JPH0784447B2 - ジヒドロレソルフイン化合物、その製造方法および該化合物を含有するヒドロラーゼ測定試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒドロラーゼの発色性および／または発螢光
性基質として適当なジヒドロレソルフイン化合物、その
製造方法および相応のヒドロラーゼ測定用試薬に関す
る。

従来の技術 ヒドロラーゼとは、一般に、水の消費下に結合を加水分
解的に分解する酵素のことである。臨床化学および診断
法においては近年就中、エステルおよびエーテル結合を
分解するようなヒドロラーゼの活性測定が重要になつて
きた。

例えば次のものを挙げることができる：エステラーゼ、
例えば白血球中に出現するカルボキシルエステルを分解
する酵素またはホスフアターゼ、例えば燐酸エステルを
加水分解するアルカリ性または酸性ホスフアターゼ。グ
リコシダーゼ、例えばガラクトシダーゼ、グルコシダー
ゼ、マノシダーゼまたはアミラーゼはグリコシド結合を
分解する。

ヒドロラーゼの活性を測定するためには、酵素を含む試
料に適当な基質を加える。基質は酵素によつて分解さ
れ、分解生成物の一つが適当な方法で検出される。基質
としては被検出酵素の天然基質が適当であることが多
い。しかし特に有利には、分解生成物の一つが可視また
は紫外域で分光学的にまたは螢光測光的に検出されうる
基である発色性または発螢光性化合物を使用する。

従来公知のヒドロラーゼ基質は、発色団として例えばフ
エノール、ナフトールまたはそれらの誘導体を有する。
このようは発色団は可視波長域では光を全然吸収しない
かまたは弱くしか吸収しない。発色団は短波長域で紫外
分光測光的に測定可能である。測定すべき酵素を含有す
る酵素は大抵、他の含有物質によつて条件づけられて、
これらの波長域で著しい特有な吸光量を有するので、測
定が著しく妨害される可能性がある。このような妨害を
回避するために、ヒドロラーゼの作用によつて先づ生成
する分解生成物、つまりフエノールまたはナフトール
を、例えばアミノアンチピリンと酸化的に結合させるか
または種々のジアゾニウム塩と反応させてアゾ色素を形
成させ、次にこうして生じる色素を測定することができ
る。

発螢光性基質による酵素活性の測定は、広く普及してい
る、それというのも螢光測光による測定の感度が測光的
方法と比べてしばしば数10乗増大されるからである。多
くの場合、例えば細胞鑑別用自動装置を用いる細胞酵素
活性の検査（細胞螢光測光）および連続微量測光（Durc
hflussmikrofluorometrie）法による固定酵素の分析の
場合には、発螢光性基質を用いて作業しなければならな
い。他の場合、例えば試験系の酵素標識の測定（酵素免
疫検定）の場合には、発螢光性基質を用いることによる
酵素触媒の増倍効果が著しく強化される。

ヒドロラーゼの従来公知の発螢光性基質は、螢光団とし
て、例えばフルオレセイン、インドキシル、メチルウン
ベリフエロンまたはこれらの化合物の誘導体を有する。
しかし複雑な系の反応速度的分析の場合にはこれらの化
合物は重大な欠点を有する。すなわちヒドロラーゼ基質
として使用したフルオレセイン誘導体はすでにもうそれ
自体で螢光を発する。インドキシル誘導体は、それらの
酵素分解により、同様に反応速度的分析を複雑にする多
数の化学的変化を受けやすい。メチルウンベリフエロン
の誘導体は紫外線で励起されなければならない。この場
合には生物学的または合成的物質の固有螢光が妨害とな
る可能性がある。さらに紫外線励起は、特にレーザー光
学の場合にはコスト高である。大抵の発螢光性基質は、
小さい溶解度のみを有する反応生成物を生じるので、こ
れらの基質は反応速度的酵素活性の分析（このためには
基質および生成物のほかならぬ良好な溶解度が必要であ
る）の場合には適当ではない。

特異的グリコシダーゼ基質としては、西独国特許出願公
開第3411574号からレソルフイングリコシドが公知にな
つた。このようなグリコシドは水溶液中で大抵黄色に着
色している。酵素反応後には生成物は赤色を有する。

ヒドロラーゼを検出するための公知の発色または発螢光
性基質は多種多様ではあるけれども、広範囲に、つまり
極めて種々のヒドロラーゼの検出のために使用でき、高
い感受性を有しかつ種々の方法、例えば紫外線測光法、
可視的測定および螢光測光法にとつて好適な化合物は依
然としてなお追求されている。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、前記諸要求を満足させる適当なヒドロ
ラーゼ基質を提供することであつた。

問題点を解決するための手段 前記課題は、ヒドロラーゼによつて酸部分またはヒドロ
キシ部分および少なくとも１個の遊離OH基を有するジヒ
ドロレソルフイン誘導体に分解される本発明による新規
化合物によつて解決される。前記化合物は、容易に酸化
されて、可視域に良好に測定可能の吸光量を有しかつ励
起されて螢光を発することのできるレソルフイン化合物
を形成しうる、水に易溶の化合物である。

本発明の対象は、一般式I: 〔式中Ｚは有機または無機酸基または糖基を表わし、Ａ
は有機または無機酸基を表わし、Ｂは有機酸基を表わ
し、R²およびR⁵は同じかまたは異つていてもよく、水
素、ハロゲンまたはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、R¹，
R³，R⁴およびR⁶は同じかまたは異なっていてもよく、水
素、ハロゲン、シアノ基、C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
−アルコキシ基、カルボキシ基、C₁〜C₅−アルコキシカ
ルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
−アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−アルキル基、場合に
より１または２回置換されたカルボキシアミド基または
基： −COO−（CH₂CH₂O）ｎ−R⁷ （基中R⁷は水素またはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、ｎ
は１〜４の整数を表わす）を表わし、R⁶はさらにスルホ
基またはニトロ基も表わすことができ、この際ａ）A,B
およびＺが同時にアシル基でないか、またはｂ）ＡがＺ
と同じでなく、ＡがＢと同じであるか；またはＡがＺと
同じであって、ＡがＢと同じでないか；またはＡ、Ｂお
よびすべて同じでない］でで示される無色水溶性化合物
である。

ＡおよびＺの定義における無機酸基とは、就中、エステ
ル結合を介してジヒドロレソルフイン基本骨核に結合さ
れているオルト−またはピロ燐酸基または硫酸基のこと
である。前記基は好ましくはPO₃MM′およびSO₃M、特にP
O₃MM′であり、この際遊離酸の場合にはＭおよびＭ′は
水素を表わすが、酸が塩として存在する場合には、Ｍお
よびＭ′はアルカリイオン、アルカリ土類イオンまたは
アンモニウムイオンを表わす。

ＭおよびＭ′の定義におけるアルカリイオンとは、就中
リチウムイオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオ
ンを意味する。アルカリ土類イオンは就中マグネシウム
イオン、カルシウムイオンまたはバリウムイオンであ
る。

ＭおよびＭ′の定義におけるアンモニウムイオンは、未
置換アンモニウムイオンまたは低級アルキル基またはア
リール低級アルキル基によつて１回以上置換されたアン
モニウムイオンである。ここで低級アルキル基とは、炭
素原子１〜５個から成る基のことである。好ましくはメ
チル基エチル基である。アリール低級アルキル基は就中
ベンジル基である。置換されたアンモニウムの置換基は
同じでも、異なつていてもよい。

Ｚの定義における有機酸基とは、就中、そのカルボキシ
ル末端をもつてエステルとしてジヒドロレソルフイン核
に結合されているアルカンカルボン酸−、アミノ酸−ま
たはオリゴペプチド基の謂である。

Ｚの定義におけるアルカンカルボン酸は、炭素原子１〜
20個を有する化合物である。特に、酢酸、プロピオン
酸、酪酸、パルミチン酸およびステアリン酸が好まし
い。またＺは、飽和酸基の他に不飽和酸基、例えばオレ
イン酸基、リノール酸基またはリノール酸基であつても
よい。

