JPH03210176A - Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．ＤＮＡメチラーゼ生産方法 - Google Patents
Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．ＤＮＡメチラーゼ生産方法Info
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- JPH03210176A JPH03210176A JP2209055A JP20905590A JPH03210176A JP H03210176 A JPH03210176 A JP H03210176A JP 2209055 A JP2209055 A JP 2209055A JP 20905590 A JP20905590 A JP 20905590A JP H03210176 A JPH03210176 A JP H03210176A
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- dna
- methylase
- spiroplasma
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
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- Molecular Biology (AREA)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
」ｉへｉ影
本発明は、グアニンの５′側に隣接するシトシン残基を
メチル化するＤＮＡメチラーゼをコードする組み換え体
ＤＮＡに係わる０本発明は特に、ＤＮＡメチラーゼＭ、
Ｓｓｓ ＭＱＩをコードする、５ｐｉｒｏｐｌａｓｓ＋
ａ ｓｐ。
メチル化するＤＮＡメチラーゼをコードする組み換え体
ＤＮＡに係わる０本発明は特に、ＤＮＡメチラーゼＭ、
Ｓｓｓ ＭＱＩをコードする、５ｐｉｒｏｐｌａｓｓ＋
ａ ｓｐ。
株ＭＱＩから取得可能な組み換え体ＤＮＡと、この組み
換え体ＤＮＡからの上記酵素の生産とに係わる。
換え体ＤＮＡからの上記酵素の生産とに係わる。
ＤＮＡメチラーゼは、ユニバーサルなメチル基供与体で
あるＳ−アデノシルメチオニンからＤＮＡ上の特異的部
位にメチル基を移転する。ＤＮＡ中のメチル化された塩
基は幾つかの生物学的機能を有すると着像されている。
あるＳ−アデノシルメチオニンからＤＮＡ上の特異的部
位にメチル基を移転する。ＤＮＡ中のメチル化された塩
基は幾つかの生物学的機能を有すると着像されている。
最も良く認められた生物学的機能は、細胞のＤＮＡを該
細胞自身が有する制限酵素による消化から保護すること
である。この制限修飾現象はこれまでのところ、細菌で
しか観察されていない、しかし、哺乳動物細胞はＤＮＡ
の、グアニンの５′側に隣接するシトシン残基（ｃｐＧ
）のみをメチル化する異なるメチラーゼを有する。この
メチラーゼによるメチル化は、幾つかの系統の証拠から
、遺伝子活性化、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体不活化
、ゲノムインプリンティングその他の主要な生物学的過
程において一定の役割を果たすことが判明している（Ｒ
ａｚｉｎ、＾、、 Ｃｅｄａｒ、 Ｈ，。
細胞自身が有する制限酵素による消化から保護すること
である。この制限修飾現象はこれまでのところ、細菌で
しか観察されていない、しかし、哺乳動物細胞はＤＮＡ
の、グアニンの５′側に隣接するシトシン残基（ｃｐＧ
）のみをメチル化する異なるメチラーゼを有する。この
メチラーゼによるメチル化は、幾つかの系統の証拠から
、遺伝子活性化、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体不活化
、ゲノムインプリンティングその他の主要な生物学的過
程において一定の役割を果たすことが判明している（Ｒ
ａｚｉｎ、＾、、 Ｃｅｄａｒ、 Ｈ，。
ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ、 Ｒ，Ｄ、 ｅｄ、、 ＤＮＡ
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａ
ｎｃｅＳｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、 １９８４）。
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａ
ｎｃｅＳｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、 １９８４）。
マウスＤＮＡメチラーゼをクローニングしようとして、
マウス遺伝子のｃＤＮ＾ＤＮＡクローニングされた（Ｂ
ｅｓｔｏｒ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｍｏ１．旧ｏｆ、
２０３．９７１゜１９８８）。しかし、遺伝子クロー
ンを含む株が活性な上記酵素を産生ずる証拠は無い、ま
た、哺乳動物のメチラーゼは“ｄｅ ｎｏｖｏ”メチラ
ーゼではなく“維持”メチラーゼで、メチル化されてい
ないＤＮＡより一方の鎖においてメチル化されたＤＮＡ
の方を１０〜１００倍有効にメチル化しくＲａｚｉｎ
ａｎｄ ５ｚｙｆ。
マウス遺伝子のｃＤＮ＾ＤＮＡクローニングされた（Ｂ
ｅｓｔｏｒ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｍｏ１．旧ｏｆ、
２０３．９７１゜１９８８）。しかし、遺伝子クロー
ンを含む株が活性な上記酵素を産生ずる証拠は無い、ま
た、哺乳動物のメチラーゼは“ｄｅ ｎｏｖｏ”メチラ
ーゼではなく“維持”メチラーゼで、メチル化されてい
ないＤＮＡより一方の鎖においてメチル化されたＤＮＡ
の方を１０〜１００倍有効にメチル化しくＲａｚｉｎ
ａｎｄ ５ｚｙｆ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｂｙｓ Ａｃｔａ ７８２．
３３１．１９８４）、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル
化されていないＤＮＡをメチル化する（ｄｅ ｎｏｖｏ
メチル化）には無効であることが留意されるべきである
。上述の総てに照らして、ＣｐＣ配列のみをメチル化す
る“ｄｅ ｎｏｖｏ”メチル化酵素が求められる。精製
作業と、酵素を採算量で生産する手段の構成とを容易に
する細菌株が有用であろう。
３３１．１９８４）、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル
化されていないＤＮＡをメチル化する（ｄｅ ｎｏｖｏ
メチル化）には無効であることが留意されるべきである
。上述の総てに照らして、ＣｐＣ配列のみをメチル化す
る“ｄｅ ｎｏｖｏ”メチル化酵素が求められる。精製
作業と、酵素を採算量で生産する手段の構成とを容易に
する細菌株が有用であろう。
“ｄｅ ｎｏｖｏ”メチラーゼの一つであるＤＮＡメチ
ラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩは、ＤＮＡ中のｃｐｃ配列の
みをメチル化しくＮｕｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏ！ １６４．１９．１９８５）、即ち哺乳
動物のＤＮＡメチラーゼを模倣する。メチラーゼの通常
用途の一つに、単離した遺伝子のメチル化が有る。この
メチル化は遺伝子を生物学的に不活性にする。現在入手
可能なメチラーゼは、ＣｐＧ配列のサブセットしかメチ
ル化しない１例えば、Ｍ、 ＨｐａＩ［は配列ｃｃｃｃ
の内側のシトシン残基をメチル化し、Ｍ、Ｈｈａｌは配
列ＧＣＧＣの内側のシトシン残基をメチル化する。これ
に対して、台、ＳｓｓＭＱｌは、メチル化されていない
ＤＮＡ中のあらゆるＣｐ［ｌ、をメチル化する（ｄｅ
ｎｏｖｏメチル化）。
ラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩは、ＤＮＡ中のｃｐｃ配列の
みをメチル化しくＮｕｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏ！ １６４．１９．１９８５）、即ち哺乳
動物のＤＮＡメチラーゼを模倣する。メチラーゼの通常
用途の一つに、単離した遺伝子のメチル化が有る。この
メチル化は遺伝子を生物学的に不活性にする。現在入手
可能なメチラーゼは、ＣｐＧ配列のサブセットしかメチ
ル化しない１例えば、Ｍ、 ＨｐａＩ［は配列ｃｃｃｃ
の内側のシトシン残基をメチル化し、Ｍ、Ｈｈａｌは配
列ＧＣＧＣの内側のシトシン残基をメチル化する。これ
に対して、台、ＳｓｓＭＱｌは、メチル化されていない
ＤＮＡ中のあらゆるＣｐ［ｌ、をメチル化する（ｄｅ
ｎｏｖｏメチル化）。
５ｐｉｒｏｐｌａｓ＋ｓａ ｓｐ、株ＭＱＩは、細胞壁
欠如細菌のＭｏ１ｌｉｃｕｔｅｓ綱のＳｐｉｒｏｐｌａ
ｓｍａｔａｃｅａｅ科に属する。
欠如細菌のＭｏ１ｌｉｃｕｔｅｓ綱のＳｐｉｒｏｐｌａ
ｓｍａｔａｃｅａｅ科に属する。
この細菌は植物寄生体で、培養では増殖が非常に遅く、
到達する細胞密度も非常に低い（集密状態で１０８細胞
／１）。そのうえ、培地は比較的複雑でかつ高価である
。従って、メチラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩの大量合成を
