JPH0372500A - 免疫グロブリンイソタイプに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、特にマウスま
たはヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられた
モノクローナル抗体およびその誘導体に関する。該モノ
クローナル抗体はキメラ抗体または二特異性抗体である
ことができる。それらは、遊離のＩｇＥおよびＩｇＥ陽
性Ｂ細胞の表面上に発現されたＩｇＥを認識するが、Ｆ
ｃεレセプター■またはＩＩを有する細胞に結合したＩ
ｇＥを認識せず、そしてメディエータ−放出を触発しな
い、そのような抗体および誘導体の調製方法、該抗体を
分泌する連続細胞系並びに該細胞系の調製方法もまた、
本発明の主題である。該モノクローナル抗体および／ま
たはそれらの誘導体は、ＩｇＥおよびＩｇＥ産生細胞の
測定並びにアレルギーの治療および予防において有用で
ある。本発明は、該抗体および／またはそれらの誘導体
を含んで成るテストキットおよび医薬組成物にも関する
。

〔従来の技術〕

アレルギーは、外来物質（アレルゲン）に対する過大な
免疫応答により引き起こされる過敏状態である。アレル
ゲンとの接触直後のアレルギー反応により特徴づけられ
る即時型（ｆ型）ｉｔ！ｌ敏症はＢ細胞により媒介され
そして抗原−抗体反応に基づいており、一方遅延型過敏
症はＴ細胞により媒介されそして細胞性免疫機構に基づ
いている。近年、「アレルギー」という用語は次第にＩ
型過敏症と同義に用いられることが多くなってきている
。

即時型過敏症は、アレルゲンと対面すると抗体を分泌す
る形質細胞に分化するＢ細胞による免疫グロブリンクラ
スＥの抗体（Ｉ　ｇＥ抗体）の産生に基づく。ＩｇＥに
より引き起こされる反応は、体内へのアレルゲンの侵入
部位、即ち粘膜表面および／または局所リンパ節で起こ
る局所反応である。局所的に産生されたＩｇＥは、まず
局所マスト細胞を感作するだろう。即ち、ＩｇＥ抗体が
マスト細胞の表面上のＦｃεレセプターに定常領域で結
合し、次いで「過剰の（ｓｐｉｌｌ−ｏｖｅｒ）　Ｊ　
Ｉ　ｇ　Ｅが循環系に入り、そして体中の循環している
好塩基球上および＆Ｉｌ織に固定されたマスト細胞上の
レセプターに結合する。結合したＩｇＥがその後アレル
ゲンと接触すると、アレルゲンの結合によりＦｃεレセ
プターが架橋し、細胞の脱顆粒を引き起こし、そして多
数のアナフィラキシ−メディエータ−１例えばヒスタミ
ン、プロスタグランジン、ロイコトリエン等の放出を引
き起こす。それらの物質の放出は、即時型過敏症に典型
的な臨床的症状、即ち気道または腸の平滑筋の収縮、毛
細血管の拡張、水および血漿タンパク質に対するそれら
の透過性の増加、例えば鼻炎、アトピー性湿疹およびぜ
ん息を生じる粘液の分泌、並びにかゆみおよび痛みを生
じる皮膚中の神経末端の刺激を招く。

加えて、アレルゲンとの一次接触後、幾つかのＢ！ｌｌ
胞は細胞表面上にＩｇＥを発現することにより表面１ｇ
Ｅ陽性Ｂ細胞（ｓ１ｇＥ″Ｂ細胞）の「記憶ブール」を
形成するので、アレルゲンとの二次接触時の反応は強化
される。

現在のアレルギーの治療法は２つのアプローチに集中し
ている。１つは、例えば抗ヒスタミン薬のようにメディ
エータ−を阻害する薬剤または細胞増殖抑制薬もしくは
コルチコステロイドのように免疫抑制性である薬剤を使
用することにより、アレルギー症状のみを治療するもの
である。このアプローチは繰り返し投薬を必要とし、そ
して望ましくない副作用を伴うことがある。脱感作と名
づけられたもう１つの治療アプローチは、アレルギーの
根本的状態を治療するように意図されている。脱感作の
目標は、原因となるアレルゲンを最初は少量、その後増
量しながら一定期間に渡り投与することにより、特定の
アレルゲンに対する患者の寛容の改善を達成することで
ある。このアプローチは、相当な不快を伴う恐れがあり
、アレルゲンの同定および入手可能性を前提としており
、そして患者の段間もの通院を必要とする。また、患者
が過敏性であるアレルゲンをいつも同定できるとは限ら
ず、脱感作治療が不可能になることがある。更に、この
治療法は危険がないわけではない。上記のアプローチの
どちらも、過敏性状態の発生に対して予防することはで
きない。

アレルギーの誘発における最も初期の反応でありそして
アレルギー状態の維持に備えるＩｇＥ免疫応答をダウン
レギュレートすることによりアレルギー反応を抑制する
治療方法が有望であろう。

この方法は、他の抗体クラスの応答に影響を与えること
なく、そのためアレルギー症状における即時効果と長期
持続効果の両方をもたらす。そのような治療は、ＩｇＥ
イソタイプ特異的であり、従ってｒｇＥを結合すること
ができる抗体、例えばモノクローナル抗体の適用に基づ
いてもよい。加えてそのような抗体は、表面１ｇＥ陽性
Ｂ細胞を機能的に除去するのに用いることができるよう
に、ＩｇＥ産生形質細胞になる表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞と
反応すべきである。しかし、ＩｇＥに対する抗体は、理
論上はＦｃεレセプターを架橋し、よって血清ＩｇＥお
よびｓ１ｇＥ″Ｂ細胞レベルに及ぼす有益な効果を拮抗
することにより、ＩｇＥで感作されたマスト細胞からの
メディエータ−の放出を誘導し得る。結果として、アレ
ルギー療法に適用できる抗体は、感作されたマスト細胞
または好塩基球上に結合したＩｇＥと反応してはならな
いが、ｓ１ｇＥ″Ｂ細胞を認識する能力を保持していな
ければならない。

ＩｇＥイソタイプ特異的抗体は、幾つかの研究グループ
により記載されている。例えばＣｏｎｒａｄら（Ｉｎｔ
、Ａｒｃｈｓ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎ
、７０，３５２．１９８３）は、マウス−抗うットＩｇ
Ｅモノクローナル抗体を記載しているが、この抗体はマ
スト細胞へのＩｇＥの結合を妨害しない、　Ｃｈｒ６ｔ
ｉｅｎら（Ｊ、■ｌｌａ＋ｕｎｏｌ。

匪、　３１２８．１９８８）は、マウス−抗ヒトｒｇＥ
モノクローナル抗体を開示しており、そのうちの２つが
ＦｃεレセプターへのＩｇＥの結合を阻害することがで
きる。しかしながら、記載された抗体はいずれもメディ
エータ−放出を誘導しない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、ＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向
けられたモノクローナル抗体を提供することであって、
該抗体は次の特徴を有する。

・ＦｃεレセプターＩまたはＩＩを有する細胞へのＩｇ
Ｅの結合を阻害し、 ・表面１ｇＥ陽性Ｂ細胞（ｓ１ｇＥ″Ｂ細胞）の表面上
に発現されたＩｇＥを認識および結合し、・Ｆｃεレセ
プターＩまたはＩＩを有する細胞、例えば感作されたマ
スト細胞および好塩基球の表面上に結合しているＴｇＥ
を認識および結合せず、そして ・感作された細胞からのメディエータ−放出を触発しな
い。

本発明のモノクローナル抗体はそれらの特徴を有し、従
って当業界で知られるＩｇＥイソタイプ特異的抗体の欠
点を克服する。それらは形成されたＩｇＥ抗体を中和し
、そして既に感作された細胞からのメディエータ−放出
を触発することなくｓｌｇＥ”　Ｂ細胞集団を涸渇させ
ることができる。従って、それらはアレルギーの治療並
びに予防のために非常に有用である。

驚くべきことに、本発明のモノクローナル抗体は、他の
抗体クラスの免疫応答に影響を及ぼすことなく、免疫応
答でのＩｇＥの形成において阻害効果を有する。結果と
して、それらはＩｇＥの形成を阻害することにより始め
から直接１ｇＥ応答を抑制するので、治療薬および予防
薬として非常に優れている。

従って、本発明の目的は、アレルギーを治療および予防
する方法を提供することであって、該方法は、 ・症状の代わりにアレルギーの根本的原因を治療し、 ・特定のアレルゲンの同定を必要とせず、・特定のアレ
ルゲンに対する過敏性応答を治療することに限定されず
、 ・段目もの繰返し投薬を必要とせず、そして・長％ＪＩ
持続効果を誘導する。

二特異性であり、従って適当な第二の抗体特異性を選択
することにより治療効果を増強することができるか、ま
たはキメラであり、即ちヒト定常領域を有し、従って免
疫原性が殆どなくそして適用時にアナフィラキシ−反応
を誘導しないような所望の特異性を有するモノクローナ
ル抗体を作製することも望ましい。定常領域は、所望に
より内因性エフェクター機能を仲介するように選択する
ことができる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、Ｆｃεレセプター１またはＩＩを有する細胞
への遊離ＩｇＥの結合を阻害し、そして表面１ｇＥ陽性
Ｂ細胞上に発現されたＩｇＥを認識するが、Ｆｃεレセ
プターＩまたはＩＩを有する細胞の表面上に結合したＩ
ｇＥを認識せず、従ってそのような細胞からのメディエ
ータ−放出を触発しない、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）
のイソタイプ決定基に対して向けられたモノクローナル
抗体；および該抗体の特異性を保持しているその誘導体
に関する。ＦｃεレセプターＩを有するマスト細胞およ
び好塩基球の表面に結合したＩｇＥを認識せず、そして
そのような細胞からのアナフィラキシ−メディエータ−
放出を触発しない本発明のモノクローナル抗体およびそ
の誘導体が好ましい。

更に免疫応答におけるＩｇＥ形成を特異的に阻害し所望
の特異性を有する本発明のモノクローナル抗体およびそ
の誘導体も好ましい。

本発明のモノクローナル抗体およびそれらの誘導体は、
クラスＥの免疫グロブリンに共通なε重鎖上の抗原決定
基を認識する。即ち、それらは異なる特異性のＩｇＥ分
子と反応するが、他のイソタイプの免疫グロブリンまた
は軽鎖とは反応しない。本発明のモノクローナル抗体お
よびその誘導体は、遊離ＩｇＥ抗体を中和する。即ち、
それらはＦｃεレセプターｆまたは■を有する細胞への
ＩｇＥの結合が阻害されるような方法で遊離ＩｇＥ抗体
と結合する。ＦｃεレセプターＩは高親和性Ｆｃεレセ
プター（解離定数Ｋｎ＝約１０”）であり、そしてマス
ト細胞および好塩基球上に見つかる。Ｆｃεレセプター
Ｈは低親和性Ｆｃεレセプター（Ｋ、＝約１０６）であ
り、単球、肺胞マクロファージ、好酸球、並びに成る種
のＴおよびＢ細胞（表面μδ゛活性化Ｂ細胞）上に見つ
かる。加えて、本発明のモノクローナル抗体およびそれ
らの誘導体は、表面１ｇＥ陽性（ｓｌｇＥ”　）　Ｂ細
胞の表面上に発現されたＩｇＥを認識するので、そのよ
うなり細胞を機能的に除去することができ、従って「ア
レルギーの記憶」に影響を与えることができる。しかし
ながら、それらはＦｃεレセプター■またはＩＩを有す
る細胞、特に感作されたマスト細胞または好塩基球、の
表面上に結合したＩｇＥを認識しない。即ち、それらは
ＩｇＥがそのような細胞上に結合する時に隠蔽されるＩ
ｇＥのエピトープと反応する。この特異性の結果として
、本発明のモノクローナル抗体およびその誘導体はＦｃ
εレセプターの架橋を行わず、従ってＦｃεレセプター
を有する細胞からのメゾ−イエ−ター放出を誘導せず、
例えばマスト細胞や好塩基球の脱顆粒並びにアナフィラ
キシ−メディエータ−の放出を引き起こさない。好まし
いのは、上述の特異性を有し、免疫応答におけるＩｇＥ
形成を特異的に阻害し、即ちＩｇＥ産生細胞へのＢ細胞
の分化を防ぐモノクローナル抗体およびその誘導体であ
る。

Ｆｃεレセプター所有細胞へのＩｇＥの結合を阻害する
本発明のモノクローナル抗体の能力は、例えば競合ラジ
オイムノアッセイにおいて測定することができる。この
場合、例えば懸濁液中のまたは適当な担体に結合したマ
スト細胞を、放射能ラベル化されたＩｇＥ、例えば１ｆ
ｆｉｓ　［（、Ｊｌおよびテストしようとする本発明の
モノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして放
射能を測定することにより該細胞に結合したＩｇＥの量
を決定する。Ｆｃεレセプター■所有細胞へのＩｇＥの
結合を阻害する本発明のモノクローナル抗体の能力は、
例えば、Ｆｃεレセプター■所有ＲＰＭＩ　Ｂ８６６細
胞を用いて、ＩｇＥでコーティングされたラテックスビ
ーズの凝集の阻害を測定することにより検出することが
できる。

染色実験は、本発明のモノクローナル抗体がｓ１ｇＥ″
Ｂ細胞を認識するが例えばマスト細胞および好塩基球の
表面上に結合したＩｇＥを認識しないことを証明する。

本発明のモノクローナル抗体により誘発される、メディ
エータ−放出は、例えば、マスト細胞をＩｇＥとインキ
ュベートし、本発明のモノクローナル抗体を加え、そし
て該細胞から放出されるビスタ旦ンの量を例えばラジオ
イムノアッセイにおいて測定することにより、測定する
ことができる。

免疫応答のＩｇＥ形成における本発明のモノクローナル
抗体の阻害効果は、例えば、試験管内または生体内免疫
応答アッセイにおいて測定することができる。この場合
、培養液中のＢ細胞または動物全体をアレルゲンで誘発
し、そして形成されたＩｇＥ抗体を例えばエンザイムイ
ムノアッセイもしくはラジオイムノアッセイにより測定
するか、またはＩｇＥ産生細胞を例えば後述の細胞プラ
ーク形成アッセイにより測定する。