アミノ酸基としては、好ましくはＬまたはＤ形のまたは
ラセミ形の天然α−アミノ酸の基が該当する。特に好ま
しくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、フエニルアラニンおよびチロシンの基であり、
この場合それぞれＬ形が極めて好ましい。場合により存
在する遊離ヒドロキシ基はアシル化、好ましくはアセチ
ル化されていてもよい。

オリゴペプチド基とは、例えばジ−、トリ−、テトラ−
およびペンタペプチド、好ましくはジ−およびトリペプ
チドを意味し、アミノ酸成分としては好ましくは前記ア
ミノ酸を使用する。

ジヒドロレソルフイン核にエステル様に結合されたアミ
ノ酸またはオリゴペプチド基のアミノ基は遊離であるか
または保護されていてもよい。ここで保護基とは費用の
すべての保護基であつて、特にアシル基、オキシカルボ
ニル基、チオカルボニル基、スルホ基、スルフイノ基、
ビニル基、シクロヘキセニル基、ホスホリル基またはカ
ルバモイル基である。特に好ましいアミノ保護基は、ト
シル基、ベンジルオキシカルボニル基およびｔ−ブトキ
シカルボニル基である。

Ｂの定義において有機酸基は、就中場合によりヒドロキ
シル基、カルボキシル基および／またはアンモニウム基
によつて１回以上置換された低級アルキルカルボニル基
を表わす。低級アルキルカルボニル基の“低級アルキル
基”は炭素原子１〜７個、好ましくは１〜５個から成る
炭化水素残基である。この残基は飽和または不飽和で、
直鎖または枝分れであつてもよい。

アンモニウム基は基−ＮR₃ ⁺であり、ここでＲは水素、
低級アルキル基またはアリール低級アルキル基であつて
よい。原則として可能なアンモニウム基としては、Ｍお
よびＭ′の定義におけるアンモニウムイオンの場合と同
じものが適用される。低級アルキル基は炭素原子１〜５
個から成る基であり、好ましくはメチルまたはエチルで
ある。好ましいアリール低級アルキル基はベンジル基で
ある。可能なアンモニウム基の置換基Ｒは同じでも、異
つていてもよい。極めて好ましいアンモニウム基は−Ｎ
（CH₃)₃ ⁺である。

Ｂの定義における有機酸基は、アセチル基、オキサリル
基、マロニル基、スクシニル基、グルタリル基またはカ
ルニチル基である。

Ａの定義における有機酸基はＢおよびＺを表わすもので
ある。Ａはアルカンカルボン酸基、アミノ酸基またはオ
リゴペプチド基であるかまたは場合によりヒドロキシル
基、カルボキシル基および／またはアンモニウム基によ
つて１回以上置換されたC₁〜C₇−アルキルカルボニル基
であつてよい。有機酸基ＢまたはＺの個々の定義は、Ａ
の定義における有機酸基の場合にも適用される。Ａが有
機酸基を表わす場合の一般式Ｉの化合物は、ＡがＢと同
じものを表わす場合が極めて好ましい。

Ｚの定義における糖基はモノまたはオリゴサツカリドで
あつてよい。糖基はジヒドロレソルフイン基本骨格にα
−またはβ−グリコシド様に結合されていてもよい。好
ましくはモノサツカリドの例はガラクトース、グルコー
スまたはマンノースである。

しかしまた糖基としてはオリゴサツカリドが適当であ
る。オリゴサツカリドとは特に、モノサツカリド単位２
〜10個、好ましくは２〜７個から構成されたものを云
う。特に好ましくはヘプタオースである。

基R¹〜R⁷の定義においてハロゲンとはフツ素、塩素、臭
素および沃素、好ましくは塩素および臭素の意である。

R¹〜R⁷の定義における“C₁〜C₅−アルキル基”は好まし
くは１〜３個を有し、メチル基が極めて好ましい。

R¹、R³、R⁴およびR⁶の定義における“C₁〜C₅−アルコキ
シ基”は好ましくは１〜３個を有し、特にメトキシ基が
好ましい。

同様に置換基R¹、R³、R⁴およびR⁶の定義におけるC₁〜C₅
−アルコキシカルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アル
キル基およびC₁〜C₅−アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−
アルキル基の“C₁〜C₅−アルコキシ基”および“C₁〜C₅
−アルキル基”も炭素原子１〜５個、好ましくは１〜３
個を有していて、特にメトキシ基およびメチル基が好ま
しい。

カルボキシアミド基の置換基としては、アルキル基、ア
ルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基およびアル
コキシカルボニルアルキル基が適当であり、アルキル基
またはアルコキシ基は炭素原子１〜５個、好ましくは１
〜３個を有する。２回置換されたカルボキシアミド官能
基の場合には、２個の置換基が閉環して、ヘテロ原子、
例えば酸素、窒素および硫黄によつて中断されていても
よい環を形成していてもよい。この意味では、特にカル
ボキシアミド基のアミン部分としてモルホリン基が好ま
しい。

一般式Ｉの好ましい化合物は、ＺがPO₃MM′、SO₃M、カ
ルボキシルの結合されたアルカンカルボン酸−、アミノ
酸−またはオリゴペプチド基、糖基を表わし;AがPO₃M
M′、SO₃M、場合によりカルボキシル基、ヒドロキシル
基および／またはアンモニウム基によつて１回以上置換
されているC₁〜C₅−アルキルカルボニル基またはカルボ
キシルの結合されたアミノ酸−またはオリゴペプチド基
を表わし;MおよびＭ′は水素、アルカリ−、アルカリ土
類−および／またはアンモニウムイオンを表し;Bは場合
によりカルボキシル基、ヒドロキシル基および／または
アンモニウム基によつて１回以上置換されたC₁〜C₇−ア
ルキルカルボニル基を表わし、；R¹〜R⁷が前記のものを
表わすような化合物である。

一般式Ｉの化合物は新規である。該化合物は自体公知の
方法により、互変異性一般式IIaおよびIIb: 〔式中R¹〜R⁶は一般式Ｉの化合物に関して記載したもの
を表わし、Ｙは窒素または基Ｎ−＞０を表わす〕で示さ
れるレソルフインから製造することができる。

ａ） ＡがＺと同じでなく、ＡがＢと同じであるか、 ｂ） ＡがＺと同じであり、ＡがＢと同じないかまたは ｃ） Ａ、ＢおよびＺがすべて同じでないか どうかにより３つの別方が区別されうる。

ＡがＺと同じでなく、ＡがＢと同じである場合の一般式
Ｉの化合物を合成するためには、互変異性の一般式IIa
およびIIbで示される化合物を、一般式III: Ｘ−Ｚ （III） 〔式中Ｚは一般式Ｉで記載したものを表わし、Ｘは反応
性基を表わす〕で示される化合物と反応させて、互変異
性一般式IVaおよびIVb: 〔式中R¹〜R⁶、ＹおよびＺは前記のものを表わす〕で示
されるレソルフイン誘導体を形成させ、還元し、一般式
V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） 〔式中Ｂは一般式Ｉの化合物に関して記載したものを表
わし、Ｘは反応性基を表わす〕で示される化合物でアシ
ル化する。

一般式IIaおよびIIbのレソルフインは、ヨーロツパ特許
出願第0156347号の対象である。

一般式IIIのアシル化試薬の場合、Ｚは一般式Ｉの化合
物に関して記載したものを表わす。これは好ましくは、
オルト燐酸または硫酸基からの無機酸基、アルカンカル
ボン酸基、アミノ酸基またはオリゴペプチド基または糖
基である。この場合アミノ酸基、オリゴペプチド基また
は糖基の遊離アミノ基またはヒドロキシ基は、場合によ
り相応の常用保護基によつて保護されていてもよく、こ
れらの保護基は後で最後のアシル化段階の後適当な条件
下でＸ−Ａによつて再び脱離されうる。