可能にする組み換えＤＮＡ技術によって細菌株を得るこ
とが商業的に要求される。
到達する細胞密度も非常に低い（集密状態で１０８細胞
／１）。そのうえ、培地は比較的複雑でかつ高価である
。従って、メチラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩの大量合成を
可能にする組み換えＤＮＡ技術によって細菌株を得るこ
とが商業的に要求される。
先賢へ」」
本発明は、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、株ＭＱＩ（
＾ＴＣＣ１３３８２５） から取得可能なりＮＡメチラーゼＨ，Ｓｓｓ ＭＱＩに
関する遺伝子をコードする組み換え体ＤＮＡと、組み換
え体メチラーゼと、この酵素を生産する関連方法とを提
供する。本発明は特に、メチラーゼＭ．ＳｓｓＭＱ１を
発現する形質転換宿主、及びＤＮＡ中の全ＣｐＧ配列を
特異的にメチル化する組み換え体メチラーゼに係わる。
＾ＴＣＣ１３３８２５） から取得可能なりＮＡメチラーゼＨ，Ｓｓｓ ＭＱＩに
関する遺伝子をコードする組み換え体ＤＮＡと、組み換
え体メチラーゼと、この酵素を生産する関連方法とを提
供する。本発明は特に、メチラーゼＭ．ＳｓｓＭＱ１を
発現する形質転換宿主、及びＤＮＡ中の全ＣｐＧ配列を
特異的にメチル化する組み換え体メチラーゼに係わる。
本発明により生産されるメチラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩ
はｄｅ ｎｏｖｏメチル化において活性である。
はｄｅ ｎｏｖｏメチル化において活性である。
ＤＮＡメチラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩをクローニングす
る好ましい方法は、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、株
ＭＱＩ由来のＤＮＡを含むライブラリーを十分な数だけ
作製することと、ライブラリーのＤＮＡをＨｈａ ｌの
ような適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ちその認識配
列を該配列がＣＧでメチル化されていなければ切断する
酵素と共にインキュベートすることにより、メチラーゼ
遺伝子を発現させるクローンを選択することと、制限エ
ンドヌクレアーゼと共にインキュベートしても切断され
なかった組み換え体ＤＮ＾で再び宿主を形質転換し、得
られた形質転換細胞をスクリーニングして、形質転換さ
れなかった宿主と混在する陽性のクローンを分離するこ
ととを含む。
る好ましい方法は、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、株
ＭＱＩ由来のＤＮＡを含むライブラリーを十分な数だけ
作製することと、ライブラリーのＤＮＡをＨｈａ ｌの
ような適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ちその認識配
列を該配列がＣＧでメチル化されていなければ切断する
酵素と共にインキュベートすることにより、メチラーゼ
遺伝子を発現させるクローンを選択することと、制限エ
ンドヌクレアーゼと共にインキュベートしても切断され
なかった組み換え体ＤＮ＾で再び宿主を形質転換し、得
られた形質転換細胞をスクリーニングして、形質転換さ
れなかった宿主と混在する陽性のクローンを分離するこ
ととを含む。
い の＝
本発明は、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ＤＮＡメチラーゼ
または該メチラーゼの一部をコードする組み換え体ＤＮ
Ａまたはその誘導体と、そのような組み換え体ＤＮＡか
ら生産されるメチラーゼとに係わる０本発明の組み換え
体ＤＮ＾の誘導体は、Ｅ、 ｃｏｌｉのような微生物宿
主での有効な発現のために遺伝暗号の縮重、即ち一つ以
上のコドンの置き換えを反映しているＤＮＡ配列、及び
メチラーゼの生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡ
配列を含む。メチラーゼ遺伝子のクローニングは、好ま
しくは、該遺伝子を発現させる組み換え体クローンのＤ
ＮＡは認識部位内の５−メチルシトシンに感受性である
制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ消化に
対して耐性であるということを利用する方法によって実
施する。
または該メチラーゼの一部をコードする組み換え体ＤＮ
Ａまたはその誘導体と、そのような組み換え体ＤＮＡか
ら生産されるメチラーゼとに係わる０本発明の組み換え
体ＤＮ＾の誘導体は、Ｅ、 ｃｏｌｉのような微生物宿
主での有効な発現のために遺伝暗号の縮重、即ち一つ以
上のコドンの置き換えを反映しているＤＮＡ配列、及び
メチラーゼの生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡ
配列を含む。メチラーゼ遺伝子のクローニングは、好ま
しくは、該遺伝子を発現させる組み換え体クローンのＤ
ＮＡは認識部位内の５−メチルシトシンに感受性である
制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ消化に
対して耐性であるということを利用する方法によって実
施する。
上記のような制限エンドヌクレアーゼには■ｐａｆｆ、
ＦｎｕＤＩ［、ＨｉｎＰ Ｉ 、Ｓｅａ Ｉ 、Ｎａｒ
Ｉ及び５ａｌｌが含まれる。上記のような消化耐性は
、総てのＣｐＧ配列をメチル化するメチラーゼＭ、Ｓｓ
ｓ ＭＱＩをコードする組み換え体クローンを選択的に
分離する手段として有効である。
ＦｎｕＤＩ［、ＨｉｎＰ Ｉ 、Ｓｅａ Ｉ 、Ｎａｒ
Ｉ及び５ａｌｌが含まれる。上記のような消化耐性は
、総てのＣｐＧ配列をメチル化するメチラーゼＭ、Ｓｓ
ｓ ＭＱＩをコードする組み換え体クローンを選択的に
分離する手段として有効である。
第１図に、本明細書に説明する、５ｐｉｒｏｐｌａｓ＋
＋＋ａメチラーゼをコードするＤＮＡを好ましくクロー
ニングし、かつ得られたクローンでの形質発現を好まし
く実現する方法を示す、この方法は、次の諸ステップを
含む。
＋＋ａメチラーゼをコードするＤＮＡを好ましくクロー
ニングし、かつ得られたクローンでの形質発現を好まし
く実現する方法を示す、この方法は、次の諸ステップを
含む。
１、ＤＮＡは、Ｓａｇｌｉｏ培地（Ｓａｇｌｉｏ ｅｔ
ａｌ、、 Ｐｈｙｓｉ−ｏｌ、 Ｖｅｇ、 ９．５６
９．１９７１）で３２℃で増殖させて集密状態としたＳ
ｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、株ＭＱＩ（＾ＴＣＣ＃３
３８２５）から取得可能である。好ましくはＤＮＡは、
本明細書に参考として含まれるＭａｒｍｕｒ。
ａｌ、、 Ｐｈｙｓｉ−ｏｌ、 Ｖｅｇ、 ９．５６
９．１９７１）で３２℃で増殖させて集密状態としたＳ
ｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、株ＭＱＩ（＾ＴＣＣ＃３
３８２５）から取得可能である。好ましくはＤＮＡは、
本明細書に参考として含まれるＭａｒｍｕｒ。
Ｊ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ３．２０８．
１９６１に開示された操作で精製する。
１９６１に開示された操作で精製する。
２゜
ＤＮＡを５ａｕ３＾■のような制限エンドヌクレアーゼ
で部分的に消化し、３〜１０ｋｂ長のＤＮＡ断片を１０
〜４０％のショ糖密度勾配から得てプールする。
で部分的に消化し、３〜１０ｋｂ長のＤＮＡ断片を１０
〜４０％のショ糖密度勾配から得てプールする。
３、ＤＮＡ断片を、一つ以上のＨｈａ １部位を有する
ｐＵＣ１８のようなりローニングベクターに連結させる
。連結したＤＮＡで、好ましくは１ｅｅｒ＾−１ｍｃｒ
Ｂ−１ｌａｅｌ’及びｒｅｃＡ−であるＥ、 ｃｏｌｉ
のような適当宿主を形質転換する。好ましい宿主の一例
としては、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＥＲ１４５１の誘導体（本
明細書に参考として含まれるＲａｌｅｉｇｈ、 Ｅ、＾
、。
ｐＵＣ１８のようなりローニングベクターに連結させる
。連結したＤＮＡで、好ましくは１ｅｅｒ＾−１ｍｃｒ
Ｂ−１ｌａｅｌ’及びｒｅｃＡ−であるＥ、 ｃｏｌｉ
のような適当宿主を形質転換する。好ましい宿主の一例
としては、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＥＲ１４５１の誘導体（本
明細書に参考として含まれるＲａｌｅｉｇｈ、 Ｅ、＾
、。
ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅ
ｓ、 １６．１５６３．１９８８参照）にＰ１形質導入
によってｒｅｃＡ−変異を導入して得られるＥ、 ｃｏ
ｌｉ ＰＲＩＯＩを挙げることができる。
ｓ、 １６．１５６３．１９８８参照）にＰ１形質導入
によってｒｅｃＡ−変異を導入して得られるＥ、 ｃｏ
ｌｉ ＰＲＩＯＩを挙げることができる。
形質転換混合物を、形質転換細胞を選択的に増殖させる
抗生物質アンピシリンのような培地上で平板培養する。
抗生物質アンピシリンのような培地上で平板培養する。
インキュベーション４ 。
後、形質転換細胞コロニーを集めて単一の培養物即ち細
胞ライブラリーとする。
胞ライブラリーとする。
細胞ライブラリーから総ての組み換え体プラスミドを精
製してプラスミドライブラリーを作製する。
