JPH03210177A - 突然変異プロテアーゼの効率的生産 - Google Patents
突然変異プロテアーゼの効率的生産Info
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- JPH03210177A JPH03210177A JP2213562A JP21356290A JPH03210177A JP H03210177 A JPH03210177 A JP H03210177A JP 2213562 A JP2213562 A JP 2213562A JP 21356290 A JP21356290 A JP 21356290A JP H03210177 A JPH03210177 A JP H03210177A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換えＤＮＡ技術を用いる変異タンパク質の生
産方法に関する。さらに具体的には、本発明は対応する
非修飾プロテアーゼを生産する能力が除去された相同バ
チルス属宿主菌株を用いるタンパク工学的手法によるバ
チルスプロテアーゼの効率的生産に関する。
産方法に関する。さらに具体的には、本発明は対応する
非修飾プロテアーゼを生産する能力が除去された相同バ
チルス属宿主菌株を用いるタンパク工学的手法によるバ
チルスプロテアーゼの効率的生産に関する。
バチルス属細菌はα−アミラーゼ、中性プロテアーゼ及
びアルカリ （またはセリン）プロテアーゼ等の工業上
重要な酵素の生産に広く用いられている〔例えばＴｈｅ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ（バチルス属細菌の分子生物学）、アカデミツ
クプレス、ニューヨーク、１９８２中の口ｅｂａｂｏｖ
：Ｔｈｅ １ｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｕｓｅ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｉ （バチルス属細菌の工業的用途）
参照〕。
びアルカリ （またはセリン）プロテアーゼ等の工業上
重要な酵素の生産に広く用いられている〔例えばＴｈｅ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ（バチルス属細菌の分子生物学）、アカデミツ
クプレス、ニューヨーク、１９８２中の口ｅｂａｂｏｖ
：Ｔｈｅ １ｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｕｓｅ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｉ （バチルス属細菌の工業的用途）
参照〕。
バチルス属細菌使用の主たる利点は大量の分泌タンパク
質、危険な物質の生産の欠如、及び安全な工業的使用の
長い歴史である。従ってバチルス属細菌のいくつかの種
は食品への適用が予定されたタンパク質の生産に用いる
ことが認可されている。
質、危険な物質の生産の欠如、及び安全な工業的使用の
長い歴史である。従ってバチルス属細菌のいくつかの種
は食品への適用が予定されたタンパク質の生産に用いる
ことが認可されている。
Ｐａ１ｖａ らはＧｅｎｅｌ ９ （１９８２）
８１−８７でバチルス・アミロリクエファシェンス（
Ｂａｃ ｉ ｔ １７ｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ）からのα−アミラーゼ遺伝子をバチルス・
ズブチリス中で発現させることにより異種タンパク質の
発現宿主としてＢ、ズブチリスを用いることができるこ
とを実証した。Ｂ。
８１−８７でバチルス・アミロリクエファシェンス（
Ｂａｃ ｉ ｔ １７ｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ）からのα−アミラーゼ遺伝子をバチルス・
ズブチリス中で発現させることにより異種タンパク質の
発現宿主としてＢ、ズブチリスを用いることができるこ
とを実証した。Ｂ。
ズブチリス中での異種遺伝子の発現を記述した他の文献
として例えば、スタフィロコッカス・アウレウスのプロ
ティンＡ遺伝子の発現を示したＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ及
びＦｉｓｈｅｒ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １
６５（１９８６）７９６−８０４ ；ヒトインターフェ
ロン−α２の発現を開示した５ｃｈｅｉｎら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ４ （１９８６） ７１９−７２
５ ；ヒト心房性ナトリウム利尿α−因子の発現及び分
泌を示したＨａｎｇら、Ｇｅｎｅ６９ （１９８８）
３９−４７等がある。これらの異種タンパク質の適
当な分泌を確保するため前二者の文献はα−アミラーゼ
シグナル配列を用い、最後の文献は発現すべき遺伝子に
融合させたＢ、ズブチリスズブチリシン遺伝子（ａｐｒ
Ｅ）のシグナル配列を用いた。
として例えば、スタフィロコッカス・アウレウスのプロ
ティンＡ遺伝子の発現を示したＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ及
びＦｉｓｈｅｒ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １
６５（１９８６）７９６−８０４ ；ヒトインターフェ
ロン−α２の発現を開示した５ｃｈｅｉｎら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ４ （１９８６） ７１９−７２
５ ；ヒト心房性ナトリウム利尿α−因子の発現及び分
泌を示したＨａｎｇら、Ｇｅｎｅ６９ （１９８８）
３９−４７等がある。これらの異種タンパク質の適
当な分泌を確保するため前二者の文献はα−アミラーゼ
シグナル配列を用い、最後の文献は発現すべき遺伝子に
融合させたＢ、ズブチリスズブチリシン遺伝子（ａｐｒ
Ｅ）のシグナル配列を用いた。
組換えタンパク質のための生産宿主としてのバチルス属
菌株の主たる問題点はそれらが生産された異種タンパク
質を分解する傾向がある種々のプロテアーゼを生産し、
分泌することである〔例えばＯｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓ
ｅ、 ”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ＧｅｎｅＭａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ （遺伝子操作の原理）、第３
版（１９８５）２８９、旧ａｃｋｗｅｌｌ−、オックス
フォード参照）。
菌株の主たる問題点はそれらが生産された異種タンパク
質を分解する傾向がある種々のプロテアーゼを生産し、
分泌することである〔例えばＯｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓ
ｅ、 ”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ＧｅｎｅＭａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ （遺伝子操作の原理）、第３
版（１９８５）２８９、旧ａｃｋｗｅｌｌ−、オックス
フォード参照）。
国際特許出願（ＰＣＴ） ＷＯ８９１０４８６６におい
て菌体外プロテアーゼの重要性が指摘されており、それ
によるとタンパク質加水分解活性の約９０％が中性金属
プロテアーゼ（ｎｐｒ）及びセリンプロテアーゼ（アル
カリプロテアーゼ＝ ａｐｒ）に帰せられる。
て菌体外プロテアーゼの重要性が指摘されており、それ
によるとタンパク質加水分解活性の約９０％が中性金属
プロテアーゼ（ｎｐｒ）及びセリンプロテアーゼ（アル
カリプロテアーゼ＝ ａｐｒ）に帰せられる。
種々の解決策がこの分解の問題を克服すべく提案された
。
。
Ｋａｗａｍｕｒａ及びＤｏｔ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 １６０ （１９８４）４４２−４４４は菌体外
中性及びアルカリプロテアーゼの両方に欠陥のあるＢ、
ズブチリス宿主菌株を開示している。すなわち、まずＢ
、ズブチリスＮＴ１８からのｎｐｒＲ２及びｎｐｒＥ１
８を移すことによってＢ、ズブチリスＤＢ１００を中性
プロテアーゼ陰性（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｎｅｇａｔｉｖｅ）にした。ついで遺伝子変換（ｇｅ
ｎｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ）によってａｐｒ遺伝子
の一部を含む１７８ｂｐ断片を欠失させた。
ｏｌ、 １６０ （１９８４）４４２−４４４は菌体外
中性及びアルカリプロテアーゼの両方に欠陥のあるＢ、
ズブチリス宿主菌株を開示している。すなわち、まずＢ
、ズブチリスＮＴ１８からのｎｐｒＲ２及びｎｐｒＥ１
８を移すことによってＢ、ズブチリスＤＢ１００を中性
プロテアーゼ陰性（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｎｅｇａｔｉｖｅ）にした。ついで遺伝子変換（ｇｅ
ｎｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ）によってａｐｒ遺伝子
の一部を含む１７８ｂｐ断片を欠失させた。
Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ及びＦｉｓｈｅｒ、＾ｐｐｒ、
εｎｖｉｒｏｎ１Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、 ５３
（１９８７）３７９−３８４はｎｐｒ 陰性株から出
発するａｐｒ陰性Ｂ、ズブチリス株の構築を記述してい
る。彼らはａｐｒ遺伝子を含有するプラスミドベクター
を用い、不活性化剤及び選択マーカーとして働（ｃａｔ
遺伝子（クロラムフェニコール抵抗性を付与する）を導
入した。この構築によって染色体ａｐｒ遺伝子を置き代
えた。
εｎｖｉｒｏｎ１Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、 ５３
（１９８７）３７９−３８４はｎｐｒ 陰性株から出
発するａｐｒ陰性Ｂ、ズブチリス株の構築を記述してい
る。彼らはａｐｒ遺伝子を含有するプラスミドベクター
を用い、不活性化剤及び選択マーカーとして働（ｃａｔ
遺伝子（クロラムフェニコール抵抗性を付与する）を導
入した。この構築によって染色体ａｐｒ遺伝子を置き代
えた。
５１ｏｍａ ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７０
（１９８８）５５５７−５５６３はＢ、ズブチリスか
ら３番目の菌体外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ）を検出
し配列決定した。この遺伝子の部分欠失によりこの遺伝
子が菌体外プロテアーゼ活性に大して貢献していないこ
とが判明した。
（１９８８）５５５７−５５６３はＢ、ズブチリスか
ら３番目の菌体外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ）を検出
し配列決定した。この遺伝子の部分欠失によりこの遺伝
子が菌体外プロテアーゼ活性に大して貢献していないこ
とが判明した。
生産された菌株のより詳しい検討によると、以上参照さ
れたＢ、ズブチリス菌株のいずれも菌体外タンパク質加
水分解活性を完全に欠くものではなかった。従って、異
種タンパク質の生産に用い得る改良されたプロテアーゼ
欠失バチルス属菌株に対する要望が依然として存在する
。この要望は突然変異したプロテアーゼの発現が目的で
ある場合に一層強いものとなる。
れたＢ、ズブチリス菌株のいずれも菌体外タンパク質加
水分解活性を完全に欠くものではなかった。従って、異
種タンパク質の生産に用い得る改良されたプロテアーゼ
欠失バチルス属菌株に対する要望が依然として存在する
。この要望は突然変異したプロテアーゼの発現が目的で
ある場合に一層強いものとなる。
いくつかの刊行物において野生型プロテアーゼ遺伝子を
発現できないバチルス・ズブチリス宿主菌株を用い、従
って変異体と野生型プロテアーゼの混合物をさける突然
変異プロテアーゼの生産が記述されている。
発現できないバチルス・ズブチリス宿主菌株を用い、従
って変異体と野生型プロテアーゼの混合物をさける突然
変異プロテアーゼの生産が記述されている。
ヨーロッパ特許公開ＥＰ−Ａ−０２４６６７８（この出
願の内容はＥＰ−Ａ−０１３０７５６に対応する）に酵
素的に活性なズブチリシンまたは中性プロテアーゼを分
泌することはできないが、Ｂ、アミロリクエファシェン
スから単離、誘導された異種プロテアーゼ遺伝子を発現
するＢ、ズブチリス菌株が開示されている。部位特異的
飽和突然変異誘導（５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ５ａ
ｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）をＢ、ア
ミロリクエファシェンス遺伝子に対して行い、変異体を
発現した。Ｂ、ズブチリス宿主菌株の陰性背景（ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ）は原プロテアー
ゼ遺伝子のいずれかもしくは両方の部分的欠失によって
、またはＮ−メチル＝Ｎ′−二トロＮ−ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）変異誘導によって得た。記述されたＢ、
ズブチリス宿主が通常胞子形成性であり、胞子非形成性
（アスポロジーナス、ａｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ ）の
変異体は（組換え）タンパク質の生産に不適であること
がさらに記載されている。
願の内容はＥＰ−Ａ−０１３０７５６に対応する）に酵
素的に活性なズブチリシンまたは中性プロテアーゼを分
泌することはできないが、Ｂ、アミロリクエファシェン
スから単離、誘導された異種プロテアーゼ遺伝子を発現
するＢ、ズブチリス菌株が開示されている。部位特異的
飽和突然変異誘導（５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ５ａ
ｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）をＢ、ア
ミロリクエファシェンス遺伝子に対して行い、変異体を
発現した。Ｂ、ズブチリス宿主菌株の陰性背景（ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ）は原プロテアー
ゼ遺伝子のいずれかもしくは両方の部分的欠失によって
、またはＮ−メチル＝Ｎ′−二トロＮ−ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）変異誘導によって得た。記述されたＢ、
ズブチリス宿主が通常胞子形成性であり、胞子非形成性
（アスポロジーナス、ａｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ ）の
変異体は（組換え）タンパク質の生産に不適であること
がさらに記載されている。
ＷＯ３６１０１８２５（上に引用したＦａｈｎｅｓ ｔ
ｏｃｋ及びＦｉｓｈｅｒ参照）に減じられた菌体外とプ
ロテアーゼレベルを有するバチルス属菌株、特にＢ、ズ
ブチリスが記載されている。該微生物に表現型形質を与
えるタンパク質をコード化する遺伝子を生体外挿入する
ことによってアルカリプロテアーゼ遺伝子を不活性化す
る。挿入によって不活性化したプロテアーゼ遺伝子を含
有するプラスミドベクターをＢ、ズブチリスに移し、相
同組換えによって不活性化遺伝子を生来の染色体遺伝子
