JPH03123500A - 核酸の分別方法 - Google Patents
核酸の分別方法Info
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- JPH03123500A JPH03123500A JP1261298A JP26129889A JPH03123500A JP H03123500 A JPH03123500 A JP H03123500A JP 1261298 A JP1261298 A JP 1261298A JP 26129889 A JP26129889 A JP 26129889A JP H03123500 A JPH03123500 A JP H03123500A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はウィルス、微生物、あるいは動植物などの核酸
を高感度に検出もしくは定量するために利用される核酸
の分別方法に関するものである。
を高感度に検出もしくは定量するために利用される核酸
の分別方法に関するものである。
ハイブリダイゼーション反応において、標識（ｌａｂｅ
＋）されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
、すなわちプローブは標的核酸と塩基対を形成しうる。
＋）されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
、すなわちプローブは標的核酸と塩基対を形成しうる。
核酸の検出に際しては、種々のハイブリダイゼーション
法が用いられてきた。直接的ハイブリダイゼーション法
では、検体（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）は溶液中または固体担
体に固定されている。固定されるべき核酸は、１つの標
識されたプローブを用いて証明（ｄ ｅ ｍ ｏ ｎ
ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ）されている。
法が用いられてきた。直接的ハイブリダイゼーション法
では、検体（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）は溶液中または固体担
体に固定されている。固定されるべき核酸は、１つの標
識されたプローブを用いて証明（ｄ ｅ ｍ ｏ ｎ
ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ）されている。
米国特許第４４８６５３９号明細書に、サンドイッチハ
イブリダイゼーション法が記載されている。この方法で
は、２つの別個のプローブが用いられている。１つは標
識され検出に用いられる検出プローブであり、他の１つ
は反応混合物から標的核酸を分離するために固体担体に
固定化された捕捉プローブである。
イブリダイゼーション法が記載されている。この方法で
は、２つの別個のプローブが用いられている。１つは標
識され検出に用いられる検出プローブであり、他の１つ
は反応混合物から標的核酸を分離するために固体担体に
固定化された捕捉プローブである。
このような従来のフィルターを支持体とした核酸のハイ
ブリッド形成分析では、検体試料中の核酸の固定、プレ
ハイブリダイゼーション、標識プローブとのハイブリッ
ド形成、洗浄、検出という一連の操作を必要とするので
時間がかかり、例えば臨床実験で日常的に用いるのには
適さないという問題を有する。
ブリッド形成分析では、検体試料中の核酸の固定、プレ
ハイブリダイゼーション、標識プローブとのハイブリッ
ド形成、洗浄、検出という一連の操作を必要とするので
時間がかかり、例えば臨床実験で日常的に用いるのには
適さないという問題を有する。
特に核酸の固定化における焼き付け、プレハイブリダイ
ゼーション、洗浄という操作は煩雑で、分析に要する時
間を長くする原因となっている。［Ｌｉｎ ｅｔ
ａ＋、： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ。
ゼーション、洗浄という操作は煩雑で、分析に要する時
間を長くする原因となっている。［Ｌｉｎ ｅｔ
ａ＋、： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ。
Ｖｏｌ、５５． ５０９ ページ（１９８５）］。
また、フィルター上でのハイブリッド形成は、固相の一
本鎖核酸と液相の標識プローブとの反応が溶液中で不均
一な状態で実施されるため、ハイブリッドの形成速度が
遅いという問題を有する。しかもハイブリッド形成効率
は極めて低（、通常、添加された標識プローブのうち計
算上期待される値の数％がハイブリッド形成に利用され
るにすぎない。
本鎖核酸と液相の標識プローブとの反応が溶液中で不均
一な状態で実施されるため、ハイブリッドの形成速度が
遅いという問題を有する。しかもハイブリッド形成効率
は極めて低（、通常、添加された標識プローブのうち計
算上期待される値の数％がハイブリッド形成に利用され
るにすぎない。
さらに、フィルターを支持体とした核酸のハイブリッド
形成分析は、感度や精度が低いという問題もある。
形成分析は、感度や精度が低いという問題もある。
以上の点から最近では溶液中でのハイブリダイゼーショ
ンが注目されている。
ンが注目されている。
溶液中でのハイブリダイゼーション法は、英国特許出願
公開第２１６９４０３号明細書に記載されている。この
方法においては、同一液相中に共存する２つの異なるプ
ローブが用いられている。検出プローブには検出されう
る標識が標識されており、捕捉プローブには他の部分（
ｍ ｏ Ｉ ｅ ｔ ｙ ）に対して親和性を有する部
分が付着されている。ハイブリダイゼーション後、捕捉
プローブ、標的核酸および検出プローブの間で形成され
たハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）は、親和性ペア（ｐａ
ｉｒ）の他の部分によってハイブリダイゼーション溶液
から分離（分別）されうる。
公開第２１６９４０３号明細書に記載されている。この
方法においては、同一液相中に共存する２つの異なるプ
ローブが用いられている。検出プローブには検出されう
る標識が標識されており、捕捉プローブには他の部分（
ｍ ｏ Ｉ ｅ ｔ ｙ ）に対して親和性を有する部
分が付着されている。ハイブリダイゼーション後、捕捉
プローブ、標的核酸および検出プローブの間で形成され
たハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）は、親和性ペア（ｐａ
ｉｒ）の他の部分によってハイブリダイゼーション溶液
から分離（分別）されうる。
上記で述べた方法では２つのプローブ即ち捕捉用プロー
ブ及び標識プローブを用いているためそのどちらをも調
製しそれぞれ捕捉用及び標識に関する処理を必要とする
。
ブ及び標識プローブを用いているためそのどちらをも調
製しそれぞれ捕捉用及び標識に関する処理を必要とする
。
また一方を捕捉用とし一方を標識する方法も考え得るが
、これも捕捉用及び標識用の処理を別々に行わざるを得
ず煩雑さは免れえない。
、これも捕捉用及び標識用の処理を別々に行わざるを得
ず煩雑さは免れえない。
また従来法では、プローブに捕捉目的のため修飾を施し
ている。
ている。
このため、これがハイブリダイズに影響を与え正確さに
欠ける要因となる。またこの捕捉目的のための修飾は一
般にある程度長いプローブを前提としているため短いプ
ローブを使用しずらく、部位特異変位の検出等を困難と
している。
欠ける要因となる。またこの捕捉目的のための修飾は一
般にある程度長いプローブを前提としているため短いプ
ローブを使用しずらく、部位特異変位の検出等を困難と
している。
本発明はこのような従来の欠点を解消し工程がきわめて
単純な核酸の分別方法ひいては、高感度の核酸検出もし
くは定量方法に適用しうる分別方法の提供を目的とする
。
単純な核酸の分別方法ひいては、高感度の核酸検出もし
くは定量方法に適用しうる分別方法の提供を目的とする
。
〔課題を解決するための手段及び作用〕そこで、本発明
は、試料核酸とプローブ核酸とを反応溶液中に混合した
状態下でハイブリダイゼーション反応させ、得られた被
分別核酸・プローブ核酸のハイブリッド形成体を、反応
混合物中より抽出する核酸の分別方法において、 ａ）前記ハイブリッド形成体のみｉこ伸展反応によって
担体と特異的に反応する固定化物質を導入する過程と、 ｂ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質が導入されたハイブリッド形成体を反応溶
液中の非ハイブリッド形成体から分離する過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法を提供する。
は、試料核酸とプローブ核酸とを反応溶液中に混合した
状態下でハイブリダイゼーション反応させ、得られた被
分別核酸・プローブ核酸のハイブリッド形成体を、反応
混合物中より抽出する核酸の分別方法において、 ａ）前記ハイブリッド形成体のみｉこ伸展反応によって
担体と特異的に反応する固定化物質を導入する過程と、 ｂ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質が導入されたハイブリッド形成体を反応溶
液中の非ハイブリッド形成体から分離する過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法を提供する。
また、試料核酸とプローブ核酸とを反応溶液中に混合し
た状態下でハイブリダイゼーション反応させ、得られた
被分別核酸・プローブ核酸のハイブリッド形成体を、反
応混合物中より抽出する核酸の分別方法において、 Ｃ）前記ハイブリッド形成体のみに伸展反応によって担
体と特異的に結合する固定化物質及び標識物質を導入す
る過程と、 ｄ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質及び標識物質が導入されたハイブリッド形
成体を反応溶液中の非ハイブリッド形成体から分離する
過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法を提供するもの
である。
た状態下でハイブリダイゼーション反応させ、得られた
被分別核酸・プローブ核酸のハイブリッド形成体を、反
応混合物中より抽出する核酸の分別方法において、 Ｃ）前記ハイブリッド形成体のみに伸展反応によって担
体と特異的に結合する固定化物質及び標識物質を導入す
る過程と、 ｄ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質及び標識物質が導入されたハイブリッド形
成体を反応溶液中の非ハイブリッド形成体から分離する
過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法を提供するもの
である。
本発明における検出しようとするＤＮＡまたはＲＮＡの
配列は特定の生物に限定されるものではない。
配列は特定の生物に限定されるものではない。
ウィルスあるいは細菌、真菌、原生動物などの微生物、
動植物細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡでよく、それが断
片であっても２重鎖であっても単鎖であってもかまわな
い。
動植物細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡでよく、それが断
片であっても２重鎖であっても単鎖であってもかまわな
い。
プローブの塩基配列は、特定の核酸配列の存在、不存在
