JPH03216186A - キメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キメラヘパドナウィルスコア抗涼蛋白の構築
に関する。

Ｂ型肝炎ウィルスは、３２００ヌクレオチドがらなる部
分的に２重鎖のゲノムをもったヘパドナウイルスである
。本ウィルスのＤＮＡは、同様に、ウイルスによってコ
ードされた表面抗原（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，　Ａｎｎ．　
Ｒｅｖ．　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ．旦，３５７−３７７．
１９７７）によって包まれているウィルスによってコー
ドされたコア抗原（ＨＢｃＡｇ）によって囲まれている
。表面抗原を温和な洗剤て・除去すると、トｌＢｃＡｇ
とウィルスＤＮＡがらなるｉ径２７ｎ＊のコア粒子が残
る。｝−ＩＢｃＡＱは、微生物のｓ１抱において、天然
のままのポリベプヂドとしＣ、及びβ−ガラクトシダ〜
ゼの末端の８ヶの９！Ｕ基（参照、Ｈｕｒｒａｙら、Ｅ
ＭＢＯＪ．３．６４５−６５０．１９８４）に融合した
誘導体として発現された。

大腸菌において合成されるとき、コア蛋白自体は、２７
ｎ一の粒子となって集合するか、これは、電子顕微鏡下
でみることができ（　ＣｏｈｅｎとＲ＋ｃｈｓｏｎｄ，
　　Ｎａｔｕｒｅ，　　　２９６，　　　６７７−６７
８．　　　１９８２）、実験動物において免疫原性であ
る（Ｓｔａｈｌ　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａ
ｄ．　Ｓｃｉ．　ｔｌｓＡ　　７９，１６０６−１６１
０．１９８２＞。コア抗原のアミノ酸配列には、カルボ
キシル末端の近くにあるブロタミン（ＤＮＡ結合蛋白》
中に見出される配列と相同であるところの１領域が存在
している。

推測により、分ｆのこの部分か、コア粒子の集合の問に
ＤＮＡと相互作用寸るものと示唆されている（　Ｐａｓ
ｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ，　２　８　２　，　５　７　５
　−　５　７　９　．１９７９）。　Ｂ型肝炎コア抗原
と非相同蛋白配列を含む組換え体粒子の強力な免疫原部
分とじての使用については、十分報告されている。我々
は蛋白の７ミノ末端に対して非相同配列を付加した結果
、その表面に非相同エピトープが高密度で差出され、実
Ｉｆ動物に接種されたとき、高度に免疫原性である粒子
構造となって、自動的に集含するコトを以前に示した（
　Ｃｌａｒｋｅら、Ｎａｒｕｒｅ　　３　３　０　．３
８１−３８４．１９８７＞。同じ様な結果か、我々の系
を使用して他のグループによって報告されている（例え
ば、Ｃｈａｎｇら、正の鎖のＲＮＡウイルスに関する第
２回国際シンポジウム、Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ
，　１　９　８　９　．要旨０１０）。

他のグループのその後の実験によって、該蛋白のカルボ
キシル末端からの、約４０のアミノ酸を、非相同配列で
置換え、依然として粒子の形態を保つことが可能である
ことが示された（　Ｓｔａｈｌ　とＨｕｒｒａｙ，　　
Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　　八ｃａｄ．　　Ｓｃｉ．
　　ＩＩＳＡ，　　８　　６　　　　６２８３−６２８
７．１９８９）。その上、これらの粒子は、明らかにア
ミン末端融合よりは弱いけれども、やはり抗原性である
。

これらの融合粒子が加えられたエピトープに対するすぐ
れた免疫応答を誘導するというｌ実にもかかわらず、い
くつかの観点から、依然として改善の余地が残されてい
る。加えられたエピトープに対する免疫応答は、すばら
しいとはいえ、トＩＢｃＡｑ配列に対して発生された相
当する応答には及ばない。第２に、アミノ末端とカルボ
キシル末端の融合においては、ともに、付加したエピト
ープはそれが一方の端だけで共有結合しているため、本
質的な可撓性を有している。これは、立体配座に融通性
がないエピトープにとっては不利となると思われる。第
３に、Ｂ型肝炎コア抗原のモデル構造から、天然て゛は
、蛋白のアミノ基と力ルボキシル基末端は、粒子の内部
に位置していることが予知された（　ＡｒｇｏｓとＦｕ
ｌｌｅｒ，　Ｅ　Ｍ　Ｂ　ＯＪ．１．８１９−８２４．
１９８８）。それらを表面にさし向けるのは、大抵の非
相同エピトープの内在性の親水性のエピトープだけであ
る。

