JPH03210196A - 合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法およびその結合体 - Google Patents
合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法およびその結合体Info
- Publication number
- JPH03210196A JPH03210196A JP333990A JP333990A JPH03210196A JP H03210196 A JPH03210196 A JP H03210196A JP 333990 A JP333990 A JP 333990A JP 333990 A JP333990 A JP 333990A JP H03210196 A JPH03210196 A JP H03210196A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stranded
- oligonucleotide
- nucleic acid
- sub
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合
方法およびその結合体に関する。さらに、本発明は、被
検出核酸と相補的な塩基配列を含有する合成オリゴヌク
レオチドを用いて被検出核酸を検出する手段に関する。
方法およびその結合体に関する。さらに、本発明は、被
検出核酸と相補的な塩基配列を含有する合成オリゴヌク
レオチドを用いて被検出核酸を検出する手段に関する。
［従来の技術］
ハイブリダイセーション反応において、同定されるべき
標的核酸と相補的な塩基配列を有し、標識されたオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いたプローブ
核酸は該標的核酸と塩基対を形成しつる。この特性を利
用して、種々のハイブリダイゼーション法か核酸の検出
に用いられている。直接的ハイブリダイゼーション法で
は、試料を溶液中に固定する方法あるいは固体担体に固
定する方法かある。試料中に標的核酸が存在する場合は
、１つの標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼー
ションによって同定される。このうち、近年、短時間か
つ簡単な操作で行うことでかきる溶液中でのハイブリダ
イゼーション法が注目されている。
標的核酸と相補的な塩基配列を有し、標識されたオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いたプローブ
核酸は該標的核酸と塩基対を形成しつる。この特性を利
用して、種々のハイブリダイゼーション法か核酸の検出
に用いられている。直接的ハイブリダイゼーション法で
は、試料を溶液中に固定する方法あるいは固体担体に固
定する方法かある。試料中に標的核酸が存在する場合は
、１つの標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼー
ションによって同定される。このうち、近年、短時間か
つ簡単な操作で行うことでかきる溶液中でのハイブリダ
イゼーション法が注目されている。
溶液中でハイブリダイセーション反応を行なった場合、
標的核酸とプローブ核酸反応生成物を何らかの形で未反
応物から分離し、抽出することが必要である、一般に、
プローブ核酸を不溶性担体に固定したのち標的核酸とハ
イブリッドを形成させ、その後遠心分離法によりハイブ
リッドを分離する方法が知られている。その−例として
は、特開昭６３−１１７２６２などがある。すなわち、
これらの方法では、まず標識核酸の特定の塩基配列に対
して相補的な塩基配列を含む一本鎖の状態の核酸を有機
高分子物質からなり表面が非多孔質の粒径０、Ｏ１〜５
０−の粒子の表面に結合させ、不溶性担体に結合したハ
イブリッド形成用プローブ核酸を形成させる。次に、こ
のプローブ核酸と試料とを反応させ、特定の塩基配列を
含む標的核酸とハイブリッドを形成させる。担体上のプ
ローブ核酸とハイブリッド形成しなかった核酸およびそ
の他の夾雑物を遠心分離法などで除去することにより、
ハイブリッドを形成している標的核酸を検出する方法で
ある。
標的核酸とプローブ核酸反応生成物を何らかの形で未反
応物から分離し、抽出することが必要である、一般に、
プローブ核酸を不溶性担体に固定したのち標的核酸とハ
イブリッドを形成させ、その後遠心分離法によりハイブ
リッドを分離する方法が知られている。その−例として
は、特開昭６３−１１７２６２などがある。すなわち、
これらの方法では、まず標識核酸の特定の塩基配列に対
して相補的な塩基配列を含む一本鎖の状態の核酸を有機
高分子物質からなり表面が非多孔質の粒径０、Ｏ１〜５
０−の粒子の表面に結合させ、不溶性担体に結合したハ
イブリッド形成用プローブ核酸を形成させる。次に、こ
のプローブ核酸と試料とを反応させ、特定の塩基配列を
含む標的核酸とハイブリッドを形成させる。担体上のプ
ローブ核酸とハイブリッド形成しなかった核酸およびそ
の他の夾雑物を遠心分離法などで除去することにより、
ハイブリッドを形成している標的核酸を検出する方法で
ある。
不溶性担体とプローブ核酸の固定方法としては、次の２
つの方法が知られている。
つの方法が知られている。
その一つの方法として、プローブ核酸の５°又は３°末
端を化学的に修飾し担体に固定化する方法があげられ、
具体的な例としては、特開昭６３２４３８７５に示され
ているようにターミナルデオキシヌクレチジルトランス
フェラーゼ（ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｔ
ｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて不溶性担