を検出しようとするＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列に対
し相補性を有しており、その塩基数は検出しようとする
ＤＮＡまたはＲＮＡにより最適なものを選べばよく、特
に制限を設けない。
を検出しようとするＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列に対
し相補性を有しており、その塩基数は検出しようとする
ＤＮＡまたはＲＮＡにより最適なものを選べばよく、特
に制限を設けない。
まず、前述のａ）及びｂ）過程を有する核酸の分別方法
について説明する。
について説明する。
第１図（１）、 （２）、 （３）に本発明の詳細
な説明するための模式図を示した。
な説明するための模式図を示した。
第１図中、符号１は試料核酸、２はプローブ核酸、３は
固定化物質、４は担体を示す。
固定化物質、４は担体を示す。
第１図（１）から（２）はハイブリッド形成体に伸展反
応によって固定化物質を導入した過程を示している。
応によって固定化物質を導入した過程を示している。
次に第１図（３）で示すように該固定化物質に担体を結
合させる。本発明でいう固定化物質は、重合試薬との併
用により伸展反応でＤＮＡハイブリッド形成体に導入さ
れるヌクレオチドトリフオスフェート先こ担体と特異的
親和性により結合する結合基を有したヌクレオチドトリ
フオスフェート誘導体であり、具体的に上記ヌクレオチ
ドトリフオスフェート誘導体として、ビオチン、重金属
誘導体、ホモポリヌクレオチド類等が使用される。
合させる。本発明でいう固定化物質は、重合試薬との併
用により伸展反応でＤＮＡハイブリッド形成体に導入さ
れるヌクレオチドトリフオスフェート先こ担体と特異的
親和性により結合する結合基を有したヌクレオチドトリ
フオスフェート誘導体であり、具体的に上記ヌクレオチ
ドトリフオスフェート誘導体として、ビオチン、重金属
誘導体、ホモポリヌクレオチド類等が使用される。
また上記重合試薬として、Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫ
ｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆
転写酵素等が使われる。
メラーゼ、Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫ
ｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆
転写酵素等が使われる。
本発明でいう担体は、前記ヌクレオチドトリフオスフェ
ート誘導体と親和性により結合し、ヌクレオチドトリフ
オスフェートとは結合しないもので、ヌクレオチドトリ
フオスフェート誘導体と結合することによりハイブリッ
ド形成体を非ハイブリッド形成体より分離できる性質を
有しているものであればよい。
ート誘導体と親和性により結合し、ヌクレオチドトリフ
オスフェートとは結合しないもので、ヌクレオチドトリ
フオスフェート誘導体と結合することによりハイブリッ
ド形成体を非ハイブリッド形成体より分離できる性質を
有しているものであればよい。
具体的には親和性ペアの部分は、他の成分（ｃｏｍｐｏ
ｎｅｎｔ）に対する親和性を有する成分である。たとえ
ば、ピオチン−アビジンまたはストレプトアビジン、重
金属誘導体−チオ基ならびにポリｄＧ−ポリｄＣ。
ｎｅｎｔ）に対する親和性を有する成分である。たとえ
ば、ピオチン−アビジンまたはストレプトアビジン、重
金属誘導体−チオ基ならびにポリｄＧ−ポリｄＣ。
ポリｄＡ−ポリｄＴおよびポリｄＡ−ポリＵのような種
々のホモポリヌクレオチド類がそのような親和性ベアと
してあげられる。
々のホモポリヌクレオチド類がそのような親和性ベアと
してあげられる。
分離としては、第２図もしくは第３図に示される態様が
ある。
ある。
なお、本発明においては、前述のａ）、ｂ）過程を有す
る方法におけるプローブ核酸にあらかじめ標識物質を導
入させてお（ことができる。
る方法におけるプローブ核酸にあらかじめ標識物質を導
入させてお（ことができる。
さらに、以下の（ｃ）から（ｄ）の過程を有する方法を
用いれば、あらかじめ標識させておく必要がなく、より
簡便な方法が提供できる。
用いれば、あらかじめ標識させておく必要がなく、より
簡便な方法が提供できる。
標識物質としては放射性同位元素、蛍光物質、化学発光
物質または酵素等の標識物質を用いることができる。
物質または酵素等の標識物質を用いることができる。
Ｃ）前記ハイブリッド形成体のみに伸展反応によって担
体と特異的に反応する固定化物質及び標識物質を導入す
る過程と、 ｄ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質及び標識物質が導入されたハイブリッド形
成体を反応溶液中の非ハイブリッド形成体から分離する
過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法。（第４図（］
）〜（３）参照） 第４図において、符号１〜４は前述の通り、５は標識物
質を示す。
体と特異的に反応する固定化物質及び標識物質を導入す
る過程と、 ｄ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質及び標識物質が導入されたハイブリッド形
成体を反応溶液中の非ハイブリッド形成体から分離する
過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法。（第４図（］
）〜（３）参照） 第４図において、符号１〜４は前述の通り、５は標識物
質を示す。
以下に具体的例を示して、本発明の態様を詳細に示す。
〔実施例１〕
検出しようとする核酸がプラスミドｐＵｃ１９の一部の