製してプラスミドライブラリーを作製する。
６、 ｐｓｌｌＩｃ１０１由来のｔｒｐ Ｔサプレッ
サー（本明細書に参考として含まれるＲａｆｔｅｒｙ、
Ｌ、＾、、ｅｔｍ１．． Ｊ、 Ｂａｃｔ、 １５８
．８４９．１９８４参照）でｐＡＬ２４９（ｐＡｃＹｃ
１８４の誘導体）を組み換えることによって、ｐＳＵ７
７のようなオパールサプレッサーを形成する。第２図に
、ｐＳＵ７７の構成を示す。ｐＳＵ７７がコードするｔ
ＲＮ＾を用いてコドンＵＧ＾の位置に上記アミノ酸（ト
リプトファン）を導入する。
サー（本明細書に参考として含まれるＲａｆｔｅｒｙ、
Ｌ、＾、、ｅｔｍ１．． Ｊ、 Ｂａｃｔ、 １５８
．８４９．１９８４参照）でｐＡＬ２４９（ｐＡｃＹｃ
１８４の誘導体）を組み換えることによって、ｐＳＵ７
７のようなオパールサプレッサーを形成する。第２図に
、ｐＳＵ７７の構成を示す。ｐＳＵ７７がコードするｔ
ＲＮ＾を用いてコドンＵＧ＾の位置に上記アミノ酸（ト
リプトファン）を導入する。
このコドンはメチラーゼ遺伝子内で４回出現する。サプ
レッサーｔＲＮ＾が不在であれば、コドンＵＧ＾はＥ、
ｃｏｌｉ中で終結コドンと解読され、従ってＥ、 ｃ
ｏｌｉにおける生物学的に活性なメチラーゼの発現を妨
げる。
レッサーｔＲＮ＾が不在であれば、コドンＵＧ＾はＥ、
ｃｏｌｉ中で終結コドンと解読され、従ってＥ、 ｃ
ｏｌｉにおける生物学的に活性なメチラーゼの発現を妨
げる。
５ 。
７、プラスミドｐＳＵ７フまたはその誘導体でＥ、 ｃ
ｏ−１ｉ ＰＲＩＯＩを形質転換し、クロラムフェニコ
ールに対して耐性であるコロニーを選択する。
ｏ−１ｉ ＰＲＩＯＩを形質転換し、クロラムフェニコ
ールに対して耐性であるコロニーを選択する。
８、 ＰＲＩＯＩ／ｐＳＵ７７をプラスミドライブラ
リーで形質転換し、得られた形質転換細胞をＩＰＴＧ（
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の存
在下に増殖させる。 ＬＢ培地においてアンピシリン／
クロラムフェニコール耐性コロニーを集める。
リーで形質転換し、得られた形質転換細胞をＩＰＴＧ（
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の存
在下に増殖させる。 ＬＢ培地においてアンピシリン／
クロラムフェニコール耐性コロニーを集める。
９、組み換え体プラスミドを精製し、かつ制限エンドヌ
クレアーゼＨｈａ Ｉで完全に消化する。
クレアーゼＨｈａ Ｉで完全に消化する。
この消化はメチラーゼを含まない未修飾クローンを選択
的に破壊し、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｗ＋ａ ｓｐ、株ＭＱ
Ｉメチラーゼクローンの相対頻度を高める。
的に破壊し、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｗ＋ａ ｓｐ、株ＭＱ
Ｉメチラーゼクローンの相対頻度を高める。
消化したプラスミドライブラリーでＰＲＩＯＩ／ｐＳＵ
７７のような適当宿主を再び形質転換し、形質転換細胞
を選択培地上での平板培養によって回収する。コロニー
を採集し、そのＤＮＡをＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラ
ーゼ遺伝子の存在について分析する。即ち、メチラーゼ
遺伝子を持つプラスミドを精製し、かつエンドヌクレア
ーゼＨｐａ ｌ［及びＭｓｐ ｌと共にインキュベート
して、該プラスミドがＨｐａ Ｕに対して耐性であり、
かつＭｓｐ ■による消化に対しては感受性であるかど
うかを調べる（第３図）、第３図において、クローン１
．５．７及び８から得たプラスミドはＨｐａ ■による
切断に対する耐性と、ＭｓｐＩによる切断に対する感受
性とを示している。クローン２．３．４及び６から得た
プラスミドはＨｐａ ｆｌ切断にもＭｓｐ ｌ切断にも
感受性である。従って、クローン１．５．７及び８が活
性なＣｐＧメチラーゼをコードするものと考えられる。
７７のような適当宿主を再び形質転換し、形質転換細胞
を選択培地上での平板培養によって回収する。コロニー
を採集し、そのＤＮＡをＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラ
ーゼ遺伝子の存在について分析する。即ち、メチラーゼ
遺伝子を持つプラスミドを精製し、かつエンドヌクレア
ーゼＨｐａ ｌ［及びＭｓｐ ｌと共にインキュベート
して、該プラスミドがＨｐａ Ｕに対して耐性であり、
かつＭｓｐ ■による消化に対しては感受性であるかど
うかを調べる（第３図）、第３図において、クローン１
．５．７及び８から得たプラスミドはＨｐａ ■による
切断に対する耐性と、ＭｓｐＩによる切断に対する感受
性とを示している。クローン２．３．４及び６から得た
プラスミドはＨｐａ ｆｌ切断にもＭｓｐ ｌ切断にも
感受性である。従って、クローン１．５．７及び８が活
性なＣｐＧメチラーゼをコードするものと考えられる。
ＣｐＧメチル化について直接評価するべく、プラスミド
ＤＮＡ及び細胞ＤＮＡも精製し、後段に詳述する隣接塩
基頻度分析法で分析する（第４図）、 Ｓｐｉｒｏｐｌ
ａｓｍａメチラーゼ遺伝子を持つクローンのプラスミド
は完全に修飾されているべきであり、かつ染色体ＤＮＡ
も実質的に修飾されているべきである。
ＤＮＡ及び細胞ＤＮＡも精製し、後段に詳述する隣接塩
基頻度分析法で分析する（第４図）、 Ｓｐｉｒｏｐｌ
ａｓｍａメチラーゼ遺伝子を持つクローンのプラスミド
は完全に修飾されているべきであり、かつ染色体ＤＮＡ
も実質的に修飾されているべきである。
１０、実施例に述べたように５ｐｉｒｏｐｌａｓ論ａメ
チラーゼクローンの細胞抽出物を生成し、この抽出物を
Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ活性について評価す
ることによって、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼを
有するクローンを同定する。
チラーゼクローンの細胞抽出物を生成し、この抽出物を
Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ活性について評価す
ることによって、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼを
有するクローンを同定する。
クローンが産生するＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ
の量は、ｐＵＣ１９（＾ＴＣＣ＃３７２５４）のような
多数複製できるベクターを用いて遺伝子用量を増大する
こと、Ｔ７バクテリオフアージプロモーターのような高
度に活性な外来プロモーターを用いて転写速度を高める
こと（本明細書に参考として含まれる５ｔｕｄｉｅｒ、
Ｆ、 Ｈ，、ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ。
の量は、ｐＵＣ１９（＾ＴＣＣ＃３７２５４）のような
多数複製できるベクターを用いて遺伝子用量を増大する
こと、Ｔ７バクテリオフアージプロモーターのような高
度に活性な外来プロモーターを用いて転写速度を高める
こと（本明細書に参考として含まれる５ｔｕｄｉｅｒ、
Ｆ、 Ｈ，、ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ。
Ｂ、＾、、 Ｊ、 Ｎｏｔ、 Ｂｉｏｌ、 １８９．１
１３．１９８６参照）、及びＤＮＡ中のメチラーゼ遺伝
子内にＴＧ＾として現れるオパールコドンを部位特異的
な突然変１１゜ 異誘発でＴＧＧに置き換えること（本明細書に参考とし
て含まれるＫｕｎｋｅｌ、 Ｔ、＾、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
１３．１９８６参照）、及びＤＮＡ中のメチラーゼ遺伝
子内にＴＧ＾として現れるオパールコドンを部位特異的
な突然変１１゜ 異誘発でＴＧＧに置き換えること（本明細書に参考とし
て含まれるＫｕｎｋｅｌ、 Ｔ、＾、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ８２．４８８．１９８５参照）
によって増加させ得る。
によって増加させ得る。
１２、 Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ遺伝子を
持つクローンからのＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ
生産は発酵槽内で、アンピシリン及びクロラムフェニコ
ールを含む濃厚培地中での増殖によって実施し得る。細
胞を遠心分離によって集め、かつ音波処理や、アルミナ
を用いて行なう粉砕などの他の処理によって破壊して、
Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ活性を有する粗細胞
抽出物を製造する。
持つクローンからのＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ
生産は発酵槽内で、アンピシリン及びクロラムフェニコ
ールを含む濃厚培地中での増殖によって実施し得る。細
胞を遠心分離によって集め、かつ音波処理や、アルミナ
を用いて行なう粉砕などの他の処理によって破壊して、
Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼ活性を有する粗細胞
抽出物を製造する。
