JPH03210193A

JPH03210193A - 加水分解酵素用測定器具

Info

Publication number: JPH03210193A
Application number: JP345690A
Authority: JP
Inventors: Tetsuaki Kawanishi; 徹朗川西; Hiroyuki Asai; 裕之浅井
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1991-09-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（発明の利用分野）本発明は、加水分解酵素用測定器具に関するものである
。詳しく述べると、エステラーゼ、プロテアーゼ等の加
水分解酵素を検出するために用いられる測定器具に関す
るものである。

（従来の技術）尿中に出現する白血球の量は、腎または尿路感染症の診
断の指針となる。さらに、腹膜透析中の白血球のモニタ
リングは、腹膜炎の早期発見の指針となる。これらの白
血球の検出は、従来、鏡検によって行なわれていたが、
この方法は高価な機器を必要とするだけでなく、長い測
定時間および複雑な測定操作を必要とする等の欠点を有
している。

このような問題点を解決するために、白血球中のエステ
ラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を指針とした検
出法が広く行なわれるようになってきた。この方法によ
れば、簡単な操作で、しかも短時間で測定結果が得られ
るという利点がある。

また、酵素活性を指針とするために、崩壊した白血球も
検出可能である。すでに、（Ａ）酵素基質としてフェノ
キシアミノ酸エステルを、また顕色剤としてジアゾニウ
ム塩を含有する蛋白質分解酵素の検出法（特公昭６１−
４５．９８２号）、（Ｂ）インドキシル−アミノ酸エス
テルおよびペプチドエステルを色原体として含有してな
るエステルおよび蛋白質分解酵素の検出法（特公昭５９
−３，４７５号）および（Ｃ）５−フェニルピロールエ
ステルを用いた加水分解対象物の検出法（特公昭６２−
４１，４７５号）が知られている。

しかしながら、これらの方法においても、使用する試薬
が高価である、呈色安定性に欠ける、感度が悪い等の問
題点を有している。

（発明が解決しようとする課題）したがって、本発明の目的は、新規な加水分解酵素用測
定器具を提供することにある。本発明の他の目的は、被
検出物である加水分解酵素に対して特異性が高く、かつ
優れた呈色性を示す基質を用いてなり、特別あるいは高
価な装置を必要とせずに簡単な操作で迅速かつ高感度で
測定するための器具を提出することにある。

（課題を解決するための手段）これらの諸口的は、一般式Ｉ（ただし、式中、Ａはアミノ酸残基またはアミノ酸残基
２〜５個からなるペプチド基、Ｂは窒素保護基、Ｘはハ
ロゲン原子、カルボキシル基、スルホン基またはチオア
ルキル基、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素原子、ハ
ロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、
アシル基、アミド基、ニトロ基およびアルキルチオール
基よりなる群から選ばれたすくなくとも１種のものであ
り、Ｒ１とＲ２およびＲ３とＲ４とはそれぞれ縮合芳香
環を形成していてもよい。）で表わされるフェノキシエ
ステル化合物、顕色剤および酸化剤を吸着性担体に保持
したことを特徴とする溶液中の加水分解酵素用測定器具
により達成される。

本発明はまた、該フェノキシエステル化合物１００当世
当り顕色剤が１００〜２００当量および酸化剤が５００
〜１，５００当量配合されてなる測定器具である。本発
明はさらに、顕色剤が４−アミノアンチピリンまたは３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンである測定器具であ
る。本発明は、酸化剤が一般式■ ＺＹ、、、０、　　　　　　　　　（ＩＩ）（ただし、
式中、Ｚはアルカリ金属、Ｙはハロゲン原子、ｍは１〜
３の整数であり、またｎは１〜６の整数である）で表わ
される塩である測定器具である。本発明はまた、吸着性
担体が濾紙または布帛である測定器具である。本発明は
さらに、界面活性剤または湿潤剤をさらに配合してなる
測定器具である。本発明は被検出物質である加水分解酵
素の反応に適するｐＨを有する緩衝剤を配合してなる測
定器具である。本発明はまた、前記測定器具を支持体に
担持してなる測定器具である。

（作用）本発明によれば、一般式Ｉで表わされるフェノキシエス
テル化合物は、エステラーゼ、プロテアーゼ等の加水分
解酵素、特に好中球−顆粒球中に存在するものに特異性
が高（、次式に示すごとくエステル結合が分解されて一
般式■で表わされる遊離のフェノールを生じる。