我々は、今や、Ｈ　Ｂ　Ｃ　Ａ　ｇ粒子の表面領域にお
ける高度に免疫原性の領域の位置をつきとめた。

ＨＢＣＡＣ）をコードしていて、この高免疫原性の順域
に制限酵素部位をもっているベクターが構築された。外
来配列を、ゐｌ１限醇糸部位において挿入し、キメラＨ
ＢＣＡＱ蛋白が発現できるようにした。キメラ蛋白は、
外来エピトープがそれらの表面に露出している粒子とな
って自己集合した。

したがっＣ、本発明は、コア抗原がＨ　Ｂ　Ｃ　Ａ　Ｇ
である場合には、アミノ酸残基６８から９０の配列、ま
たは別のヘパドナウィルスコア抗原の場合に相当するア
ミノ酸残塁配列のすべて、または一部の中に、エピトー
プを含む外来アミノ酸配列が挿入されるか、すべてまた
は一部を置換しでいるところのキメラヘパドナウイルス
コア蛋白からなる粒ｆを提供する。ｌｌ　Ｂ　ｃ　Ａ　
ａ残基は、Ｏｎｏら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ
．　　１　１．　１　７４７−１　７５７．１９８３に
よって番号がつけられている。別のヘパドナウイルスの
コア蛋白の相当する残基は、ｌｆ３ｃＡＣＪと他のコア
蛋白の配列を並べあわせることによって決定できる。

キメラ蛋白粒子は、キメラ蛋白が担っているエピトープ
に対して特異的な抗体を作るために用いることができる
。それゆえ、抗体は韻乳類に外来配列が望ましい特異性
の抗体を誘導することかー（゛きるエピトープを含むキ
メラ蛋白から構成されている粒ｆの効果的薯を投与する
ことによって作ることができる。キメラ蛋白粒子は、医
薬として、または動物薬として受入れることができる担
体を含む医薬または動物薬の１成分として、この目的の
ために提供することができる。

本発明は、また、ヘパドナウイルスコア蛋白をコードし
、そして、＠　Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｃ　Ａ　ｇアミノ酸残基６
８から９０、または、別のヘパドナウイルスの相当する
配列内に１つの制限酵素部位をもつか、υ１−ＩＢｃＡ
ｑのアミノ酸残１６８から９０までをコードする配列、
ＨＢＣＡＣＪのアミノ酸残基６８から９０までをコード
する配列の１部、または、別のヘパドナウイルスのコア
蛋白の相当する配列の側面にある２つの制限部位をもっ
ているＤＮＡ配列を提供する。ＨＢＣＡＱコドン６８か
ら９０まで、または、別のヘパドナウイルスのフナ蛋白
についてのそれらの相当するコドンか、完全にまたは部
分的欠失している場合は、制限部位は、残っている配列
において適当に位置される。２つの制限酵素部位が用意
される場合には、桑型的にはそれらは同じ酵素によって
切断される部位である。

このようなＤＮＡ配列を組込むあるベクターを構築する
ことができる。本ベクターは、宿主内に提供される。本
ベクターは、本発明のキメラ蛋白を発現することができ
るベクターの調整のために、１つの出発点を提供する。

この目的のためには、キメラ蛋白をコードするＤＮＡ配
列が構築される必要がある。さらに具体的には、このよ
うなＤＮＡ配列を組込み、適切な宿主に提供される場合
に、該キメラ蛋白を発現することができるベクターが必
要である。

キメラ蛋白を発現することができるベクターは、外来配
列をコードするＤＮＡ配列を、ヘパドナウイルスコア蛋
白をコードし、そして、上述の制限解木部位、（単数）
（ａ）または、（複数）（ハ）、をもつベクターの中に
挿入することによって調製される。好ましくは、ｉｉ＋
１限酵素部位〈ωは、Ｈ　Ｂ　Ｃ　Ａ　Ｑ」トン８０と
８１にあるか、ｂし＜は、別のヘパドナウイルスのコア
蛋白についての相当ずる：１ドンにある。さもなければ
、２つの制限部位（ハ）は、１つの隣接部がＨＢＣＡＯ
コドンの６８と６９において、他の隣接部か、８０と８
１において、または再び別のヘパドナ『クイルスのコア
蛋白質については、その相当する」ドンにおいて用意さ
れることができる。その結果生じたキメラ蛋白をコード
するベクターは、典型的には、適合性の宿主中に提供さ
れる。