１３、組み換え体メチラーゼは好ましくは、ヘパリンセ
ファロースなどでのアフィニティークロマトグラフィー
及びイオン交換クロマトグラフィーを用いる標準的なタ
ンパク質精製技術で精製する。この技術によってメチラ
ーゼを、好ましくは少なくとも約８０％に達し、更に好
ましくは約９０％にも達する均質度に精製する。約８０
％を上回る純度を有するメチラーゼは、実質的に純粋で
あると着像すことができる。
ファロースなどでのアフィニティークロマトグラフィー
及びイオン交換クロマトグラフィーを用いる標準的なタ
ンパク質精製技術で精製する。この技術によってメチラ
ーゼを、好ましくは少なくとも約８０％に達し、更に好
ましくは約９０％にも達する均質度に精製する。約８０
％を上回る純度を有するメチラーゼは、実質的に純粋で
あると着像すことができる。
これまで概説した諸ステップは本発明実施の好ましい方
法を構成してはいるが、これらのステップが当業者に公
知の技術によって変更可能であることは当業者には明ら
かであろう、以下の実施例によって、現在好まし〈実施
できる本発明の詳細な説明する。この実施例は単なる説
明のためのものであり、本発明を特許請求の範囲各項の
記載以上に限定することはないと理解される。
法を構成してはいるが、これらのステップが当業者に公
知の技術によって変更可能であることは当業者には明ら
かであろう、以下の実施例によって、現在好まし〈実施
できる本発明の詳細な説明する。この実施例は単なる説
明のためのものであり、本発明を特許請求の範囲各項の
記載以上に限定することはないと理解される。
入元ニア１：ＤＮ＾精製
＾ＴＣＣから入手可能であるＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａ
ｓｐ、細胞株ＭＱＩ （＃３３８２５）を増殖させて集
密状態とし、Ｓｏｒ−ｖａ１１冷却遠心機のＣＳＡ型ロ
ーターにおいて１０．００Ｏｒｐｍで、温度４℃で１０
分間遠心分離して採集した。
ｓｐ、細胞株ＭＱＩ （＃３３８２５）を増殖させて集
密状態とし、Ｓｏｒ−ｖａ１１冷却遠心機のＣＳＡ型ロ
ーターにおいて１０．００Ｏｒｐｍで、温度４℃で１０
分間遠心分離して採集した。
細胞を０．２Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）、５１ＩＩＭＥＤＴ＾で２回洗浄し、
ペレットを０．ＩＮ ＥＤＴ＾と、１％Ｎ−ラウリルサ
ルコシンと、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼにとを含
む混合物１０ｍ１中に再懸濁させて、５０℃で２時間イ
ンキュベートした。ＲＮアーゼ屓１００μｇ／ｍｌ）を
添加し、混合物を３７℃で更に２時間インキュベートし
た。処理した溶解物を、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５： ２４ ：１）で２回、ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２同
種やかに抽出した。
Ｉ（ｐＨ７，５）、５１ＩＩＭＥＤＴ＾で２回洗浄し、
ペレットを０．ＩＮ ＥＤＴ＾と、１％Ｎ−ラウリルサ
ルコシンと、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼにとを含
む混合物１０ｍ１中に再懸濁させて、５０℃で２時間イ
ンキュベートした。ＲＮアーゼ屓１００μｇ／ｍｌ）を
添加し、混合物を３７℃で更に２時間インキュベートし
た。処理した溶解物を、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５： ２４ ：１）で２回、ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２同
種やかに抽出した。
得られた水性相を４℃で、１０＋＋Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣ
Ｉ（ｐＨ８＞、尼 １ｍＭ ＥＤＴ＾に対して弗分に透析した。
Ｉ（ｐＨ８＞、尼 １ｍＭ ＥＤＴ＾に対して弗分に透析した。
スｊＬ工１電工： ｌ）Ｎへの消化
５０μ、のＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、株ＭＱＩ
ＤＨＡを、ＤＮ＾１μｇ当たり０．１６〜０．３単位の
酵素５ａｕ３＾で部分的に消化し、３７℃で２０分間イ
ンキュベートした。１５分間６５℃まで加熱して反応を
停止させた。得られたＤＮＡ断片を、２２ｋｒｐａで２
３時間作動させた遠心機においてシヨ糖密度勾配置０〜
４０％で分離した。
ＤＨＡを、ＤＮ＾１μｇ当たり０．１６〜０．３単位の
酵素５ａｕ３＾で部分的に消化し、３７℃で２０分間イ
ンキュベートした。１５分間６５℃まで加熱して反応を
停止させた。得られたＤＮＡ断片を、２２ｋｒｐａで２
３時間作動させた遠心機においてシヨ糖密度勾配置０〜
４０％で分離した。
平均長３〜１０ｋｂのＤＮＡ断片をプールし、連結操作
に用いた。
に用いた。
＆デュブ１：連結及び形質転換
プールしたＤＮＡ断片を、５０μｇの脱リン酸化したベ
クターｐＵＣ１８のＢａａｅｄ ■部位に、抽入ＤＨＡ
対ベクターＤＮＡのモル比３：１で連結させた。連結反
応は、３００単位のＴ４ ＤＮ＾リガーゼを補った標準
的な連結反応緩衝液［６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，６）、１ｍＭ＾ＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
ｍＭスペルミジン、１５ｍＭ ＤＴＴ、１１１１８／＋
１１１８Ｓ＾］中で１６℃で４時間継続させた。Ｅ、
ｃｏｌｉ ＰＲＩＯＩ／ｐＳＵ７７において形質転換を
、Ｈａｎａｈａｎ、 Ｄ、の方法（ＤＨＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｖｏｌ、 １． ｅｄ、 ｂｙ Ｇ
ｌｏｖｅｒ、 Ｄ、 Ｍ、。
クターｐＵＣ１８のＢａａｅｄ ■部位に、抽入ＤＨＡ
対ベクターＤＮＡのモル比３：１で連結させた。連結反
応は、３００単位のＴ４ ＤＮ＾リガーゼを補った標準
的な連結反応緩衝液［６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，６）、１ｍＭ＾ＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
ｍＭスペルミジン、１５ｍＭ ＤＴＴ、１１１１８／＋
１１１８Ｓ＾］中で１６℃で４時間継続させた。Ｅ、
ｃｏｌｉ ＰＲＩＯＩ／ｐＳＵ７７において形質転換を
、Ｈａｎａｈａｎ、 Ｄ、の方法（ＤＨＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｖｏｌ、 １． ｅｄ、 ｂｙ Ｇ
ｌｏｖｅｒ、 Ｄ、 Ｍ、。
ＪＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 ０ｘｆｏｒｄ、 ｐｐ、 １０
９−１３５．１９８６参照）で生起させた。
９−１３５．１９８６参照）で生起させた。
ｋ元ニブ４：＠胞うイブラリー
形質転換培養物を穏やかに遠心分離して上澄み液を除去
し、細胞を１ｍｌのし一ブイヨン中に再懸濁させた６細
胞懸濁液の２００μｍ部分を、５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン含有Ｌｕｒｉａ寒天平板上に接種した。平板を３７
℃で一晩インキユベートした。各平板をＬ−ブイヨンで
洗い、かつ寒天をゴムポリスマンで掻いて、平板表面で
増殖した形質転換細胞を採集した。Ｌ−ブイヨン中の８
０％グリセロールを等量添加し、得られた細胞ライブラ
リーは使用まで２０℃で保存した。
し、細胞を１ｍｌのし一ブイヨン中に再懸濁させた６細
胞懸濁液の２００μｍ部分を、５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン含有Ｌｕｒｉａ寒天平板上に接種した。平板を３７
℃で一晩インキユベートした。各平板をＬ−ブイヨンで
洗い、かつ寒天をゴムポリスマンで掻いて、平板表面で
増殖した形質転換細胞を採集した。Ｌ−ブイヨン中の８
０％グリセロールを等量添加し、得られた細胞ライブラ
リーは使用まで２０℃で保存した。
スｊＬヱフ１−ニブラスミドライブラリー２００μｍの
上記懸濁液をアンピシリン（５０μｇ／ｍ ｌ ）含有
のし一ブイヨン２５０１に接種することによって細胞ラ
イブラリーを増幅させ、このライブラリーを３７℃で１
８時間インキュベートした。 ４ｋｒｐｍで１０分間遠
心分離を行なって細胞を採集した。ペレットを、２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ）ＩｃＩ（ｐＨ８，０）と、１０ｓ＋Ｍ
ＥＤＴ＾と、１５％ショ糖とを含む混合物６ｓｉｌ中
に再懸濁させた。リゾチーム（１６ｍｇ）を添加し、混
合物を氷上で１０分間インキュベートした。新たに調製
した０、２Ｎ ＮａＯＨ１１％ＳＤＳを添加し、氷上で
１０分間インキュベートした。ｐ１１４．６の３Ｍ酢酸
ナトリウム７．５１を添加し、氷上で更に２０分間イン
キュベートした。溶解物を４℃で１５分間３０．ＯＯＯ
ｘｇで遠心分離して、染色体ＤＮＡ及び細胞破片を除去
した。透明な上澄み液に２５μｍのＲＮアーゼ＾（１０
ｍｇ／ｍｌ）を添加し、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５： ２４ ： １）での抽出
とそれに続くエタノール沈澱とによってＤＮＡを精製し