この遊離フェノールは、顕色剤と縮合されることによっ
て呈色する色原体としての性質を有している。例えば、
顕色剤として４−アミノアンチピリン、３−メチル−２
−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等のカプラーとを、酸
化剤の存在下に縮合させると呈色化合物が生成する。次
式は、４−アミノアンチピリンと縮合した場合の例であ
る。

ｈ本発明の一般式Ｉで表わされフェノキシエステル化合物
は、エステル結合に対してパラ位にハロゲン原子（好ま
しくは塩素および臭素原子）、カルボキシル基、スルホ
ン基、またはチオアルキル基（アルキル基の炭素原子数
は、好ましくは１〜６）等の脱離基を含むことを特徴と
している。これらの置換基は、酵素分解の後、生成する
遊離のフェノールが前述の顕色剤と縮合する際に、その
反応性を向上させる役割を担っている。その結果、無置
換のフェノールに比較して呈色性能が高まる。

さらに、これらの置換基の電子的効果は、基質のエステ
ル結合の分解速度に影響する。例えば、ハロゲンやチオ
アルキル等の電子供与性置換基を導入することによって
エステル結合の安定性が低下し、酵素による切断速度が
高まる。以上のように、該酵素基質のパラ位の置換は、
加水分解酵素の検出において、その感度向−トに高い効
果を示すことが明らかである。

なお、一般式Ｉにおいて、Ａは、アミノ酸残基またはア
ミノ酸残基２〜５個からなるペプチド基であり、アミノ
酸残基としては、Ｌ−アラニル、Ｌ−β−アラニル、Ｌ
−バリニル、Ｌ−イソロイシニル、Ｌ−リジニル、Ｌ−
フェニルアラニル、Ｌ−メチオニル等がある。Ｂは、窒
素保護基であり、例えばアシル基、オキシカルボニル基
、スルホニル基、ホスホリル基、カルバモイル基、チオ
カルボニル基等がある。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は
、水素原子、ハロゲン原子（好ましくは塩素および臭素
原子）、アルキル基（好ましくは炭素原子数１〜１０、
より好ましくは１〜４）、アリール基、アルコキシ基（
好ましくは炭素原子数１〜１０、より好ましくは１〜４
）、アシル基（好ましくはアルキル部分の炭素原子数が
１〜９、より好ましくは１〜３）、アミド基、ニトロ基
、アルキルチオール基（好ましくはアルキル部分の炭素
原子数が１〜１０、より好ましくは１〜４）等があり、
Ｒ１とＲ２およびＲ３およびＲ４とはそれぞれ縮合芳香
環を形成していてもよい。

本発明で使用される一般式Ｉで表わされるフェノキシエ
ステル化合物の一例を具体的に示すと、例えば、つぎの
とおりである。

（１）１−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニ
ルオキシ）−４−クロロベンゼン、（２）　１−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラ
ニルオキシ）−２，４−ジクロロベンゼン、（３）　１−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ）　−３、４−ジクロロベンゼン、（４）１−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニ
ルオキシ）−３−メトキシ−４−クロロベンゼン、（５
）４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルオ
キシ）−２−クロロトルエン、（６）１−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニル−Ｌ−アラニ
ルオキシ）−３−アセチル−４−クロロベンゼン、（７
）ｌ−＜Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルオ
キシ）−３−ニトロ−４−クロロベンゼン、（８）ｌ−
（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルオキシ）
−４−クロロナフタレン、（９）ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニ
ルオキシ）−４−ブロモベンゼン、（１０）４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ〉安息香酸、（１１）２−メトキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホ
ニル−し−アラニルオキシ）安息香酸、（１２）１−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ）−４−メチルチオベンゼン等。

前記フェノキシエステル化合物が検出目的の酵素によっ
て加水分解を受け、生成する遊離のフェノール化合物が
顕色剤と縮合する際には、酸化剤を必要とする。

本発明で使用される酸化剤は一般式■ ＺＹＩｌ、　０ｎ（ＩＩ）（ただし、式中、Ｚはアルカリ金属、好ましくはナトリ
ウムまたはカリウム、より好ましくはナトリウム、Ｙは
ハロゲン原子、ｍは１〜３の整数であり、またｎは１〜
６の整数である）で表わされる塩である。−例を挙げる
と、例えば、ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸ナトリウ
ム、臭素酸ナトリウム、過臭素酸ナトリウム、亜臭素酸
ナトリウム、塩素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、
ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸カリウム、臭素酸カリウ
ム、過臭素酸カリウム、亜臭素酸カリウム、塩素酸カリ
ウム等がある。

