえば、ＨＭＷ　−ＭＡＡは、第１
表に示される特徴により指摘されるように、黒色腫の処
置における免疫療法アプローチの開発のための試験管内
基準を全てではないにしても殆ど満たしているからであ
る。

１０−表 細胞分布：　　　　　　膜に結合している血清中のレベ
ル：　　　低い 本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体は
、任意の免疫グロブリンクラス／サブクラスのものであ
ることができ、好ましくは免疫グロブリンクラスＩｇＧ
　、特に免疫グロブリンサブクラスＩｇＧ　１のもので
あることができる。異なるイソタイプの抗イディオタイ
プ抗体は異なる免疫調節作用を有し得るので、抗イディ
オタイプＭＡｂは適宜に選択することができる。

特に、本発明は、ＭＡｂ　７６３．７４と称するモノク
ローナル抗体により認識されるＨＭＷ　−ＭＡＡの決定
基の内部像であるマウス抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体に関する。モノクローナル抗体ＭＡｂ　７６３．
７４は、Ｐ、Ｇｉａｃｏｍｉｎｉら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１３５，６９６．１９８５）により記載されている
。

特に好ましいのは、ＭＡｂ　ＭＫ２−２３と命名された
マウス抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその
誘導体である。この抗イディオタイプＭＡｂは、ＭＡｂ
　７６３．７４に対して生起され、そしてＭＡｂ７６３
．７４により認識されるＨＭＷ　−Ｍ静の決定基の内部
像である。ＭＡｂ　ＭＫ２−２３は、ＭＡｂ　７６３．
７４の特徴を模倣する抗体を惹起させることができる。

本発明の抗イディオタイプモノクローナル抗体の誘導体
は、それらが誘導された抗体の特異性を保持しており、
即ち、親の抗体の特徴的結合パターンを保持している。

そのような誘導体の例は、抗イディオタイプモノクロー
ナル抗体の断片、抗イディオタイプモノクローナル抗体
と免疫原性を増強する担体、酵素、蛍光マーカー、化学
発光マーカー、金属キレート、常磁性粒子、アビジン、
ビオヂン謔皆接合体、または放射能標識された抗イディ
オタイプモノクローナル抗体である。

本発明の抗体断片は、例えば−価の断片Ｐａｂもしくは
Ｆａｂ　’または二価の断片ｐ（ａｂ’　Ｌである。

本発明の抗イディオタイプモノクローナル抗体の免疫原
性を増強する適当な担体分子は、例えば、結合に利用で
きる遊離アミノ基を有するリジンに冨むタンパク質、特
に商業的に木量に入手可能である高分子量タンパク質、
例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ＭＷ　６６．２０
０）　、バシラス・サブチリス（Ｂ　ａ　ｃ　ｉ　ｌ　
Ｉ　ｕ　ｓ　８ｕ旦旦）由来のα−アミラーゼ（Ｍ誓５
８．０００）またはアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｍ
ｗ＞１０００．０００）である。ブタのチログロブリン
、毒素、例えば破傷風毒素、コレラ毒素またはジフテリ
ア毒素、ヒト血清アルブミン（ＩＩｓＡ）　、β−２ミ
クログロブリン、等も担体として使用することができる
。他の可能な担体分子としては、多糖、天然または合成
リボ多糖、ポリリジンなどの合成ペプチド、活性膜、ラ
テックス粒子、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌
などの細菌が挙げられる。

本発明の抗体接合体に使用される酵素は、例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼである。

本発明のモノクローナル抗体と接合される蛍光マーカー
は、フルオレセイン、フルオロクロム、ローダミン等で
ある。

化学発光マーカーは、例えばアクリジニウム誘導体、例
えばルミノールのアク、リジニウムエステルである。

金属キレートの例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
八）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、
１．４，８．１１−テトラアザテトラデカン、１゜４．
８．１１−テトラアザテトラデカン−１，４゜８．１１
−テトラ酢酸、１−オキサ−４，７，１２゜１５−テト
ラアザヘプタデカン−４，７，１２゜テトグ酢酸等であ
る。

そのような接合体においては、抗体は直接にまたはスペ
ーサーもしくはリンカ−基を介して接合パートナ−と結
合している。

放射能標識された本発明の抗体は、例えば放射性ヨウ素
（＋２３１　、Ｉｔｓ　■、＋３１１　）、重水素（３
Ｈ）、炭素（”Ｃ）、硫黄（３５３）、イツトリウム（
”Ｙ）　、テクネチウム（９９′″Ｔｃ）等を含む。

本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体お
よびその誘導体は、所望の抗イディオタイプモノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の細胞を試験
管内または生体内で増殖させ、そして必要な時、得られ
た抗イディオタイプモノクローナル抗体を単離しそして
／またはその誘導体に変換することを含んで成る、それ
自体既知の方法により調製される。

試験管内での増殖は、常用の標準培地である適当な培地
、例えばダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）また
はＲＰＭＩ　１６４０培地中で行われ、該培地は所望に
より哺乳動物血清、例えばウシ胎児血清、または微量元
素および増殖維持補足物、例えば支持細胞、例えば正常
マウス腹腔浸出細胞、肺細胞または骨髄マクロファージ
、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリ
ン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等により補足さ
れる。

試験管内生産は比較的純粋な抗体調製物を提供し、そし
て大量の所望の抗体を得るためにスケールアップするこ
とができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養の
ための技術は当業界において既知であり、そして例えば
エアーリフト反応器中もしくは連続撹拌反応器中での均
一懸濁培養、または中空繊維中、マイクロカプセル中、
アガロースミクロビーズ上もしくはセラミックカートリ
ッジ上での固定化もしくは封入細胞培養を含む。

大量の所望の抗イディオタイプモノクローナル抗体は、
細胞を生体内で増殖させることによって得ることもでき
る。このためには、組織適合性哺乳動物に所望の抗体を
産生ずるハイプリドーマ細胞を注入し、抗体産生腫瘍の
増殖を引き起こす。

所望により、動物は注入前に炭化水素、特に鉱油、例え
ば“プリスタン（テトラメチルペンタデカン）で感作さ
れる。１〜３週間後、それらの動物の体液から抗体が単
離される。例えば、所望のモノクローナル抗体を産生す
るＢａ１ｂ／ｃマウス由来のハイプリドーマ細胞を、所
望によりプリスタンで前処理されたＢａ１ｂ／ｃマウス
の腹腔内に注入し、そして１〜２週間後、その動物から
腹水を取り出す。

前に示したような常法により、そこから所望のモノクロ
ーナル抗体が単離される。

抗イディオタイプモノクローナル抗体の断片、例えばＦ
ａｂ、　Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’　）ｚ断片は、それ
自体既知の方法により、例えばペプシンもしくはパパイ
ンのような酵素での消化および／または化学的還元によ
るジスルフィド結合の開裂により、上述のようにして調
製された抗体から得ることができる。

増強された免疫原性を有する本発明の抗イディオタイプ
モノクローナル抗体誘導体は、それ自体既知の方法によ
り、担体に抗イディオタイプモノクローナル抗体を吸着
させるかまたは過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、カ
ルボジイミド、例えばＮ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレ
イミド、Ｎ（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシ
ンイミド、Ｎ−（３−（２’−ピリジルジチオ）プロピ
オンオキシ］スクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（
３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等を使
ってカップリングすることにより、調製される。

本発明の抗イディオタイプモノクローナル抗体と酵素、
蛍光マーカー、化学発光マーカー、金属キレート、常磁
性粒子、アビジン、ビオチン等との接合体は、当業界で
既知の方法により、例えば上述のようにして調製された
抗９体を、縮合剤、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ
素酸塩、Ｎ、Ｎ’−〇−フェニレンジマレイミド、Ｎ−
（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド、
Ｎ（３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンオキシ〕
スクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド等の存在下で酵素と反応
させることにより調製されビオチンとの接合体は、例え
ば、モノクローナル抗体をビオチンの活性化エステル、
例えばビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
と反応させることにより調製される。蛍光または化学発
光マーカーとの接合体は、縮合剤、例えば上に挙げたも
のの存在下で調製されるか、またはイソチオシアネート
、好ましくはフルオレセインイソチオシアネートと反応
させることにより調製される。

ヨウ素（１２：ｌｌ、ＩＺＳｌ、Ｉ：１ｌｌ）テ放射能
標識された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、例
えば、放射性ヨウ化ナトリウムもしくはカリウム、およ
び化学的酸化剤１、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロ
ラミンＴ等、または酵素的酸化剤、例えばラクトペルオ
キシダーゼもしくはグルコースオキシダーゼおよびグル
コースを用いたそれ自体既知のヨウ素化により、本発明
のモノクローナル抗体から得られる。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸
（ＤＰＴＡ）キレート化によりイツトリウム（９０Ｙ）
で標識される。テクネチウム−９９ｍ標識抗体は、リガ
ンド交換反応により、例えば過テクネチウム酸塩（Ｔｅ
Ｏ２を第一スズイオン溶液で還元し、還元されたテクネ
チウムをセファデックスカラム上にキレート化しそして
このカラムに抗体を適用することにより；または直接ラ
ベル化技術により、例えば過テクネチウム酸塩をＳｎＣ
／！　ｚのような還元剤、フタル酸カリウムナトリウム
溶液のような緩衝液および抗体と共にインキュベートす
ることにより、調製される。

本発明は更に、本発明のマウス抗イディオタイプモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系に関する
。