本発明のモノクローナル抗体は免疫グロブリンクラスＩ
ｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡまたはＩｇＤであることがで
きるが、好ましくはクラスＩｇＧ、最も好ましくはクラ
スＩｇＧ　　１である。主としてＨ鎖のカルボキシ末端
の定常領域セグメントにより決定される免疫グロブリン
の種々のクラスおよびサブクラスは、種々のエフヱクタ
ー機能（補体結合、食細胞の刺激、好中球活性化等）に
関係がある。結果として、特定のＩｇＥクラスの本発明
のモノクローナル抗体を使うことにより、所望の作用に
応じて免疫応答における該抗体の役割を選ぶことができ
る。例えば、ＩｇＧ　１抗体は抗体依存性細胞障害作用
（ＡＤＣＣ）　、即ち細胞毒性の潜在力を有する特定の
エフヱクター細胞が抗体Ｆｃ７レセプターに結合しそし
て該抗体が向けられる標的細胞を溶解する反応、におい
て主要な役割を果たす。従って、ＩｇＧサブクラスＩｇ
Ｇ　１である本発明のモノクローナル抗体は、ｓＩｇＥ
”　Ｂ細胞に結合し、そしてｓ１ｇＥ″Ｂ細胞を殺す細
胞毒性細胞を誘引することにより、ＩｇＥ″Ｂ細胞集団
を特異的に除去するために使用することができる。

マウスＩｇＥのインタイブ決定基に対して向けられた本
発明のモノクローナル抗体、好ましくはラットモノクロ
ーナル抗体、およびその誘導体が好ましい。最も好まし
いのは、マウスＩｇＥに特異的であり称号ＭＡｂ　１−
５を有するラットモノクローナル抗体、およびその誘導
体である。

更に好ましいのは、ヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対
して向けられた本発明のモノクローナル抗体、優先的に
はマウスまたはラットモノクローナル抗体、およびその
誘導体である。最も好ましいのは、ヒトＩｇＥに特異的
であり呼称ＭＡｂ　Ｆ１４３−１７を有するマウスモノ
クローナル抗体である。

ヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられた本発
明の動物／ヒトキメラモノクローナル抗体およびその誘
導体が好ましい。本発明のキメラモノクローナル抗体は
、キメラ免疫グロブリン重鎖および軽鎖から成る。各キ
メラ鎖は所望の特異性を有するヒト以外の可変領域とヒ
ト定常領域とを有する連続ポリペプチドである。キメラ
重鎖および軽鎖が会合すると、機能性抗原結合領域を有
する分子を形成する。最も好ましいのは、マウス可変領
域とヒト定常領域とから成り、ヒ）ＩｇＥのイソタイプ
決定基に対して向けられた本発明のキメラモノクローナ
ル抗体、およびその誘導体である。

キメラ免疫グロブリンの重鎖定常領域は、アルファ（α
）、〜デルタ（δ）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）
のインタイブのいずれからも選択することができる。様
々なサブクラス、例えば１ｇＧサブクラス１−４の＠鎖
を使用することができる。異なるクラスおよびサブクラ
スの重鎖は異なるエフェクター機能に関係があり、従っ
て重鎖定常領域のタイプを選択することにより所望のエ
フェクター機能を有するキメラ抗体を作製することがで
きる。軽鎖はカッパ（に）またはうムダ（λ）定常項の
いずれかを有することができる。

１つはヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられ
た本発明のモノクローナル抗体から誘導されそして２つ
目は異なる特異性を有する抗体から誘導された、２つの
異なる抗原結合性部分を含んで成る二特異性モノクロー
ナル抗体もまた好ましい。例えば、第二の特異性が細胞
増殖抑制薬または細胞毒性薬のような薬剤に対するもの
であり、表面ＩｇＥを発現しているＢ細胞（ｓｌｇＥ”
　Ｂ細胞）への薬剤輸送を達成することができる。適当
な細胞増殖抑制または細胞毒性物質は、下記にモノクロ
ーナル抗体誘導体について記載されるものである。第二
の特異性は、第一抗体とは異なるヒトＩｇＥ上のエピト
ープを認識し、従って免疫複合体の形成および補体結合
を促進するような本発明の別のモノクローナル抗体から
誘導することもできる。

本発明のモノクローナル抗体の誘導体は、それらが誘導
される抗体の特異性を保持している。即ち、それらはＩ
ｇＥへの親の抗体の特徴的結合パターンを保持している
。そのような誘導体の例は、モノクローナル抗体の断片
、モノクローナル抗体と酵素、蛍光マーカー、化学発光
マーカー、金属キレート、細胞増殖抑制物質もしくは細
胞毒性物質、アビジン、ビオチン等との接合体、または
放射能ラベル化されたモノクローナル抗体である。

本発明の抗体断片は、例えば−価の断片Ｆａｂ（Ｆａｂ
：抗原結合性断片）またはＦａｂ’および二価の断片Ｆ
（ａｂ’　）ｔである。

本発明の抗体接合体に使用される酵素は、例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。

本発明のモノクローナル抗体と接合される蛍光マーカー
は、フルオレセイン、フルオロクロム、ローダミン等で
ある。

化学発光マーカーは、例えばルミノールのアクリジニウ
ムエステルである。

そのような接合体においては、抗体は直接またはスペー
サーもしくはリンカ−基を介して接合パートナ−と結合
している。金属キレート化剤についての例は、エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴ＾）、ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（ＤＰＴＡ）　、１　。

４．８．１１−テトラアザテトラデカン、Ｉ、４゜８．
１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８゜１１−テ
トラ酢酸、ｌ−オキサ−４、７，１２，１５−テトラア
ザヘプタデカン−４，７，１２，１５−テトラ酢酸等で
ある。

本発明のモノクローナル抗体に連結して適用できる細胞
増殖抑制薬は、特に、アルキル化剤、例えばメクロルエ
タミン、トリエチレンホスホルアミド、シクロホスファ
くド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン
、メルフアランまたはトリアジクオン、更にはニトロソ
ウレア化合物、例えばカルムスチン、ロムスチンまたは
セムスチンである。代謝拮抗物質、例えばメトトレキセ
ート、メルカプトプリン、シタラビン、フルオロウラシ
ル、フロクスウリジンまたはフトラフルもまた使用され
る。細胞増殖抑制薬の更なるグループは、ビンブラスチ
ンおよびビンクリスチン、並びに成る種の抗生物質、例
えばアクチノマイシンＤ１ダウノルビシン（ダウノマイ
シン）、ドクソルビシン、ミトラマイシン、ストレプト
ニグリン、ξトマイシンおよびプレオマイシンを含む。

更に適当な細胞増殖抑制薬は、特に、プロカルバジン、
ヒドロキシウレア、Ｌ−アスパラギナーゼ、ダカルバジ
ン、ミドクン、エストラムスチンまたはポドフィロトキ
シンである。更なる細胞増殖抑制薬は、ホルモンおよび
ホルモン拮抗物質、例えばコルチコステロイド類、例え
ばプレドニゾン、プロゲスチン類、例えばヒドロキシプ
ロゲステロンまたはメトロプロゲステロン、エストロゲ
ン類、例えばジエヂルスチルベストロール、抗エストロ
ゲン類、例えばタモキシフェン、アンドロゲン類、例え
ばテストステロン、およびアロマターゼ阻害剤、例えば
アミノグルテチξドである。

細胞毒性物質と本発明のモノクローナル抗体との接合体
は、完全な毒素またはそれから誘導されたＡｔｉのいず
れかを含むことができる。抗体結合に適する毒素は、特
に、幾つかのレクチン、例えばりシンもしくはアブリン
、またはジフテリア毒素Ａ等である。

放射能ラベル化された本発明のモノクローナル抗体は、
例えば放射性ヨウ素（１！Ｊ、１５１％３１１）、イツ
トリウム（９ｏＹ）　、テクネチウム（９９″’Ｔ　ｃ
　）等を含む。

本発明のモノクローナル抗体およびその誘導体は、所望
のモノクローナル抗体を分泌する下記に定義される連続
細胞系の細胞を試験管内または生体内で既知の方法に従
って増殖し、そして必要な時、得られたモノクローナル
抗体を単離しモして／またはその誘導体に変換すること
を含んで成る、それ自体既知の方法により調製される。

試験管内での増殖は、常用の標準培地である適当な培地
、例えばダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）また
はＲＰＭＩ　１６４０培地中で行われ、該培地は所望に
より哺乳動物血清、例えばウシ胎児血清、または微量元
素および増殖維持補足物、例えば支持細胞、例えば正常
マウス腹腔浸出細胞、肺細胞または骨髄マクロファージ
、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリ
ン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等により補足さ
れる。

試験管内生産は比較的純粋な抗体調製物を提供し、そし
て大量の所望の抗体を得るためにスケールアップするこ
とができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養の
ための技術は当業界において既知であり、そして例えば
エアーリフト反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一
懸濁培養、または中空繊維中、マイクロカプセル中、ア
ガロースミクロビーズ上もしくはセラミックカートリ・
フジ上での固定化もしくは封入細胞培養を含む。

モノクローナル抗体の単離については、まず、例えば硫
酸アンモニウムでの沈澱、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）のような吸湿性物質に対する透析、選択膜を通し
た濾過等により、培地上清中の免疫グロブリンを濃縮す
る。必要および／または所望により、常用のクロマトグ
ラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥＡＥ−セルロースもしくはプロティンＡ上で
のクロマトグラフィー、または免疫アフィニティークロ
マトグラフィーにより、濃縮された該抗体を精製する。

大量の所望のモノクローナル抗体は、細胞を生体内で増
殖させることによって得ることもできる。

このためには、組織適合性および／または寛容性の【ｇ
産生細胞系からの細胞クローンを同系の哺乳動物中に注
入して抗体産生腫瘍の成長を引き起こす。所望により、
動物は注入前に炭化水素、特に鉱油、例えばブリスタン
（テトラメチルペンタデカン）で感作される。ｌ〜３週
間後、それらの動物の体液から抗体が単離される。例え
ば、所望のモノクローナル抗体を産生ずるＢａｊ！ｂ／
ｃマウスから誘導されたハイブリドーマ細胞を、所望に
よりブリスタンで前処理されたＢａｆｂ／Ｃマウスの腹
腔内に注入し、そして１〜２週間後、その動物から腹水
を取り出す。前に示したような常法により、そこから所
望のモノクローナル抗体が単離される。

モノクローナル抗体の断片、例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’
またはＦ（ａｂ’　）ｚ断片は、それ自体既知の方法に
より、例えばペプシンもしくはパパインのような酵素で
の消化および／または化学的還元によるジスルフィド結
合の開裂により、上述のようにして調製された抗体から
得ることができる。

本発明の抗体の接合体は、当業界で既知の方法により、
例えば、上述のようにして調製されたモノクローナル抗
体を、縮合剤、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸
塩、Ｎ、Ｎ’　−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ　−
（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド、
Ｎ−（３−（２’ピリジルジチオ〉プロピオンオキシ〕
スクシンイ≧ド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド等の存在下で酵素と反
応させることにより調製される。アビジンとの接合体も
同様にして調製される。ビオチンとの接合体は、例えば
、モノクローナル抗体をビオチンの活性化エステル、例
えばビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイ稟ドエステルと
反応させることにより調製される。蛍光または化学発光
マーカーとの接合体は、縮合剤、例えば上に挙げたもの
の存在下で調製されるか、またはイソチオシアネート、
好ましくはフルオレセインイソチオシアネートとの反応
により調製される。細胞増殖抑制／細胞毒性物質および
金属キレートとの抗体接合体も同様にして調製される。

ヨウ素（１２３■、Ｉｔ′Ｉ、目’Ｉ）で放射能ラベル
化されたモノクローナル抗体は、例えば、放射性ヨウ化
ナトリウムもしくはカリウム、および化学的酸化剤、例
えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等、または酵
素的酸化剤、例えばラクトペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼおよびグルコースを用いたそれ自体既知
のヨウ素化により、本発明のモノクローナル抗体から得
られる。本発明のキメラモノクローナル抗体は、例えば
ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）キレート
化によりイツトリウム（”Ｙ）と結合される。テクネチ
ウム−９９ｍラベル化キメラ抗体は、リガンド交換反応
により、例えば過テクネチウム酸塩（ＴｅＯ２−）を第
一スズイオン溶液で還元し、還元されたテクネチウムを
セファデックスカラム上にキレート化しそしてこのカラ
ムに抗体を適用することにより；または直接ラベル化技
術により、例えば過テクネチウム酸塩をＳｎＣ１ｚのよ
うな還元剤、フタル酸カリウムナトリウム溶液のような
緩衝液および抗体と共にインキュベートすることにより
、調製される。

本発明は更に連続細胞系に関する。本発明の一態様にお
いて、そのような細胞系は所望の特異性を有する本発明
の抗−１ｇＥモノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマ細胞系である。

特に、本発明は、ミエローマ細胞とＩｇＥで免疫処置さ
れた哺乳類のＢリンパ球とのハイブリッドであるハイブ
リドーマ細胞に関する。好ましくはそれらの細胞系は、
マウスのミエローマ細胞とマウスＩｇＥで免疫処置され
たラットのＢリンパ球とのハイブリッドである。特に好
ましいのは、■９８９年４月１９日にＥＣＡＣＣ８９０
４１９０２号のもとにＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ。

ＰＩＩＬＳ　Ｃｅｎｔｒｅ　　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　＆Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｐ
ｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、５ａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔ
ｓ、ＳＦ３０ＪＧ。

１１、に、）に寄託された呼称６５４−１−５を有する
ハイブリドーマ細胞系である。マウスミエローマ細胞と
ヒトＩｇＥで免疫処置された同系マウスのＢリンパ球と
のハイブリッドであるハイブリドーマ細胞もまた好まし
い。最も好ましいのは、１９９０年３月２２日にＥＣＡ
ＣＣ９００３２２１０号のもとにＥＣＡＣＣに寄託され
た呼称Ｆｌ−４３−１７を有するハイブリドーマ細胞系
である。

本発明のハイブリドーマ細胞系は遺伝的に安定であり、
一定の特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を分
泌し、そして深層凍結培養において保存でき、解凍およ
び任意の再クローニングにより再活性化することができ
る。