と置き代える。
ｏｃｋ及びＦｉｓｈｅｒ参照）に減じられた菌体外とプ
ロテアーゼレベルを有するバチルス属菌株、特にＢ、ズ
ブチリスが記載されている。該微生物に表現型形質を与
えるタンパク質をコード化する遺伝子を生体外挿入する
ことによってアルカリプロテアーゼ遺伝子を不活性化す
る。挿入によって不活性化したプロテアーゼ遺伝子を含
有するプラスミドベクターをＢ、ズブチリスに移し、相
同組換えによって不活性化遺伝子を生来の染色体遺伝子
と置き代える。
ＷＯ３８１０８０３３はズブチリシンカールスベルグ（
５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ） 、ズブ
チリシンＤＹ、ズブチリシンＢＰＮ’、Ｂ、ズブチリス
からのａｐｒズブチリシン及びＢ、メセンテリカス（Ｂ
、 ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）からのズブチリシンか
らなるズブチリシン類縁体を開示している。これらの変
異体はカルシウム結合部位中もしくは付近の１以上のア
ミノ酸を負に荷電したアミノ酸（例えばＡｓｐもしくは
Ｇ ｌｕ）に置き代えることにより得られる。変異体は
Ｂ、ズブチリス中で発現される。
５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ） 、ズブ
チリシンＤＹ、ズブチリシンＢＰＮ’、Ｂ、ズブチリス
からのａｐｒズブチリシン及びＢ、メセンテリカス（Ｂ
、 ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）からのズブチリシンか
らなるズブチリシン類縁体を開示している。これらの変
異体はカルシウム結合部位中もしくは付近の１以上のア
ミノ酸を負に荷電したアミノ酸（例えばＡｓｐもしくは
Ｇ ｌｕ）に置き代えることにより得られる。変異体は
Ｂ、ズブチリス中で発現される。
ＷＯ３９１０４８６６はａｐｒ ｎｐｒ Ｚ重度異体に
５ｐｏＯＨ変異を導入し、それによって菌株をアスボロ
ジーナスにすることによって製造された、低いプロテア
ーゼ分泌活性を有するＢ、ズブチリス菌株を開示してい
る。得られた三重変異体ａｐｒｎｐｒ−Ｓ ｐｏｏ Ｈ
−は非常に低いプロテアーゼ分泌活性を示した。
５ｐｏＯＨ変異を導入し、それによって菌株をアスボロ
ジーナスにすることによって製造された、低いプロテア
ーゼ分泌活性を有するＢ、ズブチリス菌株を開示してい
る。得られた三重変異体ａｐｒｎｐｒ−Ｓ ｐｏｏ Ｈ
−は非常に低いプロテアーゼ分泌活性を示した。
上に論じた文献はＢ、ズブチリスにおける相同の及び異
種の遺伝子の発現及びプロテアーゼ陰性Ｂ、ズブチリス
菌株の構築を記述している。プロテアーゼ遺伝子の部分
的欠失によってまたはプロテアーゼ遺伝子中への別の遺
伝子の挿入によって製造されたプロテアーゼ陰性菌株は
以下の如きいくつかの欠点を有していると考えられる：
原遺転子は不活性化されてもプロモーター領域が活性で
ある場合には部分発現産物が生成するかも知れない 挿入された遺伝子に基づく望ましくない表現型形質、例
えば抗生物質耐性の導入 ゲノム配列とプラスミドの一部の間の相同によるプラス
ミドの不安定性。
種の遺伝子の発現及びプロテアーゼ陰性Ｂ、ズブチリス
菌株の構築を記述している。プロテアーゼ遺伝子の部分
的欠失によってまたはプロテアーゼ遺伝子中への別の遺
伝子の挿入によって製造されたプロテアーゼ陰性菌株は
以下の如きいくつかの欠点を有していると考えられる：
原遺転子は不活性化されてもプロモーター領域が活性で
ある場合には部分発現産物が生成するかも知れない 挿入された遺伝子に基づく望ましくない表現型形質、例
えば抗生物質耐性の導入 ゲノム配列とプラスミドの一部の間の相同によるプラス
ミドの不安定性。
従って、染色体とプラスミドの間の可能なすべての相同
配列を欠失させることが望ましい。
配列を欠失させることが望ましい。
Ｂ、ズブチリスでのアルカリプロテアーゼまたは他の酵
素の生産にはまた他の欠点がある。−ｅｌｌｓら、Ｎｕ
ｃ ｌ 、＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １１、（１９８３）
７９１１−７９２５はＢ、ズブチリス中でのＢ、アミロ
リクエファシェンスズブチリシンＢＰＮ’の発現がそれ
自身の転写シグナルを用いて可能であることを示してい
るが、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、土３ （１９
８５）８９１３−８９２６はかかる方法が一般的に適用
できないことを示している。Ｂ、リケニフォルミスから
誘導されたズブチリシンカールスベルグ遺伝子の５′領
域はＢ、ズブチリスでは転写のためのシグナル機能を含
有していなかった。かなりの量の生産を達成するには問
題の遺伝子の前にＢ。
素の生産にはまた他の欠点がある。−ｅｌｌｓら、Ｎｕ
ｃ ｌ 、＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １１、（１９８３）
７９１１−７９２５はＢ、ズブチリス中でのＢ、アミロ
リクエファシェンスズブチリシンＢＰＮ’の発現がそれ
自身の転写シグナルを用いて可能であることを示してい
るが、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、土３ （１９
８５）８９１３−８９２６はかかる方法が一般的に適用
できないことを示している。Ｂ、リケニフォルミスから
誘導されたズブチリシンカールスベルグ遺伝子の５′領
域はＢ、ズブチリスでは転写のためのシグナル機能を含
有していなかった。かなりの量の生産を達成するには問
題の遺伝子の前にＢ。
ズブチリスプロモーターを挿入することが必要であった
。転写のみならず翻訳に関する分泌または成熟プロセス
が、完全でないシャイン・ダルガーノ配列によってまた
は異種宿主での遺伝子生産物の不適合性によっても、異
種宿主ではより小さい効率で起こるかもしれない。
。転写のみならず翻訳に関する分泌または成熟プロセス
が、完全でないシャイン・ダルガーノ配列によってまた
は異種宿主での遺伝子生産物の不適合性によっても、異
種宿主ではより小さい効率で起こるかもしれない。
上述の発現の問題は生産物が、高い生産能力が証明され
ている、相同バチルス属菌株において、高い生産レベル
に帰結する高い効率で、合成される場合にはさけること
ができる。
ている、相同バチルス属菌株において、高い生産レベル
に帰結する高い効率で、合成される場合にはさけること
ができる。
本発明は野生型プロテアーゼと少なくとも１つのアミノ
酸が異なるプロテアーゼを生産する方法であって、発現
宿主として野生型プロテアーゼを生産することができな
い相同性好アルカリバチルス属菌株を使用することを特
徴とする方法を提供する。
酸が異なるプロテアーゼを生産する方法であって、発現
宿主として野生型プロテアーゼを生産することができな
い相同性好アルカリバチルス属菌株を使用することを特
徴とする方法を提供する。
本発明の１つの面において、高アルカリプロテアーゼ遺
伝子が染色体から欠失しており、得られたプロテアーゼ
陰性菌株は相同のもしくは異種のプロテアーゼ発現のた
めの宿主として用いることができる。
伝子が染色体から欠失しており、得られたプロテアーゼ
陰性菌株は相同のもしくは異種のプロテアーゼ発現のた
めの宿主として用いることができる。
本発明の別の面においては染色体の高アルカリプロテア
ーゼ遺伝子はこの遺伝子の突然変異コピーによって置き
代えられる。
ーゼ遺伝子はこの遺伝子の突然変異コピーによって置き
代えられる。
新規形質転換菌株を構築する方法、そのために用いられ
るベクター、及び突然変異プロテアーゼを生産する方法
も提供される。
るベクター、及び突然変異プロテアーゼを生産する方法
も提供される。
好ましい態様においては対応する菌株によって最初に生
産されていたプロテアーゼと密接な相同性を示す変異プ
ロテアーゼが生産される。
産されていたプロテアーゼと密接な相同性を示す変異プ
ロテアーゼが生産される。
好ましい菌株は変異プロテアーゼコード化遺伝子によっ
て形質転換された、バチルス・ノボ・スピーシーズ（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｎｏｖｏ ５ｐｅｃｉｅｓ ） Ｐ
Ｂ ９２及びその誘導体及び密接に関連した菌株であ
る。
て形質転換された、バチルス・ノボ・スピーシーズ（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｎｏｖｏ ５ｐｅｃｉｅｓ ） Ｐ
Ｂ ９２及びその誘導体及び密接に関連した菌株であ
る。
該遺伝子はセリンプロテアーゼをコード化するバチルス
ＰＢ９２の野生型遺伝子と少なくとも３０％、好ましく
は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％
の相同性を示す、この遺伝子は好ましくは好アルカリバ
チルス属菌株の野生型から誘導される。特に好ましい菌
株はアスボロジーナスな好アルカリバチルス属菌株であ
る。
ＰＢ９２の野生型遺伝子と少なくとも３０％、好ましく
は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％
の相同性を示す、この遺伝子は好ましくは好アルカリバ
チルス属菌株の野生型から誘導される。特に好ましい菌
株はアスボロジーナスな好アルカリバチルス属菌株であ
る。
バチルス属に属する菌株によって生産されるセリンプロ
テアーゼは通常アルカリプロテアーゼと呼ばれる０本発
明で用いられるプロテアーゼは好アルカリバチルス属細
菌から導かれ、従って高アルカリプロテアーゼと呼ばれ
る。
テアーゼは通常アルカリプロテアーゼと呼ばれる０本発
明で用いられるプロテアーゼは好アルカリバチルス属細
菌から導かれ、従って高アルカリプロテアーゼと呼ばれ
る。
高アルカリプロテアーゼの生産のための宿主菌体として
は好アルカリバチルス属菌株を用いるのが好ましい、大
規模生産には工業的菌株が必要とされる。それらは土壌
から単離されるか寄託機関もしくは他のソース（５ｏｕ
ｒｃｅｓ ）から入手し得る生物に由来し、これらのバ
チルス属菌株の遺伝子修飾によって得られる。それらは
遺伝子交換（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ）、
例えばファージ感染もしくは形質転換に抵抗性を有する
ことによって特徴づけられる。これらの菌株は安定で胞
子形成能を有するかもしくは有さない。それらは通常原
栄養性で、高収率で内因性タンパク質生産物、例えば酵
素α−アミラーゼ及び種々のプロテアーゼ等を与えるよ
う修飾されている。工業的生産プロセスで得られる内因
性タンパク質産物の収量は少なくとも５ｇ／ｌ（０，５
％ｗ ／ ｖ ）に達する。工業的菌株はＤＮａｓｅｓ
も分泌し、これらは培地中のＤＮＡを分解して遺伝子交
換を予防する。
は好アルカリバチルス属菌株を用いるのが好ましい、大
規模生産には工業的菌株が必要とされる。それらは土壌
から単離されるか寄託機関もしくは他のソース（５ｏｕ
ｒｃｅｓ ）から入手し得る生物に由来し、これらのバ
チルス属菌株の遺伝子修飾によって得られる。それらは
遺伝子交換（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ）、
例えばファージ感染もしくは形質転換に抵抗性を有する
ことによって特徴づけられる。これらの菌株は安定で胞
子形成能を有するかもしくは有さない。それらは通常原
栄養性で、高収率で内因性タンパク質生産物、例えば酵
素α−アミラーゼ及び種々のプロテアーゼ等を与えるよ
う修飾されている。工業的生産プロセスで得られる内因
性タンパク質産物の収量は少なくとも５ｇ／ｌ（０，５
％ｗ ／ ｖ ）に達する。工業的菌株はＤＮａｓｅｓ
も分泌し、これらは培地中のＤＮＡを分解して遺伝子交
換を予防する。
宿主菌株としてプロテアーゼ遺伝子を最初に単離した菌
株を用いるのが有利である。その理由はその場合のみ発
現に必要なすべてのシグナルが機能することを確保でき
るからである。
株を用いるのが有利である。その理由はその場合のみ発
現に必要なすべてのシグナルが機能することを確保でき
るからである。
生産菌株として好アルカリバチルス属細菌を用いる別の
利点は発酵中のアルカリ性ｐＨのために他の微生物によ
る汚染を最少に抑えられることである。
利点は発酵中のアルカリ性ｐＨのために他の微生物によ
る汚染を最少に抑えられることである。
本発明によるとバチルスプロテアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｐｒｏｔｅａｓｅ）コード化遺伝子を、復帰変異が不
可能となるようにして、ゲノムから欠失させる方法が開
示される。かかる欠失は（染色体に残された配列がプラ
スミドにコード化されたプロテアーゼ遺伝子と相同組換
えを行うには短かすぎる限り）部分的欠失であっっても
よいが、より好ましくは遺伝子を完全に欠失させる。こ
の方法によって得られるプロテアーゼ陰性菌株は相同の
変異プロテアーゼをコード化する遺伝子を担持した発現
ベクターの導入後その変異プロテアーゼの生産に用いら
れる。しかしながら、かかるプロテアーゼ陰性菌株は相
同の及び異種の他のタンパク質の発現にも有利に用いる
ことができることが理解されよう。
ｓｐｒｏｔｅａｓｅ）コード化遺伝子を、復帰変異が不
可能となるようにして、ゲノムから欠失させる方法が開
示される。かかる欠失は（染色体に残された配列がプラ
スミドにコード化されたプロテアーゼ遺伝子と相同組換
えを行うには短かすぎる限り）部分的欠失であっっても
よいが、より好ましくは遺伝子を完全に欠失させる。こ
の方法によって得られるプロテアーゼ陰性菌株は相同の
変異プロテアーゼをコード化する遺伝子を担持した発現
ベクターの導入後その変異プロテアーゼの生産に用いら
れる。しかしながら、かかるプロテアーゼ陰性菌株は相
同の及び異種の他のタンパク質の発現にも有利に用いる
ことができることが理解されよう。
この点に関し、宿主菌体として野生型遺伝子が単離され
た菌体を用いる変異プロテアーゼの発現は相同発現であ
るべきであると考えられる。
た菌体を用いる変異プロテアーゼの発現は相同発現であ
るべきであると考えられる。
工業的なプロテアーゼ生産バチルス属菌株をこのプロテ
アーゼの変異体の生産のための宿主として用いることに
よって元のプロテアーゼの生産の高い効率が変異プロテ
アーゼにも移行することが見い出された。これにより実
験室菌株に比べて驚くほど優れた生産効率が達成される
。工業的菌株における突然変異した遺伝子の１つの染色
体コピーは、発現及び分泌に関し、実験室菌株における
該突然変異遺伝子を含有する５０プラスミドコピーより
むしろ高い収率を与える。
アーゼの変異体の生産のための宿主として用いることに
よって元のプロテアーゼの生産の高い効率が変異プロテ
アーゼにも移行することが見い出された。これにより実
験室菌株に比べて驚くほど優れた生産効率が達成される
。工業的菌株における突然変異した遺伝子の１つの染色
体コピーは、発現及び分泌に関し、実験室菌株における
該突然変異遺伝子を含有する５０プラスミドコピーより
むしろ高い収率を与える。
変異プロテアーゼを相同バチルス菌株によって、染色体
遺伝子またはその部分を対応する突然変異遺伝子と交換
する方法によって、効率よく生産できるのが本発明の１
つの面である。この方法では野生型プロテアーゼの生産
能力は除去され、一方間時に変異プロテアーゼの生産能
力が導入される。
遺伝子またはその部分を対応する突然変異遺伝子と交換
する方法によって、効率よく生産できるのが本発明の１
つの面である。この方法では野生型プロテアーゼの生産
能力は除去され、一方間時に変異プロテアーゼの生産能
力が導入される。
修飾された、すなわちいわゆるタンパク質工学的手法に
よるタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄｐｒｏｔｅｉｎｓ ）をコード化する突然変異遺伝子
の発現のための宿主菌体としては該遺伝子が高レベルで