特に、本発明は、高分子量コ黒色腫関連抗原に対して向
けられたモノクローナル抗体、好ましくは同系のモノク
ローナル抗体で免疫処置されたマウスのＢリンパ球とミ
エローマ細胞とのハイブリッドであるハイブリドーマ細
胞系に関する。好ましくは、それらの細胞系は、マウス
のミエローマ細胞と、ＭＡｂ　７６３．７４で免疫処置
されたマウス（例） えばＢａ１ｂ／ｃマウス）のＢリンパ球とのハイブリッ
ドである。特に好ましいのは、１９８９年１０月３１１
３に１１８１０２８Ｊ３号のもとにアメリカン・タイプ
・、カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０
１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
ＭＤ　２０８５２．Ｕ、Ｓ、Ａ、）に寄託されているハ
イブリドーマ細胞系ＭＫ２−２３である。

本発明のハイブリドーマ細胞系は遺伝的に安定であり、
一定の特異性を有する本発明の抗イディオタイプモノク
ローナル抗体を分泌し、そして深層凍結培養において保
存でき、解凍および任意の再クローニングにより再活性
化することができる。

本発明はまた、本発明のマウス抗イディオタイプモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の調製方
法にも関する。該方法は、高分子量−黒色腫関連抗原に
対して向けられたモノクローナル抗体、好ましくは同系
のモノクローナル抗体、またはその接合体を用いてマウ
スを免疫処置し、このマウスの抗体産生細胞を連続細胞
系の細胞と融合し、融合において得られたハイブリット
細胞をクローニングし、そして所望のモノクローナル抗
体を分泌する細胞クローンを選択することを含んで成る
。

抗イディオタイプモノクローナル抗体を惹起せしめるの
に使われる免疫原は、モノクローナル抗体それ自体であ
る。本発明のマウス抗イディオタイプＭＡｂの産生に適
当な免疫処置用抗体は、高分子量−黒色腫関連抗原上の
イディオタイプ抗原決定基（イディオトープ）を認識す
るモノクローナル抗体、特に同系のモノクローナル抗体
である。

適当なモノクローナル抗体は、任意の免疫グロフリンイ
ソタイプのものであることができる。上記に説明したよ
うに、免疫処置に使用するモノクローナル抗体の特異性
は、高分子量−黒色腫関連抗原の決定基が抗イディオタ
イプＭＡｂにより模倣されることを決定づけ、従って、
抗イディオタイプモノクローナル抗体の適用により影響
を受けるであろう免疫反応のタイプに依存して、個々に
選択することができる。好ましい免疫原はＭＡｂ　７６
３．７４（Ｐ、Ｇｉａｃｏｍｉｎｉら、上記引用文中）
である。

抗原、即ち免疫処置用モノクローナル抗体は、該モノク
ローナル抗体の免疫原性を増強するために担体に結合さ
せることができる。適当な担体分子は、例えば、結合に
利用できる遊離アミノ基を有するリジンに冨むタンパク
質、特に商業的に大量に入手可能である高分子タンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｍ匈６６．２
００）　、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
、！（ｕｂｔｉｌｉｓ）由来のα−アミラーゼ（ＭＷ　
５８，０００）またはアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ；
ＭＷ　＞１，０００，０００）である、ブタのチログロ
ブリン、毒素、例えば破傷風毒素、コレラ毒素またはジ
フテリア毒素、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）、β−２
ミクログロブリン、等も担体として使用することができ
る。他の可能な担体分子としては、多糖、天然または合
成リボ多糖、ポリリジンなどノ合成ヘブチド、活性膜、
ラテックス粒子、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）
菌などの細菌が挙げられる。

本発明の免疫原性接合体は、それ自体既知の方法により
、担体に免疫処置用モノクローナル抗体を吸着させるか
または過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、カルボジイ
ミド、例えばＮ、Ｎ’　−。

−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドヘン
ジイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（３（２′−ピリ
ジルジチオ）プロピオンオキシ〕スクシンイミド、Ｎ−
エチル−Ｎ’　−（３’　−ジメチルアミンプロピル）
カルボジイミド等を使ってカップリングすることにより
、調製される。

好ましいのは、グルタルアルデヒドを用いて免疫処置用
モノクローナル抗体をアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）
に結合させた免疫処置用モノクローナル抗体の接合体で
ある。

免疫原は、アジュバント、即ち免疫応答を更に増強する
であろう剤、と混合することができる。

可能なアジュバントは、完全フロインドアジュバント（
水、鉱油および微生物抽圧物の乳濁液）、不完全フロイ
ンドアジュバント（水と鉱油のみの乳濁液）、ミネラル
ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、界面活性物質、
例えぼりゾレシチン、ポリアニオン、ペプチド、ＢＣＧ
　（カルメットーゲラン杆菌）等である。

免疫処置の経路は、特に、皮肉、皮下、筋肉内、腹腔内
、静脈内および頭蓋的注射である。高い抗体価が所望さ
れるので、通常一連の注射が与えられる。免疫処置は、
例えば、非経口的に、例えば腹腔内および／または皮下
的に、数日、例えば３〜７日の規則的または不規則的な
間隔において、数ケ月まで、例えば４週間、２，３．４
またはそれより多くの回数、抗原を注射することによっ
て行われる。

最後の注射の例えば１〜５日後に取り出された免疫処置
マウスの抗体産生細胞、好ましくは牌リンパ球などのリ
ンパ系細胞は、連続細胞系の細胞、即し、融合から生じ
るハイブリッド細胞に複製能力を付与する連続的に複製
する細胞クローンと融合される。そのような細胞系の例
は、それ自体では免疫グロブリンまたはその断片を産生
じないが大量の抗体を産生じそして分泌する潜在能力を
有し、そしてハイブリッド細胞を未融合の親細胞に対し
て選択できるように遺伝子マーカーを担持しているＩｌ
ｌ！瘍細胞系（ミエローマ）である。幾つかの適当なミ
エローマ細胞系が当業界で知られている。好ましいのは
、ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（＋ＩＧＰＰＴ）酵素またはチミジンキナーゼ
（ＴＫ）酵素を欠き、従ってヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地
）中で生存できないミエローマ細胞系である。特に好ま
しいのは、ＩＩＡＴ培地中で生存できず、そして免疫グ
ロブリンまたはその断片を分泌しないミエローマ細胞系
および誘導細胞系、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マ
タハｓｐ　２１０〜Ａｇ１４である。

融合は、融合促進物質、例えば、所望により紫外線（Ｕ
Ｖ）で不活性化された形のセンダイウィルスもしくは他
のパラミクソウィルス、または化学融合剤（ｆｕｓｏｇ
ｅｎ）　、例えばカル、シウムイオン、界面活性脂質、
例えばりゾレシチン、もしくはポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）の存在下で、または電気融合により、行われ
る。好ましくは、ミエローマ細胞は、１０００〜４００
０の分子量のポリエチレングリコールを約３０％〜約６
０％含有する溶液中で、免疫処置動物からの３〜２０倍
過剰量の肺細胞と融合される。

融合後、細胞は遺伝子選択マーカーに依存して選択培地
、・例えばＨＡＴ培地中に再懸濁され、培養される。こ
の培地中では、ハイブリドーマ細胞のみが生き残るだろ
う。というのは、ハイブリドーマ細胞は、親のミエロー
マ細胞から受は継いだ試験管内で増殖および複製する能
力と、免疫処置動物の抗体産生肺細胞から受は継いだｌ
＋ＡＴ培地中での生存に不可欠な欠損）ＩＧＰＲＴまた
はＴＫ遺伝子とを合わせ持つからである。

ハイブリドーマ細胞の増殖のための適当な培地は、標準
培地、例えばダルベンコ改良イーグル培地（Ｄ肝Ｍ）、
最少必須培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地等であり、所望
により哺乳動物血清、例えば１０〜１５％ウシ胎児血清
により補足される。好ましくは、支持細胞、例えば正常
マウス腹腔浸出細胞、肺細胞、骨髄マクロファージ等が
、融合段階の直後の細胞増殖の開始時に添加され、特に
細胞密度が低い場合には、増殖因子等を供給することに
よりハイブリドーマ細胞に栄養を与えそしてそれらの増
殖を維持する。マクロファージや単核細胞のような食細
胞を使用するならば、アミノプテリン処理後に常に見ら
れる死んだミエローマ細胞の破片を掃除する際に役に立
つことができる。ハイブリドーマが過剰増殖しないよう
にミエローマ細胞を保護するために、培地に選択培地が
補足される。

ハイブリドーマ細胞培養上清は、イムノアッセイ、好ま
しくはエンザイムイムノアンセイまたはラジオイムノア
ッセイにより、所望のマウス抗イディオタイプモノクロ
ーナル抗体についてスクリニングされる。そのようなイ
ムノアッセイは、例えば、免疫処置用モノクローナル抗
体またはその断片で担体をコーティングし、ハイブリド
ーマ上清を添加し、そして担体に板台した抗イディオタ
イプモノクローナル抗体を、抗イディオタイプ抗体を認
識する標識抗体の添加により検出するという間接結合ア
ッセイである。

陽性のハイブリドーマ細胞は、例えば限界希釈によりま
たは軟寒天中で、好ましくは２回以上クローニングされ
る。所望により、ハイブリドーマ細胞は腹腔内注射およ
び腹水の回収により、Ｉ・、：８勿、例えばマウスで継
代される。これはハイブリトーマを安定化し、そして増
殖特性を改善する。クロニングされた細胞系は常法によ
り凍結され得る。