Ｘは、一般式IIaおよびIIbのレソルフインのフエノール
のOH基と反応することのできる反応性基である。反応性
基Ｘの選択は基Ｚの性質に依存している。Ｚが糖基であ
る場合には、Ｘは好ましくはアセチル基またはハロゲン
原子である。ハロゲン原子はフツ素、塩素、臭素および
沃素の群から選択することができ、好ましくは塩素、臭
素および沃素である。

Ｚが糖基を表わす一般式IVaおよびIVbのレソルフイング
リコシドの合成は、ヨーロツパ特許出願公開第0156347
号により行うことができる。

Ｚがアミノ酸基またはペプチド基（その末端カルボキシ
ルで一般式IIaおよびIIbのレソルフインとエステル化さ
れるべきである）を表わす場合には、反応性基Ｘとして
はペプチド化学で慣用の基が該当する。反応性誘導体と
しては、例えば酸ハロゲン化物、好ましくは酸クロリド
およびペプチド合成時に通常使用される混合無水物また
は活性エステルを使用する。また、同一反応性基は、レ
ソルフイン骨格に対するアルカンカルボン酸の結合に関
しても使用することができる。

Ｚが無機酸基を表わす場合には、一般式IIaおよびIIbの
レソルフインを、好ましくは相応の酸ハロゲン化物、特
に酸クロリドと反応させる。

Ｚが基PO₃MM′を表わす一般式IVaおよびIVbの化合物の
合成の場合には、西独国特許出願公開第3534927号に記
載された方法により合成を行うことができる。

一般式IVaおよびIVbのレソルフイン誘導体の還元は、水
添分解的に、例えば炭素上のパラジウムを介してまたは
強還元剤、例えば亜鉛粉、塩化錫（II）または酢酸クロ
ム（II）を用いて、あるいは電気化学的に行われる。還
元のためには、レソルフイン誘導体を水素雰囲気下でま
たは適当な溶剤中の強還元剤、好ましくは塩化錫（II）
の２〜10当量、好ましくは２〜６当量を用いて10分〜１
時間加熱する。

次に、引続くアシル化は、一般式V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） 〔式中Ｂは一般式Ｉの化合物に関して記載したものを表
わし、Ｘは反応性基を表わす〕で示されるアシル化剤を
用いて常法で行われる。

アシル化剤としては、就中酸ハロゲン化物、−無水物ま
たは−エステルが適当である。特に酸ハロゲン化物が好
ましい。ハロゲン原子は好ましくは塩素、臭素および沃
素の群から選択する。特に塩素および臭素が好ましい。

一般式Ｉの化合物は、好ましくは単一ポツト法（Eintop
f-Verfahren）で一般式IVaおよびIVbのレソルシン誘導
体の還元的アシル化によつて製造する。このために相応
のレソルシン誘導体を、適当な溶剤中のアシル化剤（Ｘ
−Ｂ）の存在で還元剤の２〜６当量と一緒に５分〜３時
間還流加熱するかまたは室温で４〜16時間攪拌する。

適当な溶剤は、双極性の非プロトン性液体またはアシル
化剤に相当する酸である。アセチル化の場合には例えば
溶剤として氷酢酸を使用する。

ＡがＺと同じであり、ＡがＢと同じでない場合の一般式
Ｉの化合物を製造するためには、互変異性の一般式IIa
およびIIb（式中R¹〜R⁶およびＹは前記のものを表わ
す）の化合物を還元し、一般式V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） 〔式中Ｂは一般式Ｉで記載したものを表わし、Ｘは反応
性基を表わす〕で示される化合物でアシル化し、次にエ
ステル化合物を選択的に加水分解し、次に一般式VI: Ｘ−Ａ （VI） 〔式中ＡおよびＸを前記のものを表わす〕で示される化
合物と反応させる。

一般式IIaおよびIIbのレソルフイン誘導体の還元は、一
般式IVaおよびIVbのレソルフイン誘導体の還元に関して
既述したのと同様に行うことができる。

一般式Ｖの化合物によるアシル化は常法で行う。好まし
いアシル化剤は酸ハロゲン化物、酸無水物またはエステ
ルである。特に酸ハロゲン化物および酸無水物を使用す
る。特に炭素原子１〜５個を有する低級アルカンカルボ
ン酸の酸クロリドが好ましい。極めて好ましいのはアセ
チルクロリドである。

好ましい方法の場合には、互変異性一般式IIaおよびIIb
の化合物を単一ポツト法（Eintopf-Verfahren）で還元
的にアシル化する。このために相応のレソルフイン誘導
体を水素雰囲気下で、例えば炭素上のパラジウムを介す
るかまたは強還元剤２〜６当量を用いて、適当な溶剤中
のアシル化剤の存在で５分〜３時間還流加熱するかまた
は室温で４〜16時間攪拌する。

過アシル化ジヒドロレソルフイン誘導体の製造後に、２
個のＯ−アシル基を選択的に脱離しなければならない。
レソルフインエステル化合物の選択的分解は、水と水溶
性溶剤、例えば1,4−ジオキサン、メタノールまたはエ
タノールとの混合物、好ましくは水/1,4−ジオキサン
（1:1）中の亜硫酸ナトリウム２〜10mol、好ましくは２
〜4molとの反応によつて達成される。反応温度は20〜10
0℃、好ましくは80〜100℃である。これらの条件下でＮ
−アシル−ジヒドロレソルフインを高収率で製造するこ
とができる。

このようにして製造されたＮ−アシル−ジヒドロレソル
フインを、次に一般式VI（Ｘ−Ａ）の化合物を反応させ
ることができる。この反応は、原則として別法ａ）に関
して既述したのと同一の条件下で行う。

別法ｂ）によれば、特に好ましくは、ＡおよびＺがPO₃M
M′を表わす一般式Ｉの化合物を製造する。このために
前記のようにして製造したＮ−アシル−ジヒドロレソル
フイン誘導体を、５価の燐のハロゲン化物と（好ましく
は無機または有機酸受容体の存在で）反応させ、次に得
られたジハロゲンホスホニルオキシ化合物を加水分解す
る。

５価の燐のハロゲン化物としては、例えば三塩化酸化
燐、五塩化燐または四塩化ピロ燐酸が適当である。好ま
しくは三塩化酸化燐および四塩化ピロ燐酸を使用する。
三塩化酸化燐が極めて好ましい。酸受容体としては、無
機および有機塩基、例えばアルカリ水酸化物、アルカリ
炭酸塩、トリアルキルアミンまたはピリジンが適当であ
る。

溶剤としては、液体として使用される有機酸受容体が適
当である。しかしまた溶剤および希釈剤としては、他
の、特に有機の液体、つまりクロロホルム、ジクロルエ
タン、アセトニトリルまたはテトラヒドロフランを使用
することもできる。

反応は、好ましくは溶剤または希釈剤の存在で−30〜＋
20℃の温度範囲で行う。

中間的に生成されるジクロルホスホニルオキシ化合物の
加水分解は、温度０〜20℃で水性アルカリ水酸化物、ア
ルカリ炭酸塩溶液、アルカリ土類水酸化物溶液、トリエ
チルアミンまたはトリエチルアンモニウム重炭酸塩で中
和することによつて注意深く行う。得られたアルカリ
塩、アルカリ土類塩またはアンモニウム塩を真空濃縮
し、このものから適当なクロマトグラフイー法によつて
所望の二燐酸−ジヒドロレソルフイン誘導体のエステル
が得られる。他の方法は、アルカリ−、アルカリ土類−
またはアンモニウム塩の濃縮水性溶液から二燐酸エステ
ルを沈殿させることである。遊離二燐酸化合物は、例え
ば鉱酸、例えば塩酸で酸性化し、次に沈殿させることに
よつて得ることができる。