本発明による試験器具において、前記フェノキシエステ
ル化合物１００当量に対する顕色剤の配合量は１００〜
２００当量、好ましくは１００〜１５０当量であり、ま
た酸化剤の配合量は５００〜１，５００当量である。

該フェノキシエステル化合物、顕色剤、酸化剤および必
要によりその他の反応助剤の溶液を、担体に含浸させた
のち、乾燥させることによって測定器具が得られる。

担体としては、濾紙、布帛（例えば織布、編布、不織布
等）等がある。

また、前記溶液には、必要により界面活性剤または湿潤
剤が配向される。界面活性剤ないし湿潤剤としては、ト
リトンＸ−１００、ラウリル硫酸ナトリウム、スパン、
トゥイーン、ポリエチレングリコール、高級アルコール
類、エーテルアルコール類等が挙げられ、好ましくは炭
素原子数８〜１２の直鎖アルコール、炭素原子数８〜１
５のエーテル結合を含む直鎖のアルコールが用いられる
。

また、前記溶液には、検出目的の加水分解酵素の反応に
適するｐＨを有する緩衝剤が必要により配合される。こ
のような緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸
緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液等がある。

前記試験器具は、支持体に担持させることにより把手の
ついた試験器具が得られる。このよう支持体としては、
プラスチックス、金属、木材等の板状物があり、接着剤
等を介して固着される。

被測定試料は、前記測定器具の上に滴下するか、あるい
は該測定器具を被測定試料液中に浸漬したのち、色調変
化を目視ないしは分光光度計にて反射吸光度をｍす定す
ることにより読み取る。

（実施例）つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
。

合成例１ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニルオキ
シ）−４−クロロベンゼンの合成ｐ−クロロフェノール１．０　ｇ　（７，７８ｍｍ　ｏ
　１　）、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン
２．１９ｇ　（９，Ｏｓｍｏｌ）　、４−Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノピリジン１２２　ｍｇ（１、Ｏｍｍｏｌをジ
クロロメタン２５ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながらジ
シクロへキシルカルボジイミド１．８６゜（９，Ｏｍｍ
ｏｌ）を加えた。０℃で１時間撹拌後、室温にてさらに
１０時間撹拌を続ける。反応混合物を吸引濾過して生成
した尿素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得
た。これを、酢酸エチル３　／　ｎ−ヘキサン７を溶出
溶媒とするシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供し
、１−（Ｎ−ｐ）ルエンスルホニルーＬ−アラニルオキ
シ）−４−クロロベンゼン２．６６ｇ　（収率９６．７
％）を得た。このものは油状物であった。

合成例２ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルオキ
シ）−２，４−ジクロロベンゼンの合成■、３−ジクロ
ロフェノール１．０　ｇ　（６，１３ｍｍｏｌ）、Ｎ−
ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニン１．７９ｇ　（
７，４６ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリ
ジン１２２　ｍｇ（１、Ｏｍｍｏｌ）を、ジクロロメタ
ン２５ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながらＤ　ＣＣ１，
５２ｇ　（７，３６１１１［１１０１）を加える。

０℃で１時間攪拌後、室温にてさらに１０時間撹拌を続
ける。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去し
た後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を寿だ。これを、酢酸
エチル３／ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲル
フラッシュクロマトグラフに供し、目的物２．２２ｇ　
（収率９３．２％）を得た。このものの融点は１５６℃
であった。

合成例３ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルオキ
シ）−３，４−ジクロロベンゼンの合成１．２−ジクロ
ロフェノールＬ、Ｏｇ　（６，１３ｇｍｏｌ）、Ｎ−ｐ
−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン１．７９ｇ　（７
，４６ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジ
ン１２２　ｍｇ（１，Ｏｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン
２５１に溶解し、０℃で撹拌しながらＤ　ＣＣ１，５２
ｇ　（７，３６ｍｍｏｌ）を加える。

０℃で１時間攪拌後、室温にてさらに１０時間撹拌を続
ける。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去し
た後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸
エチル３／ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲル
フラッシュクロマトグラフに供し、目的物２．１８ｇ　
（収率９１．７％）を得た。このものの融点は１４４℃
であった。

合成例４ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルオキ
シ）−３−メトキシ−４−クロロベンゼンの合成３−メ
トキシフェノール３．０　ｇ　（２４，１７ｍｍｏｌ）
をジクロロメタン２０ｍ１に溶解し０℃で撹拌しながら
塩化スルフリル２．０　ｍｌ　（２４，２ｍｍｏｌ）を
ゆっ（り加える。