本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体お
よびそれらの誘導体は、多くの治療および診断目的に有
用である。ＨＭＷ−ＭＡＡ自体の代わりに内部像抗イデ
ィオタイプモノクローナル抗体を使用することの利点は
、例えば次のことである：・抗イディオタイプＭＡｂの
高免疫原性、・抗イディオタイプ門＾ｂによる、ＨＭＷ
　−ＭＡＡに対して通常応答しないＢ細胞の刺激、 ・抗イディオタイプＭＡｂによる、ＨＬＡクラスＩ制限
でない抗−ＨＭＷ　−ＭＡＡ細胞毒性Ｔ細胞の可能な生
成、 １１ＭＷ−ＭＡＡの適用と関連がありそうな副作用の削
除、 ・大量の抗イディオタイプ”ＭＡｂの容易な生産。

本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体お
よびそれらの誘導体は、それらのイディオタイプ−抗イ
ディオタイプ反応網内での免疫調節機能のため、高分子
量−黒色腫関連抗原に対する免疫応答を活性調節するた
めに用いることができる。この活性調節は特異的であり
、抗イディオタイプＭＡｂの生産に使用されるモノクロ
ーナル抗体の選択、即ち免疫処置用Ｍ肺の特異性の選択
、および、異なるイソタイプの抗イディオタイプ抗体は
異なる免疫調節作用を有し得るので抗イディオタイプＭ
Ａｂのイソタイプの選択により、指図することができる
。

結果として、本発明のマウス抗イディオタイプＭＡｂお
よびそれらの誘導体は、黒色腫の抑制および処置のため
の有用な薬剤であり、即ち、腫瘍の後退をもたらしそし
て／または」重傷の再発を防止するために好結果に使用
することができる。本発明の抗イディオタイプＭＡｂは
、免疫処置用抗体の適切な選択により、ＨＭＷ　−ＭＡ
Ａの特定の決定基を模倣するように「注文仕立て」する
ことができる。

更に、本発明の抗イディオタイプ１八すは、免疫処置用
モノクローナル抗体により認識される高分子量−黒色腫
関連抗原の決定基に対する免疫の誘導により、黒色腫を
予防するのに有用である。

本発明は、本発明のマウス抗イディオタイプモノクロー
ナル抗体および／またはその誘導体を含んで成る医薬組
成物にも関する。該医薬組成物は、例えば、無機または
有機の固体または液体の担体と一緒にまたは混合して、
療法的有効量の本発明のマウス抗イディオタイプモノク
ローナル抗体および／またはその誘導体を含んで成る。

好ましいのは、免疫原性を増強する担体、特にアオガイ
ヘモシアニン（ＫＬＨ）　　と抗イディオタイプモノク
ローナル抗体との接合体である本発明のマウス抗イディ
オタイプモノクローナル抗体の誘導体を含んで成る医薬
組成物である。本発明の医薬組成物は、アジュバント、
即ち免疫応答を更に増加させる剤を更に含んで成ること
ができる。可能なアジュバントは、完全フロインドアジ
ュバント（鉱油、水および微生物抽出物の乳濁液）、不
完全フロインドアジュバント（水と鉱油のみの乳濁液）
、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、界面
活性物質、例えばリソッシチン、ポリアニオン、ペプチ
ド、ＢＣＧ　（カルメットーゲラン杆菌）、等である。

特に好ましいのは、免疫原性を増強する担体と抗イディ
オタイプモノクローナル抗体との接合体およびアジュバ
ントを含んで成る医薬組成物であり、特に好ましくは、
アオガイヘモシアニン（Ｋｌ、Ｈ）に結合した抗イディ
オタイプモノクローナル抗体およびカルメットーゲラン
杆菌（Ｂ　Ｃ，Ｇ　）を含んで成る医薬組成物である。

好ましいのは、非経口投与用の医薬組成物である。筋肉
内、皮下または静的投与用の医薬組成物は、例えば、所
望により凍結乾燥製剤または濃縮製剤から使用直前に調
製された、等張の水性溶液または懸濁液である。該医薬
組成物は滅菌されてもよく、そして例えば、成分を保存
、安定化、湿潤化、乳化または可溶化するための補助薬
、浸透圧の調節のための塩、緩衝剤および／または粘度
を調節する化合物、例えばカルボキシセルロースナトリ
ウム、デキストラン、ポリビニルピロリド′ンもしくは
ゼラチンを含んでもよい。それらは当業界において既知
の方法、例えば常用の混合法、）岩屑法または凍結乾燥
法により調製され、そして約０．０１％γ約５０％の活
性成分を含む。注射用製剤は、当業界において既知の方
法に従って、処理され、アンプルまたはバイアル中に充
填され、そして無菌条件下で密封される。

特定の投与形式および用量は、患者の体質、病気の状態
、処置される黒色腫のタイプ等を考慮に入れて、担当医
により選択されるだろう。哺乳動物についての療法量は
、患者の状態および投与形式に依存して、約３０ｔｔｔ
ｒ−１１００ｊｒ／　ｋｇ体重である。

例えば、進行した黒色腫にかかっている１０人の患者に
よる実験において、本発明のマウス抗イディオタイプモ
ノクローナル抗体は、ある患者では完全な後退を、そし
である患者では部分的な後退をもたらす。

本発明のマウス抗イディオタイプＭＡｂおよびそれらの
誘導体は、高分子量−黒色腫関連抗原に対して向けられ
た抗体の定性および定量のためにも使用することができ
る。これは、マウス抗イディオタイプＭＡｂおよびその
誘導体を用いた黒色腫の処置のモニタリングに特に有用
である。

例えば、本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体またはそれらの誘導体は、ｌＩＭＷ−ＭＡＡに対
して向けられた抗体のイディオタイプ抗原決定基と抗イ
ディオタイプモノクローナル抗体のイディオタイプ抗原
決定基との間の結合相互作用を顧みにする既知のイムノ
アッセイのいずれにおいても使用することができる。そ
のようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、エン
ザイムイムノアッセイ、免疫蛍光イムノアッセイ、化学
発光イムノアッセイ、免疫沈澱イムノアッセイ、ラテッ
クス凝集イムノアッセイまたは血球凝集イムノア・シャ
イである。

本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体は
、それ自体でまたは放射能標識された誘導体の形でラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することがで
きる。ＲＩＡの既知の変形、例えば、高分子量〜黒色腫
関連抗原に対して向けられた抗体の直接もしくは間接（
競合）測定を伴う、可溶外相（均一）　ＲＩＡ　、固相
（不均一）　ＰＴＡ　、単−ＲＩＡ“または二重（サン
ドインチ）Ｒ１へのいずれにおいても使用できる。

そのようなラジオイムノアッセイの例はサンドインチＲ
ＩＡであり、この場合、適当な担体、例えば、ポリスチ
レン、ポリプロピレンまたはポリ塩化ビニルのミクロタ
イタープレートもしくは試験管のプラスチック表面、ガ
ラスもしくはプラスチックビーズ、濾紙、デキストラン
等、セルロースアセテートもしくはニトロセルロース紙
、常磁性粒子等が、単純な吸着によりまたは所望により
例えばグルタルアルデヒドもしくは臭化シアンによる担
体の活性化後に、本発明のマウス抗イディオタイプモノ
クローナル抗体でコーティングされる。

次いでＩＩＭＷ−ＭＡ八に対して向けられた抗体を含む
テスト溶液、そして最後に抗ＭＡＡ抗体とも反応しそし
て例えば＋ｚｓ■で放射能標識されているポリクローナ
ル抗体が添加される。テスト溶液中の高分子量−黒色腫
関連抗原に対して向けられた抗体の量は、結合したポリ
クローナル抗体の量に正比例し、そして固相の放射能を
測定することにより決定される。

本発明のモノクローナル抗体は、それ自体でまたは酵素
接合誘導体の形でエンザイムイムノアソセイにおいて使
用することができる。ラジオイムノアッセイについて上
述したように、エンザイムイムノアッセイの既知の変形
のいずれも使用することができる。

該テストは、放射能標識の代わりに酵素標識を使って、
前述のラジオイムノアッセイと同様にして行われる。テ
スト溶液中に存在するＨＭＷ　−ＭＡＡに対して向けら
れた抗体の量に相当する形成された免疫複合体の量は、
酵素基質溶液を添加することにより測定される。酵素基
質９反応は、例えば、肉眼または光学測定装置により観
察できる色の変化を生じる。

本発明のマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体は
、それ自体でまたは化学発光マーカーと接合された誘導
体の形で化学発光アッセイにおいて使用することができ
る。ラジオイムノアッセイについて上述したように、化
学発光アッセイ（・既知の変形のいずれも使用すること
ができる。

該テストは、放射能標識の代わりに化学発光標識を使っ
て、上述のラジオイムノアッセイと同様にして行われる
。テスト溶液中に存在するＨＭＷ　−ＭＡＡに対して向
けられた抗体の量に相当する形成された免疫複合体の量
は、発光を開始させる化合物、例えばＨ，Ｏ□およびＮ
ａＯＨを添加し、そして光学測定装置により発光を測定
することにより決定される。

高分子量−黒色腫関連抗原に対して向けられた抗体の測
定のための上述の抗イディオタイプモノクローナル抗体
およびそれらの誘導体の本発明の用途としては、それ自
体既知の他のイムノアッセイ、例えば免疫蛍光アッセイ
、ラテックス凝集アンセイ、血球凝集アッセイ、抗イデ
ィオタイプＭＡｂでコーティングされた光ファイバーを
使った消失光波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ　ｌｉｇｈｔ　
１ｖａｖｅ）アッセイ、および結合反応を電気または光
のシグナルに変換する他の直接作用イムノセンサー等が
挙げられる。

更に本発明は、本発明のマウス抗イディオタイプモノク
ローナル抗体および／またはその誘導体、並びに所望に
より、他のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体
および／または添加剤を含んで成る、高分子量−黒色腫
関連抗原に対して向けられた抗体の定性および定量用の
テストキットに関する。