た。ＤＮＡを６〜８１の水に溶解させ、公知の塩化セシ
ウム／臭化エチジウム密度勾配（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅ
ｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＣ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒ’ｙ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ｐｐ、 ９３−９４．１９８２参
照）で精製した。
上記懸濁液をアンピシリン（５０μｇ／ｍ ｌ ）含有
のし一ブイヨン２５０１に接種することによって細胞ラ
イブラリーを増幅させ、このライブラリーを３７℃で１
８時間インキュベートした。 ４ｋｒｐｍで１０分間遠
心分離を行なって細胞を採集した。ペレットを、２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ）ＩｃＩ（ｐＨ８，０）と、１０ｓ＋Ｍ
ＥＤＴ＾と、１５％ショ糖とを含む混合物６ｓｉｌ中
に再懸濁させた。リゾチーム（１６ｍｇ）を添加し、混
合物を氷上で１０分間インキュベートした。新たに調製
した０、２Ｎ ＮａＯＨ１１％ＳＤＳを添加し、氷上で
１０分間インキュベートした。ｐ１１４．６の３Ｍ酢酸
ナトリウム７．５１を添加し、氷上で更に２０分間イン
キュベートした。溶解物を４℃で１５分間３０．ＯＯＯ
ｘｇで遠心分離して、染色体ＤＮＡ及び細胞破片を除去
した。透明な上澄み液に２５μｍのＲＮアーゼ＾（１０
ｍｇ／ｍｌ）を添加し、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５： ２４ ： １）での抽出
とそれに続くエタノール沈澱とによってＤＮＡを精製し
た。ＤＮＡを６〜８１の水に溶解させ、公知の塩化セシ
ウム／臭化エチジウム密度勾配（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅ
ｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＣ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒ’ｙ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ｐｐ、 ９３−９４．１９８２参
照）で精製した。
ｚヨタ」−ス」−ニブラスミドライブラリーの消化プラ
スミドライブラリーのアリコートで、ｐＳＵ７７に組み
込まれたオパールサプレッサーを有するＥ、 ｃｏｌｉ
ＰＲＩＯＩを形質転換した。平板をＬ−ブイヨンで洗
い、ゴムポリスマンで４０，０００コロニを採集した。
スミドライブラリーのアリコートで、ｐＳＵ７７に組み
込まれたオパールサプレッサーを有するＥ、 ｃｏｌｉ
ＰＲＩＯＩを形質転換した。平板をＬ−ブイヨンで洗
い、ゴムポリスマンで４０，０００コロニを採集した。
２００μｍアリコートを５０μｇ／ｍｌアンピシリン及
び１７μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有のし一ブイ
ヨン２５０ｍ ｌに接種し、３７℃でインキュベートし
た。細胞密度が１０＠細胞／ｍｌに達したところでＩＰ
ＴＧを添加し、その最終濃度を２．５ｍＭとした。培養
物を増殖させて集密状態とし、細胞を採集し、上記ステ
ップ５でのようにしてプラスミドを得た。
び１７μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有のし一ブイ
ヨン２５０ｍ ｌに接種し、３７℃でインキュベートし
た。細胞密度が１０＠細胞／ｍｌに達したところでＩＰ
ＴＧを添加し、その最終濃度を２．５ｍＭとした。培養
物を増殖させて集密状態とし、細胞を採集し、上記ステ
ップ５でのようにしてプラスミドを得た。
プラスミドライブラリーの１０μｇ部分を２５単位の制
限エンドヌクレアーゼＨｈａ ｌで完全に消化した。
限エンドヌクレアーゼＨｈａ ｌで完全に消化した。
スｊＬムフフー：形質転換
消化したライブラリーを用いて、ｐＳＵ７７に組み込ま
れたオパールサプレッサーを有するＥ、 ｃｏｌｉＰＲ
ＩＯＩをステップ３に述べたように形質転換した。
れたオパールサプレッサーを有するＥ、 ｃｏｌｉＰＲ
ＩＯＩをステップ３に述べたように形質転換した。
形質転換培養物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１
７μＨ／ｍｌクロラムフェニコール含有のし一寒天上で
平板培養した。Ｈｈａｌ消化によって、形質転換細胞の
数は未消化プラスミドで形質転換した場合のｔ／ｌｏ’
に減少した。Ｈｈａ Ｉ消化を免れたプラスミドに関連
する培養物から６５コロニーを採集し、各コロニーをア
ンピシリン及びクロラムフェニコール含有のし一ブイヨ
ン２１に接種した。培養物の細胞密度が１０″細胞／輸
１に達したところでＩＰＴＧを添加した。微量プラスミ
ド調製のために、微量培養物を増殖させて集密状態とし
、かつＬ−寒天平板上で画線培養してマスターストック
を製造した。
７μＨ／ｍｌクロラムフェニコール含有のし一寒天上で
平板培養した。Ｈｈａｌ消化によって、形質転換細胞の
数は未消化プラスミドで形質転換した場合のｔ／ｌｏ’
に減少した。Ｈｈａ Ｉ消化を免れたプラスミドに関連
する培養物から６５コロニーを採集し、各コロニーをア
ンピシリン及びクロラムフェニコール含有のし一ブイヨ
ン２１に接種した。培養物の細胞密度が１０″細胞／輸
１に達したところでＩＰＴＧを添加した。微量プラスミ
ド調製のために、微量培養物を増殖させて集密状態とし
、かつＬ−寒天平板上で画線培養してマスターストック
を製造した。
入デヱブ１：未消化個体分析
プラスミドＤＮＡの微量調製：
細胞を、１分間ミクロ遠心機に掛けてベレット状にし、
１００μＩの５ＴＥＴ［８％ショ糖、５％トリトンＸ−
１００，５０ｍＭ ＥＤＴ＾、５０＋ＩＩＭ Ｔｒｉｓ
（ｐＨ８，０）］中に再懸濁させた。この懸濁液を、１
０μｌのリゾチーム（５ｎ＋ｇ／＋＋ ｌ ）を添加し
てから室温で１０分間インキュベートした。その後、試
験管を沸騰水浴に２分漬け、氷水に移し、ミクロ遠心機
で１５分間遠心分離した。ベレットを滅菌した爪楊枝で
取り除いて廃棄し、１１０μｌのイソプロパツールを添
加混合し、ミクロ遠心機で１５分間遠心分離した。上澄
み液除去後、ベレットを真空乾燥して、５０μｇ／ｍｌ
の処理済みＲＮアーゼ＾含有の滅菌水１００μ！中に再
懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。 １
７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を添加し
、溶液を等量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５： ２４ ： １）で１回抽出した。
１００μＩの５ＴＥＴ［８％ショ糖、５％トリトンＸ−
１００，５０ｍＭ ＥＤＴ＾、５０＋ＩＩＭ Ｔｒｉｓ
（ｐＨ８，０）］中に再懸濁させた。この懸濁液を、１
０μｌのリゾチーム（５ｎ＋ｇ／＋＋ ｌ ）を添加し
てから室温で１０分間インキュベートした。その後、試
験管を沸騰水浴に２分漬け、氷水に移し、ミクロ遠心機
で１５分間遠心分離した。ベレットを滅菌した爪楊枝で
取り除いて廃棄し、１１０μｌのイソプロパツールを添
加混合し、ミクロ遠心機で１５分間遠心分離した。上澄
み液除去後、ベレットを真空乾燥して、５０μｇ／ｍｌ
の処理済みＲＮアーゼ＾含有の滅菌水１００μ！中に再
懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。 １
７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を添加し
、溶液を等量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５： ２４ ： １）で１回抽出した。
２倍量のエタノールを添加混合し、２０分間−２０℃に
保ち、かつ１５分間遠心分離することによってＤＮＡを
沈澱させた。ベレットを１鋼１の７０％エタノールで濯
ぎ、更に３分間遠心分離し、真空乾燥し、２５μＩの滅
菌水中に再懸濁させた。得られた懸濁液の２．５μｍ部
分を制限酵素での消化に用いた。その後、プラスミド微
量調製物をＨｐａ ｆｌ及びＭｓｐ ｌでの消化によっ
て分析した。
保ち、かつ１５分間遠心分離することによってＤＮＡを
沈澱させた。ベレットを１鋼１の７０％エタノールで濯
ぎ、更に３分間遠心分離し、真空乾燥し、２５μＩの滅
菌水中に再懸濁させた。得られた懸濁液の２．５μｍ部
分を制限酵素での消化に用いた。その後、プラスミド微
量調製物をＨｐａ ｆｌ及びＭｓｐ ｌでの消化によっ
て分析した。
スｊ−ムブ’９ ： Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ、
株ＭＱＩメチラーゼ遺伝子クローン 分析した６５のプラスミドＤＮＡ調製物のほぼ半分が、
Ｍｓｐ ■消化に感受性で、かつＨｐａ ｌに対しては
耐性であると判明した（第３図）、メチル感受性（ｍ５
ｃｐＧ）酵素による消化から保護されたクローンを隣接
塩基頻度分析法で分析したところ、ＣｐＧ配列のメチル
化が９５％を上回ることが明らかとなり、一方上記のよ
うに保護されていないクローンは５ｍＣを示さなかった
（第４図）、隣接塩基頻度分析からは、ＣｐＧ配列のみ