そのまま、１．５時間反応後、氷水に投入し、反応混合
物を酢酸エチルで抽出する。有機層を炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、減圧濃縮
し粗生成物を得た。これを、酢酸エチル２／ｎ−へキサ
ン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラッシュクロマトグ
ラフに供し、３−メトキシ−４−クロロフェノール２．
８２ｇ　（収率７３．６％）を得た。

１−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルオキ
シ）−３−メトキシ−４−クロロベンゼン３−メトキシ
−ｐ−クロロフェノール２．８　ｇ（１６，４ｍｍｏｌ
）、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン４．３
７ｇ（１８，Ｏｍｍｏｌ）　　、４−Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノピリジン１８３　ｍｇ（１，５ｍｍｏｌ）をジク
ロロメタン３０ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しなからＤ　
ＣＣ３，７１ｇ　（１８，Ｏｍｍｏｌ）を加える。０℃
で１時間撹拌後、室温にてさらに１０時間撹拌を続ける
。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去した後
、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチ
ル２／ｎ−ヘキサン８を溶出溶媒とするシリカゲルフラ
ッシュクロマトグラフに供し、１−Ｎ−１）−）ルエン
スルホニルーＬ−アラニンオキシ）−３−メトキシ−４
−クロロベンゼン２．０２ｇ　（収率８３，４％）を得
た。このものの融点は１５２°Ｃであった。

合成例５４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルオキ
シ）−２−クロロトルエンの合成２−クロロ−４−ヒドロキシトルエン１．０　ｇ（７，
０１ａ＋ｍｏｌ）、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−
アラニン２．０５ｇ　（８，４２ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、
Ｎ−ジメチルアミノピリジン１２２　ｍｇ（１，Ｏｍｍ
ｏｌ）を、ジクロロメタン２５ｍ１に溶解し、０℃で撹
拌しながらＤ　ＣＣ１，５２ｇ　（７，３６ｍｍｏｌ）
を加えた。０℃で１時間撹拌後、室温にてさらに１０時
間撹拌を続ける。反応混合物を吸引濾過して生成した尿
素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。こ
れを、酢酸エチル３　／　ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒と
するシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供し、目的
物２．４６ｇ　（収率９５．４％）を得た。このものの
融点は１６８℃であった。

合成例６ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルオキ
シ）−３−アセチル−４−クロロベンゼンの合成２−ク
ロロ−５−ヒドロキシアセトフェノン１．０　ｇ（５，
８６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−ア
ラニン１．７１ｇ　（７，０４１１１ｍｏｌ）、４−Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミノピリジン１２２　ｍｇ（１，０ｍ
ｍｏｌ）を、ジクロロメタン２５ｍ１に溶解し、０℃で
撹拌しながらＤ　ＣＣ１，４５ｇ　（７，０４ｍｍｏｌ
）を加えた。０℃で１時間撹拌後、室温にてさらに１０
時間撹拌を続ける。反応混合物を吸引濾過して生成した
尿素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。

これを、酢酸エチル３　／　ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒
とするシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供し、目
的物２．０７ｇ　（収率８９．１％）を得た。このもの
の融点は１９３℃であった。

合成例７ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニルオキ
シ）−３−二トロー４−クロロベンゼンの合成３−ニト
ロ−４−クロロフェノール１．０　ｇ　（５，７６ｍｍ
。

１）、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン１．
６８ｇ（６，９１ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ミノピリジン１２２ｍｇ（１，０ｍｍｏｌ）を、ジクロ
ロメタン２５ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながらＤ　Ｃ
Ｃ１，４３ｇ　（６，９１ｍｍｏｌ）を加えた。０°Ｃ
で１時間撹拌後、室温にてさらに２０時間撹拌を続ける
。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去した後
、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸エチ
ル３／ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲルフラ
ッシュクロマトグラフに供し、目的物２．１１ｇ　（収
率９１．８％）を得た。このものの融点は２０６℃であ
った。

合成例８ｌ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニンオキ
シ）−４−クロロナフタレン４−クロロナフタレン１．０　ｇ　（６，１５ｍｍｏｌ
）　、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン１．
６１ｇ　（６，６０ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノピリジン１２２　ｍｇ（１，０ｍｍｏｌ）をジク
ロロメタン３０ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながらＤ　
ＣＣ１，３６ｇ　（６，６０ｍｍｏｌ）を加える。