Ａ、ＢおよびＺがすべて同じでない場合の一般式Ｉの化
合物を製造するためには、R¹〜R⁶が前記のものを表わ
し、Ｙが基Ｎ−＞０を表わす互変異性の一般式IIaおよ
びIIbの化合物から出発することができる。一般式VII: Ｘ−Ａ′ （VII） 〔式中Ａ′は一般式ＩでＡに関して記載したものまたは
常用のフエノール保護基を表わし、Ｘは反応性基を表わ
す〕で示される化合物との反応後に、OHの置換されたレ
ザズリン誘導体を還元し、一般式V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） 〔式中Ｂは一般式Ｉの化合物に関して記載したものを表
わし、Ｘは反応性基を表わす〕で示される化合物で完全
にアシル化する。次にOBエステル結合を選択的に加水分
解し、一般式III: Ｘ−Ｚ （III） 〔式中Ｚは一般式Ｉの化合物に関して記載したものを表
わし、Ｘは反応性基を表わす〕で示される化合物を反応
させる。Ａ′が一般式ＩでＡに関して記載したものを表
わさない場合には、Ａ′は適当な方法で除去する。次
に、Ａが一般式Ｉで記録したものを表わし、Ｘが反応性
基を表わす一般式VIの化合物と反応させることによつ
て、目的分子を得ることができる。

Ｘ−Ａ′（VII）との反応後に得られるレザズリン誘導
体の還元は、一般式IVaおよびIVbのレソルフイン誘導体
の還元に関してすでに記載した様にして行うことができ
る。しかし、OA′結合がこれに関係しないような方法を
選択することに注意しなければならない。特にこれは、
Ａ′として水添分解的に脱離されうるフエノール保護
基、例えばベンジル基を使用する場合に重要である。

本発明による方法では基Ａ′として、連続反応の最後ま
で変らず、最終的に所望される基Ａに相応するすべての
基Ａを使用することができる。しかしまた、連続反応の
過程でＡによつて置換される常用のフエノール保護基
Ａ′、例えばベンジル基を使用してもよい。

OHの置換されたレザズリン誘導体の還元後に存在するジ
ヒドロレソルフイン化合物とＸ−Ｂ（Ｖ）との反応は、
アミノ基のみが選択的にアシル化されるように行うこと
ができ、その結果次に遊離OH基をＸ−Ｚ（III）と直ち
に反応させることができる。しかし好ましくは、２個の
基、つまりアミノ基ならびに遊離OH基を一反応段階でア
シル化し、次にエステル結合を再び選択的に加水分解す
る。

Ａ、ＢおよびＺがすべて同じでない場合の別法ｃ）によ
り、好ましくは、基Ｚがカルボキシルの結合されたアミ
ノ酸−またはオリゴペプチド基の表わし、これらの基の
アミノ基またはその他の官能基が遊離されていてもよい
し、常用の保護基によつて遮断されていてもよい一般式
Ｉの化合物が製造される。化合物Ｘ−Ｚ（III）の反応
の場合には、全官能基が保護されているようなアミノ酸
基またはオリゴペプチド基が極めて好ましい。Ａ、Ｂお
よびＺがすべて同じでない場合の一般式Ｉの化合物を製
造するために、連続反応の過程で前記保護基を除去する
ことができるが、不必要であることが多い。

一般式IIIの化合物中の反応性基Ｘとしては、この場合
ペプチド化学において慣用の基が該当する。

別法ｃ）により製造された化合物においてＺがアミノ酸
基またはオリゴペプチド基を表わす場合、Ａは、場合に
よりカルボキシル基、ヒドロキシル基および／またはア
ンモニウム基によつて１回以上置換されている低級アル
キルカルボニル基を表わす。極めて好ましくはグルタル
酸基またはコハク酸基である。

このような好ましい化合物の場合、Ｂは低級アルキルカ
ルボニル基であり、特に好ましくはアセチル基である。

一般式ＶおよびVIの化合物の好ましい反応性基Ｘは、通
常カルボン酸の活性化のために使用されるようなもので
ある。特に好ましくは酸ハロゲン化物および酸無水物を
使用する。

Ａ′がフエノール保護基である一般式VIIの化合物にお
いては、反応性基Ｘは、フエノールのOH基と反応するこ
とのできるすべての基であつてよい。特にハロゲン原子
が好ましく、塩素および臭素が極めて好ましい。

一般式Ｉの化合物の合成の際水に易溶で、蛍光を発しな
い無色の化合物が生成する。適当なヒドロラーゼは、こ
のような基質のＺ−Ｏ結合を分解しかつＺがＡと同じで
あるかまたはＺがＡと同じでないかにより、２個の遊離
OH基を有するわずかにＮ−アシル化された遊離のジヒド
ロレソルフインまたは１個の遊離OH基を有するＮ−アシ
ル化ジヒドロレソルフイン誘導体を遊離することができ
る。酵素の加水分解的活性によつて遊離されたこのよう
な化合物は、容易に着色し、蛍光を発するレソルフイン
誘導体を酸化することができる。これによつて同誘導体
は良好に検出されうる。

従つて一般式Ｉの物質をヒドロラーゼの検出および測定
のために使用する。基ＺおよびＡの選択に応じて、本発
明による一般式Ｉの化合物は、原則としてすべての可能
なヒドロラーゼの基質として適当である。特に該化合物
は、エステラーゼおよびグリコシダーゼの基質として有
利であることが判つた。

カルボキシル基を分離するエステラーゼは、好ましく
は、Ｚが炭素原子１〜20個から成るアルキルカルボニル
基またはカルボキシルの結合されたアミノ酸−またはオ
ルゴペプチド基を表わし、ＡおよびＢが、場合によりヒ
ドロキシル基、カルボキシル基および／またはアンモニ
ウム基によつて１回以上置換されている低級アルキルカ
ルボニル基を表わす一般式Ｉの化合物を反応させる。脂
肪酸エステルを分解するヒドラーゼを検出するための適
当な基質は、例えばＺがプロピルカルボニル基を表わ
し、ＡおよびＢがスクシニル基を表わす場合の一般式Ｉ
の化合物である。特にN,3−ジスクシニル−７−ブチリ
ル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチンである。

白血球に出現する、カルボキシエステルを分解する酵素
は、Ｚがアミノ酸基またはオリゴペプチド基、例えばア
ラニンを表わし、ＡおよびＢが場合によりカルボキシル
基、ヒドロキシル基および／またはアンモニウム基によ
つて１回以上置換された低級アルキルカルボニル基、例
えばアセチル基、カルニチル基、スクシニル基またはグ
ルタリル基を表わす場合の一般式Ｉの化合物を極めて良
好に反応させる。特に、N,3−ジスクシニル−７−アラ
ニル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチン、N,3−ジグル
タリル−７−アラニル−3,7−ジヒドロキシフエノキサ
チンおよびＮ−アセチル−３−グルタリル−７−アラニ
ル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチンが好適である。
またアミノ酸基のアミノ基は慣用の保護基によつて誘導
されていてもよい。

酸性およびアルカリ性ホスフアターゼはエステラーゼの
群に分類すべき酵素である。一般式ＩにおいてＺがPO₃M
M′を表わし、ＡおよびＢが、場合によりヒドロキシル
基、カルボキシル基および／またはアンモニウム基によ
つて１回以上置換されている低級アルキルカルボニル基
を表わす化合物は、あらゆる起源のホスフアターゼの基
質として使用することができる。特に、ＡおよびＢがア
セチル基を表わす場合の本発明による化合物が好適であ
る。特にN,3−ジアセチル−ジヒドロレソルフイン−７
−ホスフエートがホスフアターゼの基質として好まし
い。

しかしまたホスフアターゼ基質としては、一般式Ｉにお
いてＡおよびＺが同時に燐酸基を表わす化合物も使用す
ることができる。特に好ましい化合物は、Ｎ−アセチル
−ジヒドロレソルフイン−3,7−ビスホスフエートおよ
びＮ−アセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロレソルフイ
ン−3,7−ビスホスフエートである。