がメチル化されることも明らかとなった。
株ＭＱＩメチラーゼ遺伝子クローン 分析した６５のプラスミドＤＮＡ調製物のほぼ半分が、
Ｍｓｐ ■消化に感受性で、かつＨｐａ ｌに対しては
耐性であると判明した（第３図）、メチル感受性（ｍ５
ｃｐＧ）酵素による消化から保護されたクローンを隣接
塩基頻度分析法で分析したところ、ＣｐＧ配列のメチル
化が９５％を上回ることが明らかとなり、一方上記のよ
うに保護されていないクローンは５ｍＣを示さなかった
（第４図）、隣接塩基頻度分析からは、ＣｐＧ配列のみ
がメチル化されることも明らかとなった。
隣接塩基頻度分析（第４図）：
Ｈｐａ Ｕでの切断に耐性であるプラスミドを有するク
ローンの、ＩＰＴＧを用いて一晩培養した培養物からＤ
ＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを
、ＣｓＣｌ／臭化エチジウム等密度遠心法で分離した。
ローンの、ＩＰＴＧを用いて一晩培養した培養物からＤ
ＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを
、ＣｓＣｌ／臭化エチジウム等密度遠心法で分離した。
ＤＮＡ（ｌμｇ）に３７℃で１５分間、ｌｎＨのＤＮ
アーゼ■でランダムにニックを導入し、導入したニック
の位置で該ＤＮ＾を、２００μＣｉの［α−３２Ｐ］標
識デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴＰ、 ｄＡＴ
Ｐ、 ｄＴＴＰまたはｄＣＴＰ）及び４０単位のＥ、
ｃｏｌｉ ＤＮ＾ポリメラーゼＩを用いて１５℃で３０
分間インキュベートすることにより末端標識した。標識
したＤＮＡをセファデックスＧ−５０で精製後、ＤＮＡ
をミクロコツカスヌクレアーゼ及び膵臓ホスホジェステ
ラーゼで消化してモノヌクレオチドとした。得られた３
’ ｄＮＭＰを二次元薄層クロマトグラフィーで分離し
、これにオートラジオグラフィーを行なった。５−メチ
ルｃｌｃＭＰとｄＣＭＰとの相対放射能を、本明細書に
参考として含まれる（：ｒｕｅｎｂａｕｍ、 Ｙ、、
５ｔｅｉｎ、 Ｒ，、Ｃｅｄａｒ、 Ｈ，。
アーゼ■でランダムにニックを導入し、導入したニック
の位置で該ＤＮ＾を、２００μＣｉの［α−３２Ｐ］標
識デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴＰ、 ｄＡＴ
Ｐ、 ｄＴＴＰまたはｄＣＴＰ）及び４０単位のＥ、
ｃｏｌｉ ＤＮ＾ポリメラーゼＩを用いて１５℃で３０
分間インキュベートすることにより末端標識した。標識
したＤＮＡをセファデックスＧ−５０で精製後、ＤＮＡ
をミクロコツカスヌクレアーゼ及び膵臓ホスホジェステ
ラーゼで消化してモノヌクレオチドとした。得られた３
’ ｄＮＭＰを二次元薄層クロマトグラフィーで分離し
、これにオートラジオグラフィーを行なった。５−メチ
ルｃｌｃＭＰとｄＣＭＰとの相対放射能を、本明細書に
参考として含まれる（：ｒｕｅｎｂａｕｍ、 Ｙ、、
５ｔｅｉｎ、 Ｒ，、Ｃｅｄａｒ、 Ｈ，。
ａｎｄ Ｒａｚｉｎ、＾、、 ＦＥＢＳ １ｅｔｔｅｒ
ｓ、 １４２．６７、１９８１に開示されているデンシ
トメーター測定法で測定した。第４図のパネル１〜４に
示したように、放射性標識源としてｄｃＴＰを用いて隣
接塩基頻度分析を行なった場合にのみ、５−メチルシト
シンの存在を示す放射性スポットが検出できた。上記の
場合には更に、シトシンに間するスポットを検出しなが
ったが、このことはグアニンの５′側に隣接するシトシ
ンが総てメチル化されたことを示唆している。
ｓ、 １４２．６７、１９８１に開示されているデンシ
トメーター測定法で測定した。第４図のパネル１〜４に
示したように、放射性標識源としてｄｃＴＰを用いて隣
接塩基頻度分析を行なった場合にのみ、５−メチルシト
シンの存在を示す放射性スポットが検出できた。上記の
場合には更に、シトシンに間するスポットを検出しなが
ったが、このことはグアニンの５′側に隣接するシトシ
ンが総てメチル化されたことを示唆している。
一方、他の３種のヌクレオチドのいずれの５′側にも５
−メチルシトシンは存在しなかった。ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
ＰまたはｄＴＴＰを用いて隣接塩基頻度分析を行なった
場合は放射性シトシンに関するスポットしが検出しなか
った。第４図のパネル５及び６に示したように、グアニ
ンの５′側に隣接する５−メチルシトシンは形質転換し
たＥ、 ｃｏｌｉ細胞から単離した染色体ＤＮＡでのみ
検出し、形質転換しなかった細胞から単離した染色体Ｄ
ＮＡでは検出しなかった。
−メチルシトシンは存在しなかった。ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
ＰまたはｄＴＴＰを用いて隣接塩基頻度分析を行なった
場合は放射性シトシンに関するスポットしが検出しなか
った。第４図のパネル５及び６に示したように、グアニ
ンの５′側に隣接する５−メチルシトシンは形質転換し
たＥ、 ｃｏｌｉ細胞から単離した染色体ＤＮＡでのみ
検出し、形質転換しなかった細胞から単離した染色体Ｄ
ＮＡでは検出しなかった。
Ｌ元、乙埠：メチラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩ遺伝子のサ
ブクローニング Ｈｐａ ｌ［による切断に耐性であるプラスミドを有す
るクローンから得たＤＮＡ断片（ステップ９）をＢｇｌ
ｌｌ及びＰｓｔ Ｉで消化して、ＢａｍＨｌ及びＰｓｔ
Ｉで切断したＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ ＫＳ Ｍｉｎｕ
ｓ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ、。
ブクローニング Ｈｐａ ｌ［による切断に耐性であるプラスミドを有す
るクローンから得たＤＮＡ断片（ステップ９）をＢｇｌ
ｌｌ及びＰｓｔ Ｉで消化して、ＢａｍＨｌ及びＰｓｔ
Ｉで切断したＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ ＫＳ Ｍｉｎｕ
ｓ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ、。
ＬａＪｏｌｌａ、 Ｃａ１ｉｆ、）ベクターに挿入し、
このベクターでＥ、 ｅｏｌｉ ＰＲＩＯＩ／ｐＳＵ７
７を形質転換した。それによって、１５３８ｂｐのＢｇ
ｌＩ［ＤＮＡ断片上にコードされた活性なメチラーゼＭ
、Ｓｓｓ ＭＱＩと、ｔＲＮ＾υＧ＾サプレッサーをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとを含むＥ、
ｃｏｌｉ ＰＲ１０１／ｐＳＵ７７／ｐＮＴ１００ク
ローンを得た。この試料は＾ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｔｌｅｃｔｉｏｎに番号＾ＴＣＣ
＃６８０９５の下に寄託した。
このベクターでＥ、 ｅｏｌｉ ＰＲＩＯＩ／ｐＳＵ７
７を形質転換した。それによって、１５３８ｂｐのＢｇ
ｌＩ［ＤＮＡ断片上にコードされた活性なメチラーゼＭ
、Ｓｓｓ ＭＱＩと、ｔＲＮ＾υＧ＾サプレッサーをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとを含むＥ、
ｃｏｌｉ ＰＲ１０１／ｐＳＵ７７／ｐＮＴ１００ク
ローンを得た。この試料は＾ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｔｌｅｃｔｉｏｎに番号＾ＴＣＣ
＃６８０９５の下に寄託した。
第５図に、１５３８塩基対のＢｇｌＩ［ＤＮＡ断片のＤ
ＮＡ配列を示す。Ｍ、Ｓｓｓ ＭＱＩをコードする遺伝
子は、位置１０３に始まり位置１２６１で終わると考え
られる。コドンυＣ＾が位置２２９．３４９．５９５及
び７０９に対応することも留意されるべきである。
ＮＡ配列を示す。Ｍ、Ｓｓｓ ＭＱＩをコードする遺伝
子は、位置１０３に始まり位置１２６１で終わると考え
られる。コドンυＣ＾が位置２２９．３４９．５９５及
び７０９に対応することも留意されるべきである。
スｊ」仁乙月よ：メチラーゼＭ、Ｓｓｓ ＭＱＩのｉｎ
ｖｉｔｒｏでの基質及び配列特異性 Ｅ、 ｃｏｌｉ ＰＲ１０１／ｐＭＴ１００／ｐＳＵ７
７の粗抽出物を用いて、φＸ１７４ ＤＮＡをｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでメチル化した。２μｇのφＸ１７４ ＲＦ
ＤＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
と、１０醜Ｍ ＥＤＴ＾と、５−Ｍジチオトレイトール
と、１論Ｈ８−アデノシルメチオニンと、上記粗抽出物
とを含む混合物５０μｌ中で、２８℃で１８時間インキ
ュベートした。ＤＮＡをクロロホルム／フェノール抽出
した。得られたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＨｐ
ａ ｌ［による切断に対する耐性に間して分析しく第６
図のレーン１〜４）、また隣接塩基頻度分析法でも分析
した（第６図の“対照”パネル及び“メチル化”パネル
）、メチラーゼ調製物と共にインキュベートしたφＸ１
７４ ＲＦ ＤＮＡはＨｐａ ｌｉによる切断に耐性で
あった（レーン２）が、メチラーゼ調製物と共にインキ
ュベートしなかったＤＮＡはＨｐａ ＩＩによって切断
された（レーン３）、レーン１は未消化の対照であり、
またレーン４はＨｉｎｄｌｌＩで消化したλＤＮ＾の分