塩基配列を保有しているか、本発明に従って実施し、核
酸の検出を行った。
塩基配列を保有しているか、本発明に従って実施し、核
酸の検出を行った。
プローブとして用いる核酸をプラスミドｐＵｃ１９の塩
基配列の一部に対応する下記のような２種類のオリゴヌ
クレオチドをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社３８１人型）に
より合成した。
基配列の一部に対応する下記のような２種類のオリゴヌ
クレオチドをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社３８１人型）に
より合成した。
５’ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧ
ＣＡＧ３’５°ＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧ
ＣＧＣＡＡ３’このうちの３゛末端から８塩基がそれぞ
れ互いに相補的な配列をもつ。
ＣＡＧ３’５°ＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧ
ＣＧＣＡＡ３’このうちの３゛末端から８塩基がそれぞ
れ互いに相補的な配列をもつ。
これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ボリアキリルアミド電気泳動を
行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度で
あったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に用
いた。
、７Ｍ尿素を含む２０％ボリアキリルアミド電気泳動を
行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度で
あったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に用
いた。
エツペンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド ２μ
ｇ（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニーリング溶液（
１００ｍ Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ−ＨＣ１ｐ Ｈ８、０−
６０ｍ Ｍ Ｍ ｇ ＣＩ２−６０ｍＭβ−メルカプト
エタノール−５００ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃｌ ）を５μｌ
加え、蒸留水にて５０μｌに調整した。
ｇ（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニーリング溶液（
１００ｍ Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ−ＨＣ１ｐ Ｈ８、０−
６０ｍ Ｍ Ｍ ｇ ＣＩ２−６０ｍＭβ−メルカプト
エタノール−５００ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃｌ ）を５μｌ
加え、蒸留水にて５０μｌに調整した。
これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分間加温
し、その後室温になるまでゆっくり冷ました（所要時間
約１時間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチドは
下図のような部分的二本鎖を形成する。
し、その後室温になるまでゆっくり冷ました（所要時間
約１時間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチドは
下図のような部分的二本鎖を形成する。
５’ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧ
ＣＡＧ次にこのアニールしたオリゴヌクレオチド溶液２
０μｌ！に１０ｘアニーリング溶液２ μｌ、１ｍＭｄ
ＡＴＰ。
ＣＡＧ次にこのアニールしたオリゴヌクレオチド溶液２
０μｌ！に１０ｘアニーリング溶液２ μｌ、１ｍＭｄ
ＡＴＰ。
ｄＣＴＰ、及び、ｄＧＴＰを各２μｌ加え、さらに、Ｐ
−ＴＴＰ１００μＣ１，さらに、蒸留水を加えて全液量
を４０μｌとした後、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片１単位を加え、水中で１時間反応させた。
−ＴＴＰ１００μＣ１，さらに、蒸留水を加えて全液量
を４０μｌとした後、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片１単位を加え、水中で１時間反応させた。
これをフェノール抽出エタノール沈澱し沈澱物を２０μ
ｌのｄｄＨ２０に解いてプローブ溶液とした。
ｌのｄｄＨ２０に解いてプローブ溶液とした。
一方、検出を行う核酸としてｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９
及びその混合物の３種を用意した。
及びその混合物の３種を用意した。
以後簡便のため、ｐＢＲ３２２を試料Ａ、ｐＵｃ１９を
試料Ｂ１及びｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９混合物を試料Ｃ
と呼ぶことにする。
試料Ｂ１及びｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９混合物を試料Ｃ
と呼ぶことにする。
試料Ａ、 Ｂ、 Ｃをそれぞれ同様に即ち、ｌμｇ／
２μｌの試料ＤＮＡに２．０μＩ！ １０ｘＴＡバツ
フアー１６μＡｄｄＨ２０を加えた反応液に１０ｕｎｉ