本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞系の調製方法にも関し、該方法は、適当
な哺乳動物をＩｇＥで免疫処置し、この動物の抗体産生
細胞を連続細胞系の細胞と融合し、融合で得られたハイ
ブリッド細胞をクローニングし、そして所望の抗体を分
泌する細胞クローンを選択することを含んで成る。

免疫処置のための抗原として使用される免疫グロブリン
上は、それぞれマウスまたはヒトＩｇＥであることがで
きる。ε重鎖に対して向けられたＩｇＥイソタイプ特異
的抗体が惹起されることを確実にするために、異なる特
異性を有するクラスＩｇＥの異なる抗体、特にモノクロ
ーナル抗体、の混合物を使用することが好ましい。その
ようなＩｇＥ抗体は、例えば商業的に入手可能であるか
、または微生物寄託機関から得ることができる。ヒトＩ
ｇＥは［ｇＥミエローマを有する患者から得ることもで
きる。

抗原、即ちマウスまたはヒトＩｇＥは、アジュバント、
即ち免疫応答を更に増大させるであろう剤と混合され得
る。可能なアジュバントは、完全フロインドアジュバン
ト（鉱油、水および微生物油出物の乳ＥＸＪ液）、不完
全フロインドアジュバント（水と油のみの乳濁液）、水
酸化アルミニウムゲル等である。

該抗原は、外来分子としてそれを認識する適当な哺乳動
物、特に抗原がマウスＩｇＥである時はラット、抗原が
ヒトＩｇＥである時にはマウスもしくはラット、好まし
くはマウス、を免疫処置するために使われる。

免疫処置の経路は、特に、皮肉、皮下、筋肉内１＠欣内
、静脈内および頭蓋内注射である。高い抗体価が所望さ
れるので、通常一連の注射が与えられる。免疫処置は、
例えば、所望により不完全または完全フロインドアジュ
バントと混合された抗原を、３〜８回非経口的に、例え
ば腹腔内および／または皮下的に、約１０〜１５０μｇ
の量で、ＲＡ２５ラット、Ｂａｆｆ１ｂ／ｃマウスまた
はＢｉｏｚｚｉマウスに１〜３週問おきに注射し、次い
で動物を犠牲にする１〜５日前に約５〜５０ＪＩｇのブ
ースター注射を行うことにより達成される。

免疫処置された動物の抗体産生細胞、好ましくはリンパ
系細胞、例えば肺臓リンパ球をブースター注射の例えば
１〜５日後に取り出し、融合の結果生ずるハイブリッド
細胞に複製能力を付与する連続細胞系の細胞、即ち連続
的に複製する細胞クローンと前記抗体産生細胞とを融合
する。そのような細胞系の例は、それ自体は免疫グロブ
リンまたはその断片を産生しないが大量の抗体を産生お
よび分泌する潜在能力を有し、そしてハイブリッド細胞
を未融合の親細胞に対して選択できるように遺伝子マー
カーを担持している、腫瘍細胞系（旦エローマ）である
。幾つかの適当なミエローマ細胞系が当該技術で知られ
ている。好ましいのは、ヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）酵素また
はチミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素を欠き、従ってヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する選
択培地（ＨＡＴ培地）中で生存できないミエローマ細胞
系である。特に好ましいのは、ＨＡＴ培地中で生存でき
ず、そして免疫グロブリンまたはその断片を分泌しない
ミエローマ細胞系および誘導細胞系、例えばＰＡＩ　　
、Ｘ６３−Ａｇ３．６５３またはＳｐ２１０−Ａｇ１４
である。

融合は、融合促進物質、例えば、所望により紫外線（Ｕ
Ｖ）で不活性化された形のセンダイウィルスもしくは他
のパラミクソウィルス、化学融合剤（ｆｕｓｏｇｅｎ）
　、例えばカルシウムイオン、界面活性脂質、例えばり
ゾレシチン、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）の存在下で行われる。

好ましくは、ミエローマ細胞は、１０００〜４０００の
分子量のポリエチレングリコールを約３０％〜約６０％
含有する溶液中で、免疫処置動物からの３〜２０倍過剰
量の牌細胞と融合され・る。

融合後、細胞は選択培地、例えばＨＡＴ培地中に再懸濁
され、培養される。この培地中では、ハイブリドーマ細
胞のみが生き残るだろう。というのは、それらは親のミ
エローマ細胞と同じように試験管内で増殖および複製す
る能力と、免疫処置動物の抗体産生細胞から受は継いだ
ＨＡＴ培地中での生存に不可欠な欠損ＨＧＰＲＴまたは
ＴＫ遺伝子とを合わせ持つからである。

ハイブリドーマ細胞の増殖のための適当な培地は、標準
培地、例えばダルベツコ改良イーグル培地（Ｄ？ｌＥＭ
）　、最少必須培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地等であり
、所望により哺乳動物血清、例えば１０〜１５％ウシ胎
児血清により補足される。好ましくは、支持細胞、例え
ば正常マウス腹腔浸出細胞、牌細胞、骨髄マクロファー
ジ等が、融合段階の直後の細胞増殖の開始時に添加され
、特に細胞密度が低い場合には、増殖因子等を供給する
ことによりハイブリドーマ細胞に栄養を与えそしてそれ
らの増殖を維持する。マクロファージや単核細胞のよう
な食細胞を使用するならば、アミノプテリン処理後に常
に見られる死んだミエローマ細胞の破片を掃除する際に
役に立つことができる。ハイブリドーマが過剰増殖しな
いようにミエローマ細胞を保護するために、培地に選択
培地が補足される。

ハイブリドーマ細胞培養上清は、好ましくはエンザイム
イムノアッセイまたはラジオイムノアッセイにより、所
望のモノクローナル抗体についてスクリーニングされる
。そのようなイムノアッセイは、例えばエンザイムリン
クドイムノソルヘントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。

この場合、プラスチック製ミクロタイタープレートを全
ての免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの免疫グロ
ブリンおよび／またはミエローマタンパク質でコーティ
ングし、そしてテストしようとするハイブリドーマ細胞
培養上清と共にインキュベートする。結合したモノクロ
ーナル抗体は、細胞上清中の抗ＩｇＥ抗体を認識する酵
素ラベル化抗体、例えば免疫処置に使った動物種の免疫
グロブリンに対するアルカリホスファターゼラベル化抗
体とのインキュベーション、および適当な酵素基質溶液
、例えばｐ〜ニトロフェニルホスフェートの添加により
検出される。酵素基質反応は、例えば、肉眼または光学
測定装置により観察できる色の変化を生じる。ＩｇＥと
反応するが他のクラスの免疫グロブリンとは反応しない
高力価の抗体を産生ずるハイブリドーマが更なる研究の
ために選択される。

陽性のハイブリドーマ細胞は、例えば限定希釈によりま
たは軟寒天中で、好ましくは２回以上クローニングされ
る。所望により、ハイブリドーマ細胞は腹腔的注射およ
び腹水の回収により、動物、例えばマウスで継代される
。これはハイブリドーマを安定化し、そして増殖特性を
改善する。クロニングされた細胞系は常法により凍結さ
れ得る。

本発明は、動物／ヒトキメラモノクローナル抗体、好ま
しくはマウス可変領域とヒト定常領域から成る本発明の
キメラモノクローナル抗体を分泌するトランスフェクト
ーマ細胞系にも関する。定義によれば、トランスフェク
トーマ細胞系とは、本発明の動物／ヒトキメラモノクロ
ーナル抗体のキメラ軽鎖および／または重鎖をコードす
る核酸構成物でトランスフェクトされた連続細胞系、例
えば不死化された哺乳動物細胞系、例えばリンパ腫、ミ
エローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドロ
ーマ細胞系である。

更に本発明は、本発明の動物／ヒトキメラモノクローナ
ル抗体を分泌するトランスフェクトーマ細胞系の調製方
法に関する。該方法は、連続細胞系の細胞を、所望のキ
メラモノクローナル抗体の動物／ヒトキメラ軽鎖および
／または重鎖をコードしている核酸構成物、好ましくは
ＤＮＡ構成物でトランスフェクトし、そして所望のキメ
ラモノクローナル抗体を分泌する細胞クローンを選択す
ることを含んで成る。

本発明のキメラモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖そ
れぞれについてのキメラＤＮＡ構威物は、所望の特異性
を有するヒト以外好ましくはマウスの抗体の可変領域の
少なくとも機能性部分をコードする第一のＤＮＡセグメ
ント、例えば機能的に再配列された遺伝子、およびそれ
に連結されたヒト抗体の定常領域の少なくとも部分をコ
ードする第二のＤＮＡセグメントを含んで成る。

ヒト以外の可変領域をコードするＤＮＡセグメントは、
例えば、ゲノムＤＮＡの単離または単離したｍＲＮＡか
らのｃＤＮＡの調製のいずれかにより、所望の特異性を
有するヒト以外の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞か
ら得ることができる。機能的に再配列された可変領域の
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのスクリーニングは、既知
のヌクレオチド配列を有する適当なりＮＡプローブ、例
えば合成ＤＮＡ構成物の免疫グロブリンをコードする０
ＩＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、または例えば隣接保
存可変もしくは定常領域を含んで成るゲノムＤＮＡ断片
、を用いて達成され得る。正しいクローンの同定および
確認は、クローニングされた遺伝子のＤＮＡ塩基配列決
定および正確にスプライシングされた全長ｍＲＮＡの対
応する配列と該ＤＮＡ配列との比較により行うことがで
きる。

ヒト定常領域をコードするＤＮＡセグメントは、適当な
ヒト＆ＩＩ織から誘導されたゲノムライブラリーから得
ることができる。上述したようにしてゲノムＤＮＡライ
ブラリーがＤＮＡプローブによりスクリーニングされ、
そして所望のクローンが同定される。

キメラＤＮＡ構成物を作製するための前記ＤＮＡセグメ
ントの結合は、常法に従って、例えば平滑もしくは付着
末端連結、適当な粘着末端のための制限酵素消化、適当
ならば粘着末端のフィルイン、望ましくない結合を回避
するためのアルカリホスファターゼ処理、並びに適当な
りガーゼを用いた連結により行われる。

該キメラＤＮＡ構成物は複製可能なハイブリッドベクタ
ー中に挿入されるかまたは会合される。

ベクターは典型的には適合性宿主細胞と共同して２つの
機能を行う。１つの機能は、キメラ免疫グロブリン類を
コードする核酸のクローニングを促進すること、即ち使
用可能な量の該核酸を生産することである（クローニン
グベクター）。もう１つの機能は、染色体外要素として
の維持または宿主染色体中への組込みのいずれかによる
、適当な宿主中でのキメラ遺伝子構成物の複製および発
現に備えることである（発現ベクター）。クローニング
ベクターは、上述のキメラ遺伝子構成物、複製開始点ま
たは自己複製配列、優性マーカー配列、並びに所望によ
り、シグナル配列および追加の制限部位を含んで成る。

発現ベクターは、キメラ遺伝子の転写および翻訳に不可
欠な発現調節配列を更に含んで成る。

複製開始点または自己複製配列は、外来起源、例えばシ
ミアンウィルス４０　（ＳＶ　４０）もしくは他のウィ
ルス起源から誘導されたものを含むベクターの作製によ
るか、または宿主細胞の染色体機構により用意される。

マーカーは、ベクターを含む宿主細胞の選択を考慮した
ものである。選択マーカーは、銅のような重金属または
ゲンタマイシン（Ｇ−４１８）のような抗生物質に対す
る耐性を付与する遺伝子、または宿主細胞の遺伝的障害
、例えばチミジンキナーゼ、ヒボキサンチンホスホリル
トランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ等の欠
損を補完する遺伝子を含む。

シグナル配列は、例えば、抗体の分泌を指示するプレ配
列または分泌リーダー、スプライシングシグナル等であ
ることができる。

発現調節配列として、ベクターＤＮＡは、プロモーター
、翻訳の開始と終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配
列、並びに所望により、エンハンサ−および更なる調節
配列を含んで成る。宿主細胞の性質に応じて、種々様々
なプロモーター配列を使用することができる。

哺乳動物宿主に適するプロモーターは、ウィルス、例え
ばシミアンウィルス４０　（ＳＶ　４０）、ラウス肉腫
ウィルス（Ｒ３Ｖ）、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウ
ィルス（ＢＰＶ）、バポバウイルスＢＫ変異体（ＢＰＶ
）、またはマウスおよびヒトシトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）から得られる。あるいは、該ベクターは、哺乳動物
の発現生成物、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン
等からのプロモーター、または通常免疫グロブリン遺伝
子配列と組み合わされる生来のプロモーターおよび調節
配列を含んでいてもよい。転写の開始および終結並びに
ｍＲＮＡの安定化に必要な配列は、暫通ウィルスおよび
真核生物のｃＤＮＡの非コード５′領域および３′領域
それぞれから、例えば発現宿主から得られる。エンハン
サ−は、ウィルス起源、例えばシミアンウィルス、ポリ
オーマウィルス、ウシ乳頭腫ウィルスもしくはモロニー
肉腫ウィルス由来、またはゲノム、特にマウス起源の転
写促進性ＤＮＡ配列である。

ベクターＤＮＡの種々のＤＮＡセグメントは作用可能に
連結される。即ち、それらは隣接しておりそして互いと
機能的関係に配置される。

キメラＬ鎖遺伝子構威物もしくはキメラＨ鎖遺伝子構成
物のいずれか一方を含んで成る別個のベクターを作製す
ることもできるし、または、ＬおよびＨ鎖遺伝子構戒物
の両方を同一のベクター中にクローニングすることもで
きる。

好ましいベクターの例は、ＳＶ　４０初期プロモーター
により転写が調節されるプラスミドｐＳＶ、特にキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝
子を担持しているｐＳＶ２ｇｐｔ　、またはホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を担持しているｐＳＩ７ｎｅｏか
ら誘導されたものである。

ベクターを発現するのに適当な宿主は、試験管内培養で
きなければならず、そして活性な抗体の産生に適する環
境を提供するために高等真核生物起源でなければならな
い。というのは、機能的な四量体抗体分子の生合成は正
確な新生ポリペプチド鎖の折りたたみ、グリコジル化お
よび会合を必要とするからである。適当な宿主細胞の例
は、不死化された哺乳動物細胞系、例えばリンパ腫、ご
エローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドロ
ーマ細胞系、例えばミエローマ細胞系ＰＡＩ　。