子量マーカーである。［α−３２Ｐ］で標識したｄＧＴ
Ｐを用いた隣接塩基頻度分析の結果は、ＣｐＧ配列での
完全なメチル化を示した。
ｖｉｔｒｏでの基質及び配列特異性 Ｅ、 ｃｏｌｉ ＰＲ１０１／ｐＭＴ１００／ｐＳＵ７
７の粗抽出物を用いて、φＸ１７４ ＤＮＡをｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでメチル化した。２μｇのφＸ１７４ ＲＦ
ＤＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
と、１０醜Ｍ ＥＤＴ＾と、５−Ｍジチオトレイトール
と、１論Ｈ８−アデノシルメチオニンと、上記粗抽出物
とを含む混合物５０μｌ中で、２８℃で１８時間インキ
ュベートした。ＤＮＡをクロロホルム／フェノール抽出
した。得られたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＨｐ
ａ ｌ［による切断に対する耐性に間して分析しく第６
図のレーン１〜４）、また隣接塩基頻度分析法でも分析
した（第６図の“対照”パネル及び“メチル化”パネル
）、メチラーゼ調製物と共にインキュベートしたφＸ１
７４ ＲＦ ＤＮＡはＨｐａ ｌｉによる切断に耐性で
あった（レーン２）が、メチラーゼ調製物と共にインキ
ュベートしなかったＤＮＡはＨｐａ ＩＩによって切断
された（レーン３）、レーン１は未消化の対照であり、
またレーン４はＨｉｎｄｌｌＩで消化したλＤＮ＾の分
子量マーカーである。［α−３２Ｐ］で標識したｄＧＴ
Ｐを用いた隣接塩基頻度分析の結果は、ＣｐＧ配列での
完全なメチル化を示した。
んたムＡ１：メチラーゼの調製及び評価Ｅ、 ｃｏｌｉ
ＰＲ１０１／ｐＭＴ１００／ｐｓｔ１７７細胞の培養
物を増殖させて５Ｘ１０”細胞７輪ｌとし、ＩＰＴＧを
添加し、５０μｇ／ａ ｌアンピシリン及び１７μｇ／
ｍｌクロラムフェニコールを含有するし一ブイヨン中で
３７℃で一晩インキユベートした。メチラーゼ調製の以
後の諸ステップは４℃で実施する。培養物を４ｋｒｐ−
で１０分間遠心分離し、細胞ベレットをその湿潤重量の
２倍のアルミナ３０５を用いて粉砕した。ペーストを５
倍量の緩衝液＾［１０％グリセロール（ｖｏｌ、／ｖｏ
１．）、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ ＥＤＴ＾
、４０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐ）１８．０＞］中に
懸濁させた。均質な懸濁液を１２．０ＯＯｘＨで１０分
間遠心分離した。上澄み液に０．２倍量の２０％（ｕ＋
ｔ、／ｖｏ１．）［酸ストレプトマイシンを、３０分間
にわたって攪拌しつつゆっくり添加した。
ＰＲ１０１／ｐＭＴ１００／ｐｓｔ１７７細胞の培養
物を増殖させて５Ｘ１０”細胞７輪ｌとし、ＩＰＴＧを
添加し、５０μｇ／ａ ｌアンピシリン及び１７μｇ／
ｍｌクロラムフェニコールを含有するし一ブイヨン中で
３７℃で一晩インキユベートした。メチラーゼ調製の以
後の諸ステップは４℃で実施する。培養物を４ｋｒｐ−
で１０分間遠心分離し、細胞ベレットをその湿潤重量の
２倍のアルミナ３０５を用いて粉砕した。ペーストを５
倍量の緩衝液＾［１０％グリセロール（ｖｏｌ、／ｖｏ
１．）、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ ＥＤＴ＾
、４０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐ）１８．０＞］中に
懸濁させた。均質な懸濁液を１２．０ＯＯｘＨで１０分
間遠心分離した。上澄み液に０．２倍量の２０％（ｕ＋
ｔ、／ｖｏ１．）［酸ストレプトマイシンを、３０分間
にわたって攪拌しつつゆっくり添加した。
１２、ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離後の上澄み液を集
め、３０分間にわたって攪拌しつつ固体硫酸アンモニウ
ムを７０％飽和に達するまで添加した。１２．ＯＯＯｘ
ｇで１０分間遠心分離後に得られたペレットを緩衝液＾
に溶解させ、緩衝液へで平衡させたセファデックスＧ−
５０カラムにおいて脱塩した。 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣＩ（ｐＨ８，０）と、 １０ｍＭ ＥＤＴ＾と、５
−一ジチオトレイトールと、１ｍＭ Ｓ−アデノシルメ
チオニン［１３メチル］と、１〜６μｇのＤＮＡと、上
述のメチラーゼ調製物（６０μｇのタンパク質）とを含
む反応混合物（５０μｌ）においてメチラーゼ活性を評
価した０反応混合物を３０℃で２０分間インキュベート
した。０．２ｍｌのｌＮＮａＯＨ１１％ＳＤＳを添加し
、６０℃で２時間インキュベートすることによって反応
を終結させた０等量のクロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２４： １）でＤＮＡを抽出した。水性相のアリ
コートに５０μｇの仔ウシ胸腺ＤＮ＾を添加し、低温の
１０％ＴＣ＾で沈澱させたＤＮＡを集めて、にＦ／Ｃフ
ィルター上で５％ＴＣ＾で洗浄した。乾燥したフィルタ
ーに対して液体シンチレーションカウンター測定を実施
した。
め、３０分間にわたって攪拌しつつ固体硫酸アンモニウ
ムを７０％飽和に達するまで添加した。１２．ＯＯＯｘ
ｇで１０分間遠心分離後に得られたペレットを緩衝液＾
に溶解させ、緩衝液へで平衡させたセファデックスＧ−
５０カラムにおいて脱塩した。 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣＩ（ｐＨ８，０）と、 １０ｍＭ ＥＤＴ＾と、５
−一ジチオトレイトールと、１ｍＭ Ｓ−アデノシルメ
チオニン［１３メチル］と、１〜６μｇのＤＮＡと、上
述のメチラーゼ調製物（６０μｇのタンパク質）とを含
む反応混合物（５０μｌ）においてメチラーゼ活性を評
価した０反応混合物を３０℃で２０分間インキュベート
した。０．２ｍｌのｌＮＮａＯＨ１１％ＳＤＳを添加し
、６０℃で２時間インキュベートすることによって反応
を終結させた０等量のクロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２４： １）でＤＮＡを抽出した。水性相のアリ
コートに５０μｇの仔ウシ胸腺ＤＮ＾を添加し、低温の
１０％ＴＣ＾で沈澱させたＤＮＡを集めて、にＦ／Ｃフ
ィルター上で５％ＴＣ＾で洗浄した。乾燥したフィルタ
ーに対して液体シンチレーションカウンター測定を実施
した。
第１図はＳｐｉｒｏｐｌａｓｗ＋ａ ｓｐ、株ＭＱＩ
ＤＮＡメチラーゼ遺伝子のクローニングのフローチャー
ト、第２図は適合ベクターｐＡＬ２４９に組み込まれた
１ａｃＵＶ５プロモーターを含むオパールサプレッサー
ｔｒｐ Ｔ１４６を保有するプラスミドｐＳＵ７フの構
成の説明図、第３図は陽性のクローンを得るべく行なっ
たスクリーニングの結果を、Ｈｐａ ＩＩ及びＮｓｐ
ｌ消化を用いる制限酵素分析によって示す説明図、第４
図はプラスミドＤＮＡ及び染色体ＤＮＡのＣｐＣ配列で
のメチル化の様子を隣接塩基頻度分析によって示し、か
つプラスミドＤＮＡのメチル化に関してｉｎ ｖｉｖｏ
での酵素の配列特異性も示す説明図、第５図は適当な宿
主にＤＮＡメチラーゼ活性を付与する５ｐｉｒｏｐｌａ
ｓ＋＋＋ａ ＤＮＡの最短断片（１，５ｋｂ）のＤＮＡ
配列図、第６図はセルフリー抽出物中のメチラーゼクロ
ーンの活性及び基質特異性を示す説明図である。 キー− １
ＤＮＡメチラーゼ遺伝子のクローニングのフローチャー
ト、第２図は適合ベクターｐＡＬ２４９に組み込まれた
１ａｃＵＶ５プロモーターを含むオパールサプレッサー
ｔｒｐ Ｔ１４６を保有するプラスミドｐＳＵ７フの構
成の説明図、第３図は陽性のクローンを得るべく行なっ
たスクリーニングの結果を、Ｈｐａ ＩＩ及びＮｓｐ
ｌ消化を用いる制限酵素分析によって示す説明図、第４
図はプラスミドＤＮＡ及び染色体ＤＮＡのＣｐＣ配列で
のメチル化の様子を隣接塩基頻度分析によって示し、か
つプラスミドＤＮＡのメチル化に関してｉｎ ｖｉｖｏ
での酵素の配列特異性も示す説明図、第５図は適当な宿
主にＤＮＡメチラーゼ活性を付与する５ｐｉｒｏｐｌａ
ｓ＋＋＋ａ ＤＮＡの最短断片（１，５ｋｂ）のＤＮＡ
配列図、第６図はセルフリー抽出物中のメチラーゼクロ
ーンの活性及び基質特異性を示す説明図である。 キー− １
Claims (16)
- （１）グアニンの５′側に隣接するシトシン残基をメチ
ル化するメチラーゼまたは該メチラーゼの一部をコード
する、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａから取得可能なＤＮＡ配
列。 - （２）メチラーゼがＭ．ＳｓｓＭＱ１から成ることを特
徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列。 - （３）メチラーゼＭ．ＳｓｓＭＱ１をコードする、第５
図に示したＤＮＡ配列またはその誘導体。 - （４）請求項１、２もしくは３に記載のＤＮＡ配列また
はその誘導体を含むベクター。 - （５）オパールサプレッサーｔｒｐＴ１４６をも含むこ
とを特徴とする請求項４に記載のベクター。 - （６）メチラーゼＭ．ＳｓｓＭＱ１をコードするＤＮＡ
配列を含む、請求項４に記載のベクターで形質転換した
微生物宿主。 - （７）Ｇ残基の５′側に隣接するシトシン残基をメチル
化する、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａから取得可能な組み換