ｔのＨｊｎｄ■を加え３７°Ｃ２時間で完全分解した。
２μｌの試料ＤＮＡに２．０μＩ！ １０ｘＴＡバツ
フアー１６μＡｄｄＨ２０を加えた反応液に１０ｕｎｉ
ｔのＨｊｎｄ■を加え３７°Ｃ２時間で完全分解した。
これをフェノール抽出、エタノール沈澱して沈澱物を２
０μｌのｄｄＨ２０にといた。これに先のプローブ溶液
２０μ！（９０℃ ５分加熱した後）及び１０ｘアニリ
ング溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！ ｐＨ８
，０，６０ｍＭＭｇＣＲ２，６０ｍＭ β−メルカプト
エタノール、５００ｍＭ ＮａＣｊ’）を４μｌ加え
、溶液が６５℃となるように加熱し１０分間その温度を
保った後、ゆっくり室温まで冷ました（所要時間（３時
間））。
０μｌのｄｄＨ２０にといた。これに先のプローブ溶液
２０μ！（９０℃ ５分加熱した後）及び１０ｘアニリ
ング溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！ ｐＨ８
，０，６０ｍＭＭｇＣＲ２，６０ｍＭ β−メルカプト
エタノール、５００ｍＭ ＮａＣｊ’）を４μｌ加え
、溶液が６５℃となるように加熱し１０分間その温度を
保った後、ゆっくり室温まで冷ました（所要時間（３時
間））。
この溶液をフェノール抽出、エタノール沈澱し、沈澱物
を５０μｌのｄｄＨ２０にといた。
を５０μｌのｄｄＨ２０にといた。
この溶液に１ ｍ Ｍ ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、 ｄ Ｇ
Ｔ Ｐ 、及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｌ！、０．４ｍ
Ｍビオチン化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μＩ！、ｌｏ
ｘアニーリング溶液５μｌ。
Ｔ Ｐ 、及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｌ！、０．４ｍ
Ｍビオチン化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μＩ！、ｌｏ
ｘアニーリング溶液５μｌ。
蒸留水３２μｌを加え、よく混和したあとＤＮＡポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）Ｉ６
単位を加え、３７度にて１時間加温し、伸展反応を行っ
た。
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）Ｉ６
単位を加え、３７度にて１時間加温し、伸展反応を行っ
た。
この溶液に以下の処理をほどこしたゲル粒（直径５ｍｍ
程）を混在させた。ゲル粒はアガロースゲルを粉断した
もので、その表面を臭化シアンで活性化させた後アビジ
ンと結合させたものである。このゲル粒と先の溶液と２
０分間混和させた。この時ＤＮＡ内にとり込まれたビオ
チンはゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する。
程）を混在させた。ゲル粒はアガロースゲルを粉断した
もので、その表面を臭化シアンで活性化させた後アビジ
ンと結合させたものである。このゲル粒と先の溶液と２
０分間混和させた。この時ＤＮＡ内にとり込まれたビオ
チンはゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する。
その後、軽（遠心し上清を廃棄した。ＴＥで２度洗浄を
行った後沈澱物の強度をミンチレーションカウンターで
測定したところｐＵｃ１９を含む生物学試料は１０６〜
’ｃｐｍ以上の強度を示し、ｐＢＲ３２２による生物学
試料はバックグランドの２倍にもいたらず両者には著し
い違いがみられた。
行った後沈澱物の強度をミンチレーションカウンターで
測定したところｐＵｃ１９を含む生物学試料は１０６〜
’ｃｐｍ以上の強度を示し、ｐＢＲ３２２による生物学
試料はバックグランドの２倍にもいたらず両者には著し
い違いがみられた。
〔実施例２〕
検出しようとする核酸がプラスミドｐＵｃ１９の一部の
塩基配列を保有しているか、本発明に従って実施し、核
酸の検出を行った。
塩基配列を保有しているか、本発明に従って実施し、核
酸の検出を行った。
プローブとして用いる核酸をプラスミドｐＵｃ１９の塩
基配列の一部に対応する下記のようなオリゴヌクレオチ
ドをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社３８１Ａ型）により合成
した。
基配列の一部に対応する下記のようなオリゴヌクレオチ
ドをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社３８１Ａ型）により合成
した。
５’ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧ
ＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧ これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ボリアキリルアミド電気泳動を
行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度で
あったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に用
いた。
ＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧ これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ボリアキリルアミド電気泳動を