構造的に発現される菌体を用いるのが好ましい。
よるタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄｐｒｏｔｅｉｎｓ ）をコード化する突然変異遺伝子
の発現のための宿主菌体としては該遺伝子が高レベルで
構造的に発現される菌体を用いるのが好ましい。
本発明の別の面によると驚くべきことにプロテアーゼ遺
伝子の高レベルの発現を得るのにアスボロジーナスなバ
チルス属菌株を用いることができることが見い出された
。
伝子の高レベルの発現を得るのにアスボロジーナスなバ
チルス属菌株を用いることができることが見い出された
。
本発明はまたバチルス属細菌ＰＢ９２に由来する高アル
カリプロテアーゼのＢ、ズブチリスでの高生産を得るた
めに該遺伝子の前にＢ、ズブチリス中で活性なプロモー
ターを挿入することが好ましいことを示す（第１表）。
カリプロテアーゼのＢ、ズブチリスでの高生産を得るた
めに該遺伝子の前にＢ、ズブチリス中で活性なプロモー
ターを挿入することが好ましいことを示す（第１表）。
他のバチルス属細菌に由来する酵素をＢ、ズブチリスで
生産する場合にはＢ、ズブチリス中で活性なプロモータ
ーまたは他の発現シグナルの挿入が必要となり、それは
余分の工程を要することとなる。
生産する場合にはＢ、ズブチリス中で活性なプロモータ
ーまたは他の発現シグナルの挿入が必要となり、それは
余分の工程を要することとなる。
高アルカリプロテアーゼ生産性バチルス属菌は分類学的
によく分類されておらず一般に好アルカリバチルス属菌
株（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔ
ｒａｉｎｓ ）と称せられる０本発明に関しては我々は
好アルカリバチルス属菌をｐＨ９−１１のアルカリ性条
件下で増殖する（ ｇｒｏｗ ）バチルス属菌株として
定義する（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、 Ｋ、及びＴ、Ａｋｉ
ｂａ。
によく分類されておらず一般に好アルカリバチルス属菌
株（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔ
ｒａｉｎｓ ）と称せられる０本発明に関しては我々は
好アルカリバチルス属菌をｐＨ９−１１のアルカリ性条
件下で増殖する（ ｇｒｏｗ ）バチルス属菌株として
定義する（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、 Ｋ、及びＴ、Ａｋｉ
ｂａ。
１９８２ 、 Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓａ＋ （好アルカリ微生物）、スプリン
ガーフエアラーグ（ＳｐｒｉｎｇｅＶｅｒｌａｇ ）、
ニューヨーク〕、かかるバチルス属菌によって生産され
たアルカリプロテアーゼは高アルカリプロテアーゼとも
呼ばれる。アルカリ性ｐｔ＋で増殖できるバチルス属菌
株の例は、例えば米国特許３７２３２５０．Ｒｅ、３０
６０２及び４４８００３７に記述されている。好アルカ
リバチルス属菌株の例は特に米国特許Ｒｅ、３０６０２
に記載されたバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ９２で
ある。
ｏｒｇａｎｉｓａ＋ （好アルカリ微生物）、スプリン
ガーフエアラーグ（ＳｐｒｉｎｇｅＶｅｒｌａｇ ）、
ニューヨーク〕、かかるバチルス属菌によって生産され
たアルカリプロテアーゼは高アルカリプロテアーゼとも
呼ばれる。アルカリ性ｐｔ＋で増殖できるバチルス属菌
株の例は、例えば米国特許３７２３２５０．Ｒｅ、３０
６０２及び４４８００３７に記述されている。好アルカ
リバチルス属菌株の例は特に米国特許Ｒｅ、３０６０２
に記載されたバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ９２で
ある。
これらの好アルカリバチルス属菌株の、プロテアーゼ生
産用に最適化された誘導体を工業的規模でそれらのプロ
テアーゼを生産するのに用いる（ＥＰ−Ａ−０２８４１
２６参照）。生産物はいくつかの工業的適用に、例えば
洗濯用洗剤（ｌａｕｎｄｒｙｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ）
への添加剤として用いられる。
産用に最適化された誘導体を工業的規模でそれらのプロ
テアーゼを生産するのに用いる（ＥＰ−Ａ−０２８４１
２６参照）。生産物はいくつかの工業的適用に、例えば
洗濯用洗剤（ｌａｕｎｄｒｙｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ）
への添加剤として用いられる。
かかる生産物の例はマクサカル（Ｍａｘａｃａｌ” ）
（ジストブロケーズ（Ｇ１５ｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ
） ／ Ｉ Ｂ Ｉ Ｓ ）、サビナーゼ（５ａｖｉ
ｎａｓｅ” ） （ＮＯＶＯ） 、エスペラーゼ（Ｅ
ｓｐｅｒａｓｅ” ） （Ｎ ＯＶ Ｏ）である。か
かる生産物の変異体はＷＯ３９１０６２７９及び未公開
ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０３２８２２９に記述さ
れており、前者ではそれらはバチルス・レングス（１ｅ
ｎｔｕｓ ）菌株に由来するとされている。
（ジストブロケーズ（Ｇ１５ｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ
） ／ Ｉ Ｂ Ｉ Ｓ ）、サビナーゼ（５ａｖｉ
ｎａｓｅ” ） （ＮＯＶＯ） 、エスペラーゼ（Ｅ
ｓｐｅｒａｓｅ” ） （Ｎ ＯＶ Ｏ）である。か
かる生産物の変異体はＷＯ３９１０６２７９及び未公開
ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０３２８２２９に記述さ
れており、前者ではそれらはバチルス・レングス（１ｅ
ｎｔｕｓ ）菌株に由来するとされている。
本発明の好ましい態様によればＥＰ−Ａ−０３２８２２
９及びＷＯ３９１０６２７９に記述された変異体を好ま
しくは工業的規模で生産する形質転換バチルス属菌株が
提供される。
９及びＷＯ３９１０６２７９に記述された変異体を好ま
しくは工業的規模で生産する形質転換バチルス属菌株が
提供される。
本発明によればバチルス属菌株、特に好アルカリバチル
ス属菌、好ましくはバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ
９２が好適に用いられる。別の好ましいバチルス属菌株
群はアスポロジーナスな変異株であり、中でもＰＢＴＩ
ＩＯ及びその誘導体がもっとも好ましい、好アルカリバ
チルス属菌株の形質転換は該菌株のプロトプラストの使
用を含むのが好ましい。しかしながら、Ｃｈａｎｇ、
Ｓ及びＳ、 １９． Ｃｏｈｅｎ、 Ｍｅｌｅｃ、 Ｇ
ｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １６８ （１９７９）１１１
−１１５に記述された様な常用のプロトプラスト形質転
換プロトコルは好アルカリバチルス属菌株ではうまくい
かない、これらの菌株に必要とされるプロトコルはＥＰ
−Ａ−０２８３０７５に記述されており、これをここに
参考に加入する。
ス属菌、好ましくはバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ
９２が好適に用いられる。別の好ましいバチルス属菌株
群はアスポロジーナスな変異株であり、中でもＰＢＴＩ
ＩＯ及びその誘導体がもっとも好ましい、好アルカリバ
チルス属菌株の形質転換は該菌株のプロトプラストの使
用を含むのが好ましい。しかしながら、Ｃｈａｎｇ、
Ｓ及びＳ、 １９． Ｃｏｈｅｎ、 Ｍｅｌｅｃ、 Ｇ
ｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １６８ （１９７９）１１１
−１１５に記述された様な常用のプロトプラスト形質転
換プロトコルは好アルカリバチルス属菌株ではうまくい
かない、これらの菌株に必要とされるプロトコルはＥＰ
−Ａ−０２８３０７５に記述されており、これをここに
参考に加入する。
相同宿主における変異プロテアーゼ遺伝子の発現は野生
型遺伝子の置き代え及び／または不活性化を必要とする
。いくつかの方法を用い得る。
型遺伝子の置き代え及び／または不活性化を必要とする
。いくつかの方法を用い得る。
Ａ）１つの方法は遺伝子もしくはその一部をクローン化
し、それを部位特異的突然変異によって修飾し、ついで
（部分）遺伝子をプラスミド上で菌体中に再導入するこ
とである。相同組換えにより該遺伝子は染色体中に導入
される。野生型遺伝子と変異体遺伝子が直列に位置した
状態が招来される。ついで２回目の組換え後に修飾配列
は染色体に残され、それによって変異体を染色体遺伝子
に効率よく導入する（第１４図に記述）。
し、それを部位特異的突然変異によって修飾し、ついで
（部分）遺伝子をプラスミド上で菌体中に再導入するこ
とである。相同組換えにより該遺伝子は染色体中に導入
される。野生型遺伝子と変異体遺伝子が直列に位置した
状態が招来される。ついで２回目の組換え後に修飾配列
は染色体に残され、それによって変異体を染色体遺伝子
に効率よく導入する（第１４図に記述）。
Ｂ）別の方法では染色体遺伝子コピーを欠失によって不
活性化する。遺伝子の欠失を方法として選ぶ場合には欠
失させる染色体遺伝子断片は好ましくは完全コード領域
である。不活性化後、不活性化された遺伝子の変異体コ
ピーをクローニングベクターにより菌体中に運び込む。
活性化する。遺伝子の欠失を方法として選ぶ場合には欠
失させる染色体遺伝子断片は好ましくは完全コード領域
である。不活性化後、不活性化された遺伝子の変異体コ
ピーをクローニングベクターにより菌体中に運び込む。
Ｃ）別の方法では染色体遺伝子コピーに突然変異を起こ
させる。原理的には突然変異誘発性のオリゴヌクレオチ
ドで細菌を形質転換した後、（特異的）突然変異体を生
体内で得ることは可能である。 Ｍｏｅｒｓｃｈｅｌｌ
ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
させる。原理的には突然変異誘発性のオリゴヌクレオチ
ドで細菌を形質転換した後、（特異的）突然変異体を生
体内で得ることは可能である。 Ｍｏｅｒｓｃｈｅｌｌ
ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｅｉ、米国８５ （１９８Ｂ）５２４−５２８ではか
かる方法を酵母に用いて成功している。かかる方法を相
同の好ましくは相同の好アルカリバチルス属菌株に用い
る場合、それは本発明の一態様である。
かる方法を酵母に用いて成功している。かかる方法を相
同の好ましくは相同の好アルカリバチルス属菌株に用い
る場合、それは本発明の一態様である。
本発明は効率よいプロテアーゼ生産者であることが知ら
れているバチルス属菌株に関する。好ましい方法の１つ
においては、全高アルカリプロテアーゼコード領域を染
色体から欠失させる。この態様ではアルカリプロテアー
ゼ遺伝子をその５′及び３′領域を含めて含有するベク
ターを用いる。
れているバチルス属菌株に関する。好ましい方法の１つ
においては、全高アルカリプロテアーゼコード領域を染
色体から欠失させる。この態様ではアルカリプロテアー
ゼ遺伝子をその５′及び３′領域を含めて含有するベク
ターを用いる。
プロテアーゼ遺伝子を生体外でベクターから欠失させ、
５′及び３′フランキング（ｆ ｌａｎｋｉｎｇ）配列
を残す、このベクターを好アルカリバチルス属菌株中に
運び込む。ベクターをフランキング領域での相同組換え
により染色体中に組み込む、アラトリコンビネーション
（ｏｕｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）及び分離（ｒｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ）によりプロテアーゼ遺伝子を欠失
したバチルス属菌株が得られる。用いるベクターは好ま
しくはプラスミドである。選択を可能にすべく選択マー
カー、好ましくは抗生物質耐性、例えばネオマイシン耐
性をプラスミド中に導入する。
５′及び３′フランキング（ｆ ｌａｎｋｉｎｇ）配列
を残す、このベクターを好アルカリバチルス属菌株中に
運び込む。ベクターをフランキング領域での相同組換え
により染色体中に組み込む、アラトリコンビネーション
（ｏｕｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）及び分離（ｒｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ）によりプロテアーゼ遺伝子を欠失
したバチルス属菌株が得られる。用いるベクターは好ま
しくはプラスミドである。選択を可能にすべく選択マー
カー、好ましくは抗生物質耐性、例えばネオマイシン耐
性をプラスミド中に導入する。
好ましくはベクターを選択的に染色体に組み込むが、こ
れは誘導し得る複製開始点、例えばｐＥ１９４からの如
き温度感受性開始点を導入することによって達成される
。該プラスミドは相同宿主菌体に導入する。高い温度条
件ではこのプラスミドは複製できず従って染色体組込み
体を選択し得る。組込み体は当該抗生物質（例えばネオ
マイシン）の存在下高温で選択する。宿主染色体からプ
ラスミドの分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ）により染色
体中にフランキング領域が残り、コード領域が除去され
る。最後に、得られる選択された変異株は選択マーカー
遺伝子を失っており（つまりネオマイシン感受性である
）、またプロテアーゼ陰性である。
れは誘導し得る複製開始点、例えばｐＥ１９４からの如
き温度感受性開始点を導入することによって達成される
。該プラスミドは相同宿主菌体に導入する。高い温度条
件ではこのプラスミドは複製できず従って染色体組込み
体を選択し得る。組込み体は当該抗生物質（例えばネオ
マイシン）の存在下高温で選択する。宿主染色体からプ
ラスミドの分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ）により染色
体中にフランキング領域が残り、コード領域が除去され
る。最後に、得られる選択された変異株は選択マーカー
遺伝子を失っており（つまりネオマイシン感受性である
）、またプロテアーゼ陰性である。
最終的な染色体配置（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｃｏｎ
ｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は制限分析及びサザンブロッテ
ィングによって決。
ｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は制限分析及びサザンブロッテ
ィングによって決。
定する。ＷＯ３８１０６６２３は可能な組込み機構を精
力的に記述している。今度は部位特異的突然変異によっ
て修飾されたプロテアーゼ遺伝子を適当な発現ベクター
に乗せて該プロテアーゼ陰性菌体に導入する。プラスミ
ドの不安定性をさけるためプラスミドは染色体に相同の
配列は短い配列しか有さないかまたは好ましくは有さな
いように注意すべきである。
力的に記述している。今度は部位特異的突然変異によっ
て修飾されたプロテアーゼ遺伝子を適当な発現ベクター
に乗せて該プロテアーゼ陰性菌体に導入する。プラスミ
ドの不安定性をさけるためプラスミドは染色体に相同の
配列は短い配列しか有さないかまたは好ましくは有さな
いように注意すべきである。
変異プロテアーゼ遺伝子をベクターから発現する代りに
、これをプロテアーゼ陰性菌株の染色体に組み込むこと
も可能である。これはプロテアーゼ遺伝子のフランキン
グ領域をプラスミド中の変異プロテアーゼ遺伝子と面す
るようにすることによって達せられる。かかるプラスミ