グリコシダーゼ基質は、一般式ＩにおいてＡおよびＢが
同じであり、場合によりヒドロキシル基、カルボキシル
基および／またはアンモニウム基によつて１回以上置換
されている低級アルキルカルボニル基を表わし、Ｚが糖
基を表わす場合の化合物である。糖基としては原則的に
相応のグリコシダーゼによつてジヒドロレソルフイン−
基本骨骼から脱離されうるすべての単糖類またはオリゴ
糖類が該当する。好ましい単糖類はα−またはβ−ブリ
コシド結合を有するグルコース、ガラクトースまたはマ
ンノースである。グルコシダーゼの検出用に適当な基質
は、例えばN,3−ジアセチル−ジヒドロレソルフイン−
７−グルコシド、N,3−ジスクシニル−ジヒドロレソル
フイン−７−グルコシドまたはN,3−ジグルタリル−ジ
ヒドロレソルフイン−７−グルコシドである。好ましい
ガラストシダーゼ基質は例えばN,3−ジアセチル−ジヒ
ドロレソルフイン−７−ガラクトシドである。

酵素的加水分解後に酸化および加水分解によつて生じ
る、N,3−ジアシル−ジヒドロレソルフイン誘導体の生
成物は、紫外線測光および可視検出用の他にまた、就中
螢光測光用にも適している。これは、螢光測光法の感度
が測光法と比べて数10乗も増大される時に重要である。
多くの場合、例えば細胞鑑別用自動装置による細胞の酵
素活性の検査（細胞螢光測光）および連続微量螢光測光
のような固定酵素の分析の場合、螢光性基質を用いて作
業しなければならない。他の場合、例えば試験系の酵素
標識の測定（酵素免疫検定）（例えばしばしばβ−ガラ
クトシダーゼを用いて、また他のヒドロラーゼを用いて
行う）の場合には、酵素的触媒の増倍効果が蛍光性基質
を使用することによつて著しく増強される。

ヒドロラーゼの測定のためには、基質の最大吸収波長と
生じる酸化生成物の最大吸収波長との大きな相違が特に
有利であると判つた。一般式Ｉのすべての化合物は無色
の物質である。これに対して酵素的に加水分解され、酸
化された化合物は赤色乃至青赤色に呈色している。

また一般式Ｉの本発明による化合物の良好な水溶性も特
記することができる。従つて使用した発色体を溶解する
ために、有機溶剤または酵素試験用清浄剤を添加する必
要はない。この利点は、就中基質および生成物の良好な
溶解度が必要であり、溶剤または清浄剤の添加がしばし
ば酵素活性に影響を及ぼす反応速度的酵素試験の場合に
効果を発揮する。

ヒドロラーゼの測定のためには、一般式Ｉの化合物、酸
化剤、適当な緩衝系ならびに場合により他の試薬および
助剤を、測定すべき酵素を含有する試料と混合する。一
般式ＩのＮ−アシル−ジヒドロレソルフイン誘導体は、
相応のヒドロラーゼの存在で反応されて、少なくとも１
個のOH基を有するジヒドロレソルフイン誘導体を生成す
る。このものは存在する酸化剤によつて酸化される。こ
れによつて起こる、反応混合物の吸光量および蛍光強さ
の変化を測光的または蛍光測光的に測定する。標準溶液
との直接的比較または標準曲線との間接的比較によつ
て、試料中の測定すべき酵素の含量を確定することがで
きる。反応速度的測定も終点測定も可能である。

ヒドロラーゼの作用によつて先づ生成する、少なくとも
１個の遊離OH基を有するジヒドロレソルフインの酸化の
ためには、測定すべき酵素の活性に影響を与えず、生成
するジヒドロレソルフインを酸化するために十分強いす
べての酸化剤を用いることができる。このためには、置
換基によりすでに空気酸素で十分な場合がある。一般に
は酸化剤として、カリウムヘキサシアノ鉄酸塩（II
I）、過ホウ酸塩、ビリルビンオキシダーゼまたはペル
オキシダーゼ／過酸化水素を使用する。

ヒドロラーゼ測定用試薬は、一般式Ｉの本発明による基
質の１種以上の他に、酸化剤、適当な緩衝系ならびに場
合により、この様な試薬用に通常使用せれる他の適当な
添加物、例えば他の助酵素、安定剤等を含有している。
本発明による試薬は、溶液の形で、凍結乾燥物として、
粉末混合物、試薬用錠剤としてまたは適当なキヤリヤー
物質が適合されていて存在することができる。

溶液の形の本発明による試薬は、好ましくは試験は必要
なすべての試薬を含有している。溶剤としては、水また
は水と水溶性有機溶剤、例えばメタノール、エタノー
ル、アセトンまたはジメチルホルムアミドとの混合物が
適当である。保存の理由から、試験に必要な試薬を２種
以上の溶液に分け、これらを実際の試験の際に初めて混
合するのが有利であることもある。

それぞれ約５〜20mg、好ましくは10mgの全重量で凍結乾
燥物の形で試薬を製造するためには、試験のために必要
な全試薬の他に、骨格形成剤例えばポリビニルピロリド
ンおよび場合によつては他の充填剤、例えばマンニツ
ト、ソルビツトまたはキシリツトを含有する溶液を乾燥
する。

粉末混合物または試薬用錠剤の形の試薬は、試験の成分
に常用のガーレン式添加物を加え、造粒することによつ
て製造することができる。この種の添加物は例えば糖ア
ルコール、すなわちマンニツト、ソルビツトまたはキシ
リツト、または他の可溶性不活性化合物、すなわちポリ
エチレングリコールまたはポリビニルピロリドンであ
る。粉末混合物または試薬用錠剤は、一般に約30〜200m
g、好ましくは50〜80mgの最終重量を有する。

試験片の形の試薬を製造するためには、吸収性支持率、
好ましくはフイルター紙、セルロースまたは合成繊維フ
リースに、試験片の製造のために常用される必要な試薬
の、易揮発性溶剤、例えば水：メタノール、エタノール
またはアセトン中の溶液を含浸させる。これは一含浸段
階で行うことができる。しかししばしば、数段階で含浸
を行うのが有利であり、この場合にはそれぞれの段階で
試薬成分の一部分を含有する溶液を使用する。すなわち
例えば第１段階で、酸化剤、緩衝剤および他の水溶性添
加物を含有する水性溶液を含浸させ、次に第２段階でヒ
ドラーゼ基質を含有する溶液を含浸させてもよい。完成
試験片はそのまま使用してもよいし、あるいは自体公知
のようにして柄に貼付するかまたは好ましくはプラスチ
ツクと西独国特許第2118455号による細かい目のネツト
との間に封入する。

実施例 以下の例は、本発明の化合物の合成のために経過するこ
とのできる多数の別法のいくつかを示し、新規のヒドロ
ラーゼ基質を相応のヒドロラーゼの活性測定のために使
用する例を記載する。しかしこれらの例は本発明の対象
を限定するものではない。

例１ Ｎ−アセチル−ジヒドロレソルフイン−3,7−ビスホス
フエート−四ナトリウム塩 トリアセチル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチン レザズリン−ナトリウム塩2.51g（10m mol）および塩化
錫（II）4.17g（22m mol）を、無水酢酸6.7ml（72m mo
l）と氷酢酸8mlとより成る混合物中で１時間還流加熱す
ると、徐々に褐色透明溶液が生じた。次に氷浴中で攪拌
下にメタノール約30mlを加えると、自然に結晶化が起つ
た。０℃で20時間後に吸引し、氷冷却したイソプロパノ
ールおよび石油エーテルで洗浄し、塩化カルシウムを介
して真空乾燥する。

収量:2.64g（理論値の77％）、着色針状晶 融点:208℃ Rf値:0.45（珪酸ゲル上での薄層クロマトグラフイー、
クロロホルム／酢酸エステル＝2/1） Ｎ−アセチル−3,7−ジヒドロキシフエノキチサン トリアチル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチン2.39g
（7m mol）および亜硫酸ナトリウム1.9g（15m mol）
を、窒素を吸収させたジオキサン−水混合物（1:1）70m
l中に溶かし、20分還流加熱した。氷浴で冷却し、酢酸
1.14ml（20m mol）で酸性化し、綿を介して少量の不溶
部分を濾別し、濃縮して約20mlにした。すると粘性油状
物が分離された。窒素処理水約150mlを加え、混合物を
放置した。沈殿した結晶を吸引し、氷水で洗浄し、０℃
で塩化カルシウムを介して真空乾燥した。