０℃で１時間撹拌後、室温にてさらに１４時間撹拌を続
ける。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去し
た後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸
エチル３／ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカゲル
フラッシュクロマトグラフに供し、１−（Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−し−アラニンオキシ）−４−クロロナ
フタレン２．１６ｇ　（収率９０．６％）を得た。この
ものの融点は１８１℃であった。

合成例９ｌ−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルオキ
シ）−４−ブロモベンゼンの合成４−ブロモフェノール１．０　ｇ　（５，７８ｍｍｏｌ
）　、Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニン１．
８９ｇ　（８，９４ＩＩＩ層ｏｆ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノピリジン１２２　ｍｇ（１，０麿ｍｏｌ）を
ジクロロメタン２５ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながら
Ｄ　ＣＣ１，４３ｇ’（６，９４＋ｎｍｏｌ）を加えた
。

０℃で１時間撹拌後、室温にてさらに１０時間撹拌を続
ける。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去し
た後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸
エチル３　／　ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカ
ゲルフラッシュクロマトグラフに供し、目的物２．２０
ｇ　（収率９５．４％）を得た。

このものは油状物であった。

合成例１０４−ヒドロキシ安息香酸オキサゾリン保護体の合成４−ヒドロキシ安息香酸２．Ｏｇ　（１４，５ｍｌｌ１
ｏｌ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール５
．０　ｇ　（５６，ｌｌｌ１ｍ。

１）を、トルエン２０１と１．４−ジオキサン２０１１
の混合溶媒中で６時間加熱還流した。反応系に生成する
水を吸着する為のモレキュラシーブを適量添加して反応
を行った。反応混合物は濾過によってモレキュラシーブ
を除去した後、減圧乾固を行い、粗生成物２．３ｇを得
た（収率８３．０％）。

４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニルオキ
シ）安息香酸オキサゾリン保護体の合成４−ヒドロキシ
安息香酸オキサゾリン保護体１．。

ｒ　（５，２３ｍｍｏｌ）　、Ｎ−ｐ−トルエンスルホ
ニル−し−アラニン１．５３ｇ　（６，６０＋＋＋＋ａ
ｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン１２２　
ｍｇ（１，０膳■ｏｆ）をジクロロメタン２０ｍ１に溶
解し、０℃で撹拌しながらＤ　ＣＣ１，２９ｇ　（６，
２８ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で１時間撹拌後、室温に
てさらに１５時間撹拌を続ける。反応混合物を吸引濾過
して生成した尿素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗生
成物を得た。これを、２Ｎ塩酸３．０ｍｌとエタノール
５．０ｍｌの混合物に溶解し、室温で１５時間反応させ
た。反応混合物に水を添加して酢酸エチルで抽出し、減
圧濃縮後、酢酸エチル４／ｎ−ヘキサン６を溶出溶媒と
するシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供し、目的
物１．２３ｇ　（収率６４．８％）を得た。このものの
融点は２３２℃であった。

合成例１１２−メトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸オキサゾリン保
護体の合成２−メトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸２．Ｏｇ（１１
゜９ｍｍｏｌ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパ
ツール４゜２４ｇ　（４７，６ｍｍｏｌ）を、トルエン
２０ｍ　ｌと１．４−ジオキサン２０ｍ１の混合溶媒中
で６時間加熱還流した。反応系に生成する水を吸着する
為のモレキュラシーブを適量添加して反応を行った。反
応混合物は濾過によってモレキュラシーブを除去した後
、減圧乾固を行い、粗生成物２．０８ｇを得た（収率７
９．０％）。

２−メトキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し
−アラニルオキシ）安息香酸オキサゾリン保護体の合成２−メトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸オキサゾリン保
護体１．０　ｇ　（４，５２ｍｍｏｌ）　、Ｎ−ｐ−）
ルエンスルホニルーＬ−アラニンｌＪ２ｇ　（５，４３
ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン１２
２　ｍｇ（１，０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍ１
に溶解し、０℃で撹拌しながらＤＣＣ１，１２ｇ　（５
，４３ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で１時間撹拌後、室温
にてさらに１５時間撹拌を続ける。反応混合物を吸引濾
過して生成した尿素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗
生成物を得た。これを、２Ｎ塩酸３．０ｍｌとエタノー
ル５．０ａ＋１の混合物に溶解し、室温で１５時間反応
させた。反応混合物に水を添加して酢酸エチルで抽出し
、減圧濃縮後、酢酸エチル４　／　ｎ−ヘキサン６を溶
出溶媒とするシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供
し、目的物１．２０ｇ　（収率６７．２％）を得た。こ
のものの融点は１９７℃であった。