体を捕捉する物質をプローブ核酸の３゛末端側に結合さ
せる方法がある。
端を化学的に修飾し担体に固定化する方法があげられ、
具体的な例としては、特開昭６３２４３８７５に示され
ているようにターミナルデオキシヌクレチジルトランス
フェラーゼ（ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｔ
ｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて不溶性担
体を捕捉する物質をプローブ核酸の３゛末端側に結合さ
せる方法がある。
第二の方法としては、有機溶媒を用いて核酸全体を固定
する方法がある。これは特開昭５９１２２４９９などに
詳しく述べられている。
する方法がある。これは特開昭５９１２２４９９などに
詳しく述べられている。
［発明が解決しようとする課題］
前述のプローブ核酸の末端を化学的に修飾し担体に固定
化する方法では、一般にプローブ核酸として利用される
オリゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブ
リダイゼーション時の標的核酸とプローブ核酸の相補的
結合の誤りが防げる。しかし、プローブ核酸の鎖長が長
い場合、そのプローブ核酸中に相補的配列が存在する確
率が高まり、パイプリダイゼーション反応中にプローブ
核酸自身が反応し高次構造を形成してプローブ核酸の機
能を果たさなくなりハイブリッド形成の効率が著しく減
少することがある。
化する方法では、一般にプローブ核酸として利用される
オリゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブ
リダイゼーション時の標的核酸とプローブ核酸の相補的
結合の誤りが防げる。しかし、プローブ核酸の鎖長が長
い場合、そのプローブ核酸中に相補的配列が存在する確
率が高まり、パイプリダイゼーション反応中にプローブ
核酸自身が反応し高次構造を形成してプローブ核酸の機
能を果たさなくなりハイブリッド形成の効率が著しく減
少することがある。
また、有機溶媒を用いて核酸全体を担持させる方法では
、上記のようなプローブ核酸自身が高次構造を取ること
は避けられるが極性に差があるため核酸全体の特性を変
えずに核酸は固定化する条件を捜しし出すことは容易で
はなく実用的ではない。
、上記のようなプローブ核酸自身が高次構造を取ること
は避けられるが極性に差があるため核酸全体の特性を変
えずに核酸は固定化する条件を捜しし出すことは容易で
はなく実用的ではない。
本発明は、溶液中におけるハイブリダイゼーション法を
利用する前記の従来技術の問題点を解決するために鋭意
検討した結果なされたものであり、プローブ核酸として
用いるオリゴヌクレオチドを伸展させる過程において、
一端に捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドを複
数個導入することにより不溶性担体とプローブ核酸との
結合接点を増し、さらにプローブ核酸自身のハイブリダ
イゼーションによる高次構造形成を回避することによっ
て、安定性の高いプローブ核酸と不溶性担体との結合体
を形成する方法に及びその結合体を提供することを目的
とする。
利用する前記の従来技術の問題点を解決するために鋭意
検討した結果なされたものであり、プローブ核酸として
用いるオリゴヌクレオチドを伸展させる過程において、
一端に捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドを複
数個導入することにより不溶性担体とプローブ核酸との
結合接点を増し、さらにプローブ核酸自身のハイブリダ
イゼーションによる高次構造形成を回避することによっ
て、安定性の高いプローブ核酸と不溶性担体との結合体
を形成する方法に及びその結合体を提供することを目的
とする。
［課題を解決するための手段］
本発明は、合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合
方法において、 ａ） 末端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつよ
うに構成された塩基配列を有する二種類のサブオリゴヌ
クレオチドを合成し、該サブオリゴヌクレオチド間で反
応させて部分的に二本鎖で結合したオリゴヌクレオチド
鎖を形成する過程と、ｂ） 該オリゴヌクレオチド鎖中
の一本鎖部分を鋳型として、二本鎖形成部分をプライマ
ーとして利用し、捕捉体を結合しているヌクレオチドを
導入しながら鎖長伸展反応を行ない一本鎖部分を二本鎖
化し、最終的に二本鎖のうち一本鎖が目的とする合成オ
リゴヌクレオチドである二本鎖オリゴヌクレオチドを形
成する過程と、 Ｃ）該二本鎖合成ヌクレオチドを一本鎖に解離し、一本
鎖の合成オリゴヌクレオチドを形成する過程と、 ｄ）捕捉体に特異的に結合するりカントを不溶性担体の
表面に結合させ、リガンドと捕捉体との結合を介して該
合成オリゴヌクレオチドを不溶性担体に複数カ所で結合
させる過程と、 を含むことを特徴とする。
方法において、 ａ） 末端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつよ
うに構成された塩基配列を有する二種類のサブオリゴヌ
クレオチドを合成し、該サブオリゴヌクレオチド間で反
応させて部分的に二本鎖で結合したオリゴヌクレオチド
鎖を形成する過程と、ｂ） 該オリゴヌクレオチド鎖中
の一本鎖部分を鋳型として、二本鎖形成部分をプライマ
ーとして利用し、捕捉体を結合しているヌクレオチドを
導入しながら鎖長伸展反応を行ない一本鎖部分を二本鎖
化し、最終的に二本鎖のうち一本鎖が目的とする合成オ