収量：着色生成物1.5g（理論値の97％） 融点：＞250℃（分解） Rf値:0.19（珪酸ゲル上の薄層クロマトグルフイー、ク
ロロホルム／氷酢酸＝2/1） Ｎ−アセチル−ジヒドロレソルフエン−3,7−ビスホス
フエート−四ナトリウム塩 無水テトラヒドロフラン15ml中の、Ｎ−アセチル−ジヒ
ドロレソルフイン1.29g（5m mol）および三塩化酸化燐
1.62ml（20m mol）の混合物を、０℃で20分以内に無水
ピリジン10ml中に攪拌下に滴加する。氷浴を除き、室温
で引続き２時間攪拌する。次に反応混合物を氷50g上に
注ぎ、３時間後に蒸発濃縮して約20mlとなし、水性苛性
ソーダ液で調整してpH8とし、０℃で一晩中結晶化す
る。吸収し、少量の氷水、イソプロパノールおよび石油
エーテルで洗浄し、一定重量になるまで乾燥する。

収量：無色粉末1.5g（59％） Rf値:0.71（セルロース上の薄層クロマトグラフイー、1
M水性酢酸アンモニウム溶液／エタノール＝5/2） 例２ Ｎ−アセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロレソルフイン
−3,7−ビスホスフエート−四リチウム塩 トリアセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロソルフイン 2,8−ジブロムレソルフイン〔アフアナシーバ（AFANASI
EVA）、GB等、Khim. Geterotsek L.Soedin（1974）、348〜353頁〕7.4g（20m
mol）に、氷酢酸150mlと無水酢酸50mlとの混合物中
で、炭素上パラジウム（10％）0.8gの添加下に理論量の
水素を吸収するまで接触的に水素添加する。酸素を含ま
ない窒素で激して洗浄し、水分排除下に１時間還流加熱
する。熱時に濾過し、真空で蒸発乾固する。

収量：無色結晶3.5g Ｎ−アセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロレソルフイン トリアセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロレソルフイン
3.5g（7m mol）を、ジオキサン30ml中にとり、水30ml中
の亜硫酸ナトリウム0.95g（75m mol）の溶液を加え、還
流下に20分加熱する。真空で蒸発乾固し、氷水約80mlと
一緒に均質化する。沈殿を吸引濾取し、氷水で洗浄し、
乾燥する。

収量：淡灰色粉末2.15g（74％） 融点:189〜190℃ Ｎ−アセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロレソルフイン2
g（4.8mmol）を、無水ピリジン50ml中に溶かし、０℃で
２時間以内に三塩化酸化燐1.77ml（19.3m ml）と無水ピ
リジン30mlとの混合物中に滴加する。室温で加熱し、さ
らに１時間攪拌する。この混合物を氷100g上に注ぎ、2N
水性水酸化リチウム溶液で調節してpH8となし、燐酸リ
チウムに吸引し、真空で濃縮して50mlにする。

セフアデスク（Sephadex）LH201.7l（50％メタノール）
を介してクロマトグラフイーを施し、10mlの部分に分別
する。ホスフアターゼ陽性画分を集め、真空で蒸発乾固
する。残留物をアセトン200mlで浸漬し、吸引し、乾燥
する。

収量:2.57g（95％） Rf値:0.57（セルロース上薄層クロマトグラフイー、（1
M水性酢酸アンモニウム溶液／エタノール＝5/2） 例３ 酸性ホスフアターゼの活性の測定 Ｎ−アセチル−2,8−ジブロム−ジヒドロレソルフイン
−3,7−ビスホスフエート−四リチウム塩を、1m mol/l
の濃度で0.1M酢酸塩緩衝液（pH5.2、カリウムヘキサシ
アノ鉄酸塩（III）0.1m mol/lを含有する）中に溶か
す。

セル中でこの溶液2.00mlに血清0.20mlを含有する酸性ホ
スフアターゼを加える。混合後に30℃で５分間恒温保持
し、次に測定波長578nmで初期吸光度を読取り、吸光度
の読取りを正確に１分、２分および３分後に繰返す。毎
分の吸光度の差（ΔE/min）から平均値をつくり、この
値を酵素活性計算用方程式に入れる 酸性ホスフアターゼの活性は次式により計算される： U/l＝酵素活性（ｌ当りの単位） Ｖ＝全容積（ml） ｖ＝試料容積（ml） ε＝指示物質の吸光係数（1.mmol^-1．cm^-1） ｄ＝セルの層厚（cm） 例４ アルカリ性ホスフアターゼの測定 Ｎ−アセチルジヒドロレソルフイン−3,7−ビスホスフ
エート−四ナトリウム塩を、1m mol/lの濃度でジエタノ
ールアミン0.1M緩衝液（pH9.8、カリウムヘキサシアノ
鉄酸塩（III）0.1m mol/lを含有する）中で溶かす。ア
ルカリ性ホスホターゼを含有する溶液を加えると、無色
から青赤色への色の急変が起こる。

変色の強度は、試料中のアルカリ性ホスホターゼの濃度
に比例する。

アルカリ性ホスフアターゼの既知濃度を有する試料によ
つて較正曲線が得られ、これによつて試料のホスフアタ
ーゼの未知含量を特定することができる。

例５ 7,10−ジアセチル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチン
−３−ホスフエート−リチウム塩 ０−アセチル−レソルフイン レソルフイン21.3g（01mol）、無水酢酸50mlおよび氷酢
酸25mlから成る混合物を、４時間還流加熱する。０℃で
一晩中放置し、生じた結晶スラリをエーテル／石油エー
テル（1:1）と一緒に攪拌し、結晶を吸引する。次に同
結晶を石油エーテルで洗浄し、60℃で塩化カルシウムを
介して真空乾燥する。

収量：橙色結晶生成物18.5g（72.5％） 融点:185〜190℃ N,O−ジアセチル−ジヒドロレソルフイン Ｏ−アセイル−レソルフイン12.8g（50m mol）、無水酢
酸5.7ml（60m mol）およびPd/C0.6gを、氷酢酸120ml中
で６時間水添する。この混合物を水で希釈し、０℃で５
時間放置し、次に結晶を吸引する。結晶生成物をアセト
ンに溶解し、濾過して触媒を除く。この溶液に水を加
え、濃縮し、０℃で20時間放置する。形成された結晶を
吸引濾取し、水で洗浄し、塩化カルシウムを介して50℃
で真空乾燥する。

収量：結晶生成物14.6g（97.5％） 融点:182℃ 7,10−ジアセチル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチン
−３−ホスフエート−リチウム塩 N,O−ジアセチルジヒドロレソルフイン1.5q（5m mol）
オキシ塩化燐1.53g（0.92ml、10m mol）、無水ピリジン
5.6ml（70m mol）および無水ジオキサン20mlからなる混
合物中に入れ、室温で20時間攪拌する。この混合物を氷
50g上に注ぎ、DEAEセフアデスク（Sephadex）（登録商
標）240ml上に施し、0.5N水性塩化リチウム溶液を用い
て分別クロマトグラフイーにかける。一緒にした生成物
画分を濃縮し、各200mlのアセトンを２回加え、均質化
し、その都度デカンテーシヨンし、最後に吸引し、次に
アセトンで洗浄し、塩化カルシウムを介して真空乾燥す
る。生成物を水と一緒にジアイオン（Diaion:登録商
標）1.2l上に施し、イソプロ ノールを加えて溶離す
る。