ドの導入はフランキング領域に相同組換えを起こし、そ
れによって突然変異プロテアーゼ遺伝子をプロテアーゼ
陰性菌株の染色体に導入する。これはプラスミドが不安
定となる場合特に有利である。本発明はまた得られる組
換え変異プロテアーゼもしくは野生型プロテアーゼの量
はプラスミドによってコード化された遺伝子が数コピー
ある場合と該遺伝子の１コピーがゲノムに取り込まれる
場合とで後者が前者に匹敵するかまたはむしろ前者より
高いことを示している。
、これをプロテアーゼ陰性菌株の染色体に組み込むこと
も可能である。これはプロテアーゼ遺伝子のフランキン
グ領域をプラスミド中の変異プロテアーゼ遺伝子と面す
るようにすることによって達せられる。かかるプラスミ
ドの導入はフランキング領域に相同組換えを起こし、そ
れによって突然変異プロテアーゼ遺伝子をプロテアーゼ
陰性菌株の染色体に導入する。これはプラスミドが不安
定となる場合特に有利である。本発明はまた得られる組
換え変異プロテアーゼもしくは野生型プロテアーゼの量
はプラスミドによってコード化された遺伝子が数コピー
ある場合と該遺伝子の１コピーがゲノムに取り込まれる
場合とで後者が前者に匹敵するかまたはむしろ前者より
高いことを示している。
さらに別のＢ様においては染色体高アルカリプロテアー
ゼ遺伝子を、先立ってのプロテアーゼ陰性菌株の単離な
しに、相同組換えによって変異株遺伝子と置き代える。
ゼ遺伝子を、先立ってのプロテアーゼ陰性菌株の単離な
しに、相同組換えによって変異株遺伝子と置き代える。
タンパク質が発現され、分泌されると、菌体または培地
から単離できる。プロテアーゼを回収後、それを精製し
洗剤組成物に配合する。上述の生産系で野生型遺伝子は
完全に欠失されているので変異プロテアーゼ調製物は野
生型プロテアーゼを全く含有しない。
から単離できる。プロテアーゼを回収後、それを精製し
洗剤組成物に配合する。上述の生産系で野生型遺伝子は
完全に欠失されているので変異プロテアーゼ調製物は野
生型プロテアーゼを全く含有しない。
ＥＰ−Ａ−０２８４１２６に記載されたようにして構築
したプラスミドｐＭ５８は高アルカリプロテアーゼ遺伝
子を含有する。不活性化プラスミドを得るためにプロテ
アーゼ遺伝子のコード領域をＢａ１ｌ／Ｈｐａｌ二重消
化によって欠失させる。
したプラスミドｐＭ５８は高アルカリプロテアーゼ遺伝
子を含有する。不活性化プラスミドを得るためにプロテ
アーゼ遺伝子のコード領域をＢａ１ｌ／Ｈｐａｌ二重消
化によって欠失させる。
ｐＥ１９４ｎｅｏ−１からの温度感受性複製開始点をつ
いで導入する。構築物ｐＥＭ５８Δをバチルス属菌株Ｐ
ＢＴＩＩＯに導入する。
いで導入する。構築物ｐＥＭ５８Δをバチルス属菌株Ｐ
ＢＴＩＩＯに導入する。
いわゆるキャンベル型機構（Ｃａｍｐｂｅｌｌ−ｔｙｐ
ｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ ）による組込みがプロテアーゼ
遺伝子の５′フランキング領域で起こり、染色体中のプ
ロテアーゼ座中に全プラスミドベクターを担持するプロ
テアーゼ陽性菌株が得られる（第３図に示す）。
ｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ ）による組込みがプロテアーゼ
遺伝子の５′フランキング領域で起こり、染色体中のプ
ロテアーゼ座中に全プラスミドベクターを担持するプロ
テアーゼ陽性菌株が得られる（第３図に示す）。
ひき続いてのこの菌株のプロテアーゼ陰性誘導体の選択
により該プロテアーゼ遺伝子及びネオマイシンマーカー
を失った２つの菌株ＰＢＴ１２５及びＰＢＴ１２６が得
られた。さらなる分析によりこの第２の工程では異常組
換え（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ ）が起こったことが判明した。
により該プロテアーゼ遺伝子及びネオマイシンマーカー
を失った２つの菌株ＰＢＴ１２５及びＰＢＴ１２６が得
られた。さらなる分析によりこの第２の工程では異常組
換え（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ ）が起こったことが判明した。
得られたバチルス属菌株は検出し得るプロテアーゼ活性
を示さなかったので、それらは変更されたプロテアーゼ
遺伝子の発現に用いることができた。異常組換えは相異
する結果を与えるので完全な遺伝子が欠失したかどうか
を決定することが肝要である。より特異的（５ｐｅｃｉ
ｆｉｃ ）菌株を得るためには相同組換えを行ったであ
ろう。
を示さなかったので、それらは変更されたプロテアーゼ
遺伝子の発現に用いることができた。異常組換えは相異
する結果を与えるので完全な遺伝子が欠失したかどうか
を決定することが肝要である。より特異的（５ｐｅｃｉ
ｆｉｃ ）菌株を得るためには相同組換えを行ったであ
ろう。
ここに与えられる実施例は本発明の２つの具体的態様を
主として示す。１つはプロテアーゼ陰性菌株からプラス
ミドコード化変異プロテアーゼの生産である。他方はそ
のために変異遺伝子がゲノムに遺伝子交換によって導入
された変異プロテアーゼの生産である。他の態様、例え
ばプロテアーゼ陰性菌株への染色体の組込み、プラスミ
ド及び染色体に組み込まれたプラスミド上の変異遺伝子
コピーミ染色体中で直列に位置したまたは異なる位置に
ある変異遺伝子の１より多いコピーが可能であることは
当業者にとって直ちに明瞭であろう。
主として示す。１つはプロテアーゼ陰性菌株からプラス
ミドコード化変異プロテアーゼの生産である。他方はそ
のために変異遺伝子がゲノムに遺伝子交換によって導入
された変異プロテアーゼの生産である。他の態様、例え
ばプロテアーゼ陰性菌株への染色体の組込み、プラスミ
ド及び染色体に組み込まれたプラスミド上の変異遺伝子
コピーミ染色体中で直列に位置したまたは異なる位置に
ある変異遺伝子の１より多いコピーが可能であることは
当業者にとって直ちに明瞭であろう。
以下の実施例は説明として提供されるもので限定のため
のものではない。
のものではない。
実施例１
不活性化プラスミドｐＥＭ５８Δの構築プラスミドｐＭ
５８ （ＥＰ−Ａ −０２８４１２６参照）を制限酵素
Ｂａ１ｌ及びＨｐａｌで消化した。
５８ （ＥＰ−Ａ −０２８４１２６参照）を制限酵素
Ｂａ１ｌ及びＨｐａｌで消化した。
プロテアーゼ遺伝子のフランキング配列の部分を含有す
る大きな断片を精製しくＭＨｉＢｊｉ３． Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （分子クローニング：実験室マニュ
アル）、コールドスプリングハーバ−１９８２）、つい
で連結した。連結混合物でバチルス・ズブチリスＤＢ
１０４（にａｗａｍｕｒａ及びＤｏｉ、 Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、 １６０ （１９８４） ４４２−４
４４）を形質転換しく ５ｐｉｚｉｚｅｎら、Ｊ。
る大きな断片を精製しくＭＨｉＢｊｉ３． Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （分子クローニング：実験室マニュ
アル）、コールドスプリングハーバ−１９８２）、つい
で連結した。連結混合物でバチルス・ズブチリスＤＢ
１０４（にａｗａｍｕｒａ及びＤｏｉ、 Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、 １６０ （１９８４） ４４２−４
４４）を形質転換しく ５ｐｉｚｉｚｅｎら、Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８１ （１９６１） ？４ｌ−
７４６）、ついで０．４％カゼイン及び２０μｇ、７ｍ
ｌネオマイシンを含有する最小平板上でネオマイシン耐
性でプロテアーゼ陰性の形質転換体を選択した。
７４６）、ついで０．４％カゼイン及び２０μｇ、７ｍ
ｌネオマイシンを含有する最小平板上でネオマイシン耐
性でプロテアーゼ陰性の形質転換体を選択した。
プラスミドｐＭ５８Δを分離し、制限酵素分析によって
特徴づけた。第１図に示す如くプラスミドｐＭ５８Δは
ネオマイシン耐性及びバチルス複製開始点をコード化す
る高アルカリプロテアーゼ遺伝子のフランキング配列を
含有する。
特徴づけた。第１図に示す如くプラスミドｐＭ５８Δは
ネオマイシン耐性及びバチルス複製開始点をコード化す
る高アルカリプロテアーゼ遺伝子のフランキング配列を
含有する。
温度感受性複製開始点を含有する組込みプラスミドを構
築するため、９Ｍ５８Δを制限酵素Ｘｂａｌ及びＢａ１
ＩＩで消化した。高アルカリプロテアーゼフランキング
配列を含有する断片を精製し、ｐＥｌ ９４ （Ｊｏｒ
ｄａｎｅｓｃｕら、プラスミド±（１９７８）４６８−
４７９）から導かれた温度感受性複製開始点を含有する
ｐＥ １９４ｎｅｏ −１（ＥＰ−Ａ０２８４１２６）
のく精製した） Ｘｂａ Ｉ ／ Ｂａｌ ＩＩ断片に
、該断片を前述の如くして精製した後に、連結した。連
結混合物でＢ、ズブチリスＤＢ１０４を形質転換し、ネ
オマイシン耐性について選択した（上記参照）、、プラ
スミドｐＥＭ５８Δを単離し性格づけだ（第２図）。こ
れはネオマイシン耐性遺伝子、ｐＥ１９４からの温度感
受性複製開始点及びアルカリプロテアーゼ遺伝子のフラ
ンキング配列を含有する。
築するため、９Ｍ５８Δを制限酵素Ｘｂａｌ及びＢａ１
ＩＩで消化した。高アルカリプロテアーゼフランキング
配列を含有する断片を精製し、ｐＥｌ ９４ （Ｊｏｒ
ｄａｎｅｓｃｕら、プラスミド±（１９７８）４６８−
４７９）から導かれた温度感受性複製開始点を含有する
ｐＥ １９４ｎｅｏ −１（ＥＰ−Ａ０２８４１２６）
のく精製した） Ｘｂａ Ｉ ／ Ｂａｌ ＩＩ断片に
、該断片を前述の如くして精製した後に、連結した。連
結混合物でＢ、ズブチリスＤＢ１０４を形質転換し、ネ
オマイシン耐性について選択した（上記参照）、、プラ
スミドｐＥＭ５８Δを単離し性格づけだ（第２図）。こ
れはネオマイシン耐性遺伝子、ｐＥ１９４からの温度感
受性複製開始点及びアルカリプロテアーゼ遺伝子のフラ
ンキング配列を含有する。
このプラスミドｐＥＭ５８Δをバチルス属菌株ＰＢＴＩ
ＩＯを形質転換するのに用いた。
ＩＯを形質転換するのに用いた。
■
Ａ、プラスミド ＥＭ５８ΔによるバチルスＰＢＴ
の ロ −スバチルス属菌株ＰＢＴＩ
１０はバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ９２（米国
特許Ｒｅ３０６０２）のアスボロジーナス変異体であり
、古典的（ＵＶ）変異操作によって得た。この菌株をＥ
Ｐ−Ａ０２８４１２６に記載された方法と同様にしてプ
ラスミドｐＥＭ５８Δで形質転換した。組込み実験に先
立って、形質転換体が当該プラスミドを含有しているか
どうか制限酵素分析でチエツクした。
の ロ −スバチルス属菌株ＰＢＴＩ
１０はバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ９２（米国
特許Ｒｅ３０６０２）のアスボロジーナス変異体であり
、古典的（ＵＶ）変異操作によって得た。この菌株をＥ
Ｐ−Ａ０２８４１２６に記載された方法と同様にしてプ
ラスミドｐＥＭ５８Δで形質転換した。組込み実験に先
立って、形質転換体が当該プラスミドを含有しているか
どうか制限酵素分析でチエツクした。
ｐＥＭ５８へのバチルス属菌株ＰＢＴ１１０の染色体へ
の組込みはＥＰ−Ａ−０２８４１２６に記述したように
して行った。組込み体の選択は１μｇ／ｍｅのネオマイ
シン濃度で行った。組込み体の遺伝子構成は制限酵素分
析とそれに続くサザンプロソティング及びハイブリダイ
ゼーション分析によって決定した。これを第３図に示す
。ｐＥＭ５８Δの組込みはアルカリプロテアーゼ遺伝子
の５′フランキング領域における相同組換えによってい
わゆるキャンベル型機構を通して起こったと考えられる
。この結果バチルス属菌株ＰＢＴＩＩＯＩＮＴ５が得ら
れた。
の組込みはＥＰ−Ａ−０２８４１２６に記述したように
して行った。組込み体の選択は１μｇ／ｍｅのネオマイ
シン濃度で行った。組込み体の遺伝子構成は制限酵素分
析とそれに続くサザンプロソティング及びハイブリダイ
ゼーション分析によって決定した。これを第３図に示す
。ｐＥＭ５８Δの組込みはアルカリプロテアーゼ遺伝子
の５′フランキング領域における相同組換えによってい
わゆるキャンベル型機構を通して起こったと考えられる
。この結果バチルス属菌株ＰＢＴＩＩＯＩＮＴ５が得ら
れた。
Ｃ，プロテアーゼ の
バチルス属菌株ＰＢＴＩ １０− ＩＮＴ５をｌμｇ／
ｌｌ１１ネオマイシンを含有する１ ００ｍｌのトリプ
シン作用大豆ブロス（ＴＳＢ）中５０℃で２４時間植菌
した。
ｌｌ１１ネオマイシンを含有する１ ００ｍｌのトリプ
シン作用大豆ブロス（ＴＳＢ）中５０℃で２４時間植菌
した。
２４時間後に得られた培養液０．１ｉ／！をＰＢＴ最少
培地（ＫＪＰＯ４１７，４２ｇ ／ ｌ、グルタミン酸
塩１３．３６ｇ／ｌクエン酸ナトリウム・０２０２ ｇ
／ｌ、 Ｆ２ＳＯ４・７８２００．０５ ｇ／ｌ、 Ｚ
ｎＳＯ４・７ＨｚＯＩ ＩＩＩｇ／ ｌ、 Ｍｎ５Ｏ
ａ ・ Ｈ，Ｏ１ｍｇ／ ｌ、ＣａＣｌ１２−２１ｈ
０ １０ｏ＋ｇ／ ｌ−、Ｍｇ５Ｏ４Ｈ７Ｈｚ００．２
ｇ／ ｅ、ＣｕＳＯ４・５１１２００．５ｍｇ／ｊ７
． ＨｓＢＯｓ ０．５＋＋＋ｇ／１１Ｎａ２ＭｏＯ，
・２Ｊ００．５ｍｇ／ ＩＩ 、 ＣｏＣ１ｚ・６Ｈ２
Ｏ０、５ｔａｇ／ ｌ、ビオチン０．５ ｍｇ／ １、
ショＩ！ ２０ ｇ／ｌ （ｐＨ８，０； １２０℃で
２０分殺菌）。殺菌後チアミンｌＩＩＩｇ／ｌを加えた
］１００＠／を含有する５ ００ｖｇｌ振盪フラスコに
植菌した。
培地（ＫＪＰＯ４１７，４２ｇ ／ ｌ、グルタミン酸
塩１３．３６ｇ／ｌクエン酸ナトリウム・０２０２ ｇ
／ｌ、 Ｆ２ＳＯ４・７８２００．０５ ｇ／ｌ、 Ｚ
ｎＳＯ４・７ＨｚＯＩ ＩＩＩｇ／ ｌ、 Ｍｎ５Ｏ
ａ ・ Ｈ，Ｏ１ｍｇ／ ｌ、ＣａＣｌ１２−２１ｈ
０ １０ｏ＋ｇ／ ｌ−、Ｍｇ５Ｏ４Ｈ７Ｈｚ００．２
ｇ／ ｅ、ＣｕＳＯ４・５１１２００．５ｍｇ／ｊ７
． ＨｓＢＯｓ ０．５＋＋＋ｇ／１１Ｎａ２ＭｏＯ，
・２Ｊ００．５ｍｇ／ ＩＩ 、 ＣｏＣ１ｚ・６Ｈ２
Ｏ０、５ｔａｇ／ ｌ、ビオチン０．５ ｍｇ／ １、
ショＩ！ ２０ ｇ／ｌ （ｐＨ８，０； １２０℃で
２０分殺菌）。殺菌後チアミンｌＩＩＩｇ／ｌを加えた
］１００＠／を含有する５ ００ｖｇｌ振盪フラスコに
植菌した。
この培養液を３７℃で４日間培養した。４日後に培養液
ｌｌ１１を同培地１００Ｉｌｌｌで希釈し４日間培養し
た。４日後に培養菌を追加してカゼイン０．４％及び寒
天１５ｇ／ｌを含有するＰＢＴ最少培地平板上で平板培
養した。検出できるプロテアーセハロ−（ｈａｌｏ ）
ヲ欠＜コロニーをプロテアーゼマイナスと解し、ＰＢＴ
ＩＩＯアルカリプロテアーゼをコード化する遺伝子の不
存在をチエツクした。
ｌｌ１１を同培地１００Ｉｌｌｌで希釈し４日間培養し
た。４日後に培養菌を追加してカゼイン０．４％及び寒
天１５ｇ／ｌを含有するＰＢＴ最少培地平板上で平板培
養した。検出できるプロテアーセハロ−（ｈａｌｏ ）
ヲ欠＜コロニーをプロテアーゼマイナスと解し、ＰＢＴ
ＩＩＯアルカリプロテアーゼをコード化する遺伝子の不
存在をチエツクした。
Ｄ、プロテアーゼ 性 の性格づけ
前セクションに記述したカゼイン上で検出し得るハロー
を示さなかった菌株をネオマイシン感受性及びアスボロ
ジーナス表現型の存在についてまずテストした。プロテ
アーゼ陰性及び了スポロジーナス表現型を含有していた
２つの菌株バチルス属菌ＰＢＴ１２５及びＰＢＴ１２６
をプロテアーゼ生産培地１０ （１ｍｊ！を含有する５
００１１７！振盪フラスコ中で米国特許Ｒｅ、３０６０
２に記述したようにしてプロテアーゼ生産について試験
した。どちらの菌株も検出し得る量のプロテアーゼを生
産しなかった。
を示さなかった菌株をネオマイシン感受性及びアスボロ
ジーナス表現型の存在についてまずテストした。プロテ
アーゼ陰性及び了スポロジーナス表現型を含有していた
２つの菌株バチルス属菌ＰＢＴ１２５及びＰＢＴ１２６
をプロテアーゼ生産培地１０ （１ｍｊ！を含有する５