行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度で
あったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に用
いた。
一方、検出を行う核酸としてｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９
及びその混合物の３種を用意した。
及びその混合物の３種を用意した。
以後簡便のため、ｐＢＲ３２２を試料Ａ、ｐＵｃ１９を
試料Ｂ、及びｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９混合物を試料Ｃ
と呼ぶことにする。
試料Ｂ、及びｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９混合物を試料Ｃ
と呼ぶことにする。
試料Ａ、 Ｂ、 Ｃをそれぞれ同様に即ち、１μｇ／２
μｌの試料ＤＮＡに２．０μｍ １０ｘＴＡバツフア
ー１６μｊ２ｄｄＨ２０を加えた反応液に１０ｕｎｉｔ
のＨｉｎｄ■を加え３７℃ ２時間で完全分解した。こ
れをフェノール抽出、エタノール沈澱して沈澱物を２０
μｌのｄｄＨ２０にといた。これに先のプローブ溶液２
０μ１（９０°０５分加熱した後）及び１０ｘアニリン
グ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’ ｐＨ８
，０，６０ｍ ＭＭｇＣＩ！ ２．６０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、５００ｍＭ ＮａＣｊ’）を４μｌ
加え、溶液が６５℃となるように加熱し１０分間その温
度を保った後、ゆっくり室温まで冷ました。（所要時間
（３時間））この溶液をフェノール抽出、エタノール沈
澱し、沈澱物を５０μｌのｄｄＨ２０にといた。
μｌの試料ＤＮＡに２．０μｍ １０ｘＴＡバツフア
ー１６μｊ２ｄｄＨ２０を加えた反応液に１０ｕｎｉｔ
のＨｉｎｄ■を加え３７℃ ２時間で完全分解した。こ
れをフェノール抽出、エタノール沈澱して沈澱物を２０
μｌのｄｄＨ２０にといた。これに先のプローブ溶液２
０μ１（９０°０５分加熱した後）及び１０ｘアニリン
グ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’ ｐＨ８
，０，６０ｍ ＭＭｇＣＩ！ ２．６０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、５００ｍＭ ＮａＣｊ’）を４μｌ
加え、溶液が６５℃となるように加熱し１０分間その温
度を保った後、ゆっくり室温まで冷ました。（所要時間
（３時間））この溶液をフェノール抽出、エタノール沈
澱し、沈澱物を５０μｌのｄｄＨ２０にといた。
この溶液にＰ−ＴＴＰｌｏｏ μＣｉ １ｍＭｄＡＴ
Ｐ。
Ｐ。
ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰをそれぞれ２ μｌ 、 ０．
４ｍＭピオチン化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｉ；、
１０ｘアニーリング溶液５μ！、蒸留水３２μｌを加え
、よく混和したあとＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏ
ｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度に
て１時間加温し、伸展反応を行った。
４ｍＭピオチン化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｉ；、
１０ｘアニーリング溶液５μ！、蒸留水３２μｌを加え
、よく混和したあとＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏ
ｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度に
て１時間加温し、伸展反応を行った。
この溶液に以下の処理をほどこしたゲル粒（直径５ｍｍ
程）を混在させた。ゲル粒はアガロースゲルを粉断した
もので、その表面を臭化シアンで活性化させた後アビジ
ンと結合させたものである。このゲル粒と先の溶液と２
０分間混和させた。この時ＤＮＡ内にとり込まれたビオ
チンはゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する。
程）を混在させた。ゲル粒はアガロースゲルを粉断した
もので、その表面を臭化シアンで活性化させた後アビジ
ンと結合させたものである。このゲル粒と先の溶液と２
０分間混和させた。この時ＤＮＡ内にとり込まれたビオ
チンはゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する。
その後、軽（遠心し上清を廃棄した。ＴＥで２度洗浄を
行った後沈澱物の強度をシンチレーションカウンターで
測定したところｐＵｃ１９を含む生物学試料は１０３６
〜７ｃｐｍ以上の強度を示し、ｐＢＲ３２２による生物
学試料はバックグランドの２倍未満にとどまり著しい違
いがみられた。
行った後沈澱物の強度をシンチレーションカウンターで
測定したところｐＵｃ１９を含む生物学試料は１０３６
〜７ｃｐｍ以上の強度を示し、ｐＢＲ３２２による生物
学試料はバックグランドの２倍未満にとどまり著しい違
いがみられた。
以上、従来補足用、及び標識用のプローブをそれぞれ用
意する必要があったが、本発明によりハイブリダイズし
たもののみ補足用物質及び標識用物質を同時に取り込ま
せることが可能になり従来の如き煩雑な工程及び２種類
プローブを用意する必要がなくなった。
意する必要があったが、本発明によりハイブリダイズし