収量：淡灰色粉末1.42g（74％） 例６ N,O−ジアセチル−ジヒドロソルフイン−Ｄ−ガラクト
ピラノシドN,O−ジアセチル−ジヒドロレソルフイン−
2,3,4,6−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノ
シド 無水ジクロルメタン30ml中の、Ｏ−（2,3,4,6−テトラ
−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）トリク
ロルアセトイミデート〔アンゲバンテ・ヒエミー（Ange
wandte Chemie）92、763（1980）により合成〕6.8g（1
0.0m mol）、N,O−ジアセチルジヒドロレソルフイン1.5
g（5.0m mol）および三弗化ホウ素エーテレート（Bortr
ifluorid etherat）1.7g（12.0m mol）から成る混合物
を、６時間還流攪拌する。20℃に冷却し、反応混合物に
1M炭酸水素ナトリウム溶液で振出を施す。有機相を硫酸
ナトリウムを介して乾燥し、真空で蒸発させる。得られ
た生成物を、珪酸ゲルによるカラムクロマトグラフイー
（フラツシクロマトグラフイー、溶離剤クロロホルム：
石油エーテル＝8:2）によつて精製する。

収量（アノマ−混合物）:1.5g（N,O−ジアセチルジヒド
ロレソルフインに対して36％） Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：酢酸エチル＝9:1）＝0.6
3 MS:m/e＝821 N,O−ジアセチル−ジヒドロレソルフイン−Ｄ−ガラク
トピラノシド ベンジル保護基の脱離のために、N,O−ジアセチル−ジ
ヒドロレソルフイン−2,3,4,6−テトラＯ−ベンジル−
Ｄ−ガラクトピラニドをジクロルメタン70ml中に溶か
し、Pd−モール（Mohr）3gを加えた後標準圧下で水添す
る。約２時間後に反応を終了する。触媒の分離後に反応
溶液を真空で蒸発濃縮し、これによつて得られた粗生成
物を珪酸ゲルによるカラムクロマトグラフイー（フラツ
シクロマトグラフイー、溶離剤クロロホルム：酢酸エチ
ル＝9:1）によつて精製し、溶剤を真空で除去する。

収量:100mg（12％） Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：メタノール＝8:2）＝0.3
3 MS（pos.FAB）:m/e＝462、MS（neg.FAB）:m/e＝460 例７ 7,10−ジスクシニル−3,7−ジヒドロキシフエノキサチ
ン−３−ブチレート レソルフイン−Ｏ−ブチレート レソルフイン2.13g（10m mol）を、無水酪酸8ml（50m m
ol）と無水ジメチルホルムアミド5mlとの混合物中で溶
かし、50℃で水分排除下に20時間攪拌する。次に混合物
を真空で濃縮し、石油エーテルを加えると、結晶化が起
こる。結晶をアセトン／水から再結晶させる。

収量：橙色針状晶3.15（85％） 融点:133〜134℃ 7,10−ジスクシニル−3,7−ジヒドロキシフエノキサン
チン−３−ブチレート レソルフイン−Ｏ−ブチレート3gを無水テトラヒドロフ
ラン50ml中に溶かし、無水コハク酸1.8g、塩化錫（II）
1.7g、氷酢酸0.5mlおよび４−（N,N−ジメチルアミノ）
ピリジン僅少量を加える。80℃で12時間攪拌し、蒸発乾
固する。残留物をエタノールから結晶させる。

収量：無色結晶生成物2g Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：酢酸エチル＝2:1）＝0.4
5 Ｏ−（Ｎ′−Tos−Ala）−Ｎ−アセチル−Ｏ−グルタリ
ルジヒドロレソルフイン Ｏ−ベンジルレザズリン ジメチルホルムアミド300ml中の、レザズリン−ナトリ
ウム塩25.1g（0.1mol）、炭酸水素ナトリウム8.4g（0.1
mol）、沃化カリウム1.6g（0.01mol）および臭化ベンジ
ル14.3ml（0.12mol）から成る溶液を、100℃で22時間攪
拌する。反応溶液を冷却後に氷水2l中に注入し、２時間
後に沈殿生成物を濾取する。次に濾液が無色になるまで
氷水で洗浄する。生成物を35℃で塩化カルシウムを介し
て真空乾燥する。

収量:20.5g（64％） 融点:205〜207℃（分解） Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：アセトン＝7:3）＝0.75 N,O−ジアセチル−Ｏ−ベンジル−ジヒドロレソルフイ
ン Ｏ−ベンジルレザズリン10g（31m mol）を氷酢酸250ml
中に溶かし、攪拌下に亜鉛粉22g（336m mol）を除々に
加え、反応混合物を還流下で１時間煮沸する。冷却後に
無水酢酸100mlを除々に滴加し、再び還流下で５時間煮
沸する。反応混合物を冷却し、不溶物を濾取し、濾液を
真空で蒸発乾固する。残留物を酢酸エチルにとり、５％
炭酸水素ナトリウム溶液および水を用いて振出を行い、
有機相を硫酸ナトリウムを介して脱水する。溶液の蒸発
後に得られる粗生成物をトルオールから再結晶させる。

収量:6.4g（53％） 融点:134〜136℃ Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：アセトン＝7:3）＝0.87 Ｎ−アセチル−Ｏ−ベンジル−ジヒドロレソルフイン N,O−ジアセチル−Ｏ−ベンジル−ジヒドロレソルフイ
ン6.2g（16m mol）を、ジオキサン150ml中で溶かし、20
℃で水150ml中の亜硫酸ナトリウム2.25g（175m mol）の
溶液を攪拌下に加える。反応混合物を１時間90℃に加熱
する。冷却後に酢酸エチルで数回振出を行い、有機相を
硫酸ナトリウムを介して脱水し、溶剤を真空で蒸発させ
る。珪酸ゲルによるカラムクロマトグラフイーによつて
精製を行う（展開剤：クロロホルム：アセトン＝7:
3）。

収量:4.3g（78％） 融点:170〜180℃（酸化） Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：アセトン＝7:3）＝0.79 Ｏ−（Ｎ′−Tos−Ala）−Ｎ−アセチル−Ｏ−ベンジル
−ジヒドロレソルフイン Ｎ−アセチル−Ｏ−ベンジル−ジヒドロレソルフイン3.
47g（10m mol）を、無水テトラヒドロフラン10ml中に溶
かし、０℃で水分の排除および攪拌下にアラニンのトル
オールスルホニル保護酸クロリド3.93g（15m mol）およ
びトリエチルアミン2.1ml（15m mol）を順次に加え、室
温で18時間攪拌する。生じたトリエチルアミンヒドロク
ロリドを吸引し、溶液を真空で蒸発乾固すると、生成物
は樹脂状物として沈殿する。

Rf＝0.51、クロロホルム／酢酸エチル（2:1） Ｏ−（Ｎ′−Tos−Ala）−Ｎ−アセチル−Ｏ−グルタリ
ル−ジイドロレソルフイン Ｏ−（Ｎ′−Tos−Ala）−Ｎ−アセチル−Ｏ−ベンジル
−ジヒドロレソルフイン5.9gを、テトラヒドロフラン20
ml中で溶かし、Pd/C0.6gを加える。加熱煮沸し、６時間
水素の一定流を導入する。冷却溶液を濾過し、無水グル
タル酸1.4gおよび４−（N,N−ジメチルアミノ）−ピリ
ジンへ僅少量（Spatelspitze）を加え、引続き18時間加
熱煮沸させる。次に蒸発乾固する。珪酸ゲルによるカラ
ムクロマトグラフイー（展開剤：クロロホルム：酢酸エ
チル＝3:1）によつて精製する。

収量：無色結晶生成物 Rf（珪酸ゲル、クロロホルム：酢酸エチル＝2:1）＝0.2
7

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス・ミユ−レツガー ドイツ連邦共和国ポリング・レーマーシユ トラーセ ７ (56)参考文献 特開 昭60−218397（ＪＰ，Ａ)