Ｓｐ２１０−Ａｇ１４またはＸ６３−Ａｇ３．６５３　
テある。

それらの宿主細胞は、キメラＬ鎖遺伝子構成物のみで、
キメラＨ鎖遺伝子構戊物のみで、あるいは２つの別個の
ベクターの助けにより連続的にもしくは同時に導入され
たかまたは上述の二重構成物（Ｌｔｆｆ／Ｈ鎖）ベクタ
ーを使うことにより一段階法で導入された両方の遺伝子
構成物でトランスフェクトされる。

トランスフェクシヨンは、常法により、例えばリン酸カ
ルシウム沈澱、マイクロインジェクション、プロトプラ
スト融合、エレクトロポレーション、即ち細胞膜の透過
性を一時的に増加させる短い電気パルスによるＤＮＡの
導入等により行われる。

トランスフェクション操作の後、トランスフェクトされ
た細胞は、選択マーカーの性質に応じて選ばれた選択培
地、例えばハイブリドーマ細胞の選択について上記に記
載された培地中での培養により同定および選択される。

該培地中ではトランスフェクトされた細胞のみが生き残
る。

本発明は、本発明の二特異性モノクローナル抗体を分泌
する連続細胞系、例えば不死化された哺乳動物細胞系、
例えばハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ
細胞系にも関する。

更に本発明は、本発明の二特異性モノクローナル抗体を
分泌する連続細胞系の調製方法に関し、該方法は、所望
の特異性を有する本発明の抗−ＩｇＥモノクローナル抗
体の重鎖および／または軽鎖を産生ずる細胞と、異なる
特異性を有するモノクローナル抗体の重鎖および／また
は軽鎖を産生ずる細胞とを融合し、融合において得られ
たハイブリッド細胞をクローニングし、そして所望の二
特異性モノクローナル抗体を分泌する細胞クローンを選
択することを含んで成る。

融合は、例えば、本発明のモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを、二特異性モノクローナル抗体の第
二の特異性を決定する抗原で免疫処置された哺乳動物の
リンパ系細胞と、二特異性モノクローナル抗体の所望の
第二の特異性を有するミエローマタンパク質を分泌する
ミエローマと、または所望の第二の特異性を提供するモ
ノクローナル抗体を産生ずる細胞系と融合することによ
り行うことができる。二特異性モノクローナル抗体を分
泌する細胞系の一般的な調製方法は、当業界において既
知でありそして、例えば、ヨーロッパ特許出願第６８７
６３号明細書中に記載されている。

融合後、上述したような選択培地中で培養しそして２つ
の所望の抗原と反応する単一クローンの能力についてク
ローンをスクリーニングすることにより、所望の二特異
性抗体を分泌する細胞が同定および選択される。

本発明のモノクローナル抗体および／またはその誘導体
は、特に体液、例えば血清中のＩｇＥの定性および定量
に有用である。

例えば、該モノクローナル抗体および／またはその誘導
体は、ＩｇＥの抗原決定基と該モノクローナル抗体のバ
ラトープとの間の結合相互作用に頼る既知のイムノアッ
セイのいずれにおいても使用することができる。そのよ
うなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
、エンザイムイムノアッセイ、免疫蛍光イムノアッセイ
、化学発光イムノアッセイ、免疫沈澱イムノアッセイ、
うテックス凝集イムノアッセイまたは血球凝集イムノア
ッセイである。

本発明のモノクローナル抗体は、それ自体でまたは放射
能ラベル化誘導体の形でラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）において使用することができる。

ＲＩＡの既知の変形、例えば、ＩｇＥの直接もしくは間
接（競合）測定を伴う、可溶他相（均一）ＲＩＡ、固相
（不均一）ＲＩＡ、単一ＲＩＡまたは二重（サンドイッ
チ）ＲＩＡのいずれにおいても使用できる。

そのようなラジオイムノアッセイの例はサンドイッチＲ
ＩＡであり、この場合、適当な担体、例えば、ポリスチ
レン、ポリプロピレンまたはポリ塩化ビニルのごクロタ
イタープレートもしくは試験管のプラスチック表面、ガ
ラスもしくはプラスチックビーズ、濾紙、デキストラン
等、セルロースアセテートもしくはニトロセルロース紙
、常磁性粒子等が、単純な吸着によりまたは所望により
担体の活性化後に本発明のモノクローナル抗体でコーテ
ィングされる。次いでＩｇＥを含むテスト溶液、そして
最後に、抗原と−も反応しそして例えば１２％　ｌで放
射能ラベル化されているポリクローナル抗体が添加され
る。テスト溶液中のＩｇＥＯ量は、結合したポリクロー
ナル抗体の量に正比例し、そして担体に結合した放射能
を測定することにより決定される。該ポリクローナル抗
体は、第一の担体結合モノクローナル抗体とは異なる抗
原エピトープを認識する本発明の第二の放射能ラベル化
モノクローナル抗体により置き換えることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、それ自体でまたは酵素
接合誘導体の形でエンザイムイムノアッセイにおいて使
用することができる。ラジオイムノアッセイについて上
述したように、エンザイムイムノアッセイの既知の変形
のいずれも使用することができる。

該テストは、放射能ラベルの代わりに酵素ラベルを使っ
て、前述のラジオイムノアッセイと同様にして行われる
。テスト溶液中に存在するＩｇＥの量に相当する形成さ
れた免疫複合体の量は、酵素基質溶液を添加することに
より測定される。酵素基質溶液は、例えば、肉眼または
光学測定装置により観察できる色の変化を生じる。

本発明のモノクローナル抗体は、それ自体でまたは化学
発光マーカーと接合された誘導体の形で化学発光アッセ
イにおいて使用することができる。

ラジオイムノアッセイについて上述したように、化学発
光アッセイの既知の変形のいずれも使用することができ
る。

該テストは、放射能ラベルの代わりに化学発光ラベルを
使って、上述のラジオイムノアッセイと同様にして行わ
れる。テスト溶液中に存在するＩｇＥの量に相当する形
成された免疫複合体の量は、発光を開始させる化合物、
例えばＨ，０，およびＮａＯＨを添加し、そして光学測
定装置により発光を測定することにより決定される。

ＩｇＥの測定について上述したような本発明のモノクロ
ーナル抗体およびその誘導体の利用は、それ自体既知の
他のイムノアッセイ、例えば免疫蛍光アッセイ、抗体コ
ートまたは抗原コートされたラテックス粒子を用いるラ
テックス凝集アッセイ、抗体コートまたは抗原コートさ
れた赤血球を用いる血球凝集アッセイ、抗体コートされ
た光ファイバーを使った消失光波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎ
ｔ　ｌｉｇｈｔｔｖａνｅ）アッセイおよび結合反応を
電気または光のシグナルに変換する他の直接作用イムノ
センサー等を更に包含する。

本発明のモノクローナル抗体および／またはその誘導体
は、ｒｇＥ産生細胞の測定のために、好ましくはプラー
ク形成細胞（ＰＦＣ）アッセイにおいても有用である。

本発明に係るプラーク形成細胞アッセイは、固相イムノ
アッセイの理論に基づいている。固相イムノアッセイの
既知の変形、例えばラジオイムノアッセイ、エンザイム
イムノアッセイ、免疫蛍光アッセイまたは化学発光イム
ノアッセイ等のいずれも使用することができる。

そのようなプラーク形成細胞アッセイの例は、エンザイ
ムリンクドイムノソルベントアッセイ（１１７１，ｌ５
Ａ）を基にしたＰＦＣアッセイである。ＩｇＥ産生細胞
の総量の決定には、サンドイッチＲＩＡについて上述し
たような適当な担体を本発明のモノクローナル抗体でコ
ーティングする。遠心、濾過等によりＩｇＥ産生細胞を
含む体液からそのような細胞の懸濁液を得、そしてＩｇ
Ｅに特異的な第二のポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体、例えば第一抗体とは異なるＩｇＥのエピトープ
を認識し、酵素、例えばアルカリホスファターゼと接合
されている本発明のモノクローナル抗体を加える。テス
ト懸濁液中のＩｇＥ産生細胞の量は、結合した第二抗体
の量に正比例するので、例えば着色反応生成物の形成を
もたらすような適当な基質溶液を添加し、そして着色ス
ポット（プラーク）をカウントすることにより決定され
る。特定のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを産生
ずるＩｇＥ産生細胞の画分の決定のためには、上述の細
胞懸濁液を添加する前に担体をまずアレルゲンまたはア
レルゲンの吸着性接合体でコーティングする。アレルゲ
ンに対して向けられるテスト懸濁液中のＩｇＥの両分は
、表面結合したアレルゲンに結合するので、例えば着色
反応生成物の形成をもたらす適当な基質および酵素と接
合した本発明のモノクローナル抗体を添加し、そして着
色スポット（プラーク）をカウントすることにより決定
される。

更に本発明は、本発明のモノクローナル抗体および／ま
たはその誘導体、並びに所望により、他のモノクローナ
ルもしくはポリクローナル抗体および／または添加剤を
含んで成る、ＩｇＥおよび／またはＩｇＥ産生細胞の定
性および定量用のテストキットに関する。

ラジオイムノアッセイ用の本発明のテストキットは、例
えば、適当な担体、所望により凍結乾燥形かまたはｆ４
縮溶液の１もしくは複数のモノクローナル抗体、放射能
ラベル化モノクローナル抗体または放射能ラベル化１ｇ
Ｅの溶液、ＩｇＥの標準溶液、緩衝液、並びに所望によ
り、非特異的吸着および凝集物形成を防ぐための洗浄剤
、ピペット、反応容器、検量線等を含む。該テストキッ
トのモノクローナル抗体のうちの１つまたは複数が本発
明のモノクローナル抗体である。特定のアレルゲンに対
して向けられたＩｇＥを産生ずるＩｇＥ産生細胞の測定
用テストキットは、アレルゲンまたはアレルゲンの吸着
性接合体を更に含んで成る。

エンザイムイムノアッセイ用の本発明のテストキットは
、例えば、適当な担体、所望により凍結乾燥形かまたは
ｉ４縮溶液の酵素ラベル化モノクローナル抗体、酵素ラ
ベル化１ｇＥ、ポリクローナル抗−１ｇＥ血清および／
または抗−ｒｇＥ抗体を認識しそして結合する酵素ラベ
ル化モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、固体
または溶解された形の酵素基質、ＩｇＥの標準溶液、緩
衝液、洗浄剤、ピペット、反応容器、検量線、比色表等
を含む。該テストキットのモノクローナル抗体のうちの
１つまたは複数が本発明のモノクローナル抗体である。

特定のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを産生する
ＩｇＥ産生細胞の測定用テストキットは、アレルゲンま
たはアレルゲンの吸着性接合体を更に含んで成る。

また、本発明のモノクローナル抗体およびそれらの誘導
体は、既知の常用染色技術のいずれか、例えばフローサ
イトメトリー分析により、表面ＩｇＥ陽性（ｓｌｇＥ”
　）　Ｂ細胞の定性および定量に使用することができる
。今までは、当該技術において既知の抗−１ｇＥモノク
ローナル抗体と感作されたマスト細胞および好塩基球上
に結合したＩｇＥとの反応が染色反応を妨害するので、
ｓｌｇＥ”Ｂ細胞の選択的決定のためにそのような技術
を使うことは実際には不可能であった。本発明のモノク
ローナル抗体およびそれらの誘導体はマスト細胞および
好塩基球上のＩｇＥを認識しないので、この大きな欠点
を克服する。

加えて、本発明のモノクローナル抗体および／またはそ
れらの誘導体は、特にアレルギーの治療および／または
予防のための療法において有用である。

治療効果は、本発明のモノクローナル抗体およびその誘
導体の下記の特異的性質のためＩｇＥ免疫応答をダウン
レギュレートすることにより達成される。

・それらは、遊離ＩｇＥを結合することにより生成Ｉｇ
Ｅを中和し、そしてＦｃεレセプター■またはＩＩを有
する細胞、特にマスト細胞および好塩基球へのＩｇＥの
結合を阻害することができる。

・それらは、表面１ｇＥ陽性Ｂ細胞（Ｉｇｆ！″Ｂ細胞
）の表面上に発現されたＩｇＥを認識および結合し、従
ってアレルゲンへの二度目の暴露後にＩｇＥ産生を引き
起こす「記憶プール」を形成するそのような細胞の集団
を涸渇させるのに有用である。選ばれた免疫グロブリン
（サブ）クラスのモノクローナル抗体、特にキメラ抗体
を産生ずる能力は、ｓＩｇＥ″Ｂ細胞の特異的死滅をも
たらす宿主免疫系の活性化を可能にする。これは、細胞
毒性薬を標的細胞に輸送するであろう二特異性抗体によ
りまたは細胞毒性薬と本発明のモノクローナル抗体との
接合体により達成される。

・本発明のモノクローナル抗体およびその誘導体は、免
疫応答でのＩｇＥ形成において有意な阻害効果を有する
ので、長期に渡り持続する治療効果を有する。

結果として、本発明のモノクローナル抗体およびそれら
の誘導体は、例えばＩｇＥ抗体および表面１ｇＥ陽性Ｂ
細胞の除去、よってアレルギ一応答の可能性の排除、お
よびＩｇＥ形威形成害により、症状の治療よりもむしろ
アレルギーの根本的原因に作用する治療を提供する。こ
の治療法は繰返し投薬を行う必要がないこと、そして本
発明のモノクローナル抗体およびそれらの誘導体をアレ
ルギーのいずれかの症状の発見前の投与による予防処置
に使用できることが特に有利である。それらの減少され
た免疫原性のために、本発明のキメラモノクローナル抗
体およびその誘導体は治療用途および予防に特に有用で
ある。哺乳類についての治療−日量は、患者の状態およ
び投与の形式に依存して約Ｏ８１■〜ｌＯ■／ｋｇ体重
である。

本発明は、本発明のモノクローナル抗体および／または
その誘導体を含んで成る医薬製剤にも関する。該医薬製
剤は、例えば、無機または有機の固体または液体の医薬
担体と一緒にまたは混合して、治療上有効な量の本発明
のモノクローナル抗体および／またはその誘導体を含ん
で成る。