キメラ蛋白を得るためには、宿主体は、キメラ蛋白が発
現されるような条件下で培養される。宿主は、キメラ蛋
白をコードする発現ベクターを提供される。キメラ蛋白
は、発現したときは、自動的に集合して粒子となり、そ
して、単離することができる。これらの粒子は、Ｂ型肝
炎ウイルスを変性させることによって得ることができる
ＨＢＣＡＱと、ウイルスＤＮＡから構成されている２７
ｒ＋ｎコア粒子に極めて似ている。外来エピトープは、
粒子の外表に露出している。

キメラ蛋白は、エピトープを含む外来アミノ酸配列を含
む。゛外来″とは、その配列がヘパトナウイルスコア蛋
白の配列の部分ではないことを意味する。ｔ−｛　Ｂ　
ｃ　Ａ　Ｑアミノ酸残基の６８から９０までのすべて、
または１部内に挿入されたか、づぺて、または１部を置
換している外来配列は、それゆえ、ｊ〜り肝炎ウイルス
、特にアヒル（　　Ｆｃｉｔｅｌｓｏｎ　　とＭｉｌｌ
ｅｒ，　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　　八ｃａｄ．　
　ＳｃＵＳＡ．８５．６１　６２−６１　６６．１　９
８８）からのウイルスのＨＢｅ１エピトープの予知され
た位置の近くの３９の挿入部分の１部またはすべてでは
ない。キメラ蛋白のヘパドナウイルス］ア蛋白は、典型
的には、噛乳類のヘパドナウイルスコア抗原、特にヒト
のＨＢｃＡｇ、またはウッドチャックのＷ　Ｈ　Ｃ　Ａ
　ｇである。Ｂ型肝炎ウイルスａｄｗ血清型ＨＢｃＡｑ
が使用されることがある。

どんな外米エピトープ、すなわち、ヘパドナウイルスコ
ア蛋白のエビトープでないエピトープは、キメラ蛋白の
１部として提供することができる。

１ピトープは、抗体を産生ずることができるアミノ酸残
基の配列である。該エピトープは、例えば、感染体また
はウイルスやバクテリアのような病原体のエピトープの
ように、中和抗体を産牛することができるエピトープで
あってよい。それは、生長ホルモンのような非感染作用
体のエピトープであってもよい。外来配列（．！、例え
ば１つのエピトープの８こまでの、またｔよ４こ迄のコ
ピーのように、１つのエピトープの繰返しを含んでいて
よい。

それゆえ、外来配列中には、エピトープの２つのコピー
が存在ずることがある。外来配列は、例えば、３または
４この２つ以上の巽なるＪピトープを含んでいてよい。

そのエピトープか、そこに与えられてよいウイルスの例
として、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフ
ルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、ポリオウイルス（
ｐＶ）．単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（　Ｈ　Ｉ
　Ｖ−１　）　、Ｈ　Ｉ　Ｖ一２、サル免疫不全ウイル
ス（ＳＩＶ）、ヒトノイノウイルス（ＨＲＶ）、デング
熱ウイルス及び黄熱病ウイルスがあげられる。それゆえ
、キメラ蛋白によって与えられるエピトープは、ＨＢｃ
△（】のエビ１〜−ブ、ｌ−Ｉ　Ｐ．　ｃ　Ａ　ｇのｐ
　ｒ６　−Ｓ領域のエピトープまたは｝ｌ　Ｒ　Ｖ　２
の１ピトーブであってよい。

キメラ蛋白中の外来配列は、例えば、５０こまでのよう
に、１００こまでのアミノ酸残塁の長さがあってよい。

イれゆえ、外来配列は、長さが４０こまで、３０こまで
、２０こまでまたは１０こまでのアミノ酸残酷であって
よい。外来配列は、それに対し、抗体を誘導することが
望まれるエピトープを含んでいる。外来配列はまた、エ
ピトープのいずれか一方、または両末端に、さらにアミ
ノ酸残塁を含むことがある。