たもののみ補足用物質及び標識用物質を同時に取り込ま
せることが可能になり従来の如き煩雑な工程及び２種類
プローブを用意する必要がなくなった。
また修飾を施していないプローブを用いるためハイブリ
ダイズに対するその影響（正確さ）を回避することがで
きた。
ダイズに対するその影響（正確さ）を回避することがで
きた。
以上本発明によりハイブリダイゼーションの後に固定す
ることが可能であるため、ハイブリダイゼーションがプ
ローブ、標的ＤＮＡともに何ら束縛されていない状況で
行われ、その効率を著しく改善することができ同時にバ
ックグラウンドを押えることができた。またハイブリダ
イゼーション後固定相に特異的に固定することが可能な
ため、固定の形態、場所に自由度が増し遺伝子診断の多
様な検出形態が可能となった。
ることが可能であるため、ハイブリダイゼーションがプ
ローブ、標的ＤＮＡともに何ら束縛されていない状況で
行われ、その効率を著しく改善することができ同時にバ
ックグラウンドを押えることができた。またハイブリダ
イゼーション後固定相に特異的に固定することが可能な
ため、固定の形態、場所に自由度が増し遺伝子診断の多
様な検出形態が可能となった。
第１図（１）〜（３）は本発明の詳細な説明するための
模式図、 第２図（１）〜（６）及び第３図（１）〜（６）は本発
明の分別（分離）過程を示すｌ実施例図、第４図（１）
〜（３）は本発明の他の方法を説明するための模式図を
表わす。 図中、符号ｌは試料核酸、２はプローブ核酸、３は固定
化物質、４は担体、５は標識物質を示す。 （４−ン （９七′ン （２２ （らン
模式図、 第２図（１）〜（６）及び第３図（１）〜（６）は本発
明の分別（分離）過程を示すｌ実施例図、第４図（１）
〜（３）は本発明の他の方法を説明するための模式図を
表わす。 図中、符号ｌは試料核酸、２はプローブ核酸、３は固定
化物質、４は担体、５は標識物質を示す。 （４−ン （９七′ン （２２ （らン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）試料核酸とプローブ核酸とを反応溶液中に混合した
状態下でハイブリダイゼーシヨン反応させ、得られた被
分別核酸・プローブ核酸のハイブリッド形成体を、反応
混合物中より抽出する核酸の分別方法において、 ａ）前記ハイブリッド形成体のみに伸展反応によって担
体と特異的に反応する固定化物質を導入する過程と、 ｂ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質が導入されたハイブリッド形成体を反応溶
液中の非ハイブリッド形成体から分離する過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法。 ２）前記プローブ核酸が標識されていることを特徴とす
る請求項１記載の核酸の分別方法。 ３）試料核酸とプローブ核酸とを反応溶液中に混合した
状態下でハイブリダイゼーシヨン反応させ、得られた被
分別核酸・プローブ核酸のハイブリッド形成体を、反応
混合物中より抽出する核酸の分別方法において、 ｃ）前記ハイブリッド形成体のみに伸展反応によって担
体と特異的に反応する固定化物質及び標識物質を導入す
る過程と、 ｄ）さらに該固定化物質に担体を結合させることにより
、固定化物質及び標識物質が導入されたハイブリッド形
成体を反応溶液中の非ハイブリッド形成体から分離する
過程と を含むことを特徴とする核酸の分別方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1261298A JPH03123500A (ja) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | 核酸の分別方法 |
| DE69032239T DE69032239D1 (de) | 1989-10-06 | 1990-10-05 | Verfahren zur Trennung eines Zieloligonucleotids |
| AT90119175T ATE165117T1 (de) | 1989-10-06 | 1990-10-05 | Verfahren zur trennung eines zieloligonucleotids |
| EP90119175A EP0421469B1 (en) | 1989-10-06 | 1990-10-05 | Method for separating a target oligonucleotide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1261298A JPH03123500A (ja) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | 核酸の分別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03123500A true JPH03123500A (ja) | 1991-05-27 |
Family
ID=17359855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1261298A Pending JPH03123500A (ja) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | 核酸の分別方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0421469B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03123500A (ja) |
| AT (1) | ATE165117T1 (ja) |