リゴヌクレオチドである二本鎖オリゴヌクレオチドを形
成する過程と、 Ｃ）該二本鎖合成ヌクレオチドを一本鎖に解離し、一本
鎖の合成オリゴヌクレオチドを形成する過程と、 ｄ）捕捉体に特異的に結合するりカントを不溶性担体の
表面に結合させ、リガンドと捕捉体との結合を介して該
合成オリゴヌクレオチドを不溶性担体に複数カ所で結合
させる過程と、 を含むことを特徴とする。
また、本発明の合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の
結合体は前記結合方法により得ることができることを特
徴とする。
結合体は前記結合方法により得ることができることを特
徴とする。
本発明の２種類のサブオリゴヌクレオチドとしては、末
端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつように構成
された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであればど
のようなものでも利用できるが、合成機で手軽に合成で
きる短かい鎖長のオリゴヌクレオチドが利用し易い。
端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつように構成
された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであればど
のようなものでも利用できるが、合成機で手軽に合成で
きる短かい鎖長のオリゴヌクレオチドが利用し易い。
合成するサブオリゴヌクレオチドの長さは、２０塩基か
ら４０塩基程度が望ましい。サブオリゴヌクレオチドの
構成としては、サブオリゴヌクレオチドの一方の一部又
は全塩基配列が他方のサブオリゴヌクレオチドの５゛末
端の一部の塩基配列と互いに相補性をもつ塩基配列を有
するものを利用するが、そのうち、サブオリゴヌクレオ
チドの一方の全塩基配列が他方の塩基配列と相補性を有
するものが利用しやすい。互いに相補性を有する塩基数
は特に制限はないが、６〜８の塩基数の範囲が望ましい
。
ら４０塩基程度が望ましい。サブオリゴヌクレオチドの
構成としては、サブオリゴヌクレオチドの一方の一部又
は全塩基配列が他方のサブオリゴヌクレオチドの５゛末
端の一部の塩基配列と互いに相補性をもつ塩基配列を有
するものを利用するが、そのうち、サブオリゴヌクレオ
チドの一方の全塩基配列が他方の塩基配列と相補性を有
するものが利用しやすい。互いに相補性を有する塩基数
は特に制限はないが、６〜８の塩基数の範囲が望ましい
。
また、本発明の結合体を用いて、ハイブリダイゼーショ
ン法によって被検出核酸の有無の分析及び被検出核酸を
検出する場合には、被検出核酸の塩基配列に対して相補
的な塩基配列を有するようにサブオリゴヌクレオチドを
合成するとよい。
ン法によって被検出核酸の有無の分析及び被検出核酸を
検出する場合には、被検出核酸の塩基配列に対して相補
的な塩基配列を有するようにサブオリゴヌクレオチドを
合成するとよい。
各サブオリゴヌクレオチドの相補的な塩基配列部分での
二本鎖形成はアニーリング反応によって行うことができ
る。
二本鎖形成はアニーリング反応によって行うことができ
る。
アニーリング反応では、該２個の一本鎖サブオリゴヌク
レオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で１分
間以上、好ましくは、６５度にて１０分間、或は、９５
度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷す
る。この反応により、該サブオリゴヌクレオチドは互い
に相補的な塩基配列部分で結合し、部分的に二本鎖を有
するオリゴヌクレオチド鎖を形成することができる。
レオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で１分
間以上、好ましくは、６５度にて１０分間、或は、９５
度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷す
る。この反応により、該サブオリゴヌクレオチドは互い
に相補的な塩基配列部分で結合し、部分的に二本鎖を有
するオリゴヌクレオチド鎖を形成することができる。
本発明の方法においては、前記のようにして得られたオ
リゴヌクレオチド鎖の非結合部分の鎖長を伸展させ二本
鎖化する際に、側鎖に捕捉体を結合したヌクレオチドフ
ォスフェートを伸展部分に取り込ませて捕捉体を複数ケ
所に有する二本鎖ヌクレオチドを形成する。この二本鎖
形成の伸展反応では、オリゴヌクレオチド鎖の非結合部
である末鎖が鋳型となり、その鋳型を有するサブヌクレ
オチドと結合している他方のサブオリゴヌクレオチドの
二本鎖形成部分がプライマーとなって作用し、５°側か
ら３゛側方向に捕捉体を結合しているヌクレオチドを導
入しながら鎖長を伸展して合成ヌクレオチドが形成され
る。
リゴヌクレオチド鎖の非結合部分の鎖長を伸展させ二本
鎖化する際に、側鎖に捕捉体を結合したヌクレオチドフ
ォスフェートを伸展部分に取り込ませて捕捉体を複数ケ
所に有する二本鎖ヌクレオチドを形成する。この二本鎖
形成の伸展反応では、オリゴヌクレオチド鎖の非結合部
である末鎖が鋳型となり、その鋳型を有するサブヌクレ
オチドと結合している他方のサブオリゴヌクレオチドの
二本鎖形成部分がプライマーとなって作用し、５°側か
ら３゛側方向に捕捉体を結合しているヌクレオチドを導
入しながら鎖長を伸展して合成ヌクレオチドが形成され
る。
合成試薬としては、ヌクレオチドトリフオスフェート、
捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドトリフオス
フェート及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合