好ましいのは、非経口投与および吸入用の医薬製剤であ
る。筋肉内、皮下もしくは静的投与または吸入用の医薬
製剤は、例えば、所望により凍結乾燥製剤または濃縮製
剤から使用直前に調製された、等張の水性溶液または懸
濁液である。該医薬製剤は滅菌されてもよく、そして例
えば、成分を保存、安定化、湿潤化、乳化または可溶化
するための補助薬、浸透圧の調節のための塩、緩衝剤お
よび／または粘度を調節する化合物、例えばカルボキシ
セルロースナトリウム、デキストラン、ポリビニルピロ
リドンもしくはゼラチンを含んでもよい。それらは当業
界において既知の方法、例えば常用の混合法、溶解法ま
たは凍結乾燥法により調製され、そして約０．０１％〜
約５０％の活性成分を含む。注射用製剤は、当業界にお
いて既知の方法に従って、処理され、アンプルまたはバ
イアル中に充填され、そして龍条件下で密封される。

〔実施例］ 次の例は本発明を説明するためであり、決して限定する
ためではない。

曵羅 ＢＰＯ−ベンジルペニシリン（ベンジルベニシロイル） ＢＳＡ＝ウシ血清アルブξン Ｂ５５＝平衡塩類溶液 ＣＦＡ＝完全フロインドアジュバント ＦＣ３＝ウシ胎児血清 ＨＡＴ＝ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン Ｈｔ！ＰＥＳ　＝Ｎ　−（２−ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン−Ｎ’　−（２’　−エタンスルホン酸） １ｇ　　＝免疫グロブリン ｉ、ｐ、　　−腹腔内 ｉ、ｖ、　　＝静脈内 ＭＡｂ＝モノクローナル抗体 ＰＢＳ＝リン酸塩緩衝化塩溶液 ＰＣ＝ホスホリルコリン ｒｐｍ−回毎分 第一」−一に 第１表に示される多数の免疫グロブリンクラスＩｇＥの
精製マウスモノクローナル抗体（ＩｇＥ　ＭＡｂ）を用
いてＲＡ　２５ラツトを免疫処置する。それらのＩｇＥ
　ＭＡｂは、抗−イソタイプであり且つ抗−イデオタイ
プでない抗体、即ち他の全てのクラスの免疫グロブリン
上には存在しないＩｇＥクラスの免疫グロブリンが分け
もつ抗原部位を認識する抗体、の誘起に有利である異な
る特異性を有する。

完全フロインドアジュバント中の第１表のＩｇＥＭＡｂ
の混合物（各１ｏｎ）をラットに腹腔内（ｉ、ｐ、）注
射する。その１４日後に、不完全フロインドアジュバン
ト中間−濃度の同一混合物を更にｉ、ｐ、注射する０例
１．３に記載されるようにして血清抗体価を測定し、そ
してマウスＩｇＥに対して最も高い血清抗体価を有する
ラットに、融合の４日前にＰＢＳ中の第１表のＩｇｆ！
　ＭＡｂの混合物を静脈内にブースター注射する。

１．２　　豊豊轟金 細胞融合は、免疫処置されたラットの牌細胞１０３個お
よびマウスミエローマ細胞系Ｓｐ２１０−Ａｇ１４（Ｓ
ｃｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　　１７６．２６９．
１９７８）からの細胞３ＸｌＯ’個を使って、ｌ−の５
０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　４０００．Ｍｅ
ｒｃｋ）の存在下で従来の方法（Ｋろｈｌｅｒ　＆　Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　　２５６　ｔ４９５＋
１９７５）に従って行う、洗浄後、細胞を３００ｄの標
準ダルベツコ最少必須培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）中に再懸
濁する。

支持細胞として融合あたり３ＸｌＯ’個のマウス腹腔浸
出細胞および１０％ウシ胎児血清を添加する。

得られた細胞を６枚の４８穴Ｘ　１　ｄ　Ｃｏ５ｔａｒ
プレ一ト間に分配する。培養物に標準ＨＡＴ選沢培地、
後にＨＴ培地を３〜６週間の間−週間に２回補給する。

ハイブリドーマ細胞の増殖が目に見えるようになった時
、例１．３のＥＬＩＳ＾テストによりマウスＩｇＥへの
結合について培養上清をスクリーニングし、そしてその
後ヒスタミン放出およびマウス表面１ｇＥへの結合につ
いてテストする（例５および７参照）。

選択されたハイブリドーマ細胞を培養において増殖させ
、−８０°Ｃまたは液体窒素中で凍結せしめ、次いで再
活性化することができる。該細胞を限定希釈（Ｇｏｄｉ
ｎｇ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９，２
８５．１９８０）によりクローニングし、そしてブリス
タンで感作されたＢａ１ｂ／ｃマウス中で腹水を形成せ
しめることにより増やす。

増殖しているハイブリドーマをサンドインチ型エンザイ
ムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に
よりマウスＩｇＥイソタイプに対して向けられた抗体（
抗−マウスＩｇＥ抗体）の存在についてテストする。

５００にの第１表の４種のＩｇＥ　ＭＡｂ（例１．１参
照）または対照として他の全ての免疫グロブリンクラス
のマウスＭＡｂおよびξエローマタンパク質（Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ）　（下記第２表参照）を０．０５Ｍ炭酸水
素ナトリウム緩衝液ｐｕｑ、６中で３７°Ｃにて２時間
および４°Ｃにて１５時間インキュベートすることによ
り、プラスチックミクロタイタープレートを免疫グロブ
リンでコーティングする。

第ユ５Ｌ−表 ＰＢＳで洗浄した後、プラスチック表面上にまだ残って
いるタンパク質反応性部位を、ＰＢＳＴｗｅｅｎ９緩衝
液（０，２％ＮａＮ、および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中
０．０５％ＴｗｅｅｎＯ２０，ｐＨ７，４）１５０ｍと
３７°Ｃで２時間インキュベートすることにより飽和し
、そしてプレートをＰＢＳで洗浄する。１００ｍの細胞
培養上清および対応するその希釈液を３７’Ｃで２時間
インキュベートしそしてプレートを洗浄した後、結合し
たラットモノクローナル抗体を、アルカリホスファター
ゼ−ラベル化ヤギＩｇＧ抗ラット免疫グロブリン調製物
（Ｓｉｇｍａ）の対応して予め決められた希釈液１００
μｌとのインキュベーションにより検出する。取り込ま
れた酵素の量を、酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート溶液（０，５ミリモルのＭｇＣ１，を含む１０％ジ
ェタノールアミン緩衝液ｐＨ９，８中１■／Ｍｌ）１０
０Ｊ１１とのインキュベーションおよびマルチスキャン
フォトメーター（Ｆｌｏｗ　Ｉｒｖｉｎｅ）を使った４
０５ｎ−での反応生成物の光学濃度（ＯＤ４゜５）の測
定により決定する。

下の第３表に与えられたスクリーニング結果に基づいて
、１８−２０．４６−４８．４Ａ１−２８．４８３−３
９．１−５および３−１１と命名された６つのハイブリ
ドーマを更なる研究のために選択する。それらは４つの
異なる融合から誘導され、そしてマウスＩｇＥに対する
高い結合反応性（１００％）を示すモノクローナル抗体
を分泌するが、他の１ｇイソタイプのＭＡｂおよびミエ
ローマタンパク質とはバックグラウンドの交差反応性し
か示さない。ハイブリドーマ１−５の正式名称は６５４
−１−５であるが、便宜上最初の３文字が省略される。

ＭＡｂは、それらが分泌されるハイブリドーマ細胞系を
引用して、ＭＡｂ１８−２０．　ＭＡｂ　４６−４８．
　ＭＡｂ　４Ａ１−２８．　ＭＡｂ　４Ｂ３−３９゜旧
ｂ　１−５およびＭＡｂ　３−１１と命名される。

第−」Ｌ−表 腹水の生成のために、雌のＢａ１ｂ／ｃマウス（２０−
２５ｇ）（Ｔｉｅｒｆａｒｍ　５ｉｓｓｅｌｎ、スイス
）を０．３−のブリスタン油（Ａｌｄｒｉｃｈ）で腹腔
内的に前処理する。１〜３週間後、このマウスに二回目
のブリスタン注射（０，２ａｌｌ、　ｉ、ｐ、）を行い
、同時に０．２−のＰＢＳ中の２Ｘ１０ｂ個のハイブリ
ドーマ細胞をｉ、ｐ、接種する。８〜１０日後、生じた
腹水を回収し、８ＯＯＸｇで遠心し、そして−２０゛Ｃ
または一８０°Ｃで保存する。

解凍した腹水を３０，０ＯＯＸ　ｇでの１時間の遠心に
より清澄化する。脂質を含む最上層を除去した後、タン
パク質濃度を測定し、ＰＢＳで１０〜１２■／ｄに調整
する。０°Ｃでの０．９容の飽和硫酸アンモニウムの滴
下添加により免疫グロブリンＧ画分（ＩｇＧ）を沈澱さ
せる。１時間後、２２，０ＯＯＸ　ｇでの１時間の遠心
により１６０画分をペレット化する。このペレットを５
０ｍＦＩ　ＮａＣ１を含む２０ｎ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液ｐＨ７，９中に溶解し、そして同一緩衝液に対し
て４℃で一晩透析する。ＤＥ５２ジエチルアミノエチル
セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）カラム上でのアニオン交
換クロマトグラフィーにより１６０画分を更に精製する
。精製試料を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１ｐＨ７，９
中に１　：　２　（ｖ／ｖ）希釈して２５ｎ＋Ｍの最終
濃度にし、そしてカラム上に１０■タンパク質／ｄゲル
の割合で負荷する。塩化ナトリウム濃度を２５ｍ１’ｌ
から２００５Ｍに増加させる（直線勾配）ことにより溶
出液を得る。一般に、ＭＡｂは８０ＩＩＭＮａ（ｆ！付
近で溶出する。その画分をＰＢＳに対して４℃で一晩透
析する。５Ｏ５−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動により
純度を評価する。純度は９５％よりも大きい。

２．２　　バイブリドーマの １０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭＩ　１６４
０培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）中生理的温度（３７°Ｃ付近
）でハイブリドーマ細胞を５Ｘ１０’〜１０６細胞数／
ｄの最終細胞密度まで培養することにより、ハイブリド
ーマ細胞系のプレ培養物を得る。全てのプレ培養物をＢ
ｅｔ　ｌｃｏ培養容器に入れ、そして新鮮なＲＰＭＩ１
６４０培地／１０％ＦＣＳで１５００ｍの全容量に調製
する。

培養物を３７°Ｃ付近で５％ＣＯ１下３０ｒｐｍ＋で２
〜３日間撹拌し、次いでＲＰＭＩ　１６４０　／１０％
ＦＣ３で３０００１ｄの全容量に希釈し、更に７〜ｌＯ
日間撹拌する。この後、９５％の細胞は死んでいる。培
養ブロスを４℃で２０分間１１０００Ｘで遠心する。上
清を無菌条件下で孔径０．２　ｎのフィルターを通して
濾過する。

ＯｏＣで０．９容量当量の飽和硫酸アンモニウムをゆっ
くりと滴下添加することにより、粗製免疫グロブリンを
沈澱させる。この沈澱物を例２．１に記載のようにして
精製する。

例１．３のラット抗−マウスｒｇＥ　ＭＡｂの免疫グロ
ブリンクラスおよびサブクラスを、０ｕｃｈｔｅｒｌｏ
ｎｙにより記載のようにして決定する。ＭＡｂ　４Ｂ３
〜３９゜ＭＡｂ　１−５およびＭＡｂ　３−１１はＩｇ
Ｇ　　１クラスであり、ＭＡｂ　４６−４８はＩｇＧ　
２ａクラスであり、モしてＭＡｂ　１８−２０およびＭ
Ａｂ　４Ａ１−２８はＩｇＧ　２ｂクラスである。

近 約１５０ｎｇのラット抗−マウスＩｇＥモノクローナル
抗体が１ウエル当たりに結合するように、例１、３のモ
ノクローナル抗体でミクロタイタープレートをコーティ
ングする。３ｑ（２０倍過剰）の同−モノクローナル抗
体または異なるモノクローナル抗体をＲＩＡ緩衝液（１
％ＢＳＡおよび０．２％ＮａＮ　２を含むＰ　Ｂ　Ｓ　
）　１０ｍ中の５ｎｇの１２５１−ラベル化マウスＩｇ
Ｅ　ＭＡｂ　ａＰｃ１２−１３と共に３７゛ｃにて４時
間ブレインキュベートし、そしてコーティングされたミ
クロタイタープレートのウェル中で３７°Ｃにて２時間
および４°Ｃで１５時間インキュベートする。

次いで該プレートを洗浄し、そして放射能を測定するこ
とにより結合したＩｇＥを決定する。この交差−阻害実
験の結果を第４表に示す。

易−二り一表 ０−３０％　阻害 ＋　３１−６０％　阻害 ＋＋　６１−９５％　阻害 ＋＋＋　９６−１００％　阻害 表面結合モノクローナル抗体へのＩｇＥの結合は、溶液
中の同一モノクローナル抗体（第４表、対角ｉｌ＃）と
のブレインキュベーションにより完全に（９５％より大
きく）阻害される。ＭＡｂ　４Ｂ３−３９と交差反応す
るモノクローナル抗体ＭＡｂ　４６−４８は、モノクロ
ーナル抗体ＭＡｂ　３−１１により同様に交差阻害され
るが、ＭＡｂ　４Ｂ３−３９およびＭＡｂ　３−１１は
互いには全く影響を与えない。従ってそれら３つのモノ
クローナル抗体は、ＩｇＥ分子上の部分的に重なってい
る連続のエピトープを認識する。モノクローナル抗体の
唯一の別のペア、即ちＭＡｂ　４Ａ１−２８と門＾ｂ　
１−５は幾らか交差反応性を示す、しかしながら、この
阻害は一方向のみである。モノクローナル抗体ＭＡｂ　
Ｌ５はＩｇＥ分子へのＭＡｂ　４Ａ１−２８の結合を阻
害するが、ＭＡｂ　４Ａ１−２８はＩｇＥへのＭＡｂ　
１−５の結合を阻害することができない。従ってこれら
２つのモノクローナル抗体は近隣のエピトープを認識し
、ただしＭＡｂ　Ｌ５はＩｇＥ分子へのＭＡｂ４Ａ１−
２８の結合を立体的に妨害する。他の全てのモノクロー
ナル抗体のペアは相互作用を全く示さず、従ってＩｇＥ
分子上の空間的に離れたエピトープに結合する。