ラジオイムノアッセイ用の本発明のテストキットは、例
えば、適当な担体、所望により凍結乾燥された１もしく
は複数のポリクローナルおよび／またはモノクローナル
抗体の溶液、放射能標識抗体の溶液、ＩＩＭＷ−ＭＡＡ
に対して向けられた抗体の標準溶液、緩衝液、並びに所
望により、非特異的吸着および凝集物形成を防く；ため
のペプチドおよび洗浄剤、ピペット、反応容器、検量線
等を含む。

該テストキットの抗体のうちの１つが本発明の抗イディ
オタイプモノクローナル抗体である。

エンザイムイムノアンセイ用の本発明のテストキットは
、例えば、適当な担体、所望により凍結乾燥された１も
しくは複数のポリクローナルおよび／またはモノクロー
ナル抗体の溶液、所５１°　より凍結乾燥または濃縮さ
れた酵素−もしくは゛オチンー接合抗体の溶液、ビオチ
ン標識抗体を使用する場合は酵素−アビジン接合体の溶
液、固体または溶解された形の酵素基質、ＨＭＷ　−Ｍ
ＡＡに対して向けられた抗体の標準溶液、緩衝液、並び
に所望により、非特異的吸着および凝集物形成を防ぐた
めのペプチドおよび洗浄剤、ピペット、反応容器、検量
線、操作マニュアル等を含む。該テストキットの抗体の
うちの１つが本発明の抗イディオタイプモノクローナル
抗体である。

〔実施例〕

次の実施例は、本発明を例示するものであり、決して限
定するものではない。

絡号 ＢＣＧ　　　　力ルメットーゲラン杆菌ＣＦＡ　　　　
完全フロインドアジュバントＤＥＡＥ　　　　ジメチル
アミノエチルＦＣＳ　　　　ウシ胎児血清 ＦＰＬＣ １１ＡＴ ＬＡ Ｔ ＩＣＡＭ−Ｉ ＩＦＡ ｉ、ｐ。

ＬＨ ＰＢＳ ＰＢＳ−７２０ Ｔ ＳＯ５−ＰＡＧＥ 高速タンパク質液体クロマトグラフ ィー ヒポキサンチン／アミノプテリン／ チミジン ヒトリンパ球抗原 ヒボキサンチン／アミノプテリン 抗細胞間接着分子−１ 不完全フロイントアジハント 腹腔内（的に） アオガイヘモシアニン リン酸塩緩衝化塩溶液 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０が補足されたリン酸塩緩衝
化塩溶液 室温 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク リルアミドゲル電気泳動 ８〜１２週齢の１Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ
　ＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｒｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に　アオガイ
ヘモシアニン（ＫＬ）Ｉ）　（Ｓｉｇｍａ）に縮合され
、ＰＢＳ（ｐｔｌ？、２．）中の２．５％グルタルアル
デヒド溶液４μ！を用いて重合されそして同容量の完全
フロインドアジュバント（ＣＦＡ）　（Ｇｉｂｃｏ）と
混合された２００ｊ１ｇの精製抗−）ＩＭＷ　　ＭＡＡ
　ＭＡｂ　７６３．７４（Ｐ、Ｇｉａｃｏｍｉｎｉら、
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５，６９６．１９８５）を腹
腔内（ｉ、ｐ、）注射する。縮合および重合操作は、Ｇ
、Ｂｕｔｔｉｎら（Ｃｕｒｒ。

Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８１，２７，１９７８）
に従って行う。次に、７日目に不完全フロインドアジュ
バント（ＩＦＡ）中の同一免疫原２００．ｑを用いてマ
ウスにブースター腹腔内注射を行う。３００日目、ＰＢ
Ｓ　（ｐｌ（７，３）中の同一免疫原２００　Ｊｔｇを
用いて２回目のブースター注射を腹腔内に行う。２回目
のブースター注射の３日後、マウスを犠牲にし、肺臓を
取り出し、そして例１．２に記載のようにして肺細胞を
マウスミエローマ細胞Ｐ３−　Ｘ６３−　Ａｇ８．６５
３と融合させる。

１、２　　狙曜敗金 既に記載されている常法（Ｋ′ｏｈｌｅｒおよび旧１ｓ
ｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５．１９７５）に従って、
免疫処置マウスの肺細胞１０”個とマウスミエローマ細
胞系Ｐ３−　Ｘ６３Ａｇ８．６５３を使って１　ｍｌの
５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　４０００．Ｍ
ｅｒｃｋ）の存在下で細胞融合を行う。洗浄後、細胞を
３００−の標準ダルベツコ最少必須培地（Ｓｅｒｏｍｅ
ｄ）中に再懸濁する。支持細胞として１融合あたり３Ｘ
１０ｂ個の正常マウス腹腔浸出細胞と１５％ウシ胎児血
清を添加する。細胞を６枚の４８Ｘ１ｍｆのＣｏｓ　ｔ
ａｒプレートに分配する。３〜６週間の間、週２回培養
物に１（ＡＴ選沢培地、後にＨＴ培地を供給する。例１
．３に記載のアッセイにより、ハイブリドーマをスクリ
ーニングする。

モノクローナル抗体のＦ（ａｂ′、）ｚ断片を用いる結
合アッセイおよびサンドインチイムノアッセイにおいて
、抗イディオタイプＭＡｂの存在についてハイブリドー
マ上清をテストする。

間接結合アッセイについては、Ｋｕｓａｍａら（Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ、４７．４３１２．１９８７）により記載
されたようニシテＭＡｂ　７６３．７４のＦ（ａｂ’　
）２断片を調製する。各ウェルに０．１　Ｍ炭酸水素塩
緩衝液（ｐＨ９，５）中の抗体断片溶液（５μｇ／ｍ）
５０μｌを添加することにより、９６ウエルのポリ塩化
ビニル製マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａ　ｔｅｃ
ｈ）をＭＡｂ　７６３．７４のＦ（ａｂ’　）１断片で
コーティングする。４°Ｃで１６時間インキュベートし
た後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０が補足されたＰＢＳ
　（ｐ）１７．４）でプレートを２回洗浄し、そして５
０μｌ／ウエルのハイブリドーマ上清を添加する。４°
Ｃで６時間インキュベートした後、ＰＢＳ　−Ｔ２Ｏで
プレートを４回洗浄し、そして１２５１−標識抗マウス
ｔｇｃ異種抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓ
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ；　Ｉ　Ｘ１０’ｃｐｍ）を添加す
る。４°Ｃで４時間インキュベートした後、ＰＢＳ　−
７２０でプレートを４回洗浄し、そしてガンマカウンタ
ー中で結合した放射能を測定する。

サンドインチイムノアッセイについては、０．１Ｍ炭酸
水素塩緩衝液（ｐＨ９，５）中のモノクローナル抗体溶
液（１００Ｉ！ｇ／　Ｉｎ１）１００Ｉ１１を４°Ｃで
１６時間インキュベートすることにより、９６ウエルの
マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａ　ｔｅｃｈ）をＭ
Ａｂ　７６３．７４でコーティングする。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ　２０が補足されたＰＢＳ（ｐＨ７，４）で３
回洗浄した後、１００μ！のハイプリドーマ上清を添加
し、４　”Ｃで４時間インキュベーションを続ける。Ｐ
ＢＳ　−７２０でプレートを３回洗浄し、そして１２５
Ｉ−標識ＭＡｂ　７６３．７４　（Ｉ　Ｘ１Ｘ１０５ｃ
ｐと共に４°Ｃで４時間インキュベートする。ＰＢＳＴ
２０で５回洗浄後、ガンマカウンター中で結合した放射
能を測定する。

抗イディオタイプ抗体を産生ずるハイブリドーマは、４
．９％の頻度で検出される。

抗体Ｆ（ａｂ’　）ｚ断片の代わりに標的として細胞を
使って、上記の結合アッセイと同様な結合アッセイにお
いて、ＨＭＷ−ＭＡＡを担持しているヒト黒色腫細胞Ｃ
ｏ１ｏ　３８　（Ｑｕｉｎｎら、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

５９．３０１．１９７７）を使ってバイブ、リドーマ上
清をテストする。このテストにおいてハイブリドーマ上
清の１．２％が陽性であることがわかる。それらのハイ
プリドーマは全て、抗イディオタイプＭＡｂを分泌する
ものとは異なっている。それらの上清の別のテストは、
それらがヒトリンパ系細胞ＬＧ−２（Ｒ，八、Ｇａｔｔ
ｉ　　＆　　Ｗルｅｉｂｏｄ、Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ａｎｔ
ｉｇｅｎｓ　　１３＋３５、１９７９）とも反応するこ
とを示す。それらの抗体は、ヒトの有核細胞に対する天
然抗体を産生ずる肺細胞を用いて作製されたハイプリド
ーマにより分泌されるらしい。

抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマのうち、３つをそれぞれＭＫ２２３、　ＭＫ２
−７２およびＭＫ２−１２０と命名した。それらは、そ
れぞれ称号ＭＡｂ　ＭＫ２−２３．　Ｍ＾ｂＭＫ２−７
２およびＭＡｂ　ＭＫ２−１２０を有する抗イディオタ
イプモノクローナル抗体を分泌する。

腹水の形成のために、雌Ｂａ１ｂ／ｃマウス（２０〜２
５ｇ）を０．３　ｍｌのブリスタン油（Ａｌｄｒｉｃｈ
）でｉ、ｐ。

処理する。１〜３週間後、マウスに２回目のプリスタン
注射（０，２ｄ、ｉ、ｐ、　）を与え、そして同時に０
．２　ｍｌのＰＢＳ中の２Ｘ１０’個のハイブリドーマ
細胞をｉ、ｐ、接種する。８〜１０日後、生じた腹水を
回収し、８００ｇで遠心分離し、そして−２０°Ｃまた
は一８０°Ｃで保存する。