合成例１２１−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルオキ
シ）−４−メチルチオベンゼンの合成４−メチルチオフェノール１．０　ｇ　（７，１３ｍｍ
ｏｌ）、Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニン２
．０８ｇ　（８，５８ｍｍｏｌ）、４−Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルアミノピリジン１２２　＋ｎｇ（１，０ｍｍｏｌ）を
ジクロロメタン２５ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながら
Ｄ　ＣＣ１，７６Ｋ　（８−５６ｍｍｏｌ）を加えた。

０℃で１時間撹拌後、室温にてさらに１０時間撹拌を続
ける。反応混合物を吸引濾過して生成した尿素を除去し
た後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。これを、酢酸
エチル３　／　ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒とするシリカ
ゲルフラッシュクロマトグラフに供し、目的物２．３１
ｇ　（収率８８．６％）を得た。

このものの融点は１６９℃であった。

実施例１〜１２濾紙（アトバンチツクＮｏ、　１６５０）を、１００ｍ
Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム、２００ｍＭボラツクスー塩酸
緩衝液（ｐＨ＝８．０）を含有する水溶液に含浸し、６
０℃で５０分通風乾燥した。さらにこの濾紙を、１０ｍ
Ｍの第１表に示すフェノキシエステル化合物、１０ｍＭ
４−アミノアンチピリンおよび２％エチレングリコール
モノヘキシルエーテルを含有するクロロホルム溶液に含
浸し、４０℃で２０分通風乾燥した。これを５％５ｍｍ
角に切断し、２００個／μｍ顆粒球画分ＰＢＳ懸濁液を
滴下し、１．５分後の呈色変化を試験紙表面の５００ｎ
ｍの反射吸光度を測定することにより観察した。測定は
大塚電子株式会社製のＭＣＰＤ−２００を用いて測定し
た。

５（５１表（発明の効果）以上述べたように、本発明による加水分解酵素測定器具
は、一般式Ｉで表わされるフェノキシエステル化合物、
顕色剤および酸化剤を吸着性担体に保持してなるもので
あるから、被検出物である加水分酵素に対して特異性が
高いため、良好な呈色性を示し、しかもなんら高価な装
置を必要とせずに、極めて簡単な操作で迅速に、しかも
高感度で測定できるという利点がある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（ただし、式中、Ａはアミノ酸残基またはアミノ酸残基
２〜５個からなるペプチド基、Ｂは窒素保護基、Ｘはハ
ロゲン原子、カルボキシル基、スルホン基またはチオア
ルキル基、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３およびＲ＾４は水素
原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコ
キシ基、アシル基、アミド基、ニトロ基およびアルキル
チオール基よりなる群から選ばれたすくなくとも１種の
ものであり、Ｒ＾１とＲ＾２およびＲ＾３とＲ＾４とは
それぞれ縮合芳香環を形成していてもよい。）で表わさ
れるフェノキシエステル化合物、顕色剤および酸化剤を
吸着性担体に保持したことを特徴とする溶液中の加水分
解酵素用測定器具。
（２）該フェノキシエステル化合物１００当量当り顕色
剤が１００〜２０当量および酸化剤が５００〜１，５０
０当量配合されてなる請求項１に記載の測定器具。
（３）顕色剤が４−アミノアンチピリンまたは３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾリノンである請求項１に記載の測
定器具。
（４）酸化剤が一般式II ＺＹ＿ｍＯ＿ｎ（II）（ただし、式中、Ｚはアルカリ金属、Ｙはハロゲン原子
、ｍは１〜３の整数であり、またｎは１〜６の整数であ
る）で表わされる塩である請求項１に記載の測定器具。
（５）吸着性担体が濾紙または布帛である請求項１〜４
のいずれか一つに記載の測定器具。
（６）界面活性剤または湿潤剤をさらに配合してなる請
求項１〜５のいずれか一つに記載の測定器具。
（７）被検出物質である加水分解酵素の反応に適するｐ
Ｈを有する緩衝剤を配合してなる請求項１〜６のいずれ
か一つに記載の測定器具。
（８）請求項１〜７いずれか一つに記載の測定の器具を
支持体に担持してなる溶液中の加水分解酵素用測定器具
。