のための試薬を利用する。ヌクレオチドトリフオスフェ
ートとしては、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ
および捕捉体を側鎖に結合したｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ％ｄＵＴＰヌクレオチドトリフオスフェートを利
用することができる。この場合、該捕捉体結合のヌクレ
オチドトリフオスフェートのみを加えてもよいし、捕捉
体非結合のヌクレオチドトリフオスフェートを混在させ
てもよい。例えば捕捉体非結合のヌクレオチドトリフオ
スフェートを全く加えず、捕捉体結合のヌクレオチドト
リフオスフェートのみを加えて反応させた場合、作成さ
れた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列は、捕捉体結合
のヌクレオチドトリフオスフェートを取り込んだ領域と
取り込んでいない領域が交互になるように構成されたも
のになる。
捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドトリフオス
フェート及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合
のための試薬を利用する。ヌクレオチドトリフオスフェ
ートとしては、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ
および捕捉体を側鎖に結合したｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ％ｄＵＴＰヌクレオチドトリフオスフェートを利
用することができる。この場合、該捕捉体結合のヌクレ
オチドトリフオスフェートのみを加えてもよいし、捕捉
体非結合のヌクレオチドトリフオスフェートを混在させ
てもよい。例えば捕捉体非結合のヌクレオチドトリフオ
スフェートを全く加えず、捕捉体結合のヌクレオチドト
リフオスフェートのみを加えて反応させた場合、作成さ
れた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列は、捕捉体結合
のヌクレオチドトリフオスフェートを取り込んだ領域と
取り込んでいない領域が交互になるように構成されたも
のになる。
重合試薬として用いる酵素には、Ｅ、 ｃｏｉｌ ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのにｌｅｎｏｗ
断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、ｅｔ。
ＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのにｌｅｎｏｗ
断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、ｅｔ。
ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １０８
．Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂａｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ） 、 Ｔ ７ Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ（Ｓ
、Ｔａｂｏｒｅｔ、ａＪ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．４７６７−４７７１（＋９
８７） 、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ，に。
．Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂａｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ） 、 Ｔ ７ Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ（Ｓ
、Ｔａｂｏｒｅｔ、ａＪ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．４７６７−４７７１（＋９
８７） 、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ，に。
５ａｉｋｉ、ｅｔ、ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９，４
８７−４９１（１９８８） 、他の入手可能なりＮＡ
ポリメラーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、
各核酸の相補的であるプライマー伸展生成物を形成する
ために適当な態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵
素が含まれる。
８７−４９１（１９８８） 、他の入手可能なりＮＡ
ポリメラーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、
各核酸の相補的であるプライマー伸展生成物を形成する
ために適当な態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵
素が含まれる。
連結試薬として用いる酵素としては、ＤＮＡリガーゼが
ある。ＤＮＡリガーゼ゛は、Ｅ、Ｃｏ１１由来のもので
もファージＴ４由来のものでも良い。また、同じ様な働
きをする他の酵素でも良い。
ある。ＤＮＡリガーゼ゛は、Ｅ、Ｃｏ１１由来のもので