さらに、アミノ酸残基が存在している場合には、これら
は、ヘパドブウイルスコア抗原をコードするベクターに
望ましいエビトープをコードしているＤＮＡを挿入する
のに必要な操作によって決定することができる。それら
は、天然にエピトープに並列しているアミノ酸であって
よい。例えば、４こまでのように１０こまでのアミノ酸
を、さらに外来エピトープの末端に促供してよい。

外来の配列は、例えば、ｌ−Ｉ　Ｂ　ｃ　Ａ　ｇ残基配
列６９から９０、７１から９０、または７５から８５の
ように６８から９０の、または別のヘパドナウイルスコ
ア蛋白の相当する残基の中に挿入しでよい。最も好まし
いのは、外来配列を、ＨＢｃＡｇのアミノ酸残５８０と
８１の間、または別のヘパドナウイルスのコア蛋白の相
当する残基間に挿入することである。代替策としては、
’Ｊ７？Ｊｉ白残基の配列のすべて、または１部は、外
来配列によって置換することができる。それゆえ、ＨＢ
ＣＡＱのアミノ酸残基７５から８５、８０と８１、また
は、より好ましくは、７０から７９、または別のヘパド
ナウイルスのコア蛋白の相当する残基は、それゆえ、外
来の配列によって置換することができる。外来配列が天
然のままのコア蛋白配列のづべて、または１部を置換す
る場合には、挿入された外来配列は、それが置換するＨ
　Ｂ　Ｃ　Ａ　ｑ配列よりも一般的に短かくない。

２番目の外来アミノ酸の配列は、コア蛋白のアミノ酸の
Ｎ末端またはＣ末端に融合づることができる。この２番
目の外来配列も、エピトープを含むことかぐきる。この
エピトープは、ＨＢＣＡＱアミノ酸残塁６８から９０、
または別のヘパドナウイルスのコア蛋白の相当する残基
のすべて、または１部内に挿入されたか、すべて、また
は１部を置換するエピトープ（第１のエピトープ）と同
一であっても、異っていてもよい。第１のエピトブに閏
連して、上述したように、どのようなエピトープも、２
番目のエピトープとして存在してよい。２蚕目のエピト
ープを含む外来配列の長さと構造も、第１のエビトープ
に関連して、上に記述された通りであってよい。

キメラ蛋白を調製するためには、発現ベクターがまず構
築される。このようにして、望ましいキメラ蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列が提供される。

該ＤＮＡ配列を組込み、適当な宿主中に捉供されたとき
、１メラ蛋白を発現することができる発現ベクターが調
製される。ＤＮＡ配列に対するブロＬ一ター、転写末端
部位、翻訳開始部位及び停葎フトンをはじめとする適切
な転写ならびに翻訳調節要素が用意される。ＤＮＡ配列
は、ベクターと適合性をもつ宿主において、ポリベブヂ
ドの発現がおこることが可能になるような正しいフレー
ムの中で用意ざれる。

キメラ蛋白を発現することかできる適切なベクターは、
上記のように、ｖ１限醇索部位（ａ）、または、２つの
−１ｒｉ１酵素部位（ヘ）をもつＨＢｃＡｇ発現ベクタ
ーから構築することができる。制限酵素部位（→は、例
えば、ＨＢｃＡｇアミノ酸残基７１から９０、もしくは
別のヘパドナウイルスのコア蛋白の相当する残基内に提
供することができる。

外来のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をｉｌ１限
酵素部位（ａ）において、Ｈ　８　ＣＡ　ｇの発現ベク
ターに挿入するか、制限酵素部位（ハ）の横に接したＤ
ＮＡ配列の代りに挿入する。Ｈ　Ｂ　Ｃ　Ａ　Ｑ発現ベ
クターは、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化され、
脱燐酸化される。外来配列をコードするＤＮＡ配列を切
断した発現ベクターにつなぐ。挿入されたＤＮＡ配列は
、典型的にはオリゴヌクレオチド合成の標準技術によっ
て．ＪＩ’［される。