え体メチラーゼ。 - （８）メチラーゼが実質的に純粋であることを特徴とす
る請求項７に記載の組み換え体メチラーゼ。 - （９）（ａ）Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｐ．ＭＱ１株由
来のＤＮＡからライブラリーを作製すること、及び （ｂ）ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａＤＮＡメチラーゼ遺伝子
を持つクローンを単離すること を含むＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｐ．ＭＱ１株ＤＮＡメ
チラーゼ遺伝子のクローニング方法。 - （１０）ライブラリーの作製を、 （ａ）Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｐ．ＭＱ１株からＤＮ
Ａを精製し、 （ｂ）精製ＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成し、 （ｃ）ＤＮＡ断片をクローニングベクターに連結させ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
胞を形質転換して細胞ライブラリーを作製し、 （ｅ）細胞ライブラリーから組み換え体ベクターを精製
してプラスミドライブラリーを作製するという手順で実
施することを特徴とする請求項９に記載の方法。 - （１１）クローニングベクターが発現ベクターｐＵＣ１
８であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 - （１２）宿主細胞がオパールサプレッサーを含むＥ．ｃ
ｏｌｉ株ｍｃｒＡ＾−、ｍｃｒＢ＾−、ｌａｃＩ＾ａ、
ｒｅｃＡ＾−であることを特徴とする請求項１０に記載
の方法。 - （１３）ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａＤＮＡメチラーゼ遺伝
子を持つクローンの単離を、宿主において作製したプラ
スミドライブラリーをエンドヌクレアーゼＨｈａＩで消
化して消化プールを形成し、この消化プールで宿主細胞
を形質転換し、メチラーゼ遺伝子を持つクローンを選択
することによって実施することを特徴とする請求項１０
に記載の方法。 - （１４）宿主細胞がプラスミドｐＳＵ７７またはその誘
導体を有するＥ．ｃｏｌｉＰＲ１０１を含むことを特徴
とする請求項１０に記載の方法。 - （１５）グアニンの５′側に隣接するシトシン残基をメ
チル化する組み換え体メチラーゼを生産する方法であっ
て、 （ａ）Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｐ．からＤＮＡを精製
し、 （ｂ）精製ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで消
化してＤＮＡ断片を形成し、 （ｃ）ＤＮＡ断片をクローニングベクターに連結させて
ＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
転換してライブラリーを作製し、（ｅ）Ｓｐｉｒｏｐｌ
ａｓｍａｓｐ．メチラーゼ遺伝子を持つクローンを単離
し、 （ｆ）ステップ（ｅ）のクローンを含む宿主細胞を培養
し、 （ｈ）培養物からＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａメチラーゼを
回収する ことを含む組み換え体メチラーゼ生産方法。 - （１６）ステップ（ｆ）の宿主細胞がプラスミドｐＭＴ
１００及びｐＳＵ７７を有するＥ．ｃｏｌｉＰＲ１０１
から成ることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39064989A | 1989-08-07 | 1989-08-07 | |
| US390,649 | 1989-08-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03210176A true JPH03210176A (ja) | 1991-09-13 |
| JP2538806B2 JP2538806B2 (ja) | 1996-10-02 |
Family
ID=23543364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2209055A Expired - Lifetime JP2538806B2 (ja) | 1989-08-07 | 1990-08-07 | Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．ＤＮＡメチラ―ゼ生産方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5296371A (ja) |
| EP (1) | EP0412676B1 (ja) |
| JP (1) | JP2538806B2 (ja) |
| DE (1) | DE69019890T2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991002069A1 (en) * | 1989-08-10 | 1991-02-21 | Plant Genetic Systems N.V. | Plants with modified flowers |
| FR2750704B1 (fr) | 1996-07-04 | 1998-09-25 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production d'adn therapeutique |
| AU2797399A (en) * | 1998-03-02 | 1999-09-20 | Vanderbilt University | Improved eukaryotic expression vector |
| US7700324B1 (en) * | 1998-11-03 | 2010-04-20 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methylated CpG island amplification (MCA) |
| US20020197639A1 (en) * | 2001-06-08 | 2002-12-26 | Shia Michael A. | Methods and products for analyzing nucleic acids based on methylation status |
| EP2568040A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-13 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identyfing new endonucleases with the same or varied specificity |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8600245D0 (en) * | 1986-01-07 | 1986-02-12 | Shell Int Research | Preparation of 2-arylpropionic acids |
| JPH022365A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
| US4999293A (en) * | 1987-12-17 | 1991-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the HhaI restriction endonuclease and methylase |
-
1990
- 1990-07-24 EP EP90308101A patent/EP0412676B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-24 DE DE69019890T patent/DE69019890T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-07 JP JP2209055A patent/JP2538806B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-10-04 US US07/771,525 patent/US5296371A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BACTERIOL.=1985 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0412676A1 (en) | 1991-02-13 |
| DE69019890T2 (de) | 1996-02-08 |
| DE69019890D1 (de) | 1995-07-13 |
| EP0412676B1 (en) | 1995-06-07 |
| US5296371A (en) | 1994-03-22 |
| JP2538806B2 (ja) | 1996-10-02 |
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