もファージＴ４由来のものでも良い。また、同じ様な働
きをする他の酵素でも良い。
伸展されたヌクレオチドにニック（切れ目）が入ってい
る場合には、Ｔ４ライゲースなどの酵素により切れ目か
ないように連結することができる。
る場合には、Ｔ４ライゲースなどの酵素により切れ目か
ないように連結することができる。
該反応生成物である二本鎖ヌクレオチドからの一本鎖合
成オリゴヌクレオチドの形成は、変性条件下で処理する
ことによって得られる。変性は熱変性でも、アルカリに
よる方法でも、二本鎖を一本鎖に解離する方法であれば
他の方法でも良い。
成オリゴヌクレオチドの形成は、変性条件下で処理する
ことによって得られる。変性は熱変性でも、アルカリに
よる方法でも、二本鎖を一本鎖に解離する方法であれば
他の方法でも良い。
例えば、熱変性であれば９５℃下５分の加熱処理で一本
鎖に解離することができる。
鎖に解離することができる。
一方、不溶性担体はその表面上に捕捉体と特異的に結合
するリガンドを結合させることによって、合成オリゴヌ
クレオチドと結合させることがでる。表面処理された該
不溶性担体は、前記捕捉体とリガンドとの結合により一
本鎖にした合成オリゴヌクレオチドと結合する。
するリガンドを結合させることによって、合成オリゴヌ
クレオチドと結合させることがでる。表面処理された該
不溶性担体は、前記捕捉体とリガンドとの結合により一
本鎖にした合成オリゴヌクレオチドと結合する。
捕捉体としては、後述する不溶性担体の表面に結合する
ことができるリガンドと選択特異的に結合可能な物質で
あり、かつヌクレオチドの側鎖に結合できる物質であれ
ばどのようなものでも利用することができる。
ことができるリガンドと選択特異的に結合可能な物質で
あり、かつヌクレオチドの側鎖に結合できる物質であれ
ばどのようなものでも利用することができる。
例えば、具体的な捕捉体およびリガンドとしては、ビオ
チン−アビジン、ハブテン−抗体、フラビンアデニンジ
ヌクレオチド（ＦＡＤ）−グルコースオキシターゼ、ビ
オチン−抗ビオチン抗体等の抗原−抗体があげられる。
チン−アビジン、ハブテン−抗体、フラビンアデニンジ
ヌクレオチド（ＦＡＤ）−グルコースオキシターゼ、ビ
オチン−抗ビオチン抗体等の抗原−抗体があげられる。
担体に用いられる有機高分子物質としては、芳香族ビニ
ル化合物、不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミ
ド類、不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物
、共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステル
からなるビニル系単量体の一種以上を重合して得られる
水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学的
に変性して得られる水不溶性の有機高分子物質、もしく
はアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖類
の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン
、カゼインなどの架橋体をあげることができる。
ル化合物、不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミ
ド類、不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物
、共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステル
からなるビニル系単量体の一種以上を重合して得られる
水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学的
に変性して得られる水不溶性の有機高分子物質、もしく
はアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖類
の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン
、カゼインなどの架橋体をあげることができる。
〈実施例〉
ａ０合成オリゴヌクレオチドの作製
プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部と相補性を有す
る塩基配列を含む下記のような二種類のサブオリゴヌク
レオチドをＤＮＡ合成装置（ＡｐｐｌｉｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社３８１Ａ）により合成した。
る塩基配列を含む下記のような二種類のサブオリゴヌク
レオチドをＤＮＡ合成装置（ＡｐｐｌｉｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社３８１Ａ）により合成した。
５°ＧＡＴＣＧＣＣＣ３゜
５“（：ＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ
ＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＩｌ：ＧＡＴＣ３゜この
二種のサブオリゴヌクレオチドの塩基配列のうち３゛末
端からの８塩基が互いに相補的な配列をもつように合成
されている。
ＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＩｌ：ＧＡＴＣ３゜この
二種のサブオリゴヌクレオチドの塩基配列のうち３゛末
端からの８塩基が互いに相補的な配列をもつように合成
されている。
これらの合成されたサブオリゴヌクレオチドの部につい