Ｈ８ＣＡＱ発現ベクターにおける各制限酵素部位は、よ
り好ましくは、ＨＢＣＡＧアミノ酸配列が変化しないよ
うに、ＨＢｃＡｇをコードする配列において提供される
。制限酵素部位（ａ）は、−ＩＢＣＡ（１−］ドン８０
及び８１または別のヘパドナウイルスコア蛋白のための
相当するコドンに存在することができる。より好ましく
は、ＨＢｃＡｇをコードする配列中の］ドン８０と８１
におい℃、ＮｈｅＩ部位が提供される。このようなＮｈ
ｅＩ部位が備えられているＨＢｃＡｑ発現ベクターであ
るブラスミドｐｐｖ−Ｎｈｅを宿しテイるＥ．　ｃｏｌ
ｉ　Ｘ　Ｌ　−　Ｉ　　Ｂｌｕｅを１９８９年９月１２
日にＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　
　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａ　　Ａｂｅｒｄｅｅｎ　ＧＢに、受入れ番号
ＮＧ　ＩＭＢ４０２　１　０の下で寄託した。

これに替る、または付加的な好ましい制限酵素部位は、
Ｈ　［３　ｃ　Ａ　ａコドン６８と６９、または他のヘ
パドナウイルスのコア蛋白についての相当するコドンに
またがっている。適切には、Ｎ　ｈ　ｅ　Ｉ部位（下線
が引かれている）は、以下の如く提供される。

ＡＣＧ　　　　ＣＴＡ　　　　ＧＣＴ Ｔ　　　　　　　Ｌ　　　　　　　Ａ １つのＮｈｅＴ部位か、コドン８０と８１において、コ
ドン６８と６９に上述の如く用意されているＨＢｃＡｑ
の発現ベクターであるプラスミドｐＮ２ｃ．　ｃｏｌｉ
　ＸＩ−−１ＢＩｏｅを、１９９０年８月２０日にＮａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ
　Ａｂｅｒｄｅｅｎ，　ＧＢにおいて受入れ番号ＮＧ　
ＩＭＢ４０３　１　２の下に寄託した。

新しい制限酵素部位は、２つの方法のうちのいずれかに
おいて達成することができる。第１に、それは、この領
域をコードしている制限酵素部位断片を、この領域をコ
ードする一連の合成オリゴヌクレオチドによって置換え
、新規の制限部位を導入することによって達成すること
ができる（例１を参照）。

第２に、それは、同じコード領域（例５を参照）の制限
部位の突然変異誘発によって達成することかでぎる。こ
れは、典型的には１本鎖ＤＮＡを生産することができる
Ｍ１３ｎｐ１８のようなベクターの中に、この領域を代
表する制限断片を、最初にサブクローニングすることに
よって実行することができる。次に、特定部位の突然変
異誘発は、特異的不適性合成オリゴヌクレオチドを使用
して、標準的方法によって達成することができる。次に
、このような突然変異誘発を受ＧＪだ−１限酵素断片は
、適切な発現ベクターにおける親遺伝子中に置換導入す
ることができる。

７ミノ！！１６８から９０の、例えば７１から９０まで
のＨＢｃＡｇの］一ディング配列のすべて、または１部
か、制限酵素部位によって置換されたトＩＢＣＡＣ＋の
発現ベクターの場合には、外来アミノ酸配ｊノをコード
するＤＮＡ配列か、上に述べられたように挿入されるこ
とができる。このＤＮＡ配列は、リジン残基の外に天然
のｌ−Ｉ　Ｂ　Ｃ　Ａ　（Ｊアミノ酸配列の部分か、６
８と９０残基の間で提供されるように、１つ以上の天然
のＨ　Ｂ　Ｃ　Ａ　ｇ残基をコードすることができる。

例えば、ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｃ　Ａ　ｕ残基６８．６９及び７
０は、この方沫で提供されることができる。

キメラ蛋白をコードする発現ベクターは、適切な宿主に
おいて提供ざれている。そのとぎ、キメラ蛋白が発現さ
れる。ベクターを宿している細胞は、発現がおこること
が可能にように生育させるか、培養する。発現されるキ
メラ蛋白は、自動的に集合して粒子となる。そのとき、
キメラ粒ｆを単離することができる。

いかなる適切な宿主一ベクター系も用いることができる
。ベクターはブラスミドであってよい。

その場合において、Ｅ．　ｃｏｌｉやＳ．　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのような細菌または酵母の宿主を用いること
ができる。代替策としては、ベクターは、ウイルスのベ
クターであってよい。これは、ポリベブチドの発珊を起
りために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
のような噛乳類細胞系の細胞を、トランスフエクトする
のに使用することができる。