００１１７！振盪フラスコ中で米国特許Ｒｅ、３０６０
２に記述したようにしてプロテアーゼ生産について試験
した。どちらの菌株も検出し得る量のプロテアーゼを生
産しなかった。
２つの菌株の遺伝子構成を制限酵素分析及び染色体プロ
ッティングによって決定した。これを第４図に示す、異
常組換えを除き相同組換えは起こっておらず、結果とし
てプロテアーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子が完
全に欠失した２つのの菌株が得られた。しかしながら、
プロテアーゼ遺伝子の欠失の後の染色体に小さなプラス
ミド断片が残っているようであった。この断片の配列は
以下のようにして決定された。プラスミド／染色体連結
点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ）を含有する菌株ＰＢＴ１２５
及びＰＢＴ１２６の染色体Ｈｉｎｄｌｎ断片をファージ
ベクターＭ １３ｍｐｒ ｌ Ｂ （Ｍｅｓｓｉｎｇ
ら、Ｎｕｃｌ。
ッティングによって決定した。これを第４図に示す、異
常組換えを除き相同組換えは起こっておらず、結果とし
てプロテアーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子が完
全に欠失した２つのの菌株が得られた。しかしながら、
プロテアーゼ遺伝子の欠失の後の染色体に小さなプラス
ミド断片が残っているようであった。この断片の配列は
以下のようにして決定された。プラスミド／染色体連結
点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ）を含有する菌株ＰＢＴ１２５
及びＰＢＴ１２６の染色体Ｈｉｎｄｌｎ断片をファージ
ベクターＭ １３ｍｐｒ ｌ Ｂ （Ｍｅｓｓｉｎｇ
ら、Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、９ （１９８１） ３０３−３２
１）に連結し、ついでそれでもってＥ、コリＪＭＩ ０
１をＣｏｈｅｎ ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、米国旦（１９７２）２１１０−２１１４
に記述された操作に従ってトランスフェクトした。Ｅ、
コリＪＭ１０１中でのファージ増殖後に５ｓＤＮＡを単
離した（ Ｈｅ１ｄｅｃｋｅｒ ら、Ｇｅｎｅ上０
（１９８０）６９−７３）。
１）に連結し、ついでそれでもってＥ、コリＪＭＩ ０
１をＣｏｈｅｎ ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、米国旦（１９７２）２１１０−２１１４
に記述された操作に従ってトランスフェクトした。Ｅ、
コリＪＭ１０１中でのファージ増殖後に５ｓＤＮＡを単
離した（ Ｈｅ１ｄｅｃｋｅｒ ら、Ｇｅｎｅ上０
（１９８０）６９−７３）。
挿入物をＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、米国１↓（１９７７）６４６３に記述
された方法を用いて配列決定した。結果を第５Ａ及び５
Ｂ図にそれぞれ示す。
ａｄ、 Ｓｃｉ、米国１↓（１９７７）６４６３に記述
された方法を用いて配列決定した。結果を第５Ａ及び５
Ｂ図にそれぞれ示す。
プラスミドｐＭ５８をＨｐａｌ及びＢａ１ｌで消化した
。プロテアーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片を精製（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、 １９８２）後、この断片を５ｅａｌで消
化したファージＭ１３ｍｐ１８に連結した。連結混合物
でＥ、コリＪＭＩＯＩをトランスフェクトした（ Ｃｏ
ｈｅｎら、既出）、Ｅ、コリＪＭＩ ０１中でのファー
ジ増殖後、旧ｒｎｂｏｉ＋ａ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌ。
。プロテアーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片を精製（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、 １９８２）後、この断片を５ｅａｌで消
化したファージＭ１３ｍｐ１８に連結した。連結混合物
でＥ、コリＪＭＩＯＩをトランスフェクトした（ Ｃｏ
ｈｅｎら、既出）、Ｅ、コリＪＭＩ ０１中でのファー
ジ増殖後、旧ｒｎｂｏｉ＋ａ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌ。
＾ｃｉｄｓＲｅｓ、７ （１９７９）１５１３ １５２
３）によって記述された方法に従ってｄｓＤＮＡを単離
した。挿入物及びその方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ
）を制限酵素分析でチエツクした。ベクター５ｐ１８
〜ＭＸＬをさらなるサブクローニング実験のために用い
たが、これを第６図に示す。
３）によって記述された方法に従ってｄｓＤＮＡを単離
した。挿入物及びその方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ
）を制限酵素分析でチエツクした。ベクター５ｐ１８
〜ＭＸＬをさらなるサブクローニング実験のために用い
たが、これを第６図に示す。
第７図はプラスミドｐＢＨＡ１のヌクレオチド配列を示
す。このプラスミドは５ｔａｎｓｓｅｎｓ ら（〜ｕｃ
１．＾ｃｉｄｓＲｅｓ、１７ （１９８９）４４４１−
４４５４）によって記述された対をなす（ｔｗｉｎ ）
ベクター系ｐＭａ／Ｃ５−８であって追加のプロモータ
ーが挿入された該ベクター系から誘導された。プラスミ
ドＢＨＡ１は以下の断片よりなる：位置１１−１０５
：バクテリオファージＦＤ、ターミネータ− 位置１２１−２１５ ：バクテリオファージＦＤ、タ
ーミネータ− 位置２２１−３０７ ニブラスミドｐＢＲ３２２の部
分（すなわち、位置２０６９−２１５３）位置３１３−
７６８ ：バクテリオファージＦ１、複製の開始点（
すなわち位置５４８２− ５９４３） 位置７７２−２５７１ ：プラスミ、ドｐＢＲ３２２の
部分、すなわち複製開始点及びβ−ラク タマーゼ遺伝子 位置２５７２−２６８５： トランスボゾンＴｎ９０３
、完全ゲノム 位置２７１９−２７７２： ）リプトファンターミネー
ター（二重） 位置２７７３−３７２９： ）ランスボゾンＴｎ ９、
クロラムフェニコール−アセチルトランス フェラーゼ（−ｃａｔ）遺伝子。位置 ３００５ （Ａ） 、３０３８ （Ｃ）、３３０２（Ａ
）及び３４０９（Ａ） でのヌクレオチドが野生型ｃａｔコ ード配列と異なる。ＮＣｏ Ｉ 、 Ｂａ１Ｉ、Ｅｃｏ
ＲＩ及びＰｒｕ１１部位をなくすためにこれらの変異を
導入した。
す。このプラスミドは５ｔａｎｓｓｅｎｓ ら（〜ｕｃ
１．＾ｃｉｄｓＲｅｓ、１７ （１９８９）４４４１−
４４５４）によって記述された対をなす（ｔｗｉｎ ）
ベクター系ｐＭａ／Ｃ５−８であって追加のプロモータ
ーが挿入された該ベクター系から誘導された。プラスミ
ドＢＨＡ１は以下の断片よりなる：位置１１−１０５
：バクテリオファージＦＤ、ターミネータ− 位置１２１−２１５ ：バクテリオファージＦＤ、タ
ーミネータ− 位置２２１−３０７ ニブラスミドｐＢＲ３２２の部
分（すなわち、位置２０６９−２１５３）位置３１３−
７６８ ：バクテリオファージＦ１、複製の開始点（
すなわち位置５４８２− ５９４３） 位置７７２−２５７１ ：プラスミ、ドｐＢＲ３２２の
部分、すなわち複製開始点及びβ−ラク タマーゼ遺伝子 位置２５７２−２６８５： トランスボゾンＴｎ９０３
、完全ゲノム 位置２７１９−２７７２： ）リプトファンターミネー
ター（二重） 位置２７７３−３７２９： ）ランスボゾンＴｎ ９、
クロラムフェニコール−アセチルトランス フェラーゼ（−ｃａｔ）遺伝子。位置 ３００５ （Ａ） 、３０３８ （Ｃ）、３３０２（Ａ
）及び３４０９（Ａ） でのヌクレオチドが野生型ｃａｔコ ード配列と異なる。ＮＣｏ Ｉ 、 Ｂａ１Ｉ、Ｅｃｏ
ＲＩ及びＰｒｕ１１部位をなくすためにこれらの変異を
導入した。
位置３７３０−３８０４ ：多重クローニング部位位置
３８０７−７２６４ ニブラスミドｐＵＢ１１０の部分
（すなわち、複製機能及びカナマ イシン耐性遺伝子、ＥｃｏＲＩ ＰｖｕＩＩ断片） （ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｌａｓｍ
ｉｄ１５ （１９８６）９３−１０３及 びＰｌａｓｍｉｄ １７ （１９８７） ８３８
５） 位置’７２６７−７３３１ ：多重クローニング部位こ
れらの断片を既知のクローニング技術、例えばクレノー
による付着末端のフィリングイン（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉ
ｎ ）、アダプタークローニング等を用いて結合した。
３８０７−７２６４ ニブラスミドｐＵＢ１１０の部分
（すなわち、複製機能及びカナマ イシン耐性遺伝子、ＥｃｏＲＩ ＰｖｕＩＩ断片） （ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｌａｓｍ
ｉｄ１５ （１９８６）９３−１０３及 びＰｌａｓｍｉｄ １７ （１９８７） ８３８
５） 位置’７２６７−７３３１ ：多重クローニング部位こ
れらの断片を既知のクローニング技術、例えばクレノー
による付着末端のフィリングイン（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉ
ｎ ）、アダプタークローニング等を用いて結合した。
すべてのデータはＧｅｎｂａｎｋ”Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔ
ａ Ｂａｎｋ’ＮＩＨ（遺伝子バンク国立核酸配列デー
タバンクＮＩＨ）、米国から導いた。プラスミドｐＭｃ
５８はＤＳＭ４５６６として寄託された。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔ
ａ Ｂａｎｋ’ＮＩＨ（遺伝子バンク国立核酸配列デー
タバンクＮＩＨ）、米国から導いた。プラスミドｐＭｃ
５８はＤＳＭ４５６６として寄託された。
突然変異操作に先立って対のベクター系ｐＢＨＡ ／Ｃ
−１を以下の如く修飾して対のベクター系ｐＢＨＡＲＢ
−ＭＸＬ／ｐＢＨＣＲＢ−ＭＸＬを得た。
−１を以下の如く修飾して対のベクター系ｐＢＨＡＲＢ
−ＭＸＬ／ｐＢＨＣＲＢ−ＭＸＬを得た。
１、ベクターｍｐ１８〜ＭＸＬをＫｐｎｌ及びＨｉｎｃ
ｌｌで消化した。プロテアーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ
断片を精製し、ＥｃｏＲＶ及びＫｐｎｌで消化したｐＢ
ＨＡｌに連結した。連結混合物でＥ、コリＪＭＩ Ｏ１
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 １９８２）を形質転換し、トリ
プトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ ） ５
ｇ／ｌ、Ｎａｃｅ ８ ｇ／ｌ、チミ７２５ｍｇ／ｌ。
ｌｌで消化した。プロテアーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ
断片を精製し、ＥｃｏＲＶ及びＫｐｎｌで消化したｐＢ
ＨＡｌに連結した。連結混合物でＥ、コリＪＭＩ Ｏ１
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 １９８２）を形質転換し、トリ
プトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ ） ５
ｇ／ｌ、Ｎａｃｅ ８ ｇ／ｌ、チミ７２５ｍｇ／ｌ。
ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０１ｇ／ｌアンピシリン１００μｇ
／ａｔ’及びネオマイシフ２０ ｐ ｇ／ｌｌｌ、 ｐ
Ｈ７，０を含有するＬＣ”平板上で平板培養した。形質
転換体のプラスミドＤＮＡを単離しく Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ＋ 既出）制限酵素分析によって性格づけた。このよ
うにしてｐＢＨＡｌ−ＭＸＬを単離した（第８図参照）
。
／ａｔ’及びネオマイシフ２０ ｐ ｇ／ｌｌｌ、 ｐ
Ｈ７，０を含有するＬＣ”平板上で平板培養した。形質
転換体のプラスミドＤＮＡを単離しく Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ＋ 既出）制限酵素分析によって性格づけた。このよ
うにしてｐＢＨＡｌ−ＭＸＬを単離した（第８図参照）
。
２、入手し得る１セツトのオリゴヌクレオチドを用いて
プロテアーゼ遺伝子中に導入した突然変異体を配列決定
するため、プロテアーゼ遺伝子と比較したＦ１開始点の
方向を逆にすることが必要であった。これは以下の様に
して行ったニブラスミドｐＢＨＡ１−ＭＸＬをＢａｍＨ
Ｉで消化し、再連結した。連結混合物でＥ、コリＷ Ｋ
６ （Ｍａｎｉａｔｉｓ＋既出）を形質転換し、トリ
プトンｌｅｇ／ｊ！、酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ８ｇ／ｌ。
プロテアーゼ遺伝子中に導入した突然変異体を配列決定
するため、プロテアーゼ遺伝子と比較したＦ１開始点の
方向を逆にすることが必要であった。これは以下の様に
して行ったニブラスミドｐＢＨＡ１−ＭＸＬをＢａｍＨ
Ｉで消化し、再連結した。連結混合物でＥ、コリＷ Ｋ
６ （Ｍａｎｉａｔｉｓ＋既出）を形質転換し、トリ
プトンｌｅｇ／ｊ！、酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ８ｇ／ｌ。
チミン２５１１ｇ／ １１ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０１ｇ／
１１アンピシリン１００μｇ７ｍｌ及びネオマイシン２
０μｇ ／１Ｉｌｉｌ 、 ｐＨ７，０を含有するＬＣ
”平板上でネオマイシンまたはアンピシリン耐性につい
て選択した。形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離しく
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＋既出）、制限酵素分析で性格づけ
た。このようにしてｐＢＨＡＲ−ＭＸＬを単離した。こ
のものはＥ、コリ配列の方向が逆になっている点でｐＢ
ＨＡ−ＭＸＬと異なる（第９図参照）３、 さらなるフ
ランキング配列をプラスミドｐＢＨＡＲ−ＭＸＬに導入
するため、以下の消化を行った。プラスミドｐＭ５８を
５ｐｈｌ及び旧ｎｄ■で消化した。プラスミドｐＢＨＡ
Ｒ−ＭＸＬ（第１０図）を５ｈｐｌ及びＨｉｎｄｌｌｒ
で消化した。
１１アンピシリン１００μｇ７ｍｌ及びネオマイシン２
０μｇ ／１Ｉｌｉｌ 、 ｐＨ７，０を含有するＬＣ
”平板上でネオマイシンまたはアンピシリン耐性につい
て選択した。形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離しく
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＋既出）、制限酵素分析で性格づけ
た。このようにしてｐＢＨＡＲ−ＭＸＬを単離した。こ
のものはＥ、コリ配列の方向が逆になっている点でｐＢ
ＨＡ−ＭＸＬと異なる（第９図参照）３、 さらなるフ
ランキング配列をプラスミドｐＢＨＡＲ−ＭＸＬに導入
するため、以下の消化を行った。プラスミドｐＭ５８を
５ｐｈｌ及び旧ｎｄ■で消化した。プラスミドｐＢＨＡ
Ｒ−ＭＸＬ（第１０図）を５ｈｐｌ及びＨｉｎｄｌｌｒ
で消化した。
より大きな断片を精製した０両消化物を連結し、Ｂ、ズ
ブチリスＤＢ１０４を形質転換し、ネオマイシン１０μ
ｇ／−ｌ及びカゼイン０．４％を含有する最少培地平板
上でネオマイシン耐性及びプロテアーゼ活性について選