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式： ［式中Ｚは有機または無機酸基または糖基を表わし、Ａ
   は有機または無機酸基を表わし、Ｂは有機酸基を表わ
   し、R²およびR⁵は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲンまたはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、R¹、
   R³、R⁴およびR⁶は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲン、シアノ基、C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシ基、カルボキシ基、C₁〜C₅−アルコキシカ
   ルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−アルキル基、場合に
   より１または２回置換されたカルボキシアミド基または
   基： −COO−（CH₂CH₂O)n-R⁷ （基中R⁷は水素またはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、ｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、R⁶はさらにスルホ
   基またはニトロ基も表わすことができかつＡ、Ｂおよび
   Ｚが同時にアシル基ではない］で示される無色水溶性化
   合物。
2. 【請求項２】ＡがＺと同じではなく、ＡがＢと同じであ
   るか；またはＡがＺと同じであってＡがＢと同じでない
   か；またはＡ、ＢおよびＺがすべて同じでない、特許請
   求の範囲第１項記載の化合物。
3. 【請求項３】ＺがPO₃MM′、SO₃M、カルボキシルの結合
   されたアルカンカルボン酸−、アミノ酸−またはオリゴ
   ペプチド基、糖基を表わし、ＡがPO₃MM′、SO₃M、場合
   によりカルボキシル基、ヒドロキシル基および／または
   アンモニウム基によって１回以上置換されたC₁〜C₅−ア
   ルキルカルボニル基またはカルボキシルの結合されたア
   ミノ酸−またはオリゴペプチド基を表わし、Ｍおよび
   Ｍ′は水素、アルカリ−、アルカリ土類−またはアンモ
   ニウムイオンを表わし、Ｂが場合によりカルボキシル
   基、ヒドロキシル基および／またはアンモニウム基によ
   って１回以上置換されたC₁〜C₇−アルキルカルボニル基
   を表わし、かつR¹〜R⁷は前記のものを表わす特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の化合物。
4. 【請求項４】一般式： ［式中Ｚは有機または無機酸基または糖基を表わし、Ａ
   は有機または無機酸基を表わし、Ｂは有機酸基を表わ
   し、R²およびR⁵は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲンまたはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、R¹、
   R³、R⁴およびR⁶は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲン、シアノ基、C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシ基、カルボキシ基、C₁〜C₅−アルコキシカ
   ルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−アルキル基、場合に
   より１または２回置換されたカルボキシアミド基または
   基： −COO−（CH₂CH₂O）ｎ−R⁷ （基中R⁷は水素またはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、ｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、R⁶はさらにスルホ
   基またはニトロ基も表わすことができかつＡはＺと同じ
   でなく、ＡはＢと同じである］で示される化合物を製造
   するに当り、互変異性一般式IIaおよびIIb: ［式中R¹〜R⁶は前記のものを表わし、Ｙは窒素または基
   Ｎ→０を表わす］で示される化合物を、 Ｘ−Ｚ （III） ［式中Ｚは前記のものを表わし、Ｘは反応性基を表わ
   す］と反応させ、中間生成物として生じる、一般式IVa
   およびIVb: ［式中R¹〜R⁶、ＹおよびＺは前記のものを表わす］のレ
   ソルフィン誘導体を還元し、一般式V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） ［式中Ｂは前記のものを表わし、Ｘは反応性基を表わ
   す］で示される化合物とアシル化することを特徴とする
   前記一般式Ｉで示される化合物の製造方法。
5. 【請求項５】一般式： ［式中Ｚは有機または無機酸基または糖基を表わし、Ａ
   は有機または無機酸基を表わし、Ｂは有機酸基を表わ
   し、R²およびR⁵は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲンまたはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、R¹、
   R³、R⁴およびR⁶は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲン、シアノ基、C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシ基、カルボキシ基、C₁〜C₅−アルコキシカ
   ルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−アルキル基、場合に
   より１または２回置換されたカルボキシアミド基または
   基： −COO−（CH₂CH₂O）ｎ−R⁷ （基中R⁷は水素またはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、ｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、R⁶はさらにスルホ
   基またはニトロ基も表わすことができかつＡはＺと同じ
   であり、ＡはＢと同じでない］で示される化合物を製造
   するに当り、互変異性一般式IIaおよびIIb: ［式中R¹〜R⁶は前記のものを表わし、Ｙは窒素または基
   Ｎ→０を表わす］で示される化合物を還元し、一般式V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） ［式中Ｂは前記のものを表わし、Ｘは反応性基を表わ
   す］で示される化合物を用いてアシル化し、次にエステ
   ル化合物を選択的に加水分解し、次いで一般式VI: Ｘ−Ａ （VI） ［式中ＸおよびＡは前記のものを表わす］で示される化
   合物と反応させることを特徴とする前記一般式Ｉで示さ
   れる化合物の製造方法。
6. 【請求項６】一般式： ［式中Ｚは有機または無機酸基または糖基を表わし、Ａ
   は有機または無機酸基を表わし、Ｂは有機酸基を表わ
   し、R²およびR⁵は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲンまたはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、R¹、
   R³、R⁴およびR⁶は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲン、シアノ基、C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシ基、カルボキシ基、C₁〜C₅−アルコキシカ
   ルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−アルキル基、場合に
   より１または２回置換されたカルボキシアミド基または
   基： −COO−（CH₂CH₂O）ｎ−R⁷ （基中R⁷は水素またはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、ｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、R⁶はさらにスルホ
   基またはニトロ基も表わすことができかつＡ、Ｂおよび
   Ｚがすべて同じでない］で示される化合物を製造するに
   当り、互変異性一般式IIaおよびIIb: ［式中R¹〜R⁶は前記のものを表わし、ＹはＮ→０を表わ
   す］で示される化合物を還元し、一般式VII: Ｘ−Ａ′ （VII） ［式中Ａ′はＡを表わすものまたはフェノール保護基を
   表わし、Ｘは反応性基を表わす］で示される化合物を反
   応させ、次に還元し、一般式V: Ｘ−Ｂ （Ｖ） ［式中Ｂは前記のものを表わし、Ｘは反応性基を表わ
   す］で示される化合物で十分にアシル化し、最後に生成
   されたエステル化合物を選択的に加水分解し、一般式II
   I: Ｘ−Ｚ （III） ［式中Ｚは前記のものを表わし、Ｘは反応性基を表わ
   す］で示される化合物と反応させ、場合によりＡ′がフ
   ェノール保護基を表わす場合には同保護基を除去して一
   般式VI: Ｘ−Ａ （VI） ［式中Ａは前記のものを表わし、Ｘは反応性基を表わ
   す］で示される化合物でアシル化することを特徴とする
   前記一般式Ｉで示される化合物の製造方法。
7. 【請求項７】１種以上の発色性または／および発蛍光性
   基質、適当な緩衝系ならびに場合により他の常用試薬お
   よび助剤を含有するヒドロラーゼ測定用試薬において、
   発色性または／および発蛍光性基質として、一般式I: ［式中Ｚは有機または無機酸基または糖基を表わし、Ａ
   は有機または無機酸基を表わし、Ｂは有機酸基を表わ
   し、R²およびR⁵は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲンまたはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、R¹、
   R³、R⁴およびR⁶は同じかまたは異なっていてもよく、水
   素、ハロゲン、シアノ基、C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシ基、カルボキシ基、C₁〜C₅−アルコキシカ
   ルボニル基、カルボキシ−C₁〜C₅−アルキル基、C₁〜C₅
   −アルコキシカルボニル−C₁〜C₅−アルキル基、場合に
   より１または２回置換されたカルボキシアミド基または
   基： −COO−（CH₂CH₂O）ｎ−R⁷ （基中R⁷は水素またはC₁〜C₅−アルキル基を表わし、ｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、R⁶はさらにスルホ
   基またはニトロ基も表わすことができかつＡ、Ｂおよび
   Ｚは同時にアシル基ではない］で示される無色水溶性化
   合物を含有し、および酸化剤を含有することを特徴とす
   るヒドロラーゼ測定試薬。
8. 【請求項８】ＡはＺと同じでなく、ＡはＢと同じである
   か；またはＡはＺと同じであって、ＡはＢと同じでない
   か；またはA,BおよびＺがすべて同じでない、一般式Ｉ
   で示される無色水溶性化合物を含有し、および酸化剤を
   含有する、特許請求の範囲第７項記載の試薬。
9. 【請求項９】酸化剤として、K₃［Fe(CN)₆］、過ホウ酸
   塩、空気酸素、ゼリルビンビンオキシダーゼまたは過酸
   化水素／ペルオキシダーゼを含有する、特許請求の範囲
   第７項記載の試薬。