二段階法により腹水からモノクローナル抗体を精製する
。カプリル酸または４０％硫酸アンモニウム沈澱後、Ｄ
ＥＡＥ上でのイオン交換クロマトグラフィーにより抗体
を精製する。

純度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）により評価する。

２．２　−　　　でのバイブ１　ドーマのハイブリドー
マ細胞を、１０％ＦＣ５を含むＲＰＭ１１６４０培地（
Ｓｅｒｏｍｅｄ）中で生理的温度（３７°Ｃ付近）にお
いて５Ｘ１０’〜１０６細胞の最終細胞密度まで培養す
ることにより、ハイブリドーマ細胞の予備培養物を得る
。予備培養物全体をＢａ１ｌｃｏ培養フラスコに入れ、
新鮮なＲＰ旧１６４０培地／１０％ＦＣＳで全量を１５
００ｍｆｆｉに調整し、そして更に７〜１０日間撹拌す
る。この後、９５％の細胞が死んでいる。培養ブロスを
４°Ｃにて１０００　ｇで２０分間遠心する。上清を無
菌条件下で孔径０．２　ｔｎｎのフィルターに通して濾
過する。０゛Ｃにて０．９容の飽和硫酸アンモニウムの
ゆっくりした滴下添加により、粗免疫グロブノンを沈澱
させる。この沈澱物を実施例２．１に記載のようにして
精製する。

？ＩＡｂ　ＭＫ２−２３は、次のように更に特徴付けら
れる。

３．１　　称異性 クロラミンＴ法を使ってＭＡｂ　ＭＫ２−２３を１２５
１で放射能標識し、ＨＭＷ　−Ｍ静、　ＨＬＡクラス■
抗原およびＨＬＡクラス■抗原に対して向けられた比較
１’ｌＡｂのパネルを用いた結合アッセイにおいてテス
トする。比較抗体の特異性を下の第２表に示す。

このテストは次のようにして行う。まず比較モノクロー
ナル抗体でコーティングされたマイクロタイタープレー
ト（Ｄｙｎａ　ｔｅｃｈ）を１２５■−標識抗イディオ
タイプＭＡｂ（２Ｘ１０’ｃｐｍ／ウェル）と共に４“
Ｃで４時間インキュベートする。次いでＰＢＳ−７２０
でプレートを洗浄し、そしてガンマカウンター中で結合
した放射能を測定する。第２表に与えられた結果が示す
ように、ＭＫ２−２３は免疫処置用ＭＡｂ７６３．７４
とのみ反応する。

ロ６／６４ ＮＡＭＢ−１ Ｂ７／２１ ０２／７０ ＣＲＩＩ−４６２ ０５／１３ 男１遣。

Ｇ２ａ　　ＨＬＡ−８ ０，７ １ β２−ミクログロブリン ０ ０．６ ＨＬＡ−ＤＰ ＨＬＡ−ＤＲ ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＲ ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ ０，３ ０，４ ０，５ ０，７ 凡例、＊Ｉ２５１−標識ＭＡｂ　ＭＫ　２　２３　（ｃ
ｐｍ　Ｘ　１Ｏ−３）Ｉ　　Ｐ、Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ　
　ら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５゜６９６　　（１
９８５） ２に、Ｉｍａｉら、　Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、７２
，２３９（１９８２） ３　　Ｍ、Ｒ，Ｚｉａｉら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、
４１．２４１４（１９８７） ４　　Ｃ０Ｒｕ５ｓｏ　ら、　　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　１８．２３（１９８３） ５　　Ｍ、Ｔｓｕｊｉｓａｋｉ　　ら、　Ｔｒａｎｓｐ
ｌａｎｔａｔｉｏｎ本丘、６３２　（１９８８） ６に、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　　ら、　ｌｌｕｍ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、２１１９３　　（１９８８） ７　　　Ｖ、Ｑｕａｒａｎｔａら、　　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　１４゜４０３　　（１９８１） ３　　Ｍ、Ｃ，Ｔｕｒｃｏ　ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１３５．２２６８（１９８５） ９　　Ｖ、Ｑｕａｒａｎｔａら、　　Ｉｍｍｕｎｏｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ　１３＋２８５　　（１９８１） １０　　Ｍ、Ａ、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏら、３４．１８
　（１９８２） １１　　Ｔ、Ｃｒｅｐａｌｄｉら、 ２５　　（１９８５） １２　　八ｊ、Ｗａｔｓｏｎら・ （１９８２） １３　　Ｖ、Ｑｕａｒａｎｔａら、 （１９８１） Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９，７５５Ｔｉｓｓｕｅ　
Ａｎｔｉｇｅｎｓ　２６゜Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
１２６．５４８Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ；　　ｎ 抗イディオタイプモノクローナル抗体ＭＫ２−２３によ
り定義されるイディオタイプ抗原決定基と、免疫処置用
抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ　ＭＡｂ　７６３．７４の抗原結合
部位との間の関係を調べるために、培養された黒色腫細
胞Ｃｏ１ｏ　３ＢへのＭＡｂ　７６３．７４の結合を阻
害するＭＡｂ　ＭＫ２−２３の能力についてＷＭＫ２−
２３をテストする。

＋ｚｓ夏−標識抗−）ＩＭＷ　−ＭＡＡモノモノーナル
抗体ＭＡｂ　７６３．７４　（２Ｘ　１０’ｃｐｍ／　
５０ｍ）を、精製された未標識の抗イディオタイプＭＡ
ｂ　ＭＫ２−２３．　ＭＡｂＭＫ２−７２およびＭＡｂ
　ＭＫ２−１２０の溶液５０μ！と混合する。４°Ｃで
４時間インキュベートした後、各混合物を培養黒色腫細
胞Ｃｏ１ｏ　３８（２Ｘｌ０５）に添加する。４°Ｃに
て更に２時間インキュベーションを続ける。細胞をＰＢ
Ｓで５回洗浄し、結合した放射能をガンマカウンター中
でカウントする。

結果を第１図に示す。ＭＡｂ　ＭＫ２−２３はＩＩＭＷ
−Ｍ静の別の決定基に対して向けられたモノクローナル
抗体の黒色腫細胞への結合に影響を及ぼさないので、こ
の阻害は特異的である。更に、黒色腫細胞への抗−〇Ｍ
Ｗ−Ｍ静モノクローナル抗体７６３．７４の結合は、無
関係の抗イディオタイプＭＡｂにより影響を受けない。

３．３　　イディオタイプ　　゛　　のマツピング抜粋
した数の抗イディオタイプＭＡｂを用いて交差ブロッキ
ング実験を行い、免疫処置用抗−１（ＭＷ−門へへＭＡ
ｂ　７６３．７４上のＭＡｂ　ＭＫ２−２３により認識
されるイディオタイプ抗原決定基をマツピングする。

この目的に、上述のようにしてマイクロタイタープレー
トをモノクローナル抗体ＭＡｂ　７６３．７４でコ−テ
ィングする。未標識の抗イディオタイプ抗体ＭＡｂ　Ｍ
Ｋ２−２３．　ＭＡｂ　ＭＫ２−７２オヨびＭＡｂ　Ｍ
Ｋ２−１２０それぞれの倍々希釈液（最終濃度１００−
０．０００１ｘ／ｄ）と共に４°Ｃで４時間インキュベ
ートした後、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中の３種の抗イデ
ィオタイプ１２５■標識ＭＡｂ（２Ｘ１Ｘ１０５ｃｐの
各々と共に４°Ｃで４時間プレートをインキュベートす
る。次いでＴｗｅｅｎ　２０が補足されたＰＢＳでプレ
ートを洗浄し、そして結合した放射能をガンマカウンタ
ー中で測定する。

結果を下の第３表に示す。

第１表 １八すによ　ｆｉｌｌ　　されるイー゛イオタイフ。

ＭＫ２−２３　　　９２　　　　　８８　　　　　　０
ＭＫ２−７２　　　８４　　　　　９６　　　　　’Ｉ
ＭＫ２−１２０　　　２　　　　　　１　　　　　８０
ＭＡｂ　７６３．７４に対して向けられた３種の抗イデ
ィオタイプＭＡｂのうち、ＭＡｂ　ＭＫ２−２３とＭＫ
２−７２は互いを交差阻害するが、ＭＡｂ　Ｍに２−１
２０を阻害せｆＭＫ　２−１２０により阻害されない。

従って、ＭＡｂＭＫ２−２３とＭＫ２−７２は、ＭＡｂ
　ＭＫ２−１２０　ニより認識されるイディオタイプ抗
原決定基から空間的に離れた同一のまたは空間的に近い
イディオタイプ抗原決定基を認識する。

次の証拠により示されるように、ＭＡｂ　ＭＫ２−２３
は、ＨＭＷ　−ＭＡＡに対する体液性免疫および細胞性
免疫を誘導することができる（実施例５も参照のこと）
。

４．１　　−　イディオ　イブ　　′の４匹のＢａ１ｂ
／ｃマウスを、にＬＨに結合され、グルタルアルデヒド
で重合されそしてＣＦＡと混合された５０ｘの抗イディ
オタイプＭＡｂ　ＭＫ２−２３の皮下注射により感作す
る（実施例１．１参照）。次いで１４日目にＩＦＡ中の
そして２８日目にはＰＢＳ中の同一免疫原５０Ｉ！ｇで
マウスにブースター注射を行う。１２日目に血清を収得
する。対照グループのマウスは、免疫処置用モノクロー
ナル抗体ＭＡｂ　７６３．７４の抗原結合部位の外側の
イディオタイプ抗原決定基に対して向けられた抗イディ
オタイプＭＡｂ　ＭＫ２−１２０を用いて同じ方法で処
置される。