択した。形質転換体を制限酵素分析で性格づけた。これ
らのうちの１つ、ｐＢＨＡＲＢ−ＭＸＬ （第１０図）
をさらなる実験に用いた。
ブチリスＤＢ１０４を形質転換し、ネオマイシン１０μ
ｇ／−ｌ及びカゼイン０．４％を含有する最少培地平板
上でネオマイシン耐性及びプロテアーゼ活性について選
択した。形質転換体を制限酵素分析で性格づけた。これ
らのうちの１つ、ｐＢＨＡＲＢ−ＭＸＬ （第１０図）
をさらなる実験に用いた。
対のベクター系ｐＢＨＡＲＢ−ＭＸＬ／ｐＢＨｃＲＢ−
Ｍ Ｘ Ｌ （５ｔａｎｓｓｅｎｓ＋既出）を用いて突
然変異誘発を行った。
Ｍ Ｘ Ｌ （５ｔａｎｓｓｅｎｓ＋既出）を用いて突
然変異誘発を行った。
刻み目をつけた二重らせんアプローチ（ｇａｐｐｅｄｄ
ｕｐｌｅｘ ａｐｐｒｏａｃｈ ）（Ｋｒａｍｅｒ ら
、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ。
ｕｐｌｅｘ ａｐｐｒｏａｃｈ ）（Ｋｒａｍｅｒ ら
、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ。
１２ （１９８４）９４４１）及びプラスミド（ｐｈａ
ｓｓ＋ｉｄ） （ファージ／プ’ｐ スミＦｌｌｔｌｌ
） ｒ、ニーＪＪツく方法を用いた。この方法は本質的
に抗生物質に対する耐性を与える遺伝子中の、野生型抗
生物質耐性マーカーを含有する刻み目をつけた鎖（−鎖
）とアンバー変異を保持する鋳型値（＋ｔｉ）からなる
刻み目をつけた二重らせんＤＮＡに基づく、アニーリン
グ後、生体外ギャップフィリング（ｇａｐｆｉｌｌｉｎ
ｇ ）及びシーリング（ｓｅａｌｉｎｇ ）反応の間に
、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが刻み目をつけた
鎖に入る。得られる分子を用いて目的とする変異体（ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ ）と抗生物質耐性マーカーの間の結合
が保存れている不適合修復欠損（ｍｉｓｍａｔｃｈｒｅ
ｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ） （Ｍｕｔ Ｓ）宿
主を形質転換した。この菌株から単離した混合ファスミ
ド集団をサプレッサー陰性宿主菌株中で分離するにまか
せる。形質転換体を抗生物質含有培地で平板培養し、そ
れによって刻み目をつけた鎖に由来する子孫についての
選択が余儀なくされる。
ｓｓ＋ｉｄ） （ファージ／プ’ｐ スミＦｌｌｔｌｌ
） ｒ、ニーＪＪツく方法を用いた。この方法は本質的
に抗生物質に対する耐性を与える遺伝子中の、野生型抗
生物質耐性マーカーを含有する刻み目をつけた鎖（−鎖
）とアンバー変異を保持する鋳型値（＋ｔｉ）からなる
刻み目をつけた二重らせんＤＮＡに基づく、アニーリン
グ後、生体外ギャップフィリング（ｇａｐｆｉｌｌｉｎ
ｇ ）及びシーリング（ｓｅａｌｉｎｇ ）反応の間に
、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが刻み目をつけた
鎖に入る。得られる分子を用いて目的とする変異体（ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ ）と抗生物質耐性マーカーの間の結合
が保存れている不適合修復欠損（ｍｉｓｍａｔｃｈｒｅ
ｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ） （Ｍｕｔ Ｓ）宿
主を形質転換した。この菌株から単離した混合ファスミ
ド集団をサプレッサー陰性宿主菌株中で分離するにまか
せる。形質転換体を抗生物質含有培地で平板培養し、そ
れによって刻み目をつけた鎖に由来する子孫についての
選択が余儀なくされる。
ｐＭａ型ヘクターではヌクレオチド３４０９がＧからＡ
に変化し、ｐＭｃ型ベクターではヌクレオチド２２３８
がＧからＣに変化しており、それによってそれぞれクロ
ラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子
及びβ−ラクタマーゼ遺伝子中にアンバー停止コドンが
作出され、これらの遺伝子を不活性にする。
に変化し、ｐＭｃ型ベクターではヌクレオチド２２３８
がＧからＣに変化しており、それによってそれぞれクロ
ラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子
及びβ−ラクタマーゼ遺伝子中にアンバー停止コドンが
作出され、これらの遺伝子を不活性にする。
突然変異誘発を行うためにｐＭａ５−８またはその誘導
体の多重クローニング部位に標的ＤＮＡ断片をクローン
化する。標的ＤＮＡを含有するｐＭａ５−８とｐＭｃ５
−８との間に刻み目をつけた二重らせんをついで構築す
る。
体の多重クローニング部位に標的ＤＮＡ断片をクローン
化する。標的ＤＮＡを含有するｐＭａ５−８とｐＭｃ５
−８との間に刻み目をつけた二重らせんをついで構築す
る。
標的ＤＮＡよりなる一本鎖ギャノプは、化学的または酵
素的なヌクレオチドの誤移入（ｍ１ｓｉｎｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ ）を用いて、突然変異誘発性ヌクレオチド
と低レベルの誤って移入されたヌクレオチドを有する長
い合成オリゴヌクレオチドで突然変異誘発することがで
きる。詳細な記述についてはＡｕ５ｕｂｅｌら、ｌ ９
３７ 、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （分子生物学にお
ける現在のプロトコル）、ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ社、ニューヨーク、またはＢ、 Ｐｅｒｂａｌ、
１９８ｇ、＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （分子クローニ
ングへの実用ガイド〉、第２版、ジョン・ウィリー・ア
ンド・サンズ社、ニューヨーク参照。
素的なヌクレオチドの誤移入（ｍ１ｓｉｎｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ ）を用いて、突然変異誘発性ヌクレオチド
と低レベルの誤って移入されたヌクレオチドを有する長
い合成オリゴヌクレオチドで突然変異誘発することがで
きる。詳細な記述についてはＡｕ５ｕｂｅｌら、ｌ ９
３７ 、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （分子生物学にお
ける現在のプロトコル）、ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ社、ニューヨーク、またはＢ、 Ｐｅｒｂａｌ、
１９８ｇ、＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （分子クローニ
ングへの実用ガイド〉、第２版、ジョン・ウィリー・ア
ンド・サンズ社、ニューヨーク参照。
Ｄ、工業的プロテアーゼ生産のためのベクターの構築
目的とする変異体のプラスミドｐＢＨＡＲＢＭＸＬ中へ
の導入後、望ましくないＥ、コリ配列を以下の如くして
プラスミドから除いた二当面の変異体を含有するプラス
ミドｐＢＨＡＲＢＭＸＬをＩ３ａｍＨＩで消化し、希釈
条件下で再連結した。連結混合物でＢ、ズブチリスＤＢ
１０４を形質転換し、ネオマイシン２０μｇ／ｍｌ及
びカゼイン０．４％を含有する最少培地でネオマイシン
耐性及びプロテアーゼ活性について選択した。形質転換
体のＤＮＡを単離し、制限酵素分析によってｍｌづけた
。このようにしてＥ、コＩＪＤＮＡを欠き、生産物の工
業的生産に適したベクターを単離した。
の導入後、望ましくないＥ、コリ配列を以下の如くして
プラスミドから除いた二当面の変異体を含有するプラス
ミドｐＢＨＡＲＢＭＸＬをＩ３ａｍＨＩで消化し、希釈
条件下で再連結した。連結混合物でＢ、ズブチリスＤＢ
１０４を形質転換し、ネオマイシン２０μｇ／ｍｌ及
びカゼイン０．４％を含有する最少培地でネオマイシン
耐性及びプロテアーゼ活性について選択した。形質転換
体のＤＮＡを単離し、制限酵素分析によってｍｌづけた
。このようにしてＥ、コＩＪＤＮＡを欠き、生産物の工
業的生産に適したベクターを単離した。
以上の操作は第１１図に示され、そこでは変異体Ｍ２１
６Ｑを例として取り、プラスミドρＢＩＢ−ＭＸＬ
Ｍ２１６（ｌ＜得らレル。Ｍ２１６Ｑｌび後程言及する
Ｍ２１６ＳＳＳ１６０Ｄ及びＮ２１２ＤはＥＰ−Ａ−０
３２８２２９に記載されたバチルスＲｍＦＢ９２の変異
プロテアーゼである。
６Ｑを例として取り、プラスミドρＢＩＢ−ＭＸＬ
Ｍ２１６（ｌ＜得らレル。Ｍ２１６Ｑｌび後程言及する
Ｍ２１６ＳＳＳ１６０Ｄ及びＮ２１２ＤはＥＰ−Ａ−０
３２８２２９に記載されたバチルスＲｍＦＢ９２の変異
プロテアーゼである。
実施例４
バチルス属菌株ＰＢＴ１２５をＥＰ−Ａ−０２８４１２
６に記載された形質転換操作に従ってプラスミドｐＢＨ
Ｂ−ＭＸＬまたはそれから誘導された変異体プロテアー
ゼを含有するプラスミドで形質転換した。生産研究に先
立ち、形質転換体が当該プラスミドを含有するかどうか
制限酵素分析でチエツクした。
６に記載された形質転換操作に従ってプラスミドｐＢＨ
Ｂ−ＭＸＬまたはそれから誘導された変異体プロテアー
ゼを含有するプラスミドで形質転換した。生産研究に先
立ち、形質転換体が当該プラスミドを含有するかどうか
制限酵素分析でチエツクした。
プラスミドｐＥ １９４ｎｅｏ −１（ＥＰ−Ａ０２８
４１２６）を５ａｌｌで消化し、再連結した。
４１２６）を５ａｌｌで消化し、再連結した。
連結混合物でＢ、ズブチリスＤＢ１０４を形質転換し、
ネオマイシン２０μｇ７’ａｌを含有する最少培地でネ
オマイシンの耐性について選択した。
ネオマイシン２０μｇ７’ａｌを含有する最少培地でネ
オマイシンの耐性について選択した。
プラスミドｐＥ１９４ｎｅｏ−３を単離し、逆の方向に
おけるネオマイシン耐性遺伝子の存在についてチエツク
した（第１２図参照）。プラスミドＰＥ１９４ｎｅｏ−
３をＨｐａｌ及びＢｇｌｌｌで消化した。温度感受性複
製開始点を有する断片を精製した（ Ｍａｎｉａｔｉｓ
＋既出）。
おけるネオマイシン耐性遺伝子の存在についてチエツク
した（第１２図参照）。プラスミドＰＥ１９４ｎｅｏ−
３をＨｐａｌ及びＢｇｌｌｌで消化した。温度感受性複
製開始点を有する断片を精製した（ Ｍａｎｉａｔｉｓ
＋既出）。
プラスミドｐＢＨＢ−ＭＸＬ Ｍ２１６Ｑ（実施例３
及び第１１図参照）をＢｇｌＩＩ及びＢａ１ｌで消化し
た。プロテアーゼ遺伝子を含有する断片を精製した。両
断片を連結した。連結混合物でＢ。
及び第１１図参照）をＢｇｌＩＩ及びＢａ１ｌで消化し
た。プロテアーゼ遺伝子を含有する断片を精製した。両
断片を連結した。連結混合物でＢ。
ズブチリスＤＢ１０４を形質転換し、上述の如くしてプ
ロテアーゼ活性及びネオマイシン耐性について選択した
。形質転換体を制限酵素消化によって性格づけした。そ
れらの１つでプラスミドｐＥＮ ＩＧを含有するものを
選択した（第１３図）。このプラスミドはネオマイシン
耐性遺伝子、プラスミドｐＥ１９４ｎｅｏ−３からのｔ
、５．複製開始点、及びＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子中
のＭ２１６Ｑ変異を含有していた。
ロテアーゼ活性及びネオマイシン耐性について選択した
。形質転換体を制限酵素消化によって性格づけした。そ
れらの１つでプラスミドｐＥＮ ＩＧを含有するものを
選択した（第１３図）。このプラスミドはネオマイシン
耐性遺伝子、プラスミドｐＥ１９４ｎｅｏ−３からのｔ
、５．複製開始点、及びＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子中
のＭ２１６Ｑ変異を含有していた。
８８組込みベクターｐ Ｅ Ｎ ３ Ｓ組込みベクター
ｐＥＮ、Ｑについて記載したと同様な方法により出発ベ
クターｐ ＢＨＡＲＢＭＸＬ Ｍ２１６Ｓからｐ Ｅ
Ｎ ｘ Ｓを構築した。
ｐＥＮ、Ｑについて記載したと同様な方法により出発ベ
クターｐ ＢＨＡＲＢＭＸＬ Ｍ２１６Ｓからｐ Ｅ
Ｎ ｘ Ｓを構築した。
夫施炎五
バチルス属菌株ＰＥＰＩＩＩ及びＰＥＰ １１２の構築
Ａ、プラスミド ＥＮ、Ｑによるバチルス属菌ＰＢＴＩ
ＩＯのプロトプラスト バチルス属菌株ＰＢＰＩＩＯをＥＰ−Ａ０２８４１２６
に記述したと同様にしてプラスミドｐＥＮ：＋Ｑで形質
転換した。組込み実験に先立ち、形質転換体が当該プラ
スミドを含有しているかどうかを制限酵素分析によって
チエツクした。
ＩＯのプロトプラスト バチルス属菌株ＰＢＰＩＩＯをＥＰ−Ａ０２８４１２６
に記述したと同様にしてプラスミドｐＥＮ：＋Ｑで形質
転換した。組込み実験に先立ち、形質転換体が当該プラ
スミドを含有しているかどうかを制限酵素分析によって
チエツクした。
プラスミドｐＥＮｓＱを用いるバチルス属菌株ＰＢＴＩ
ｌ Ｏ染色体への組込み実験はＥＰ−Ａ０２８４１２
６に記述されたようにして行った。
ｌ Ｏ染色体への組込み実験はＥＰ−Ａ０２８４１２
６に記述されたようにして行った。
組込み体の選択はネオマイシン濃度ｌμｇ／ｍ！及びプ
ラスミド複製の非許容温度（５０℃）で行った。染色体
へのｐＥＮ３Ｑの組込みをチエツクするため可能性ある
組込み体の染色体ＤＮＡを単離し、Ｈｉｎｄｌｌ＋また
はＣ１ａｌで消化し、０．８％ＤＮＡアガロースゲルに
付し、ニトロセルロースにプロットしく ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ＋ Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｌ、 ９８（１９７
５）５０３−５１７） 、ついで３２ｐ標識のニックト
ランスレートした（ ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
）ｐ ＥＮ３Ｑ ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ＋ １
９８２）とハイブリッドした。
ラスミド複製の非許容温度（５０℃）で行った。染色体
へのｐＥＮ３Ｑの組込みをチエツクするため可能性ある
組込み体の染色体ＤＮＡを単離し、Ｈｉｎｄｌｌ＋また
はＣ１ａｌで消化し、０．８％ＤＮＡアガロースゲルに
付し、ニトロセルロースにプロットしく ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ＋ Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｌ、 ９８（１９７
５）５０３−５１７） 、ついで３２ｐ標識のニックト
ランスレートした（ ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
）ｐ ＥＮ３Ｑ ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ＋ １
９８２）とハイブリッドした。
ｐＥＮ３Ｑの組込みが相同組換えによって起こっており
、染色体上に直列に位置した２つのプロテアーゼ遺伝子
（１つの野生型と１つの変異体Ｍ２１６Ｑ）を有する菌
株（ＰＢＴｌ １０Ｍ／Ｑ）が得られたことが明らかと
なった。このようにｐＥＮ、Ｑの組込みは第１４図に示
される如くいわゆるキャンベル型機構によって起こった
（ＥＰ−Ａ−０２８４１２６も参照）。
、染色体上に直列に位置した２つのプロテアーゼ遺伝子
（１つの野生型と１つの変異体Ｍ２１６Ｑ）を有する菌
株（ＰＢＴｌ １０Ｍ／Ｑ）が得られたことが明らかと
なった。このようにｐＥＮ、Ｑの組込みは第１４図に示
される如くいわゆるキャンベル型機構によって起こった
（ＥＰ−Ａ−０２８４１２６も参照）。
Ｃ，ネオマイシン 性 の
ネオマイシン感受性組換体を選択した。これらは染色体
中に野生型または変異体プロテアーゼ遺伝子を含有して
いた（以後［外部組換え体（ｏｕｔｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔｓ）という）。選択操作は実施例２Ｃに記載した操