キメラ蛋白は、ヒトまたは動物のためのワクチンとして
使用することができる。それは、どのような適切な方法
においても投与されることができる。経口投与か、皮下
、静脈または筋肉内投与のような、非経口経路かのいず
れを選ぶか、そして、投与量の選択は、予防接種の目的
と予防接ｉ４されるのがヒトであるか噛乳動物であるか
に依存している。同様な基準によって、ワクチン製剤に
おいて使用される生理学的に受入れることができる担体
または希釈剤が左右される。従来の製剤、担体または希
釈剤を使用することができる。しかし、典型的には、融
合蛋白は、経口、または非経口経路によって、用量あた
り１−１０００μｇ、より好ましくは、用看あたり１０
−１００μ９の槍で投与される。

以下の例は、本発明を具体的に説明する。随伴している
図面において： 第１図に、ブラスミドｐＢｃ４０４が示されている。Ｂ
，Ｅ，及びＰは、それぞれＢａｍＨ１，ＥｃｏＲＩ及び
Ｐｓｔ工についての制限酵素部位を示１。ｔａｃはｔａ
ｃプロモーターを意味し：ｏｒｉは複製の起点を意味り
る；ｂｌａは、βラクタマーゼ、そし、ＳＤはシャイン
ダルガノ配列を意味する。

第２図は、ブラスミドＤＰＶ−Ｎｈｅの構築を示す。

の調製物 発現ブラスミドｐＰＶ４０４は、第１図に示されている
親ブラスミドｐ［３ｃ４０４から調製された。ｌ）ＢＣ
４０４を宿しているＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ　１　０１を
、１９８９年２月９日にＮａｔｌＯｎａＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒ
ｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ　　Ａｂｅｒｄｅｅｎ　ＧＢの
受入れ番号４０１１１の下に寄託した。Ｐ　Ｖ　１　Ｈ
ａｈｏｎｅｙからのＰＶＩのアミノ１１９５から１０４
を表す合成オリゴヌクレオチドを標準的手順によって、
Ｔ４リガーゼを使用して、ｐＢＣ４０４に連結した。こ
の結果、ｐＰＶ４０４を生じた。合成オリゴヌクレオチ
ド、それらか、どのようにともにアニールするか、Ｎ一
末端の延長のコーディング配列は、以下の通りである。

ＬＡ入ＴＴＣＡＧＡＴＡＡＴＣＣＡＧＣＴＡＧＴ入ＣＴ
ＡＣＣＡＡＣＡ入ＡＧＡＴ入ＡＧ　　（］９）２・ＧＡ
ＴＣＣＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＧ
ＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＴＧ　（：］９）入ＡＴＴＣＡＧ
　　ＡＴＡＡＴＣＣＡＧＣ　　ＴＡＧＴＡＣＴＡＣＣ　
　ＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡ　　ＡＧＧＴＣ　　ＴＡＴＴＡ
ＧＧＴＣＧ　　ＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧ　　ＴＴＧＴＴＴ
ＣＴＡＴ　　ＴＣＣＴＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴ
ＡＡＴＣＣＡＧＣＴＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧ
ＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ．．．．．ＣＯＲＥＭＮＳ　　　
ＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＤＬ一一一一一」 ｌ１冫力−　　　　　　　　　　　　／ｉ１Ｆ’ｌイー
ウイｌレス例１：ブラスミドｏＰＶ−Ｎｈｅの調製２０
このアミノ酸の長さの一連ペブチドを化学合成した。こ
れらのべブチドは、互に１０このアミノ酸が重複してい
て、全部でＢ型肺炎ウイルスと血清型からのコア蛋白の
全アミノ酸配列を表している。これらのべブチドの各々
か、炭酸塩コーティングバッファ−中で、ミクロタイタ
ープレートをコートするのに用いられ、モルモットから
の血清でのエンザイムーリンクトイムノソルベントアツ
セイ（ＥＬＩＳＡ）分析において使用さｔした。