各マウスの血清を、培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８およ
び培養Ｂリンパ系細胞ＬＧ−２との反応性についてテス
トする。５０１１！の免疫血清および免疫前血清をそれ
ぞれ２Ｘ１０５の黒色腫細胞およびリンパ系細胞に添加
する。４°Ｃで２時間インキュベーション後、細胞を洗
浄し、１２５Ｉ−標識抗マウスＩｇ異種抗体（Ｉ　Ｘ１
０’ｃｐｍ）を添加する。インキュベーションを更に２
時間続けた後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、そして結合
した放射能をガンマカウンター中で測定する。

抗イディオタイプモノクローナル抗体ＭＡｂＭＫ２２３
で免疫処置されたマウスの血清のみが、第２図に示され
るように、黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３Ｂと反応する。この
免疫血清は培養Ｂリンパ系細胞ＬＧ−２とは反応しない
ので、結合は特異的である（第２図を参照のこと）。

ＭＡｂ　ＭＫ２−２３により惹起された抗体がＢＭＷ−
Ｍへへと反応すること、即ち抗−ＨＭＷ　−ＭＡＡ抗体
であることを証明するために、培養された黒色腫細胞Ｃ
ｏ１ｏ　３ＢからＭＡｂ　ＭＫ２−２３で免疫処置され
たＢａ１ｂ／Ｃマウスの血清により免疫沈澱された抗原
のＳＯＳ　−ＰＡＧＥ分析を行う。

この目的に、培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８をラクトペ
ルオキシダーゼ法で＋ｔＳ（、標識し、ＮＰ　４０を用
いて可溶化せしめる。抗＝ＭＡｂ　ＭＫ　２−２３血清
を用いた間接免疫沈澱後、免疫吸着体から抗原を溶出せ
しめ、そして２％のβ−メルカプトエタノールの存在下
で５％スラブゲル中でのＳＯ５−ＰＡＧＥにより分析す
る。ＮＰ　４０を用いた可溶化、免疫沈澱およびＳＯ５
−ＰＡＧＥは、Ｗｉｌｓｏｎら（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃ
ｅｒ　２８＋２９３、１９８１）により記載された通り
に行う。ＭＡ１１７６３．７４および正常マウス血清を
対照として使用する。ゲルはＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フ
イルム（Ｅａｓｔｍａｎ　ＫｏｄａｋＣｏ、）を使って
オートラジオグラフィー処理する。

ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析は、抗−ＭＡｂ　Ｍｇ２−２３
血清が、培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８から）ＩＭＷ　
−ＭＡＡに特徴的な電気泳動プロフィールを有する成分
を免疫沈澱させるので、抗−ＭＡｂ　Ｍｇ２−２３血清
がＨ肺−ＭＡＡと反応する抗体を含有することを示す。

最初に、同系の抗イディオタイプＭＡｂ　Ｍｇ２−２３
のＦ（ａｂ’　）２断片への抗−抗イディオタイプ抗体
の結合をテストする。

Ｐａｔｈａｍ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３１．２８
９５．１９８３）により記載された方法に従って、ＭＡ
ｂ　Ｍに２−２３のＦ（ａｂ’　）ｚ断片を作製する。

簡単に言えば、精製ＭＡｂ　Ｍｇ２−２３を１＝４０の
酵素：タンパク質比においてペプシン（Ｓｉｇｍａ）　
　と共にイン；トユベートする。消化はρ）１３．５に
おいて３７°Ｃで８時間行う。ＩＭＴｒｉｓ溶液でｐＨ
を７．０に上げることにより反応を停止させる。

次に混合物をＰＢＳ（ｐＨ７，４）に対して透析し、そ
して濃縮する。プロティンＡ−セファロース上でのアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、ＦＣ断片と未消
化の免疫グロブリンを除去する。

抗−抗イディオタイプ血清とＭＡｂ　Ｍに２−２３のＦ
（ａｂ’　）ｚ断片との反応性についてのテストは、実
施例４．２の結合アッセイと同様に行う。各マウスの血
清は該断片調製物と反応する。ＭＡｂ　Ｍｇ２−２３の
Ｆ（ａｂ’　）ｚ断片と反応性の抗体の力価は、培養黒
色腫細胞と反応性の抗体の力価よりも著しく高い。

更に、抗−抗イディオタイプ血清が免疫処置用抗−）Ｉ
ＭＷ−ＭＡＡ　ＭＡｂ　７６３．７４への＋ｚｓｌ−標
識ＭＡｂＭＫ２−２３の結合を阻害するかどうかを調べ
る。対照として、抗−抗イディオタイプ血清が、ＭＡｂ
７６３．７４により限定されるものとは全く別の決定基
を認識する対応する免疫処置用抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ　Ｍ
Ａｂへの別の抗イディオタイプモノクローナル抗体の結
合を阻害するかどうかもテストする。テストしようとす
る抗−抗イディオタイプ血清１００１１１を”５Ｉ−標
１ｋｔＪＬイア　４　オタイ７”ＭＡｂ（２Ｘ１０’Ｃ
−１）と共に４°Ｃで４時間インキュベートすることに
より、阻害アッセイを行う。次いでこの混合物を、免疫
処置用モノクローナル抗体（１ｎ／ウエル）でコーティ
ングされたマイクロタイタープレートのウェルに添加す
る。室温で２時間インキュベートした後、プレートをＰ
ＢＳ　−Ｔ２Ｏで５回洗浄する。

結合した放射能をガンマカウンター中で測定する。

結果は、免疫前血清の存在下で行った結合に比較した時
の、抗−抗イディオタイプ血清の存在下での１２５１−
標識抗イディオタイプＭＡｂの結合の阻害の百分率（％
）として表わす。

抗イディオタイプ？？Ａｂ　Ｍｇ２−２３で免疫処置さ
れたマウスの血清は、ＭＡｂ　７６３．７４への１２’
　Ｉ　−ＭＡｂＭＫ２−２３の結合を阻害する。５０％
の阻害を与える血清の希釈度は、培養黒色腫細胞への最
大結合の５０％を与えるものよりもずっと高いが、ＭＡ
ｂＭＫ２−２３０Ｆ　（ａｂ　’　）　ｚ断片への最大
結合の５０％を与えるものよりも低い。この血清は、免
疫処置用ＭＡｂ２２５．２８への１２５１−抗イディオ
タイプＭＡｂ　ＭＦＩＩ　−３０の結合、免疫処置用Ｍ
Ａｂ　ＴＰ４１．２への１２５Ｉ−抗イディオタイプＭ
Ａｂ　ＴＫ６−７４の結合、および免疫処置用ＭＡｂ　
ＴＰ６１．５への１２５１−抗イディオタイプＭＡｂ　
ＴＫ７−１１０の結合を阻害しないので、この血清の阻
害活性は非常に限定されている。

４．５　　−　イー゛イオ　イブ　　の　　グロブ１ン
クラス 黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３Ｂと反応する抗−抗イディオタ
イプ抗体（実施例４．２参照）およびＭＡｂ　Ｍに２−
２３のＦ（ａｂ’　）ｚ断片と反応する抗−抗イディオ
タイプ抗体（実施例４．４参照）の免疫グロブリンクラ
スは、マウスＩｇＭおよびマウスＩｇＧに特異的な＋２
Ｊ−標識異種抗体を使って、実施例４．２の結合アッセ
イの変形において決定した。ＭＡｂＭＫ２−２３０Ｆ（
ａｂ’　）ｚ断片と反応する抗体グループの中で、大部
分の抗体群はＩｇＧクラスのものであり、一方Ｃｏ１ｏ
　３８細胞と反応する抗体グループの中では、ＩｇＭ成
分はＩｇＧ成分よりもごくわずかに少ない。

４．６　　ＭＡｂ淋２−２３による里色　　　への−Ｍ
Ａｂ　ＭＫ２−２３により惹起された抗−抗イディオタ
イプ抗体がそれらの抗原結合部位において対応するイデ
ィオタイプ抗原決定基を発現するかどうかを決定するた
めに、阻害実験を行う。

阻害アッセイは、抗−抗イディオタイプ血清（１００ｍ
）をＭＡｂ　ＭＫ２−２３と共にＲＴで２時間インキュ
ベートすることにより行う。次に、この混合物を培養さ
れたヒト黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８に添加し、そして４
　”Ｃで更に２時間インキュベーションを続ける。細胞
をＰＢＳ　−ＢＳＡで３回洗浄し、そしてｚｓｌ−標識
抗ヒトＩｇ異種抗体と共にインキュベートする。５回の
洗浄後、結合した放射能をガンマカウンター中で測定す
る。無関係の抗イディオタイプモノクローナル抗体の存
在下での結合に比較した時の阻害の割合（％）として結
果を表わす。

抗−門Ａｂ　ＭＫ　２−２３血清は、ＭＡｂ　ＭＫ２−
２３とのインキュベーション後、培養黒色腫細胞Ｇｏｌ
ｏ　３８との反応性の減少を示す。この阻害は用量依存
性である。更に、抗−ＨＭＷ−旧へＭＡｂ　ＴＰ４１．
２により惹起された抗イディオタイプＭＡｂ　ＴＫ６−
７４は培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８と抗−ＭＡｂ　Ｍ
Ｋ２−２３との反応性７に影響を与えないので、この阻
害は特異的である。

この結果は、門＾ｂ７６３．７４と同様に、抗−抗イデ
ィオタイプ抗体が、ＭＡｂ　ＭＫ２−２３により認識さ
れるイディオタイプ抗原決定基をそれらの抗原結合部位
で発現することを明らかに示している。