て、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動
を行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の絹製を行わずに以下の反応に
用いた。
て、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動
を行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の絹製を行わずに以下の反応に
用いた。
エッペンドルフチューブに各サブオリゴヌクレオチド２
μｇ（約１３０ ｐｍｏｌｅ ）に１０×アニリング溶
液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０−６０
ｍＭ ＭｇＣｌ３，６０ｍＭβメルカプトエタノール
、５００ｍＭ Ｎａ１１）を５μｌ加え、蒸留水にて５
０μｌに調整した。これを６５度の温水が入ったビーカ
ー中で１０分間加温し、その後約１時間かけて室温にな
るまでゆっくり冷ました。この反応で二本のサブオリゴ
ヌクレオチドは下図のような部分的に二本鎖を含むオリ
ゴヌクレオチド鎖を形成した。
μｇ（約１３０ ｐｍｏｌｅ ）に１０×アニリング溶
液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０−６０
ｍＭ ＭｇＣｌ３，６０ｍＭβメルカプトエタノール
、５００ｍＭ Ｎａ１１）を５μｌ加え、蒸留水にて５
０μｌに調整した。これを６５度の温水が入ったビーカ
ー中で１０分間加温し、その後約１時間かけて室温にな
るまでゆっくり冷ました。この反応で二本のサブオリゴ
ヌクレオチドは下図のような部分的に二本鎖を含むオリ
ゴヌクレオチド鎖を形成した。
この溶液５０μｌに１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。
及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｌ 、 ０．４ ｍＭビオ
チン化ＤＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｍ、１０ｘアニリ
ング溶液５μｌ、蒸留水３２μｌを加え、よく混和した
あとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹ
ＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温し
、−本鎖部分の伸展反応を行った。
チン化ＤＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｍ、１０ｘアニリ
ング溶液５μｌ、蒸留水３２μｌを加え、よく混和した
あとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹ
ＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温し
、−本鎖部分の伸展反応を行った。
反応後６５度で５分間加熱し反応を停止させた後フェノ
ール処理し除タンパクを行なった。
ール処理し除タンパクを行なった。
その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌＰ ２ ；
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製 ０．５ ｘ ５ ｃｍ）で特製
した。
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌＰ ２ ；
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製 ０．５ ｘ ５ ｃｍ）で特製
した。
目的の二本鎖合成ヌクレオチドはほとんどカラムを素通
りした分画に回収された。各フラクションを０．５ ｍ
ｌずつ収集し、それぞれ２μｌをニトロセルロースフィ
ルターに吸着させ、ＢＲＬ社のプロトコールに従って発
色反応を行ったところ、２番目のフラクションが強く発
色し、目的の二本鎖合成ヌクレオチドが捕捉体のビオチ
ンを含有していることが確認できた。
りした分画に回収された。各フラクションを０．５ ｍ
ｌずつ収集し、それぞれ２μｌをニトロセルロースフィ
ルターに吸着させ、ＢＲＬ社のプロトコールに従って発
色反応を行ったところ、２番目のフラクションが強く発
色し、目的の二本鎖合成ヌクレオチドが捕捉体のビオチ
ンを含有していることが確認できた。
次に、得られた捕捉体を含む二本鎖合成ヌクレオチドを
含む溶液を９５度で５分間加熱処理して一本鎖を一本鎖
に解離し、合成オリゴヌクレオチドを得た。
含む溶液を９５度で５分間加熱処理して一本鎖を一本鎖
に解離し、合成オリゴヌクレオチドを得た。
ｂ０合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との結合体の
調整 不溶性担体として以下のように処理した約粒径１０μｍ
のゲル粒を用いた。ゲル粒は、アガロースケルを粉砕し
たもので、その表面を臭化シアンで活性化させたあとア
ビジンと結合させた。このアビジン結合のゲル粒と先の
合成オリゴヌクレオチドを含む溶液とを２０分間混和さ
せた。この時合成オリゴヌクレオチド内に取り込まれた
ビオチンは、ゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する
。
調整 不溶性担体として以下のように処理した約粒径１０μｍ
のゲル粒を用いた。ゲル粒は、アガロースケルを粉砕し
たもので、その表面を臭化シアンで活性化させたあとア
ビジンと結合させた。このアビジン結合のゲル粒と先の
合成オリゴヌクレオチドを含む溶液とを２０分間混和さ