モルモットに細菌を宿主として発現した肝炎Ｂ］ア粒子
を接種しておいた。

アミノ酸７１から９０に相当するベブチドの１つか、極
めて強力な反応を与えた。これは、コア粒子が直線ペブ
チドと反応した抗体を、ニュｖｉｖｏで引出したことを
示している。該配列は、大ざっぱに、肝炎Ｂのコア粒了
（　Ｗｉ　Ｉ　ｌ　ｉａｍｓとＬｅＢｏｕｖｉｅｒ　，
　Ｂｉｂｉｌｏｔｈｅｃａ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ
ａ±３−，７１−７５．１９７６）の報告されているＨ
３ｅ　ｌエピトープに相当した。我々の結果から、外来
のエビトープによるＨＢｃＡｇのこの免疫優勢域（　ｉ
ｌｌｌＵｎｏ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）の挿
入またはそれによる置換の結果、外来エピトープに関す
る免疫性の増強を示すキメラ蛋白を生ずることを示唆し
た。それゆえ、我々は、外来配列をａｄｗコア配列に挿
入することを試みた。

我々が従った戦略は、第２図に示されている。

最初、プラスミドは、ブラスミドｐＰＶ４０４であった
。このブラスミドは、動物において極めて免疫性の強い
キメラ粒子を、バクテリア中で大…に発現する。その戦
略は、コア遺伝子中のアミノ酸の位置８０−８１にあけ
る独特なＮｈｅＩ制限部位の導入を含んでいる。これは
コア蛋白中において、アミノ酸の変化を生じない。突然
変異の性質は、以下の通りである Ｍｎｎｏａｃｌｄ　　　Ｌ　　Ｅ　　Ｄ　　Ｐ　　Ａ　
　Ｓ’　　Ｒ　　Ｄ　　Ｌａｄｗ　　　　　　　　　　
　ＴＴＧ　　Ｇ八入　Ｇ八Ｔ　　ＣＣＡ　　ＧＣＡ　　
ＴＣＣ　　入ＧＧ　　ＧＡＴ　　ＣＴＡａｄｗ−Ｎｈｅ
工　　　　　ＴＴＧ　　ＣＡ．Ａ　　ＧＡＴ　　ＣＣＡ
　　ＧＣＴ　　ＡＧＣ　　ＡＧＧ　　ＧＡＴ　　ＣＴＡ
最初にｐＰＶ４０４を制限酵素Ｘｂａ　ｌとＡｃｃｌＩ
［で消化し、その結果、．３．９６ｋｂｐと３４０ｂｐ
の２つの断片を生じた。これらの断片を、電気泳動で分
離し、切出し、比較的小さい断片をさらに、ＸｈｏＩ［
で消化し、その結果、第２図において示されるように３
つの断片を生じた。

第２図に示した如くの配列をもった、２つのオリゴヌク
レオチドを同時に合成した。これらのオリゴヌクレオチ
ドを、それらがＸｈＯ■適合性の付＠端及び内部のＮｈ
ｅＩ部位をもったリンカーとなるように標準的方沫によ
ってアニールさせ、リン酸化した。次に、これらのオリ
ゴヌクレオチドは、３４０ｂｌ）の断片に連結され、１
９ｂｌ）の天然のＸｈｏＩＩ断片と置き換えた。この連
結物質は、次に、大きな３．９６ｋｂｐ断片に連結し戻
し、標準法によって、Ｅ．　ｃｏｌｉの株Ｘ　Ｌ　−　
Ｉ　Ｒｉｖｅに導入して形質転換した。

この戦略のデザインは、天然の１９ｂｌ）Ｘｈｏ［断片
がベクター中に再挿入される可能性を除外していない。

新しいＮｈｅＩ部位を含むブラスミドを宿しているバク
テリアを選択するために、形質転換によって発生した組
換え体のクローンすべてから培養物を調製した。次に、
この培養物を使用して、コロニーの全“ライブラリー″
を代表しているブラスミドＤＮＡを抽出した。塩化セシ
ウムで精製した後、このＤＮＡをＮｈｅＩで消化した。

新しいリンカーを担っているこれらの組換え体のブラス
ミドのみ、この方法によって消化され、その結果、この
集団の線形化に至った。したがって、線形のＤＮＡは、
残りの未消化分子から、アガロースグル電気泳動により
精製し、再連結の後、Ｅ．　ｃｏｌｉに導入して形質転
換し戻し、ＮｈｅＩ陽性の形質転換体の集団を得た。個
々のクローンを制限＃素部位地図作成によって分析した
。挿入ＮｈｅＩ部位をもつことが確認されたＮｈｅ１部
位は、ＤＮＡ配グ１決定によって、さらに特徴づけを行
った。得られたクローンＯＰＶ−Ｎｈｅの正しい配列を
もつでいた１つの制限酵素部位の地図を第２図に示して
ある。