作と同様である。
中に野生型または変異体プロテアーゼ遺伝子を含有して
いた（以後［外部組換え体（ｏｕｔｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔｓ）という）。選択操作は実施例２Ｃに記載した操
作と同様である。
菌株ＰＢＴＩ １０Ｍ／Ｑを出発菌株として用いた。菌
株ＰＢＴＩ １０Ｍ／ＱをＰＢＴＩｌ少培地で培養した
後、培養菌をカゼイン０．４％及び寒天１５ｇ／／を含
有するＰＢＴ最少培地平板で平板培養した。これらの平
板は３７℃で４時間培養し、それぞれネオマイシン１μ
ｇ／１ｍｌを含有するがネオマイシンを含有しないハー
トインフュージョン（Ｈｅａｒｔ １ｎｆｕｓｉｏｎ
） （ＨＩ ）平板にレプリカ平板培養した（ ｗｅｒ
ｅ ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌａｔｅｄ ） ６ネオマイシ
ン怒受性コロニーを外部組換え体と考えた。
株ＰＢＴＩ １０Ｍ／ＱをＰＢＴＩｌ少培地で培養した
後、培養菌をカゼイン０．４％及び寒天１５ｇ／／を含
有するＰＢＴ最少培地平板で平板培養した。これらの平
板は３７℃で４時間培養し、それぞれネオマイシン１μ
ｇ／１ｍｌを含有するがネオマイシンを含有しないハー
トインフュージョン（Ｈｅａｒｔ １ｎｆｕｓｉｏｎ
） （ＨＩ ）平板にレプリカ平板培養した（ ｗｅｒ
ｅ ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌａｔｅｄ ） ６ネオマイシ
ン怒受性コロニーを外部組換え体と考えた。
Ｄ、ネオマイシン え の づけ可能性ある
外部組換え体の染色体ＤＮＡを単離し、Ｃ１ａｌまたは
ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、０．５％アガロースゲルに付
し、ニトロセルロースにプロットしく ５ｏｕｔｈｅｒ
ｎ、 １９７５ ） 、ついで３２Ｐで標識したニッ
クトランスレートしたｐ Ｅ Ｎ ｓ Ｑ （Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ。
外部組換え体の染色体ＤＮＡを単離し、Ｃ１ａｌまたは
ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、０．５％アガロースゲルに付
し、ニトロセルロースにプロットしく ５ｏｕｔｈｅｒ
ｎ、 １９７５ ） 、ついで３２Ｐで標識したニッ
クトランスレートしたｐ Ｅ Ｎ ｓ Ｑ （Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ。
１９８２）とハイブリッドした。Ｍ２１６Ｑ変異によっ
てＣ１ａ［が除去されるので、野生型プロテアーゼまた
は変異プロテア・−ゼ遺伝子を含有する菌株と中間菌株
ＰＢＴＩ １０Ｍ／Ｑとは容易に区別できる（第１４図
参照）。
てＣ１ａ［が除去されるので、野生型プロテアーゼまた
は変異プロテア・−ゼ遺伝子を含有する菌株と中間菌株
ＰＢＴＩ １０Ｍ／Ｑとは容易に区別できる（第１４図
参照）。
ＰＨ１０のＭ２１６Ｑ変異プロテアーゼ遺伝子を含有す
る外部組換え体を単離した。ＰＢ９２野生型プロテアー
ゼのＰＢ９２変異プロテアーゼへの置き代えが起こった
ことが示された後、該菌株の生産物をＥＰ−Ａ−０３２
８２２９に記述されたように生化学パラメーター（Ｋｃ
ａｔ、に−）、酸化耐性、特異的活性及び洗浄性能によ
って性格づけした。すべての結果はコントロールプロテ
アーゼＭ２１６Ｑに等しかったが、このことは形質転換
菌株の生産物が現に変異Ｍ２１６Ｑを含有するＰＢ９！
プロテアーゼであったことを示している。
る外部組換え体を単離した。ＰＢ９２野生型プロテアー
ゼのＰＢ９２変異プロテアーゼへの置き代えが起こった
ことが示された後、該菌株の生産物をＥＰ−Ａ−０３２
８２２９に記述されたように生化学パラメーター（Ｋｃ
ａｔ、に−）、酸化耐性、特異的活性及び洗浄性能によ
って性格づけした。すべての結果はコントロールプロテ
アーゼＭ２１６Ｑに等しかったが、このことは形質転換
菌株の生産物が現に変異Ｍ２１６Ｑを含有するＰＢ９！
プロテアーゼであったことを示している。
この形質転換株はバチルス属菌ＰＥＰＩＩＩと呼ばれる
。
。
ベクターＰＥＮｌ５を用いて同様の実験を行ってバチル
ス属菌株ＰＥｐＨ２を構築した。この菌株は変異Ｍ２１
６Ｓを有するＰＢ９２プロテアーゼを含有する。
ス属菌株ＰＥｐＨ２を構築した。この菌株は変異Ｍ２１
６Ｓを有するＰＢ９２プロテアーゼを含有する。
ＥＰ−Ａ−０２８４１２６に記載された操作に従って、
バチルス属菌株ＰＥＰＩＩＩをプラスミドｐＥＮ、Ｑで
形質転換した０組込み操作に先立ち、形質転換体が当該
プラスミドを含有しているかどうか制限酵素分析によっ
てチエツクした。組込み操作及び組込み体の選択（ネオ
マイシン濃度２０μｇ／ｒａ１、プラスミド複製の非許
容温度（５０℃））はＥＰ−Ａ−０２８４１２６ニおけ
ると同様にして行った。
バチルス属菌株ＰＥＰＩＩＩをプラスミドｐＥＮ、Ｑで
形質転換した０組込み操作に先立ち、形質転換体が当該
プラスミドを含有しているかどうか制限酵素分析によっ
てチエツクした。組込み操作及び組込み体の選択（ネオ
マイシン濃度２０μｇ／ｒａ１、プラスミド複製の非許
容温度（５０℃））はＥＰ−Ａ−０２８４１２６ニおけ
ると同様にして行った。
プラスミドｐＥＮ＊Ｑの染色体への組込みをチエツクす
るために、可能性ある組込み体の染色体ＤＮＡを単離し
、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、０．８％アガロースゲルに
付し、ニトロセルロースにプロットしく ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎら、１９７９）、ついで３１ｐで標識したニックト
ランスレートしたｐＥＮ３Ｑとハイブリッドした。染色
体上に離れて位置した２つの変異（Ｍ２１６Ｑ）ＰＢ９
２プロテアーゼ遺伝子を含有する菌株が単離されたこと
が判明した。この菌株をＰＥＰ２１１と称する。その染
色体方向性を第１５図に示す。
るために、可能性ある組込み体の染色体ＤＮＡを単離し
、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、０．８％アガロースゲルに
付し、ニトロセルロースにプロットしく ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎら、１９７９）、ついで３１ｐで標識したニックト
ランスレートしたｐＥＮ３Ｑとハイブリッドした。染色
体上に離れて位置した２つの変異（Ｍ２１６Ｑ）ＰＢ９
２プロテアーゼ遺伝子を含有する菌株が単離されたこと
が判明した。この菌株をＰＥＰ２１１と称する。その染
色体方向性を第１５図に示す。
変異Ｍ２１６Ｓを有する２つのプロテアーゼ遺伝子を含
有する類似の菌株を得るため、野生型遺伝子の遺伝子置
き代え後の変異遺伝子（Ｍ２１６Ｓ）を含有する菌株Ｐ
ＥＰ１１２をプラスミドｐＥＮ３ｓで形質転換し、つい
で上述の操作を路盤した、これらの実験により染色体上
に２つの分れて位置したＰＢ９２変異Ｍ２１６Ｓプロテ
アーゼ遺伝子を含有する菌株ＰＥＰ２１２を得た。
有する類似の菌株を得るため、野生型遺伝子の遺伝子置
き代え後の変異遺伝子（Ｍ２１６Ｓ）を含有する菌株Ｐ
ＥＰ１１２をプラスミドｐＥＮ３ｓで形質転換し、つい
で上述の操作を路盤した、これらの実験により染色体上
に２つの分れて位置したＰＢ９２変異Ｍ２１６Ｓプロテ
アーゼ遺伝子を含有する菌株ＰＥＰ２１２を得た。
プロテアーゼ変異体の生産は変異プロテアーゼコード化
遺伝子がプラスミド上または染色体上に位置した形質転
換バチルス属菌株を用いて行った。
遺伝子がプラスミド上または染色体上に位置した形質転
換バチルス属菌株を用いて行った。
コード化されたプラスミドの生産のために、２つの型の
菌株、ここに記述した好アルカリ菌株バチルス属菌株Ｐ
ＢＴ１２５とＢ、ズブチリスＤＢ１０４から誘導したア
スボロジーナスな菌株Ｂ。
菌株、ここに記述した好アルカリ菌株バチルス属菌株Ｐ
ＢＴ１２５とＢ、ズブチリスＤＢ１０４から誘導したア
スボロジーナスな菌株Ｂ。
ズブチリス株Ｄ Ｓ １２３６７ （Ｋａｗａｎ＋ｕｒ
ａら、ｊ。
ａら、ｊ。
８ａｃｔｅｒｉｏ１． ＜１９８４） １６０．
４４２−４４４）を用いた。これらの菌株をｐＢＨＢ−
ＭＸＬに由来するプラスミド（ｐ Ｂ ＨＢ−ＭＸ Ｌ
ｄｅｒｉｖｅｄｐｌａｓ＋＋＋ｉｄｓ ）で形質転換
した。プロテアーゼをコード化しているプラスミドを有
さないバチルス属菌ＰＢＴ１２５及びＢ、ズブチリスＤ
Ｓ１２３６７をコントロール菌株として用いた。
４４２−４４４）を用いた。これらの菌株をｐＢＨＢ−
ＭＸＬに由来するプラスミド（ｐ Ｂ ＨＢ−ＭＸ Ｌ
ｄｅｒｉｖｅｄｐｌａｓ＋＋＋ｉｄｓ ）で形質転換
した。プロテアーゼをコード化しているプラスミドを有
さないバチルス属菌ＰＢＴ１２５及びＢ、ズブチリスＤ
Ｓ１２３６７をコントロール菌株として用いた。
組み込まれたプロテアーゼ突然変異遺伝子を染色体に含
有する菌株による生産のために、ここに記述したバチル
ス属ＰＥＰ菌株を用いた。野生型プロテアーゼ遺伝子を
含有するバチルス属ＰＢＴ菌株１０Ｂ及び１１０をコン
トロール菌株として用いた。ＰＢ７１０８は染色体上に
離れて位置した２つの野生型遺伝子を含有する菌株であ
る（ＥＰ−Ａ−０２８４１２６参照）。ＰＢＴＩ １０
については実施例２Ａ参照。
有する菌株による生産のために、ここに記述したバチル
ス属ＰＥＰ菌株を用いた。野生型プロテアーゼ遺伝子を
含有するバチルス属ＰＢＴ菌株１０Ｂ及び１１０をコン
トロール菌株として用いた。ＰＢ７１０８は染色体上に
離れて位置した２つの野生型遺伝子を含有する菌株であ
る（ＥＰ−Ａ−０２８４１２６参照）。ＰＢＴＩ １０
については実施例２Ａ参照。
ＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子の原プロモーターのＢ、ズ
ブチリス中での活性をチエツクするため、ＨｐａＩＩプ
ロモーター（Ｚｙｐｒｉａｎら、ＤＮＡ ５（１９８
６）２１９−２２５）に対するプロテアーゼ遺伝子の方
向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ）が逆になっており、そ
の結果プロテアーゼ遺伝子の発現がその原プロモーター
によってのみ指示される構築物ｐＢＨＢ−ＭＸＬＲを作
製した。
ブチリス中での活性をチエツクするため、ＨｐａＩＩプ
ロモーター（Ｚｙｐｒｉａｎら、ＤＮＡ ５（１９８
６）２１９−２２５）に対するプロテアーゼ遺伝子の方
向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ）が逆になっており、そ
の結果プロテアーゼ遺伝子の発現がその原プロモーター
によってのみ指示される構築物ｐＢＨＢ−ＭＸＬＲを作
製した。
生産はプロテアーゼ生産培地１００ａｔを含有する５
００ｒａｌ＠盪フラスコ中で行った。
００ｒａｌ＠盪フラスコ中で行った。
好アルカリバチルス属菌株を用いた場合、培養菌を米国
特許Ｒｃ、３０６０２に記載した生産培地に植菌後３７
℃で４０時間培養した。プラスミド含有菌株の場合には
ネオマイシン（２０μｇ／ｌｌ１ｌ）を加えた。
特許Ｒｃ、３０６０２に記載した生産培地に植菌後３７
℃で４０時間培養した。プラスミド含有菌株の場合には
ネオマイシン（２０μｇ／ｌｌ１ｌ）を加えた。
Ｂ、ズブチリスＤＳ１２３６７株を用いた場合、酵母エ
キス（Ｄｉｒｃｏ） １２．５ｇ／ｆ、Ｃａ（ｌｚ・
６１ｈ００．９７ ｇ／ ｌ、 ＭｇＣ１ｇ・６Ｈ，０
２，２５ｇ／ｌ、 Ｍｎ５Ｏｉ ・４Ｈｚ０２０ｍｇ／
ｌ、 ＣｏＣｊ！ｚ ＋ ６Ｈ２゜ｌｎ＋ｇ／Ｊ、ク
エン酸塩０．５ｇ／ｌ消泡剤５６９３０．５ｍｇ、マル
トース６冗Ｗ／Ｗ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８
を含有する同等の培地を適用した。
キス（Ｄｉｒｃｏ） １２．５ｇ／ｆ、Ｃａ（ｌｚ・
６１ｈ００．９７ ｇ／ ｌ、 ＭｇＣ１ｇ・６Ｈ，０
２，２５ｇ／ｌ、 Ｍｎ５Ｏｉ ・４Ｈｚ０２０ｍｇ／
ｌ、 ＣｏＣｊ！ｚ ＋ ６Ｈ２゜ｌｎ＋ｇ／Ｊ、ク
エン酸塩０．５ｇ／ｌ消泡剤５６９３０．５ｍｇ、マル
トース６冗Ｗ／Ｗ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８
を含有する同等の培地を適用した。
プラスミド含有菌株の場合ネオマイシン（２０μｇ／ｌ
１Ｎ）を加えた。
１Ｎ）を加えた。
Ｂ、ズブチリス菌株を含有する培養液を３７℃で６５時
間培養した。すべての場合において振盪フラスコにネオ
マイシン２０μｇ／１ａｒｔを含有し、予め３７℃で２
４時間培養した当該菌株を含有するトリプシン作用大豆
プロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ ５ｏｙａＢｒｏｔｈ ）培養
液０．１ｍ６を植菌した。
間培養した。すべての場合において振盪フラスコにネオ
マイシン２０μｇ／１ａｒｔを含有し、予め３７℃で２
４時間培養した当該菌株を含有するトリプシン作用大豆
プロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ ５ｏｙａＢｒｏｔｈ ）培養
液０．１ｍ６を植菌した。
プロテアーゼ活性をしｌｎ ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ。
ｅｍ。
２４４ （１９６９）７８９−７９３に記載された如
く基質としてジメチルカゼインを用いて測定した。プロ
テアーゼ変異体の特異的活性（ＥＰ−Ａ−０３２８２２
９）をｍｇベースでの生産を決定するのに用いた。
く基質としてジメチルカゼインを用いて測定した。プロ
テアーゼ変異体の特異的活性（ＥＰ−Ａ−０３２８２２
９）をｍｇベースでの生産を決定するのに用いた。
発酵実験の結果を以下の第１表に要約する。
第１表
ＢＴＩＩＯ
ＢＴ１２５
Ｂ７１０８
ＢＴｌｌＩ
Ｂ７１１２
ＰＢＴ１２５ ｐＢＨＢ−ＭＸＬ
ＰＢＴ１２５ ｐｅｔ（Ｂ−ＭＸＬ
ＰＢＴ１２５ ρＢＨＢ−ＭＸＬ
ＰＢＴ１２５ ｐＢ）１Ｂ−ＭＸＬ
ＰＢＴ１２５ ｐＢＨＢ−ＭＸＬ
ＢＰ２１１
１００％
０％
１２０％
１００％
１００％
９５−１００％
Ｍ２１６Ｑ ９５−１００％
Ｍ２１６Ｓ ９５−１００％
５１６００ ９５−１００％
Ｎ２１２０ ９５−１００％
１２０％
Ｔ
Ｔ
２１６０
２１６Ｓ
Ｔ
２１６０
２１６Ｓ
Ｓ１６０口
２１２０
２１６Ｑ
ＰＥＰ２１２ １２０χ
Ｍ２１６ＳＤＳ１２３６７
０−１χＤＳ１２３６７ ｐＢＨＢ−ＭＸＬＲ
４Ｘ ＷＴＤＳ１２３６７ ｐＢＨＢ−
ＭＸＬ ４０χ −ＴＤＳ
１２３６７ ＰＢ）ＩＢ−ＭＸＬ Ｍ２１６Ｑ ４
０χ Ｉ’１２１６ＱＤＳ１２３６７ ｐ
ＢＨＢ−ＭＸＬ Ｍ２１６Ｓ ４０χ
Ｍ２１６ＳＤＳ１２３６７ ＰＢＨＢ−ＭＸＬ ５１
６０Ｄ ４０χ ５１６０Ｄ０５１
２３６７ ｐＢＨＢ−ＭＸＬ Ｎ２１２Ｄ ４０χ
Ｎ２１２Ｄこの明細書で記述したすべての
刊行物（特許出願も含む）は本発明が関与する分野の熟
練者の熟練のレベルを表示する。すべての刊行物は個々
の刊行物が具体的に個々的に参考に加入されるように指
し示されたと同じ程度に参考にここに加入する。
Ｍ２１６ＳＤＳ１２３６７
０−１χＤＳ１２３６７ ｐＢＨＢ−ＭＸＬＲ
４Ｘ ＷＴＤＳ１２３６７ ｐＢＨＢ−
ＭＸＬ ４０χ −ＴＤＳ
１２３６７ ＰＢ）ＩＢ−ＭＸＬ Ｍ２１６Ｑ ４
０χ Ｉ’１２１６ＱＤＳ１２３６７ ｐ
ＢＨＢ−ＭＸＬ Ｍ２１６Ｓ ４０χ
Ｍ２１６ＳＤＳ１２３６７ ＰＢＨＢ−ＭＸＬ ５１
６０Ｄ ４０χ ５１６０Ｄ０５１
２３６７ ｐＢＨＢ−ＭＸＬ Ｎ２１２Ｄ ４０χ
Ｎ２１２Ｄこの明細書で記述したすべての
刊行物（特許出願も含む）は本発明が関与する分野の熟
練者の熟練のレベルを表示する。すべての刊行物は個々
の刊行物が具体的に個々的に参考に加入されるように指
し示されたと同じ程度に参考にここに加入する。
以上の発明は理解の明瞭さのため例示及び実施例によっ