せた。この時合成オリゴヌクレオチド内に取り込まれた
ビオチンは、ゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する
。
Ｃ０被検出核酸の調整
検出を行う核酸（被検出核酸）として、ｐＵｃ１９、ｐ
ＢＲ３２２及びＰＵＣ１９とｐＢＲ３２２の混合物の３
種を用意した。２μｌの蒸留水に各核酸試料１μｇを含
む３種の各々の試料に２μｌの１０×↑Ａバツフアー
１６μｌのｄｄＨ２０を加えた反応液に１０ｕｎｉｔの
旧ｎｄＩＩＩを加え、３７度２時間で完全加水分解した
。この後フェノール抽出、エタノール沈殿を行い沈殿物
を１０μｌの蒸留水に溶解した。
ＢＲ３２２及びＰＵＣ１９とｐＢＲ３２２の混合物の３
種を用意した。２μｌの蒸留水に各核酸試料１μｇを含
む３種の各々の試料に２μｌの１０×↑Ａバツフアー
１６μｌのｄｄＨ２０を加えた反応液に１０ｕｎｉｔの
旧ｎｄＩＩＩを加え、３７度２時間で完全加水分解した
。この後フェノール抽出、エタノール沈殿を行い沈殿物
を１０μｌの蒸留水に溶解した。
これに混合試薬液（０，３３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐ
Ｈ７，９゜３３ ｍＭ ＭｇＣｌ２．３３ｍＭジチオス
リトール）６μｍ。
Ｈ７，９゜３３ ｍＭ ＭｇＣｌ２．３３ｍＭジチオス
リトール）６μｍ。
５ｍＭｄＣＴＰ １ μｍ 、 ５ｍＭｄＧＴＰ １
μｍ 、 ５ｍＭｄＡＴＰ１１，５ｍＭｄＴＴＰ１μｍ
、［ａ−３２Ｐ］ ｄＧＴＰ （１０Ｃｉ ） １μｍ
、蒸留水７μｌおよびＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ２μｌ
（４ｕｎｉｔ）を添加し、３０分間２０度で反応を行
い、放射性標識を施した。
μｍ 、 ５ｍＭｄＡＴＰ１１，５ｍＭｄＴＴＰ１μｍ
、［ａ−３２Ｐ］ ｄＧＴＰ （１０Ｃｉ ） １μｍ
、蒸留水７μｌおよびＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ２μｌ
（４ｕｎｉｔ）を添加し、３０分間２０度で反応を行
い、放射性標識を施した。
その後、放射性標識を付した各試料の被検出核酸を９５
度で５分間加熱処理することによって、一本鎖に解離し
た。
度で５分間加熱処理することによって、一本鎖に解離し
た。
ｄ、ハイブリダイゼーション
ｂ、で調製した合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の
結合体に、Ｃ１で得た一本鎖に解離した被検出核酸を含
む溶液及びｉｏｘアニーリング溶液５μｌを加え、蒸留
水にて５０μｌに調整した。これを軽く攪拌した後、６
５度の温水が入ったビーカー中で１０分間加温し、その
後約１時間かけて室温になるまでゆっくり冷ました。
結合体に、Ｃ１で得た一本鎖に解離した被検出核酸を含
む溶液及びｉｏｘアニーリング溶液５μｌを加え、蒸留
水にて５０μｌに調整した。これを軽く攪拌した後、６
５度の温水が入ったビーカー中で１０分間加温し、その
後約１時間かけて室温になるまでゆっくり冷ました。
軽く遠心して上滑を廃棄し、さらにＴＥ温溶液２度洗浄
した後、沈殿物の放射性強度をシンチレーションカウン
ターで数度測定したところｐＵＣ１９をふくむ試料は１
０’ 〜１０’ ｃｐｍの値を示し、ｐＢＲ３２２のみ
の試料におけるその値はバックグランドの２倍に満たな
かった。
した後、沈殿物の放射性強度をシンチレーションカウン
ターで数度測定したところｐＵＣ１９をふくむ試料は１
０’ 〜１０’ ｃｐｍの値を示し、ｐＢＲ３２２のみ
の試料におけるその値はバックグランドの２倍に満たな
かった。
［発明の効果］
本発明の方法では、複数個の捕捉体を含有する合成オリ
ゴヌクレオチドを得ることができた。このことにより合
成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との接点が増加し、
従来法と比較して強固な結合を持ち安定した結合体を得
ることができた。
ゴヌクレオチドを得ることができた。このことにより合
成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との接点が増加し、
従来法と比較して強固な結合を持ち安定した結合体を得
ることができた。
さらに、プローブ自体の高次構造形成を防ぐこともでき
た。その結果、ハイブリッド形成の効率を減少させるこ
となく長い合成オリゴヌクレオチドを簡単に不溶性担体
に結合させることが可能となった。
た。その結果、ハイブリッド形成の効率を減少させるこ
となく長い合成オリゴヌクレオチドを簡単に不溶性担体
に結合させることが可能となった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法に
おいて、 ａ）末端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつよう
に構成された塩基配列を有する二種類のサブオリゴヌク
レオチドを合成し、該サブオリゴヌクレオチド間で反応
させて部分的に二本鎖で結合したオリゴヌクレオチド鎖
を形成する過程と、 ｂ）該オリゴヌクレオチド鎖中の一本鎖部分を鋳型とし
て、二本鎖形成部分をプライマーとして利用し、捕捉体
を結合しているヌクレオチドを導入しながら鎖長伸展反
応を行ない一本鎖部分を二本鎖化し、最終的に二本鎖の
うち一本鎖が目的とする合成オリゴヌクレオチドである
二本鎖合成ヌクレオチドを形成する過程と、 ｃ）該二本鎖合成ヌクレオチドを一本鎖に解離し、一本
鎖の合成オリゴヌクレオチドを形成する過程と、 ｄ）捕捉体に特異的に結合するリガンドを不溶性担体の
表面に結合させ、リガンドと捕捉体との結合を介して該
合成オリゴヌクレオチドを不溶性担体に複数ヵ所で結合