輿工：ラット　−マウスＩ　Ｅ　ＭＡｂによ　沫　され
ラット好塩基性白血病りローンＲＢＬ−２１１３（Ｅｕ
ｒｏｐ。

ｎｕｍ、１１，３１７．１９８１）を７５ｃ４のＦａｌ
ｃｏｎフラスコ中の１５％ＦＣＳ含有最少必須培地中で
３７°Ｃおよび７．５％ＣＯ□の湿潤培養器内で増殖さ
せる。アッセイのために細胞をトリプシン処理し、平衡
塩類溶液で洗浄し、そしてカウントする。１０’個のＲ
ＢＬ−２８３細胞あたりＩｇのマウス■ｇＥ　ＭＡｂ　
ａＰｃ１２−３（ホスホリルコリン特異的、第１表参照
、例１．１　）を加え、回転しながら３７℃で３０分間
インキュベートする。

次いで細胞を培地中で１回洗浄し、１０’細胞１５０ｄ
に調整し、そして （１）種々の抗−ＩｇＥ　ＭＡｂの希釈液（５０１１１
中０．５．ｑ）； （２）正の対照としてのＰＣ−ＢＳＡ　（５０Ｉｌ！中
ｌＩｔｇ）；もしくは （３）自然ヒスタミン放出の測定のため５０ｍのＢＳＳ
　。

と共に３７°Ｃの振盪機水浴中で１５分間インキュベー
トするか、または （４）全ヒスタミン放出の測定のため５０Ｉｌ！のＢＳ
Ｓ　。

と共に９０°Ｃで１５分間インキュベートする。

各試験管を３０００Ｘｇで５分間遠心し、そして例５．
２に記載されるヒスタミン放出測定のために別の試験管
に移す。

５．２　　ヒスタミン　　の溌 ６０μのＳＡＭ反応混液（ｌｄのＰＢＳ中１０　ｐ　Ｃ
ｉの３Ｈ−アデノシルメチオニン（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｎ
ＥＬ１５５１１）＋ヒスタミンーＬ−メチル−トランス
フェラーゼ）を５０μｌの上清に添加し、振盪機水浴中
で３７°Ｃにて９０分間インキュベートする。その試験
管に４０ｄの１．５Ｎ　　ＨＣｆｆｉ０４、次いで４０
ｐｌのＩＯＮ　Ｎａ０ｆｌおよび５００　Ｉｌ！のイソ
アミルアルコール／ドルオール（比２：８）を添加し、
１分間渦動撹拌し、モして１９０Ｘｇで５分間遠心する
。放射能ラベル化されたメチルヒスタミンは、アルカリ
性条件下では有機相中に存在する。３００ｍの有機相を
、ｌｌｌ１１のエタノールおよび１０　ｍｌのシンチレ
ーション反応混液（Ｉｆのドルオール＋４２−のＬｉｑ
ｕｉｆ　Ｉｏｒ”Ｄｕ　Ｐｏｎ　ｔ）を含むバイアルに
移し、そしてＴｒｉ−Ｃａｒｂ”液体シンチレーション
分析機でカウントする。測定された放射能はヒスタミン
放出に比例する。

その結果を第５表に示す。

１２．１４ｎｇヒスタミン／１０５細胞上記結果は、種
々の抗−ＩｇＥ　ＭＡｂがＩｇＥで感作されたＲＢＬ−
マスト細胞からヒスタミン放出を誘導することを明らか
に指摘している。しかしながら、ＭＡｂ　１−５はＩｇ
Ｅを結合した非マスト細胞と高度に反応するけれどもヒ
スタミン放出を誘導しない。

ＰＢ３マスト細胞（Ｂａｌｌら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ
ａｔｉｏｎ２４．７４．１９８３）への１５１−ラヘル
化マウスＩｇＥの結合を阻害する例１．３のラット抗−
マウスＩｇＥモノクローナル抗体の能力を、次に記載さ
れるような阻害イムノアッセイにおいて測定する。

平底のポリ塩化ビニル製ミクロタイタープレートを２０
ｎ／ｙｄｌ　ＰＢＳの濃度のポリーＬ−リジン５０ＩＩ
Ｉでコーティングする。ＰＢＳで洗浄した後、各ウェル
に３Ｘ１０’個のＰＢ３マスト細胞（６Ｘ１０’個／−
で５０／Ｊりを添加し、次いで４°Ｃにて調製したばか
りのＰＢＳ中０．２５％グルタルアルデヒド中に静かに
浸漬し、５分間維持する。軽く払い落とす動作によりグ
ルタルアルデヒドをウェルから除去し、プレートを１４
２のＰＢＳ浴中で３回連続して洗浄する。１％ＢＳＡお
よび０．２％ＮａＮ、を含むＰＢＳ　２２５１１！でプ
レートを３７°Ｃにて１時間インキュベートすることに
より、プラスチック表面上にまだ存在している残りのタ
ンパク質反応性部位を飽和する。ＰＢＳ中で洗浄した後
、緩衝液２５ｕｌまたは緩衝液中の抗−ｒｇＥモノクロ
ーナル抗体の希釈液２５ｄを適当なウェルに添加する。

各ウェルに１５Ｉ−ラベル化マウスＩｇＥ　ＭＡｂ　ａ
Ｐｃ１２−１３（４０，０００ｃｐ１１１、約３ｎｇ）
　２５Ｉｌｌを添加する。プレートを穏やかに振盪し、
モして３７°Ｃで１５分間および室温で１時間インキュ
ベートする。次いで各ウェルに１７５μｌのＰＢＳを添
加し、モしてウェルが空になるまでプレートをプラスチ
ックで裏付されたティッシュ上に逆さにしておく。次い
でプレートを１１のＰＢＳ浴中で４回洗浄し、そして乾
燥する。ウェル中の放射能をカウントし、そして阻害率
を算出する。抗体ＭＡｂ　１−５についての結果を第６
表に示す。

０５０％　阻害　＝　　９．５μｇ　ＭＡｂ　Ｌ５Ｉｇ
Ｅ担持Ｂ細担持上びＩｇＥコートされたマスト細胞への
ラット抗−マウスＩｇＥ　ＭＡｂの結合をフローサイト
メトリー分析により測定する。

ＴｇＥ　ＭＡｂ　ａＰｃ１２−３（第１表参照）を産生
ずるハイブリドーマ細胞は、表面１ｇＥｉＢ持Ｂ細胞（
ｓｌｇＥ”Ｂ細胞）として働く。例５．１において記載
されたようにＩｇＥ　ＭＡｂ　ａＰｃ１２−３で感作さ
れたラット好塩基性白血病細胞系ＰＢＬ−２８３の細胞
を、ＩｇＥコートされたマスト細胞として使用する。

染色は次のようにして行われる：１−５ｑのビオチニル
化うット抗−マウスＩｇＥ　ＭＡｂを、５％ＦＣＳを含
むＲＩＡ緩衝液２００．ｕ／中で１０”個の細胞と共に
４°Ｃで３０分間インキュベートする。洗浄した後、３
μのアビジン−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ。

漱９０１１）を含む２００　ＩｌｌのＲＩＡ緩衝液中に
４℃で３０分間細胞を再懸濁し、そして再び洗浄する。

それらを２００　ＩｌｌのＲＩＡ緩衝液中に再懸濁し、
フローサイトメトリー（２１５０コンピユーターに接続
された０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅ
ｍ　５０ＨＨ）により分析する。

一第一ヨーー表 財ニラ　ト　−マウスＩ　Ｅ　ＭＡｂの第一のテストシ
リーズでは、特定の抗原により誘導される試験管内（ｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏ　）免疫応答を研究する。

上記結果は、種々の抗−マウスＩｇＥ　ＭＡｂが両方の
細胞のタイプと反応することを明らかに証明している。

しかしながら、ＭＡｂ　１−５は、Ｂ細胞上の表面Ｉｇ
Ｅとは高度に反応するけれども、ＩｇＥコートされたマ
スト細胞には結合しない。

Ｂａｆｆ１ｂ／ｃマウス（Ｓｉｓｓｅｌｎ　ａｎｉｍａ
ｌ　ｆａｒｏ＋）を、２００　ｕｌのＡ７！ｕ−３−ゲ
ル”　（Ｓｅｒｖａ）中のアオガイヘモシアニン（にＬ
Ｈ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とカップリングされたベン
ジルペニシリン（ＢＰＯ，５ｅｒｖａ）　１０ｎで２ｉ
！１間間隔で２回ｉ、ｐ、感作せしめる。カップリング
はＮａｋａｇａｗａら　（Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、＾ｌｌｅ
ｒｇｙ　Ａｐｐｌ、Ｉｍｓ＋ｕｎｏｌ。

６３．２１２．１９８０）に従って行われる。二回目の
感作注射の３ケ月後以降に、３匹のマウスから膵臓を取
り出し、ホモジナイズし、そして冷ＢＳＳ中で３回洗浄
する。異なる濃度の種々のラット抗−マウスＩｇＥ　Ｍ
Ａｂと共に０．５ＨのＢＰＯ−ｉ）１の存在下において
、５％ＦＣＳを含むｌ５ｃｏｖｅ培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ
　ＦＯ４６５）中１０”個／ｄの濃度で細胞を２４ウエ
ルのプレートに加える。該プレートを３７°Ｃおよび７
．５％ＣＯ□において湿潤インキュベーター中で６日間
インキュベートする。次いで例８．１．３および８．１
．４に記載のＥＬＩＳＡにおけるＩｇＧ　　ｌおよびＩ
ｇＥの測定のために、上清を別のプレートに移す。例８
．１．２のプラーク形成細胞アッセイにおいて細胞を抗
体産生活性についてテストする。

抗体産生細胞の発生における抗−１ｇＥモノクローナル
抗体の効果を分析するために、抗体産生細胞の検出用の
新規ＥＬＩＳＡプラークアッセイを開発した。

例８．１．１のミクロタイタープレートのウェルに１　
ｍｆｔの冷ＢＳＳを添加し、そして細胞を注意深く再懸
濁し、５成のＦａｌｃｏｎ試験管に移す。冷ＢＳＳの更
なる添加により量を３ｄに調整し、試験管を氷上に維持
する。

４８ウエルのプレートを、ＰＢＳ中のＢＳＡ−結合ＢＰ
Ｏ（ＫＬＨについて例８．１．１に記載された方法に従
ったカップリング；　　５００ｇ／−で２００μ）を用
いて４°Ｃにて１５時間コーティングする。洗浄（表、
１％ＢＳＡ、０．２％ＮａＮ：＋およびＴｗｅｅｎＯ２
０を含むＰＢＳｌｄでプレートを３７°Ｃで１時間イン
キュベートし、まだ遊離になっているタンパク質反応性
部位をブロックする。次いでプレートを再度ＰＢＳ中で
洗浄する。収得した細胞を１９０Ｘｇで７分間遠心し、
そして１　ｍｌの培地中に再懸濁する。

測定しようとするイソタイプに依存して、異なる細胞＋
状ｄ１１１Ｉ１１（ＩｇＥについては１／１、ＩｇＧ　
２については１／１０、およびＩｇＧ　Ｉについては１
／３０）をプレートに添加し、これを７．５％ＣＯ□を
有する湿潤インキュベーター中３７℃にて１８時間イン
キュベートする。洗浄後、適当なイソタイプ特異性を有
するアルカリホスファターゼラベル化抗体１００ＩＪ１
をプレートに添加し、３７°Ｃで２時間インキュベート
する。ＰＢＳで洗浄した後、２−アミノ−２−メチル−
１−プロパノール（ＡＭＰ、　Ｆｌｕｋａ）中の基質５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（
ＢＣＩＰ、　５１ｇ５＋ａ）　１００．Ｊをウェルに加
え、明瞭な青色スポット　（プラーク）が見えるように
なるまで（約６０分間）室温でインキュベートする。

結果を第８表に示す（例８．２．３参照）。

例８．１．１の細胞上清中のＢＰＯ−特異的ＩｇＥ抗体
を下記に記載のＥＬＩＳＡにより定量する。

５０ｊｌＩの０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，６）中１ｎのＢＰＯ−ＢＳＡをプラスチック製ミ
クロタイタープレート中で３７°Ｃにて２時間および４
°Ｃにて１５時間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄し
た後、プラスチック表面上にまだ残存しているタンパク
質反応性部位を、２００１のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＠緩街
液（０，２％ＮａＮｘを含むＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ　＠２０、　ｐＨ７，４）と共に３７°Ｃで２時間
インキュベートすることにより飽和し、次いでプレート
をＰＢＳで洗浄する。５０ｍの細胞上清およびその希釈
液を３７°Ｃで２時間および４°Ｃで１５時間インキュ
ベートする。既知濃度のＢＰＯ−特異的マウスＩｇＥ　
ＭＡｂ１３−１０　（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）の希釈液
５０ｕも同様に３７°Ｃで２時間および４℃で１５時間
インキュベートする。

プレートを洗浄した後、ビオチン接合モノクローナルラ
ット抗−マウスｒｇＥｌｉ製物の対応して予め決められ
た希釈液５０１１１とのインキュベーション、プレート
の再洗浄、および１　／１０００でのアルカリホスファ
ターゼ−ラベル化アビジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）５
０ＩＪ１との３７°Ｃでの１時間のインキュベーション
により、結合したＩｇＥ−特異的抗体を検出する。

取り込まれた酵素の量は、酵素基質ｐ−ニトロフェニル
ホスフェート（０，５ミリモルのＭｇＣ１，を含む１０
％ジェタノールアミン緩衝液ＰＨ９，８中ｌ■／ｄ）と
のインキュベーションおよびマルチスキャン光度計（Ｆ
ｌｏｗ　Ｉｒｖｉｎｅ　、スコツトランド）を使った４
０５ｎｉ＋での反応生成物の光学濃度（００４（１５）
の測定により決定される。細胞上清中のＢＰＯ−特異的
ＩｇＥ抗体の濃度は、ＢＰＯ−特異的ＩｇＥモノクロー
ナル抗体希釈液から得られた標準曲線を使って算出され
る。