| DE (1) | DE69032239D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5017258A (en) * | 1986-06-20 | 1991-05-21 | Shell Oil Company | Pipe rehabilitation using epoxy resin composition |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4106251A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation |
| US9670527B2 (en) | 2011-06-29 | 2017-06-06 | The Johns Hopkins University | Enrichment of nucleic acids by complimentary capture |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60244300A (ja) * | 1984-05-07 | 1985-12-04 | アライド―シグナル・インコーポレーテッド | 組換えタンパク質を用いる置換ポリヌクレオチド検定および診断用キツド |
| JPS61243098A (ja) * | 1985-03-15 | 1986-10-29 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | オリゴヌクレオチドの標識付け |
| JPS62188970A (ja) * | 1985-12-11 | 1987-08-18 | カイロン コーポレイション | 液相核酸サンドイツチアツセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプロ−ブ |
| JPH01222800A (ja) * | 1987-10-09 | 1989-09-06 | Orion Yhtymae Oy | 核酸を検出する方法、それに用いる器具およびキット |
| JPH0242999A (ja) * | 1988-03-10 | 1990-02-13 | Imperial Chem Ind Plc <Ici> | ヌクレオチド配列を検出する方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766064A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit |
| CA1278755C (en) * | 1985-03-15 | 1991-01-08 | William J. Knowles | Labelling of oligonucleotides |
| US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
| CA1325761C (en) * | 1987-12-25 | 1994-01-04 | Takanori Oka | Method of detecting an intended nucleic acid in a sample |
| AU633036B2 (en) * | 1988-12-09 | 1993-01-21 | Chemicon International, Inc. | Amplified dna assay |
| CA2044591C (en) * | 1989-02-13 | 2002-08-13 | James Langham Dale | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
-
1989
- 1989-10-06 JP JP1261298A patent/JPH03123500A/ja active Pending
-
1990
- 1990-10-05 EP EP90119175A patent/EP0421469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-05 DE DE69032239T patent/DE69032239D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-05 AT AT90119175T patent/ATE165117T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS62188970A (ja) * | 1985-12-11 | 1987-08-18 | カイロン コーポレイション | 液相核酸サンドイツチアツセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプロ−ブ |
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| US5017258A (en) * | 1986-06-20 | 1991-05-21 | Shell Oil Company | Pipe rehabilitation using epoxy resin composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0421469A3 (en) | 1993-02-24 |
| EP0421469B1 (en) | 1998-04-15 |
| ATE165117T1 (de) | 1998-05-15 |
| EP0421469A2 (en) | 1991-04-10 |
| DE69032239D1 (de) | 1998-05-20 |
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