させる過程と、 を含むことを特徴とする合成オリゴヌクレオチドと不溶
性担体の結合方法。 ２）サブオリゴヌクレオチドが、その塩基配列の中に被
検出核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する請求項
１に記載の方法。 ３）サブオリゴヌクレオチドの一方の全塩基配列が、他
方の５’末端の一部の塩基配列と互いに相補性をもつよ
うに構成されたものである請求項１に記載の方法。 ４）請求項１に記載の方法により結合した結合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP333990A JPH03210196A (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法およびその結合体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP333990A JPH03210196A (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法およびその結合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03210196A true JPH03210196A (ja) | 1991-09-13 |
Family
ID=11554600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP333990A Pending JPH03210196A (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法およびその結合体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03210196A (ja) |
-
1990
- 1990-01-12 JP JP333990A patent/JPH03210196A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5830643A (en) | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide | |
| JP4222635B2 (ja) | ２段階ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドの捕捉 | |
| US6060246A (en) | Reagent and method for isolation and detection of selected nucleic acid sequences | |
| JP4675141B2 (ja) | 核酸を増幅するため、核酸配列のための終結後標識プロセス、および減少した熱力学安定性を有する核酸を生成するための新規の方法 | |
| JP2801051B2 (ja) | 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 | |
| JPH11510369A (ja) | 鋳型依存性生産物の形成による核酸の検出 | |
| US5324829A (en) | High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties | |
| US7105318B2 (en) | Specific and sensitive nucleic acid detection method | |
| US5538872A (en) | Method of preparing nucleotide probes using a bridging complement | |
| EP2367959B1 (en) | Methods for shortening incubation times in hybridization assays | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| US20030180776A1 (en) | Detection by sliding template amplification | |
| JP2609738B2 (ja) | 核酸の増幅および検出方法 | |
| JPH03210196A (ja) | 合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法およびその結合体 | |
| JP3122106B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 | |
| EP1114185B1 (en) | Method of isolating primer extension products with modular oligonucleotides | |
| JP2005160387A (ja) | 核酸の増幅法および核酸増幅用プライマーセット | |
| JPH074275B2 (ja) | 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット | |
| JPH03123500A (ja) | 核酸の分別方法 | |
| AU773108B2 (en) | Method of isolation primer extension products with modular oligonucleotides | |
| JPH03127999A (ja) | オリゴヌクレオチドの形成方法 | |
| JPH04187100A (ja) | 核酸の検出方法 |