８、１．４　　　　　上　　　のＢＰＣＩ−ＩＧＩ例８
．１．１の細胞上清中のＢＰＯ−特異的ＩｇＧ　　ｌ抗
体を、例８．１．３のＥＬＩＳＡに類似したＥＬ４Ｓ八
において定量する。

既知濃度のＢＰＯ−特異的マウスＩｇＧ　　Ｉ　　ＭＡ
ｂｋｌ　１６　（Ｓｗｉｓｓ　１ｎｓｔ、ｆｏｒ　Ａｌ
ｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　ＡｓｔｈｍａＲｅｓｅａｒｃｈ　
、　ＤａｖｏｓのＯｒ、に、Ｂｌａｓｅｒから人手）の
希釈液５０ｍのインキュベーションにより標準曲線を得
る。アルカリホスファターゼ−ラベル化つサギＩｇＧ抗
−マウスＩｇＧ　　１調製物の対応して予め決められた
希釈ｉ５０＃とのインキュベーションにより、結合した
ＢＰＯ−特異的ＩｇＧ　１抗体を検出する。取り込まれ
た酵素の量は、ＩｇＥと同し方法で決定され、そしてＢ
ＰＯ−特異的ＩｇＧ　　１抗体の濃度は、ＢＰＯ−特異
的モノクローナル抗体希釈液から得られた標準曲線を使
って算出される。

第２のテストシリーズにおいて、ポリクローナル的に誘
導される試験管内免疫応答を研究する。

８、２．１　　　な　た　　　の　　のポリクローナル
透見 フィコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で単離された小静止
Ｂ細胞培養物（Ｊｕｌｉｕｓら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、１４＋７５３１９８４）を、Ｌ−グルタミン（
２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｉ
Ｕ／ｄ）　、２−メルカプトエタノール（２Ｘ１０’Ｍ
）、ピルビン酸ナトリウム（１ａ＋Ｍ）およびｌ０％の
選択されたウシ胎児血清（Ｓｅｒｏｍｅｄ）が補足され
たＲＰ？ＩＩ　１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に５％Ｃ
ＯＸ中３７°Ｃに設定する。５Ｘ１０’細胞／威を、マ
イトジェン（Ｅ、コリＢ　０２６：Ｂ６（Ｄｉｒｃｏ　
３９２０−１０３からのリボ多糖（ＬＰＳ）。

２５μｇ　／　Ｉｎ１）およびマウスインターロイキン
４、並びに種々の濃度のラット抗−マウスＩｇＥ　ＭＡ
ｂの存在下または非存在下で全量０．２−において９６
ウエルの平底ミクロタイタープレート（Ｃｏｓ　ｔａｒ
）中で培養する。細胞培養上清を収集し、そして例８、
２．２および例８．２．３に記載のサンドイッチＥＬＩ
ＳＡにおいて全１ｇＥおよびＩｇＧ　３について分析す
る。

８、２．２　　　　上　のＩＥの　　の　　のためのＥ
ＬＩＳＡ 例８．２．１の細胞上清中のＩｇＥ抗体の総量は、下記
に記載のＥＬＩＳＡにより測定される。

０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝’ｌ＆　（ｐＨ９，
６）　５０〃中のＩＩ！ｇのラット抗−マウスＩｇＥ　
ＭＡｂ　４８３−３９をプラスチックミクロタイタープ
レート中で３７°Ｃで２時間および４　”Ｃで１５時間
インキュベートする。

ＰＢＳで洗浄した後、プラスチック表面上にまだ残って
いるタンパク質反応性部位を、２００　ＩＩＩのＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ＠緩衝液（０，２％ＮａＮｚを含むＰＢＳ
中０．０５％Ｔｗｅｅｎ９２０．　ｐｌ！　７．４　）
と共に３７°Ｃで２時間インキエベートすることにより
飽和する。プレートをＰＢＳで洗浄し、そして細胞上清
およびその希釈液５０ｍを３７°Ｃで２時間または４°
Ｃで１５時間インキュベートする。既知濃度のモノクロ
ーナルマウスＩｇＥ抗体の希釈液５０ｍも同様に３７°
Ｃで２時間または４°Ｃで１５時間インキュベートする
。

プレートを洗浄した後、ラット抗−マウスＩｇＥＭＡｂ
　３−１１を使って、例８．１．３においてＢＰＯ特異
特異的１抗Ｅ抗ついて記載したようにして、結合したＩ
ｇＥ抗体を検出する。ＩｇＥモノクローナル抗体希釈液
から得られた標準曲線を使って、細胞上清中のＩｇＥ抗
体の総量を算出する。

その結果を第８表（例８．２．３参照）に示す。

８、２．３　　　　上　のＩＧ３の　　の　　めための
ＥＬＩＳＡ 例８．２．１の細胞上清中のＩｇＧ　３抗体の総量は、
例８．２．２のＥＬＩＳＡに類似したＥＬＩＳＡにおい
て測定される。

コーティング抗体としてウサギＩｇＧ抗−マウスＩｇＧ
　３　（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）を使う。既知濃度のモ
ノクローナル抗−マウスＩｇＧ　３抗体ａＰｃ６１−１
（第２表参照）の希釈液のインキュベーションにより標
準曲線を得る。ビオチン接合ラットモノクローナル抗−
マウスに抗体Ｒａ３３−１８−１２（Ｇ、）１Ｍａ＋ｍ
ｉｎｇａ授、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙから
人手）を検出抗体として用いる。

その結果を下の第８表に示す。

」−」Ｌ−表 ±２００μｇ／ＩｎＩｌＩｇＧ　３または５１Ｂ±６４
ｔｔｇ／ｒａｉｌ　ＩｇＥ。

（１）　０．５　ｐｇ／ｍｌｌのＢＰＯ４Ｌ１１および
１ｎ／ｒｒｒｉの抗Ｉｇ已抗体の存在下でのマウス牌細
胞（ｔｏ”／ｄ）の６日間の培養：プラーク形成細胞ア
ッセイ（例８．１．３　、８．１．４　）による分析；
　　１００％−６６４０±１５２７　ＩｇＧ　ｌプラー
ク形成細胞（ＰＦＣ）または５３±１１　ＩｇＥ　ＰＦ
Ｃ。

（２）　Ｌ　Ｐ　Ｓ　（２５ｇ／ｍ１）および１　ｔｒ
ｇ　／　ｄの抗−ＩｇＥ　ＭＡｂの存在下でのＰｅｔｃ
ｏｌｌＱ単離された小静止Ｂ細胞（５ｘ１０５／ｄ）の
７日間の培養：　ＥＬＩＳＡ（例８．２．２　、８．２
．３　）による分析；１００％＝４７９生後６−８週の
Ｂａ１ｂ／ｃマウス（Ｓｉｓｓｅｌｎ飼養場）を、ｌＯ
！１ｇのＢＰＯ−にＬＨ（例８．１．１参照）を含む０
、２　ａｌｌの２％水性水酸化アルミニウム（Ｓｅｒｖ
ａ）で２回（２週間間隔で）　ｉ、ｐ、免疫処置する。

１年後、予め免疫処置されたそれらのマウスを次のよう
にして処理する。

グループ１　（６匹のマウス）は、第０日に５０μｇの
ＢＰＯ−ＫＬＨを含む０．２１ｎｌのＡ　ｌ　（Ｏｌｌ
）　：ｌをｉ、ｐ、に与えられニゲループ２（６匹のマ
ウス）は、第一１日（ｉ、ｐ、）　、第０日（ｉ、ｖ、
）　、２日目（ｉ、ｐ、）および５日目（ｉ、ｖ、）に
２００．−ｇの精製ラット抗−マウスｒｇＥＭＡｂ　ｌ
−５を与えられ；そしてグループ３および４（共に６匹
ずつのマウス）は、それぞれラット抗−マウスＩｇＥ　
ＭＡｂ　４８３−３９および正常ラッ）　１　ｇ　Ｇ　
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅａ＋）を用いる以外はグループ２
と同様に処理される。更に、グループ２，３および４は
、第０日に５０／／ｇのＢＰＯ−ＫＬｌｌを含む０．２
　ｄのＡｆ（ＯＨ）ｚをｉ、ｐ、に与えられる。

１４４日目、全てのマウスから採血し、そして例８、１
．３および８．１．４において細胞上清について記載し
たＥＬＩＳＡテストにより、ＢＰＯ−特異的ＩｇＥおよ
びＩｇＧ　　１について血清を分析する。その結果を第
９表（例９．２参照・）に示す。

第一ヨし一表 マウスを例９．１に記載のようにして予め免疫処置する
。１年後、−１，０，１および３日目にグループ２．３
および４に抗体を与えること以外は、例９．１と同様に
してマウスを処理する。

６日目に、マウスから肺臓を取り出し、そして例８．１
．２に記載のプラーク形成細胞アッセイにより分析する
。その結果を下の第９表に示す。

（１）６動物の平均値±Ｉ　ＳＵＭ　（平均値の標準誤
差）（２）５動物の平均値±Ｉ　ＳＥＭ　（平均値の標
準誤差）Ｂｉｏｚｚｉマウス（Ｉｎｓｔ、Ｃｕｒｉｅ、
Ｐａｒｉｓ）を、第１０表に挙げた免疫グロブリンクラ
スＩｇＥの精製ヒト抗体で免疫処置する。それらのＩｇ
Ｅ抗体は、抗インタイブ抗体の誘導に有利である異なる
特異性を有する。

完全フロインドアジュバント中の第１０表のＩｇＥ抗体
（各２５μｇ）の混合物をマウスに腹腔内（ｉ、ｐ、）
注射する。それから１４日目に、不完全フロインドアジ
ュバント中の同濃度の同一混合物を更にｉ、ｐ。

注射する。例１．３に記載のようにして血清抗体価を測
定し、そしてヒトＩｇＥに対する高い血清抗体価を有す
るマウスに、融合の３日前にＰＢＳ中の第１０表のＩｇ
Ｅ抗体の混合物（各７．５ｘ）を半分静内に、半分腹腔
内にブースター注射する。

１０．２　　狙胆敗金 例１．２に記載したようにして、ｌｄの５０％ポリエチ
レングリコールの存在下で、免疫処置マウスの牌細胞１
０８個およびマウス旦エローマ細胞系Ｆ　Ａ　Ｉ　　（
Ｊ、Ｗ、５Ｌｏｃｋｅｒ、Ｈ，に、Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ｖ
、Ｍｉｇｇｉａｎｏ、Ｃ０５Ｌｉｈｌｉ、Ｇ、ＳＬａｉ
ｇｅｒ、Ｂ、ＴａｋａｃｓおよびＴｈ、５ｔａｅｈｅｌ
　ｉｎ＋「ハイプリドーマ作製のための２つの新規マウ
スミエローマ細胞系“ＦＡＩ”およびＦＡＩ−０”の生
成」、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓ−ｕｒｅ　２
１７１３＋１９８２年朗、ｐ、　１５５）からの細胞３
Ｘ１０’個を使って、細胞融合を行う。

例１０．３のＥＬｒＳＡテストおよびＲＩＡにより、ヒ
］・ＩｇＥへの結合について細胞上清をスクリーニング
する。その後、例１１に従ってヒスタミン放出について
テストする。

選択したハイブリドーマ細胞を培養において増殖させ、
−８０℃または液体窒素中で凍結し、次いで再活性化す
ることができる。それらの細胞を限定希釈（Ｇｏｄｉ、
ｎｇ＋Ｊ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９＋
２８５＋１９８０）によりクローニングし、そしてプリ
スタンで感作されたｎｕ／ｎｕまたはＢａｊ２ｂ／ｃマ
ウス中で腹水を形成させることにより増殖させる（例１
０．４参照）。

増殖しているハイブリドーマを、例１．３のＥＬＩＳＡ
と同様なサンドインチ型エンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイにより、ヒトＩｇＥイソタイプに対して
向けられた抗体（抗−ヒトＩｇＥ抗体）の存在について
テストする。

５０ｍの０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液９Ｈ９，
６中の第１０表のＩｇＥ抗体（例１０．１参照）または
対照として他の全ての免疫グロブリンクラスのヒトミニ
ローマタンパク質（ＷＩＩＯ５ｔａｎｄａｒｄｓ）　（
下の第１１表参照）　　ｌＩｔｇをインキュベートする
ことにより、プラスチック製ミクロタイタープレートを
免疫グロブリンでコーティングする。例１．３に記載の
ようにしてインキュベーションおよび洗浄を行う。

結合したマウスモノクローナル抗体をアルカリホスファ
ターゼラベル化モノクローナルラットＩｇＧ抗−マウス
に軽ｔ＊Ｒａ３３−１８−１２を用いて検出する。

１０．３．２　　　−ジオイムノアッセイ　ＲＩＡ）第
二のスクリーニングにおいて、例１０．２のハイブリド
ーマを固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によりヒト
ＩｇＥイソタイプに対して向けられた抗体（抗−ヒトＩ
ｇＥ抗体）についてテストする。

５０４の０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９，
６中で１ｇのヒツジ抗−マウスＩｇ抗体を３７°Ｃで２
時間および４°Ｃで１５時間インキュベートすることに
より、ポリ塩化ビニル製ミクロタイタープレートをコー
ティングする。ＰＢＳで洗浄した後、プラスチック表面
上にまだ残存しているタンパク質反応性部位を、２００
　ＪＩＩのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＠　緩衝液（０，２％Ｎ
ａＮ１および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ０２０、ｐｎ７．４）と共に３７°Ｃで２時間イ
ンキュベートすることにより飽和し、そしてプレートを
ＰＢＳで洗浄する。全ての細胞上清５０Ｊを３７°Ｃで
４時間プレート中でインキユヘートし、そしてＰＢＳで
プレートを洗浄した後、ｌ！＋ｌ−ヨウ素化ヒトｒｇＥ
５０ｊｌＩを加え、３７°Ｃで１時間インキユヘートす
る。プレートを洗浄した後、ＰａｃｋａｒｄＣｏｂｒａ
”　５００５ガンマカウンター中でウェルをカウントす
ることにより、結合したＩｇＥの量を測定する。