ＭＡｂ　Ｍ）［２−２３により惹起された抗−抗イディ
オタイプ抗体の優れた特異性を、抗−１１ＭＷ−ＭＡＡ
ＭＡｂ　７６３．７４のそれと比較する大めに、交差阻
害実験を行う。このアッセイは、培養黒色腫細胞Ｃｏｌ
。

３Ｂ（２Ｘ１ｏ５）を１００Ｉ１１の抗−抗イディオタ
イプ血清と共に４°Ｃで２時間インキュベートすること
により行う。次いで上清を除去し、細胞に１２５１標識
抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ　ＭＡｂ　７６３．７４　（２ｘｌ
ｏ５ｃｐｍ）または１２５１−標識抗−ＩＣＡＭ−Ｉ　
ＭＡｂ　ＣＬ２０７．１４を添加する。４°Ｃで２時間
インキュベートした後細胞をＰＢＳ　−ＵＳＡで５回洗
浄し、そして結合しノ、・放射能をガンマカウンター中
で測定する。免疫前の血清と共にブレインキュベートし
た細胞への放射能標識モノクローナル抗体の結合に比較
した時の、抗−抗イディオタイプ血清と共にブレインキ
ュベートした細胞への放射能標識モノクローナル抗体の
結合の阻害の百分率（％）として、結果を表わす。

増加していく希釈度の抗−ＭＡｂ　ＭＫ２−２３血清と
の培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３Ｂのインキュベーション
は、用量依存形式においてＣｏ１ｏ　３８細胞への＋ｚ
ｓ■標識ＭＡｂ　７６３．７４の結合を阻害する。最低
の希釈度の抗−抗イディオタイプ抗血清を用いて得られ
た最大阻害は約６０％である。培養黒色腫細胞Ｃｏｌ。

３８と抗−抗イディオタイプ血清とのインキュベーショ
ンは、ＭＡｂ　７６３．７４により認識されるものとは
全く別個で且つ空間的に離れたｌ（ＭＷ−Ｍ八への決定
基をＬ２識する　Ｉｚ５Ｉ−標識抗−ＨＭＷ−−へへ門
へｂ２２５．２８、および１２５Ｉ−標識抗−ＩＣＡＰ
Ｉ−１？ｌＡｂ　ＣＬ２０７．１４を結合する能力を阻
害しないので、この阻害は特異的である。他方、抗−抗
イディオタイプ血清は、ＨＡｂ　７６３．７４と同一か
または空間的に近いＢＭＷ−Ｍ静の決定基を認識する＋
２Ｊ−標識ＭＡｂＶＴ８０のＣｏ１ｏ　３８細胞への結
合を阻害し、そして黒色腫細胞ｃｏｌｏ３８へのＭＡｂ
　７６３．７４の結合を交差阻害する。更に、正常マウ
ス血清とのインキュベーションは、　ｌ”　Ｉ　−１ｉ
ＭＡｂ　７６３．７４ヲ結合スルＣｏ１ｏ　３８細胞の
能力に影響を与えない。

抗イディオタイプＭＡｂ　ＭＫ２−２３での免疫処置が
培養黒色腫細胞に対する遅延型通感作（ＤＴＨ）を誘発
するかどうかを調べるため、に、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを
０，１４および２８日目にＭＡｂ　ＭＫ２−２３　（実
施例４．１）で免疫処置し、次いで５０日目に右後足肉
証に５Ｘ１０’個の放射線照射した（２０．０００Ｒａ
ｄ）培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８を注入する。各肉踊
の種火の厚さを０時、２４　、４８および７２時間後に
、ＤｉｇｉｔＯｕｔｓｉｄｅ　Ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ（
Ｍｉｔｕｔｏｙｏ　Ｃｏｒｐ、）で測定する。

対照として、反対の後足内証に培養Ｂリンパ系）、°Ｉ
胞ｔ、Ｃ＝２の注入を平行して行う。

注入の′２．４時間後に顕著な種火の厚さの増加が観察
され、再チャレンジ後７２時間持続する。この増加は、
ＬＧ−２細胞を注入した内証において観察されるものよ
りも有意に大きい。

抗−抗イディオタイプ抗体の誘導の際のＭＡｂ　ＭＫ２
−２３の用量効果を調べるために、４匹のマウスから成
る３つのグループの各々に５硝（グループＡ）　、５０
μｇ　（グループＢ）および５００ｘ　（グループＣ）
のＭＡｂ　ＭＫ　２１３（にＬＨに接合されており、０
白目にはＣＦＡと、１４日目にはＩＦＡとそして２８日
目にはＰＢＳと混合されたもの）を注入する。４２日目
に血清を収得し、そして１２５Ｉ−標識抗マウスｒｇ異
種抗体を用いる結合アッセイにおいて培養黒色腫細胞Ｃ
ｏ１ｏ　３８およびＭＡｂ　ＭＫ２−２３のＦ（ａｂ’
　）ｚ断片を用いてテストする。このテスト方法は、実
施例４．２と４．３に記載したアッセイと同様にして行
う。Ｃｏ１ｏ　３８細胞と反応する抗体は、グループへ
のマウス１匹、グループＢのマウス全部、およびグルー
プＣのマウス２匹の血清において検出される。どの血清
も培養Ｂリンパ系細胞りに−２との反応性を示さない。

全てのマウスがＭＡｂ　ＭＫ　２−２３０Ｆ（ａｂ’　
）２断片と反応する抗−抗イディオタイプ抗体を生成す
る。免疫処置に使われるＭＡｂ　ＭＫ２−２３の用量に
かかわらず、培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３Ｂと反応する
抗体のレベルは、ＭＡｂ　ＭＫ２−２３のＦ（ａｂ’　
）ｚ断片と反応する抗体のレベルよりも低い。更に、後
者の抗体のレベルは、５０および５００Ｉｇを注入され
たマウスよりも５μｇのＭＡｂ　ＭＫ２−２３を注入さ
れたマウスにおいて比較的低か、ったが、後の２つのグ
ループでは同様である。

６．２Ｍ八へＭＫ２−２３による　　　　の　　の抗−
抗イディオタイプ抗体の誘導の際の免疫処置の回数の効
果を調べるために、４匹ずつのマウスから成る３つのグ
ループを、ＫＬＨと接合されそしてＣＦＡとｌ捏合され
た５０μｇの１八ｂＭＫ：２−２３で０白目に感作し、
次いで異なるスケジュールに従って更に処理した。

・グルーマ°Ａ：追加免疫なし； ・グループＢ：１４白目にＫＬＨと接合されそして［Ｆ
Ａと混合されたＭＡｂ　ｌ’ｌＫ２−２３によるブース
ター免疫処置； ・グループＣ：ＫＬＨと１妾合されそして１４日目には
ＩＦＡとそして２８日目にはＰＢＳと混合されたＭＡｂ
　ＭＫ２−２３による１４日目と２８日目の）゛−スタ
ー免疫処胃。

４２日目に血清を収得し、そして１２５１−標識抗マウ
スＩｇ異種抗体を用いる結合アッセイにおいて、培養黒
色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８およびＭＡｂ　ＭＫ２−２３０
Ｆ　（ａｂ　’　）　ｚ断片との反応性についてテスト
する。培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８と反応する抗体は
、グループＡのマウス１匹、グループＢのマウス全部、
およびグループＣのマウス３匹において検出される。

いずれの血清も、培養Ｂリンパ系細胞ＬＧ−２との反応
性を示さない。全てのマウスは、ＭＡｂ　ＭＫ２−２３
のＦ（ａｂ’　）２断片と反応する抗−抗イディオタイ
プ抗体を誘導する。抗−抗イディオタイプ抗体のレベル
は、１回のみ注入されたマウスでは他の２グループのマ
ウスよりも低いが、この２グル一プ間では顕著な相違は
全く認められない。免疫処置の回数に関係なく、ＭＡｂ
　ＭＫ２−２３のＦ（ａｂ’　）ｚ断片と反応する抗体
は比較的高レベルを示し、またはＣｏ１ｏ　３８細胞と
反応する検出可能な抗体を持たないマウスにおいてさえ
も存在する。

６．３　　旦　およびアジュバントの入渠ＭＡｂ　ＭＫ
２−２３の免疫原性における担体および／またはアジュ
バントへの接合の効果を調べるために、各々４匹のマウ
スから成るグループを、次のように与えられた５０ｔｔ
ｇの抗体を用いて０白目と１４日目に免疫処置する。

・グループＣ：感作用のＭＡｂ　ＭＫ２−２３・グルー
プＢ：ＫＬＨと接合されたＭＡｂ　ＭＫ２−２３・グル
ープＣ：感作用にはＣＦＡ　、そしてブースター用には
ＩＰ八と混合されたＭＡｂ　ＭＫ　２−２３４２日目に
血清を収得し、そして培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８お
よびＭＡｂ　ＭＫ２−２３のＦ（ａｂ’　）ｚ断片との
反応性についてテストする。

アジュバントと混合されたＭＡｂ　ＭＫ　２−２３によ
り免疫処置された（グループＣ）１匹のマウスの血清は
、培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８との低反応性を示すが
、残りのマウスの血清にはＣｏ１ｏ　３８細胞と反応す
る抗体が全く検出されない。未接合のＭＡｂ　ＭＫ２−
２３を注入されたマウス（グループＡ）の血清はＭＡｂ
　ＭＫ２−２３のＦ（ａｂ’　）ｚ断片と反応しないが
、一方他の２グループのマウスの血清は同様な低い結合
活性を示し、そしてＭＡｂ　７６３．７４への１２５１
標識ＭＡｂ　ＭＫ２−２３の結合を５０％未満阻害する
。