てかなり詳細に記述したが、本特許請求の精神または範
囲を逸脱することなく多くの変化及び修飾を加えること
ができることは当業者に明らかであろう。
てかなり詳細に記述したが、本特許請求の精神または範
囲を逸脱することなく多くの変化及び修飾を加えること
ができることは当業者に明らかであろう。
第１図はバチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ９２からの
アルカリプロテアーゼ遺伝子の５′及び３′フランキン
グ領域の一部を含有するプラスミドＰＭ５８Δの構築を
示す。 第２図は複製の温度感受性開始点のプラスミドｐＥ１９
４ｎｅｏ−１からプラスミドｐＭ５８Δへの導入による
プラスミドｐＥＭ５８Δの取得を示す。 第３図はバチルス属菌株ＰＢＴＩＩＯのプロテアーゼ遺
伝子の５′フランキング領域へのプラスミドｐＥＭ５８
Δの相同組換えによる導入を示す。 第４図は異常組換え後の欠失プロテアーゼ遺伝子を取り
巻く領域の簡略化した制限地図を示す。 第５図はＰＢＴ１２５ （Ａ）及びＰＢＴ１２６（Ｂ）
のＨｉｎｄ ｍ断片のヌクレオチド配列を示す。 第６図はプロテアーゼ遺伝子のＭ１３＋＋＋ｐ１８への
導入の図式表示を示す。 第７図はプラスミドｐＢＨＡ−１のヌクレオチド配列を
示す。 第８図はバチルス属菌株ＰＢＴＩ １０のプロテアーゼ
遺伝子のプラスミドｐＢＨＡ１への導入を示す。 第９図はＦ１オリ（ｏｒｉ）を含有するｐＢＨＡＩＭＸ
ＬのＢａｍＨ断片の再配向（ｒｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）によるプラスミドｐＢＨＡＲ−ＭＸＬの取得を示す
。 第１０図は高アルカリプロテアーゼの３′配列のプラス
ミドｐＢＨＡＲ−ＭＸＬへのサブクローニングによるプ
ラスミドｐ ＢＨＡＲＢ−ＭＸＬの取得を示す。 第１１図はプラスミドｐＢＨＡＲＢ−ＭＸＬＭ２１６Ｑ
からＥ、コリ配列の欠失によるプラスミドｐＢＨＢ−Ｍ
ＸＬ Ｍ２１６Ｑの取得を示す。 第１２図はプラスミドｐＥ１９４ｎｅｏ −１中のネオ
マイシン耐性の再配向によるプラスミドｐＥ１９４ｎｅ
ｏ−３の取得を示す。 第１３図は温度感受性複製開始点のプラスミドｐＥ１９
４ｎｅｏ−３からプラスミドｐＢＨＢ−ＭＸＬＭ２１６
Ｑへの導入によるプラスミドＩ）ＥＮ３Ｑの取得を示す
。 第１４図はバチルス属菌株ＰＥＰ １ を図式的に示す。 第１５図はバチルス属菌株ＰＥＰ２ を図式的に示す。 １の構築 １の構築 区− トＣ 峡力 区へ 区− ｅつ トＣ 区へ 区− ば） トＣ 派忠 図− ｑコ トＣ 派工 区へ 第９図 １、事件の表示 平成２年特許願第２ １３５６２号 ２、発明の名称 突然変異プロテアーゼの効率的生産 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人 ５、補正命令の日付 平成２年１１月２７日 ６、補正の対象 明細書、全図面 ７、補正の内容
アルカリプロテアーゼ遺伝子の５′及び３′フランキン
グ領域の一部を含有するプラスミドＰＭ５８Δの構築を
示す。 第２図は複製の温度感受性開始点のプラスミドｐＥ１９
４ｎｅｏ−１からプラスミドｐＭ５８Δへの導入による
プラスミドｐＥＭ５８Δの取得を示す。 第３図はバチルス属菌株ＰＢＴＩＩＯのプロテアーゼ遺
伝子の５′フランキング領域へのプラスミドｐＥＭ５８
Δの相同組換えによる導入を示す。 第４図は異常組換え後の欠失プロテアーゼ遺伝子を取り
巻く領域の簡略化した制限地図を示す。 第５図はＰＢＴ１２５ （Ａ）及びＰＢＴ１２６（Ｂ）
のＨｉｎｄ ｍ断片のヌクレオチド配列を示す。 第６図はプロテアーゼ遺伝子のＭ１３＋＋＋ｐ１８への
導入の図式表示を示す。 第７図はプラスミドｐＢＨＡ−１のヌクレオチド配列を
示す。 第８図はバチルス属菌株ＰＢＴＩ １０のプロテアーゼ
遺伝子のプラスミドｐＢＨＡ１への導入を示す。 第９図はＦ１オリ（ｏｒｉ）を含有するｐＢＨＡＩＭＸ
ＬのＢａｍＨ断片の再配向（ｒｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）によるプラスミドｐＢＨＡＲ−ＭＸＬの取得を示す
。 第１０図は高アルカリプロテアーゼの３′配列のプラス
ミドｐＢＨＡＲ−ＭＸＬへのサブクローニングによるプ
ラスミドｐ ＢＨＡＲＢ−ＭＸＬの取得を示す。 第１１図はプラスミドｐＢＨＡＲＢ−ＭＸＬＭ２１６Ｑ
からＥ、コリ配列の欠失によるプラスミドｐＢＨＢ−Ｍ
ＸＬ Ｍ２１６Ｑの取得を示す。 第１２図はプラスミドｐＥ１９４ｎｅｏ −１中のネオ
マイシン耐性の再配向によるプラスミドｐＥ１９４ｎｅ
ｏ−３の取得を示す。 第１３図は温度感受性複製開始点のプラスミドｐＥ１９
４ｎｅｏ−３からプラスミドｐＢＨＢ−ＭＸＬＭ２１６
Ｑへの導入によるプラスミドＩ）ＥＮ３Ｑの取得を示す
。 第１４図はバチルス属菌株ＰＥＰ １ を図式的に示す。 第１５図はバチルス属菌株ＰＥＰ２ を図式的に示す。 １の構築 １の構築 区− トＣ 峡力 区へ 区− ｅつ トＣ 区へ 区− ば） トＣ 派忠 図− ｑコ トＣ 派工 区へ 第９図 １、事件の表示 平成２年特許願第２ １３５６２号 ２、発明の名称 突然変異プロテアーゼの効率的生産 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人 ５、補正命令の日付 平成２年１１月２７日 ６、補正の対象 明細書、全図面 ７、補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）野生型プロテアーゼと少なくとも１つのアミノ酸
が異なるプロテアーゼを生産する方法であって、発現宿
主として野生型プロテアーゼを生産することができない
相同性好アルカリバチルス属菌株を使用することを特徴
とする方法。 （２）発現宿主としてプロテアーゼ陰性好アルカリバチ
ルス属菌株を用いる請求項１の方法。 （３）発現宿主として野生型プロテアーゼ遺伝子がゲノ
ムから欠失したプロテアーゼ陰性好アルカリバチルス属
菌株を用いる請求項２の方法。 （４）バチルス・ノボ・スピーシーズＰＢ９２のプロテ
アーゼ陰性誘導体を用いる請求項１−３のいずれか１つ
の方法。 （５）アスポロジーナスな好アルカリバチルス属菌株を
用いる請求項１−４のいずれか１つの方法。 （６）相同組換えもしくは異常組換えによって野生型プ
ロテアーゼ遺伝子が欠失したアスポロジーナスなバチル
ス属細菌を用いる請求項１−５のいずれか１つの方法。 （７）突然変異高アルカリプロテアーゼがプラスミドに
コード化されている請求項１−６のいずれか１つの方法
。 （８）野生型高アルカリプロテアーゼがバチルス・ノボ
・スピーシーズＰＢ９２プロテアーゼのアミノ酸配列を
本質的に有する請求項１、２または３の方法。 （９）野生型高アルカリプロテアーゼ遺伝子が染色体か
ら欠失し、突然変異高アルカリプロテアーゼ遺伝子の少
なくとも１つのコピーがゲノムに挿入される請求項１−
６の方法。（１０）野生型高アルカリプロテアーゼ遺伝
子が突然変異高アルカリプロテアーゼ遺伝子の少なくと
も１つのコピーによって置き代えられている請求項１−
６の方法。 （１１）突然変異高アルカリプロテアーゼ遺伝子の少な
くとも１つのコピーがゲノムに挿入され、別のコピーが
プラスミドにコード化されている請求項９または１０の
方法。 （１２）減じられた菌体外高アルカリプロテアーゼレベ
ルを有する好アルカリバチルス属菌株を得る方法であっ
て、 −高アルカリプロテアーゼをコード化する遺伝子をその
５′及び／または３′非コード領域も含めて単離し、 −該遺伝子をクローニングベクターに挿入し、−クロー
ニングベクターから該遺伝子のコード領域を欠失させ、 −バチルス属菌株を該クローニングベクターで形質転換
し、 −形質転換体を該ベクターの複製機能が不活性の条件下
で増殖させ、 −該アルカリプロテアーゼをコード化するＤＮＡ配列を
失った形質転換体を選択する ことを特徴とする方法。 （１３）該好アルカリバチルス属菌株がバチルス・ノボ
・スピーシーズＰＢ９２またはその誘導体である請求項
１２の方法。 （１４）請求項１２によって得られ、突然変異高アルカ
リプロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミド発現ベクタ
ーによって形質転換された好アルカリバチルス属菌株。 （１５）好アルカリバチルス属菌株が相同組換えまたは
異常組換えによって得られた、バチルス・ノボ・スピー
シーズＰＢ９２の誘導体である請求項１４のバチルス属
菌株。 （１６）野生型高アルカリプロテアーゼで汚染されてお
らず、該野生型プロテアーゼと少なくとも１つのアミノ
酸が異なり、突然変異した遺伝子の少なくとも１つのコ
ピーを有し活性プロテアーゼを与える野生型遺伝子のコ
ピーを有さないバチルス属菌株によって生産される高ア
ルカリプロテアーゼ。 （１７）好アルカリバチルス属菌株によって生産される
請求項１６の高アルカリプロテアーゼ。 （１８）突然変異遺伝子がプラスミド上に及び／または
ゲノム中に配置された請求項１６または１７の高アルカ
リプロテアーゼ。 （１９）請求項１６−１８のいずれか１つの高アルカリ
プロテアーゼの１つ以上を活性成分として含有する洗剤
組成物。 （２０）請求項１６−１８のいずれか１つの高アルカリ
プロテアーゼの１つ以上の洗剤組成物における使用。 （２１）請求項１６−１８のいずれか１つの高アルカリ
プロテアーゼ変異体の洗浄プロセスにおける使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89202117 | 1989-08-11 | ||
| EP89202117.1 | 1989-08-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03210177A true JPH03210177A (ja) | 1991-09-13 |
| JP3490435B2 JP3490435B2 (ja) | 2004-01-26 |
Family
ID=8202457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21356290A Expired - Lifetime JP3490435B2 (ja) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | 突然変異プロテアーゼの効率的生産 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040014175A1 (ja) |
| EP (1) | EP0414297B1 (ja) |
| JP (1) | JP3490435B2 (ja) |
| KR (1) | KR0169978B1 (ja) |
| CN (1) | CN1049866A (ja) |
| AT (1) | ATE144283T1 (ja) |
| AU (1) | AU629970B2 (ja) |
| BG (1) | BG60567B1 (ja) |
| BR (1) | BR9003956A (ja) |
| CA (1) | CA2023094C (ja) |
| DD (1) | DD297187A5 (ja) |
| DE (1) | DE69028890T2 (ja) |
| DK (1) | DK0414297T3 (ja) |
| ES (1) | ES2095233T3 (ja) |
| FI (1) | FI110365B (ja) |
| GR (1) | GR3021669T3 (ja) |
| IE (1) | IE77037B1 (ja) |
| PT (1) | PT94961B (ja) |
| RU (1) | RU2060276C1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DK0772684T3 (da) | 1994-06-17 | 2005-12-12 | Genencor Int | Amylolytiske enzymer afledt fra B. Licheniformis alpha-amylasen med forbedrede karakteristika |
| JP4263241B2 (ja) * | 1996-03-27 | 2009-05-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | アルカリプロテアーゼを欠失した糸状真菌 |
| JP3440694B2 (ja) * | 1996-05-16 | 2003-08-25 | ライオン株式会社 | 口腔用組成物 |
| GB0024554D0 (en) | 2000-10-06 | 2000-11-22 | Agrol Ltd | Ethanol production |
| DK1495128T3 (da) * | 2002-03-29 | 2014-08-11 | Genencor Int | Forstærket proteinekspression i Bacillus |
| WO2006088972A2 (en) | 2005-02-16 | 2006-08-24 | The General Hospital Corporation | Use of modulatirs of compounds of tgf-beta superfamily to regulate hepcidin-mediated iron metabolism |
| RU2510821C1 (ru) * | 2012-10-24 | 2014-04-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Штамм бактерий bacillus pumilus мк-10 с низкой протеолитической активностью и его применение |
| RU2511416C1 (ru) * | 2012-10-24 | 2014-04-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАО ВПО КФУ) | Штамм бактерий bacillus pumilus 2a-5 с низкой протеолитической активностью, повышенной активностью фосфатазы, способ его получения и применения |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1234445A (ja) * | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
| JPS6055118B2 (ja) * | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
| NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
| US4828994A (en) * | 1984-09-21 | 1989-05-09 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
| ES2135386T3 (es) * | 1987-02-27 | 1999-11-01 | Genencor Int | Transformacion de cepas de bacillus alcalofilas. |
| WO1988006623A1 (en) * | 1987-02-27 | 1988-09-07 | Gist-Brocades N.V. | Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms |
| CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
-
1990
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