スクリーニング操作の結果に基づき、Ｆｌ−１８−２２
゜Ｆｌ−３０−３，Ｆｌ−４３−１７，Ｆｌ−６２−４
８，Ｆｌ−７３−６３，Ｆｌ−７４−２０およびＦｌ−
７５−１４と命名した７つのハイブリドーマを更なる研
究のために選択する。それらは、ヒトＩｇＥとの結合反
応性を示すモノクローナル抗体を分泌するが、他の１ｇ
イソタイプのミエローマタンパク質とはバックグラウン
ドの交差反応性しか示さない。抗−ＩｇＥＭＡｂは、そ
れらが分泌されるハイブリドーマ細胞系に従って命名さ
れる。

例２．１に記載のようにして１０７個のハイブリドーマ
細胞が接種されたｎｕ／ｎｕマウスまたはＢａｆｆ１ｂ
／Ｃマウスの生体内でハイブリドーマを増殖させる。試
験管内での増殖については、例２．２の方法に従う。た
だし、細胞培養培地はＲＰＭＩ　１６４０の代わりにＤ
ＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ）を使う。例２．１に記載のよう
にして免疫グロブリンＧ画分を沈澱せしめそしてクロマ
トグラフィーを行う。

１０．５　　マウス　−ヒ　ＩＥモノクローナル例１０
．３のマウス抗−ヒトｒｇｓ　ＭＡｂの免疫グロブリン
クラスおよびサブクラスを、０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙに
より記載されたようにして決定する。テストした全ての
モノクローナル抗体はクラスＴｇＧ　　１である。

下記に記載の５ｕｂｒａｓ＋ａｎｉａｎ　＆　Ｂｒａｙ
　（Ｊ、Ｉｎｎ＋ｕｎｏｌ。

１３８．２７１，１９８７）に従った方法により、ヒス
タミン放出を誘導する能力についてマウス抗−ヒｌ−Ｉ
ｇＥ！ＭＡｂをテストする。

１１．１　　二五上星ロ坐貝製 健康な提供者からのヒト末梢血液を、シリコン処理した
試験管中に収集し、そしてＥＤＴＡでコーティングした
プラスチック試験管中で６％デキストラン（８ｄの血清
に対して２ｄ）と混合する。反転により混合した後、細
胞を室温で沈澱させ、そして白血球に冨む血漿層を流し
出し、１．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心する。上清を吸引
により除去し、細胞ペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液（２５
ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ、０，９％ＮａＣｌ、０．５ｍＭグ
ルコース、ｐＨ’７．４　）中に！Ａ濁し、そして１，
０００Ｘｇで１０分間再遠心する。この洗浄段階を２回
繰り返す。最後の細胞ペレットを、０．６ｓＭＣａＣｊ
２ｚおよび０゜６ｍＭＭｇＣｌ！、ｚを含む同緩衝液中
に再懸濁する。

１１．２　　ヒス　藁ン　　の演 約１０００個の細胞のアリコートを、適当な量の例１０
．３の抗−ヒト１ｇ［！ＭＡｂ（１／　３希釈液）によ
り３７°Ｃで１５分間誘発せしめる。溶解された細胞（
９５°Ｃ１１Ｏ分）の上清から、細胞の全ヒスタミン含
量を評価する。全てのテストは３回ずつ行い、そして各
試料については２回ずつヒスタミン評価を行う。

インキュベーション後、テスト上清のアリコートを酵素
−アイソトープアッセイによりヒスタミン含量について
アッセイする。５０ＩＪＩの上清（またはリン酸緩衝液
ｐＨ７，９で５０Ｊに希釈したアリコート）を、ラット
腎臓ヒスタくンメチルトランスフエラーゼ（２５〜３０
趨タンパク質）および０．６μＣｉ（’Ｈ）　−３−ア
デノシルメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ。

６０−８０μＣｉ／ξリモル）を含む反応混液６０Ｉ１
１と共に３７°Ｃで９０分間インキュベートする。４０
ｊｌｌの１．５Ｎ　　）ＩＣｊ２０４を添加しそして小
遠心管立パイブレークー（Ｅρｐｅｎｄｏｒｆ）上で混
合することにより反応を止める。次いで、４０μｌの１
０　Ｎ　ＮａＯＨを添加し、混合した後、５００　ｊｌ
ｌのトルエン：イソアミルアルコール混合物（８０：　
２０、ｖ　／　ｖ　）を添加する。アリコートを徹底的
に混合し、酵素反応により形成されたラベル化メチルヒ
スタミンを抽出する。次いで、４．０００ｒｐｍで５分
間試験管を遠心し、そして有Ｉ相３００μｌをポリプロ
ピレン製シンチレーションバイアルに移す。１ｒＩｄｌ
のエタノールおよび１０Ｆｎ１のシンチレーション反応
混液（Ｌｉｑｕｉｆｏｒτ舛；シンチレーション用トル
エンで希釈し、４ｇ／／！ＰＰＯおよび５０ｍｇ／ｆ　
ＰＯＰＯＰの最終濃度にしたもの）を添加した後、液体
シンチレーションカウンター（ＴｒｉｃａｒｂＴ′４；
　Ｐａｃｋａｒｄ）中で放射能をカウントする。

７つのテストした抗−ヒトＩｇＥ　ＭＡｂのうち、ＭＡ
ｂ　Ｆｌ−４３−１７は例１０．３．１のＥＬＩＳＡで
測定するとヒトＩｇＥに対する高い反応性を示すが、生
体内で１、、−ｇＥによりコーティングされたマスト細
胞から１０ｐｇ／ｍｌ　ＭＡｂまでのヒスタミン放出（
少なくとも５％）を誘導しない。

（１）例１０．３．１に従ったサンドイッチＥＬＩＳＡ
アッセイにより測定；０．５の光学濃度の読みを生じる
濃度。

（２）例比２に従って測定；５％の最大放出を生しる濃
度。

（３）標準偏差。

次のようにして、ＦｃεレセプターＩＩを有する細胞へ
のＩｇＥコートされたラテックス粒子の結合を阻害する
能力についてモノクローナル抗−ヒト１ｇＥ抗体をテス
トする。

製造業者の指示に従って、ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍ
ａ）を４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニ
ル酢酸（ＮＩＰ）とＢＳＡとの接合体（Ｂｒｏｗｎｓｔ
ｏｎｅら、Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．１０．４６５．１９６６
）でコーティングする。ビーズを洗浄し、０．１％ＢＳ
Ａ、０．２％ＮａＮ：＋を含むＰＢＳ（ｐＨ７，４）中
に再懸濁し、モして５００ＩＩＩ中で１００１！ｇのヒ
トＩｇＥキメラ抗−１１ｒＰ抗体Ｊ　Ｗ　８　（Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　　３１４　＋２６８、
１９８５）　と共に室温で４５分間インキュベートし、
次いで洗浄する。０．１ｍｇ／ｄの濃度での１００ｇの
抗−ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（または対照として
緩衝液）を、適当に希釈されたＩｇＥコートラテックス
ビーズ懸濁液２０１１１と室温で４５分間インキュベー
トし、次いで１００μｌの緩衝液中の２×１０’個のリ
ンパ芽球様細胞ＲＰＭＩ　８８６６細胞（Ｊｅｎｓｅｎ
ら、Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．５３．　Ｌ１９８４）を添加し
、そして室温で更に６０分間インキュベートする。ＲＰ
ＭＩ　８８６６細胞へのラテックス凝集の阻害を顕微鏡
検査により調べる。

実際に、抗−ヒトＩｇＥモノクローナル抗体は、ＩｇＥ
でコーティングされた粒子とＲＰＭＩ　８８６６細胞と
の間の相互作用を阻害することがわかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫グロブリンＥのイソタイプ決定基に対して向け
   られたモノクローナル抗体であって、Ｆｃεレセプター
   I またはIIを有する細胞への遊離ＩｇＥの結合を阻害
   しそしてＩｇＥ表面陽性Ｂ細胞の表面上に発現されるＩ
   ｇＥを認識するが、Ｆｃεレセプター I またはIIを有
   する細胞の表面上に結合したＩｇＥを認識せずそしてそ
   のような細胞からのメディエーター放出を触発しないモ
   ノクローナル抗体；および該抗体の特異性を保持してい
   るその誘導体。 ２、Ｆｃεレセプター I またはIIを有するマスト細胞
   および好塩基球の表面上に結合したＩｇＥを認識せずそ
   してそのような細胞からのアナフィラキシーメディエー
   ター放出を触発しない請求項１に記載のモノクローナル
   抗体、およびその誘導体。 ３、免疫応答におけるＩｇＥ形成を特異的に阻害する請
   求項１に記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体
   。 ４、免疫グロブリンクラスＩｇＥである請求項１に記載
   のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 ５、マウスＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられ
   た請求項１に記載のモノクローナル抗体、およびその誘
   導体。 ６、ラット抗体である請求項５に記載のモノクローナル
   抗体、およびその誘導体。 ７、称号ＭＡｂ１−５を有する請求項６に記載のモノク
   ローナル抗体、およびその誘導体。 ８、ヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられた
   請求項１に記載のモノクローナル抗体、およびその誘導
   体。 ９、マウスまたはラット抗体である請求項８に記載のモ
   ノクローナル抗体、およびその誘導体。 １０、マウス抗体である請求項８に記載のモノクローナ
   ル抗体、およびその誘導体。 １１、称号ＭＡｂＦ１−４３−１７を有する請求項１０
   に記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 １２、動物／ヒトキメラ抗体である請求項８に記載のモ
   ノクローナル抗体、およびその誘導体。 １３、マウス可変領域およびヒト定常領域から成る請求
   項１２に記載のキメラモノクローナル抗体、およびその
   誘導体。 １４、第一が請求項８に記載のモノクローナル抗体から
   誘導されそして第二が異なる特異性を有する抗体から誘
   導された２つの異なる抗原結合性部分を含んでなる二特
   異性モノクローナル抗体、およびその誘導体。 １５、第二の抗原結合性部分が、細胞増殖抑制性または
   細胞毒性物質に対して向けられた抗体から誘導される請
   求項１４に記載の二特異性モノクローナル抗体、および
   その誘導体。 １６、抗体断片である請求項１に記載のモノクローナル
   抗体の誘導体。 １７、酵素、蛍光マーカー、化学発光マーカー、金属キ
   レート、アビジンまたはビオチンとの抗体接合体である
   請求項１に記載のモノクローナル抗体の誘導体。 １８、放射能ラベル化された抗体である請求項１に記載
   のモノクローナル抗体の誘導体。１９、請求項１に記載
   のモノクローナル抗体およびその誘導体の調製方法であ
   って、前記モノクローナル抗体を分泌する連続細胞系の
   細胞を試験管内または生体内で増殖させ、そして必要な
   時、得られた前記モノクローナル抗体を単離しそして／
   またはその誘導体に変換することを含んで成る方法。 ２０、請求項１に記載のモノクローナル抗体を分泌する
   連続細胞系であるハイブリドーマ細胞系。 ２１、ミエローマ細胞とＩｇＥで免疫処置された哺乳動
   物のＢリンパ球とのハイブリッドである、請求項２０に
   記載のハイブリドーマ細胞系。 ２２、マウスミエローマ細胞とＩｇＥで免疫処置された
   ラットのＢリンパ球とのハイブリッドである、請求項２
   ０に記載のハイブリドーマ細胞系。 ２３、１９８９年４月１９日にＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐ
   ｅａｎＣｏｌｌｅｃ−ｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌ
   ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ）にＥＣＡＣＣ８９０４１９０２号
   のもとに寄託された呼称６５４−１−５を有する、請求
   項２０に記載のハイブリドーマ細胞系。 ２４、マウスミエローマ細胞とＩｇＥで免疫処置された
   同系マウスのＢリンパ球とのハイブリッドである、請求
   項２０に記載のハイブリドーマ細胞系。 ２５、１９９０年３月２２日にＥＣＡＣＣにＥＣＡＣＣ
   ９００３２２１０号のもとに寄託された呼称Ｆ１−４３
   −１７を有する、請求項２４に記載のハイブリドーマ細
   胞系。 ２６、請求項２０に記載のハイブリドーマ細胞系の調製
   方法であって、適当な哺乳動物をＩｇＥで免疫処置し、
   この動物の抗体産生細胞を連続細胞系の細胞と融合し、
   融合で得られたハイブリッド細胞をクローニングし、そ
   して所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞クローン
   を選択することを含んで成る方法。 ２７、請求項１２に記載の動物／ヒトキメラモノクロー
   ナル抗体を分泌するトランスフェクトーマ細胞系である
   連続細胞系。 ２８、請求項２７に記載のトランスフェクトーマ細胞系
   の調製方法であって、連続細胞系の細胞を、所望のキメ
   ラモノクローナル抗体の動物／ヒトキメラ軽鎖および／
   または重鎖をコードしている核酸構成物でトランスフェ
   クトし、トランスフェクトされた細胞をクローニングし
   、そして所望のキメラモノクローナル抗体を分泌する細
   胞クローンを選択することを含んでなる方法。 ２９、請求項１４に記載の二特異性モノクローナル抗体
   を分泌する連続細胞系。 ３０、請求項２９に記載の連続細胞系の調製方法であっ
   て、ヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられた
   モノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖を産生す
   る細胞と、異なる特異性を有するモノクローナル抗体の
   重鎖および／または軽鎖を産生する細胞とを融合し、融
   合で得られたハイブリッド細胞をクローニングし、そし
   て所望の二特異性モノクローナル抗体を分泌する細胞ク
   ローンを選択することを含んで成る方法。 ３１、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体を使用することを含んで成るＩｇＥの定
   性および定量方法。 ３２、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
   イまたは化学発光イムノアッセイを使用することを含ん
   で成る、請求項３１に記載の方法。 ３３、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体を使用することを含んで成るＩｇＥ産生
   細胞の定性および定量方法。 ３４、プラーク形成アッセイを使用することを含んで成
   る、請求項３３に記載の方法。 ３５、ＩｇＥおよび／またはＩｇＥ産生細胞の定性およ
   び定量方法のためのテストキットであって、請求項１に
   記載のモノクローナル抗体および／またはその誘導体、
   並びに所望により他のモノクローナル抗体もしくはポリ
   クローナル抗体および／または添加剤を含んで成るテス
   トキット。 ３６、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体を使用することを含んで成る表面ＩｇＥ
   陽性（ｓＩｇＥ＾＋）Ｂ細胞の定性および定量方法。 ３７、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体を使用することを含んで成るアレルギー
   の治療および／または予防方法。 ３８、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体を含んで成る医薬製剤。