実１捌ユニＪｕ訓双生 実施例１と２に従って調製した０、２５ｍｇの抗イディ
オタイプモノクローナル抗体ＭＡｂ　ＭＫ２−２３を、
５　ｍｌの生理的食塩水に溶かす。この溶液を細菌フィ
ルターに通過させ、そして無菌条件下で濾液をアンプル
に充填する。アンプルは好ましくは冷却下、例えば−２
０°Ｃで保存する。

夫嵐炭■’　　イディオタイプモノクローナル−進行し
た（第■朋）黒色腫にかかっている患者を用いた臨床試
験において、抗イディオタイプモノクローナル抗体ＭＫ
２−２３を適用する。患者は生体応答調節剤を含む様々
なタイプの治療で前に処置され不成功に終わった。

１５人の患者を、ＫＬＨに接合されそしてカルツ・ント
ーゲラン杆菌（ＢＣＧ）　　と混合された２ｍｇのＭＡ
ｂ　ＭＫ２−２３で免疫処置し、そして１２人の患者を
ＭＡｂ　ＭＫ２−２３（接合およびアジュバントなし）
で免疫処置する。免疫処置は、０．７および２８日目に
皮肉投与により行う。毎週血清を得、抗−抗イディオタ
イプ抗体（対応する抗−［ＭＷ　−ＭＡＡ抗体への免疫
原として使用した抗イディオタイプ抗体の結合を阻害す
る抗体）の生成、ＨＭＷ　−ＭＡＡ有する黒色腫細胞と
の反応性、ＨＭＷ　−ＭＡＡ　レベル、および抗マウス
抗体の生成についてテストする。用量段階的増加試験は
、抗−抗イディオタイプ抗体の誘導においては、注射あ
たり２■用量がそれより低用量よりも効果的であり、そ
してそれより高用量と同じ位効果的であることを示す。

黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８と反応する抗体は、ＫＬＨに
接合されそしてＢＣＧと混合されたＭＡｂ　ＭＫ２−２
３により免疫処置された患者の７３％において検出され
、そして未接合のＭＡｂ　ＭＫ２−２３により免疫処置
された患者の１６％において検出される。それらの結果
は、動物モデル系において得られた結果（実施例６．３
参照）と一致して、担体分子へのモノクローナル抗体の
接合およびアジュバントとの混合が抗体の免疫原性を増
強することを示す。

免疫処置された患者の血清は、特異的な形式においてＣ
ｏ１ｏ　３８黒色腫細胞への１２５１−標識抗１１ＭＷ
−ＭＡＡ　ＭＡｂ　７６３．７４の結合を部分的に阻害
する。

ＭＡｂ　ＭＫ２−２３は、培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３
８への免疫処置患者の血清の結合を阻害する。

患者の血清から抗−マウスＩｇ抗体を除去し、そして血
清中のＭＫ２−２３により誘導された抗体を、固定化Ｍ
Ａｂ　Ｍに２−２３上でのアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製する。この精製抗体は、固定化抗−Ｈ
ＭＷ−ＭＡＡ　ＭＡｂ　１４９．５３上でのアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより黒色腫細胞Ｃｏｌ。

３８の抽出物から単離されたＨＭＷ　−ＭＡＡ　と反応
する。

ＫＬＨに接合されそしてＢＣＧと混合されたＭＡｂ　Ｍ
Ｋ２−２３により免疫処置された患者の約８５％、およ
び未接合のＭＡｂ　ＭＫ２−２３により免疫処置された
患者の約６０％が、抗−Ｈ肚−ＭＡＡ　ＭＡｂ　７６３
．イ４への１２５■−標識ＭＫ２−２３の結合を阻害す
る抗−抗イディオタイプ抗体を持つようになる。

はとんど全ての患者が、２グループの患者間に顕著な相
違なく、増加されたレベルの抗−マウスＩｇ抗体を持つ
ようになる。

免疫処置された患者の少なくとも６人において、転移病
変のサイズの減少が観察される。

このデータは、マウス抗イディオタイプＭＡｂ　Ｍに２
−２３が、黒色腫病変中でＨＭＷ　−ＭＡＡを発現する
が検出可能な抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を全く示さな
い患者において抗−〇ＭＷ−ＭＡＡ抗体を誘導すること
を示す。従って、抗イディオタイプＭＡｂＭＫ２２３は
、対応する抗原１（ＭＷ−ＭＡＡそれ自体よりもより免
疫原性であると思われる。

【図面の簡単な説明】

■上回：抗イディオタイプ門静による培養黒色腫細胞Ｃ
ｏ１０３８への１２５Ｉ−標識抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ　Ｍ
Ａｂ７６３．７４の結合の阻害。 記号　・：抗イディオタイプＭＡｂ　ＭＫ２−２３■：
抗イディオタイプＭＡｂ　ＭＫ２−７２ム：抗イディオ
タイプＭＡｂ　ＭＫ２−１２０１ｍ：抗イディオタイプ
ＭＡｂ　ｌ’ｌＫ　２−２３（Ｂａｌｂ／　ｃマウス由
来）と培養黒色腫細胞との反応性。 記号　−：黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８ ：Ｂリンパ系細胞ＬＧ−２（対照） △：免疫血清 ○：免疫前血清（対照） 五匹胚Ｊ 七ノクローカレ抗ｊオ〜（■／ｍ１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）
   上のモノクローナル抗体により認識される決定基の内部
   像であるマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体、
   それが誘導される抗体の特異性を保持しているその誘導
   体。 ２、ＩｇＧイソタイプである、請求項１に記載のマウス
   抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその誘導体
   。 ３、高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）上の
   ＭＡｂ７６３．７４と称するモノクローナル抗体により
   認識される決定基の内部像である、請求項１に記載のマ
   ウス抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその誘
   導体。 ４、ＭＡｂＭＫ２−２３と称する請求項３に記載のマウ
   ス抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその誘導
   体。 ５、ＭＡｂＭＫ２−２３およびＭＡｂＭＫ２−１２０か
   ら成る群がら選択される請求項３に記載のマウス抗イデ
   ィオタイプモノクローナル抗体およびその誘導体。 ６、抗体断片である、請求項１に記載のマウス抗イディ
   オタイプモノクローナル抗体の誘導体。 ７、免疫原性を増強する担体、酵素、蛍光マーカー、化
   学発光マーカー、金属キレート、常磁性粒子、アビジン
   またはビオチンとの接合体である、請求項１に記載のマ
   ウス抗イディオタイプモノクローナル抗体の誘導体。 ８、放射能標識されている、請求項１に記載のマウス抗
   イディオタイプモノクローナル抗体の誘導体。 ９、請求項１に記載のマウス抗イディオタイプモノクロ
   ーナル抗体およびその誘導体の調製方法であって、前記
   抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌するハイブ
   リドーマ細胞を試験管内または生体内で増殖させ、そし
   て所望する時、得られた抗イディオタイプモノクローナ
   ル抗体を単離しそして／またはその誘導体に変換するこ
   とを含んで成る方法。１０、請求項１に記載のマウス抗
   イディオタイプモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
   ドーマ細胞系。 １１、高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に
   対して向けられたモノクローナル抗体で免疫処置された
   マウスのＢリンパ球とミエローマ細胞とのハイブリッド
   である、請求項１０に記載のハイブリドーマ細胞系。 １２、ＭＡｂ７６３．７４で免疫処置されたマウスのＢ
   リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリッドであ
   る、請求項１１に記載のハイブリドーマ細胞系。 １３、１９８９年１０月３１日にＨＢ１０２８８号のも
   とにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
   ＡＴＣＣ）に寄託されている、ＭＫ２−２３と称する請
   求項１２に記載のハイブリドーマ細胞系。 １４、ＭＫ２−７２およびＭＫ２−１２０と称するハイ
   ブリドーマ細胞系から成る群から選択される、請求項１
   ２に記載のハイブリドーマ細胞系。 １５、請求項１０に記載のハイブリドーマ細胞系の調製
   方法であって、高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−Ｍ
   ＡＡ）に対して向けられたモノクローナル抗体でマウス
   を免疫処置し、該マウスの抗イディオタイプ抗体産生細
   胞を連続細胞系の細胞と融合せしめ、融合で得られたハ
   イブリッド細胞をクローニングし、そして所望の抗イデ
   ィオタイプ抗体を分泌する細胞クローンを選択すること
   を含んで成る方法。 １６、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合された高
   分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に対して向
   けられたモノクローナル抗体でマウスを免疫処置するこ
   とを含んで成る、請求項１５に記載の方法。 １７、請求項１に記載のマウス抗イディオタイプモノク
   ローナル抗体および／またはその誘導体を含んで成る医
   薬組成物。 １８、前記マウス抗イディオタイプモノクローナル抗体
   の誘導体が免疫原性を増強する担体との接合体である、
   請求項１７に記載の医薬組成物。 １９、前記担体がアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）であ
   る、請求項１８に記載の医薬組成物。 ２０、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）アジュバント
   を更に含んで成る、請求項１９に記載の医薬組成物。 ２１、高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に
   対して向けられた抗体の定性または定量方法であって、
   請求項１に記載のマウス抗イディオタイプモノクローナ
   ル抗体および／またはその誘導体をイムノアッセイにお
   いて使用することを特徴とする方法。 ２２、前記イムノアッセイがラジオイムノアッセイ、エ
   ンザイムイムノアッセイまたは化学発光イムノアッセイ
   であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。 ２３、高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に
   対して向けられた抗体の定性または定量のためのテスト
   キットであって、請求項１に記載のマウス抗イディオタ
   イプモノクローナル抗体および／またはその誘導体、並
   びに所望により、他のモノクローナルもしくはポリクロ
   ーナル抗体および／または添加剤を含んで成るテストキ
   ット。