前に述べた通り、実験のデザインによって正しいＨＢｃ
Ａｇのアミノ酸配列の維持が確保された。

したがって、イソプロごルーβ−Ｄ−ヂオガラクトビラ
ノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した後の発現分析により高収
儒のＰＶ−ＨＦ３ｃＡｏ粒ｆの存在が確認されたことは
、驚くにあたらない。

例２：キメラト＋ＢＣＡＱ蛋白から構成されでいる粒子
の：ｌ４製 ｐＰＶ−Ｎｈｅが非相同性配列を発現する能力は、始め
は、ヒトライノウイルス２型（トＩＲＶ２）とＢ型肝炎
表面抗原（ＨＢｓＡａ）からのエピトープの挿入によっ
て評価された。これは、Ｎｈｅ■付者端が横に接してい
る各配列をコードする合成オリゴヌクレオチドをＮｈｅ
工で消化し、脱リン酸したｐＰＶ−Ｎｈｅに導入するこ
とによって達成された。Ｉ）ＰＶ−ＮｈｅのＮｈｅＩ部
位に挿入された配列か、以下に示されている。

ＨＲＶ２　　ＶＰ２ ＣＴＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＣＧＧ入入入ＣＧＣＧＴＴＴ
ＧＡＡＣＣＣＡＧ入ＴＣＴＧＣ入ＡＣＣＧＡＣＣＧ入Ａ
ＴＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴＧＣＧＣＡＡＡ
ＣＴＴＧＧＧＴＣＴＡＧ入ＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴ
入ＣＧＣＧＡＴＣＨＢｓＡａ　　］ｊ９−１４７ ＡＳＧＡＣＴＫＰＴＤＧＮＣＡＧＡＳ ＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣ八入入ＡＣＣＴＡＣ
ＴＧＡＴＧＧＴ入ＡＣＴＧＣＧＣ八ＧＧＴＧＧＣＣＡＣ
ＧＴＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＴＡＣＣＡＴＴ
Ｃ，ＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣ合成オリゴヌクレオ
チドを連結したブラスミドを、Ｅ　ｃｏｌ＋ａ　Ｘ　ｌ
−　−　１　ＢＬｕｅに導入Ｌ’ｒ［１転Ｆｅした。各
新構造体は、分析のための内部の制限酵木部位が存在し
て、得られたクローンの迅速なスクリーニングができる
ようにデザインが行われた。

内部制限酵素部位はＨＲＶ２については、Ｍ１ｕ１であ
り、ＨＢＳＡｇについては、ＳｐｈＩであった。正しい
υｊ限部位を有する得られたクローンを、普通ブイヨン
中で高密度迄培養し、ＩＰＴＧを培地に添加することに
よってキメラ蛋白の発現が誘導された。３７℃で６から
８時間培養した優、バクテリアの細胞を遠心分離によっ
て収穫し、標準的手順によって溶解し、発現蛋白をＰＡ
ＧＥ．ウ１スターンプロット及びエリザで分析した。粒
子構造の存在は、蔗糖密度勾配遠心分離によって決定し
た。

＋４　Ｒ　Ｖ　２エピトープからＨＢＳＡＱのいずれか
を含むキメラ蛋白の発現がＨ寮された。キメラ蛋白は、
自動的に集合して粒子となった。ＨＲＶ２エピトープ構
造物に関する詳細な分析により、バクテリアにおいては
、発現の水準は極めて高く、粒子の形成が雑持され、キ
メラ蛋白がウエスターンプロットによって、抗−Ｈ　Ｒ
　Ｖ　２血清と反応することが示された。エリサ分析に
よってもＨＲＶ２エピトープが粒子の表面に露出してい
ることが示された。

例３：さらなる粒子状キメラＨＢｃＡｑ蛋白の調製 さらにエピトープをｐＰＶ−Ｎｈｅに挿入した。

合成Ａリゴヌクレオチド（複数）を一緒に連結して、■
ビトーブをコードし、ＮｈｅＩ付着末端をもっているＤ
ＮＡ断片を７１４製した。該ＤＮＡ断片をＮｈｅＩで消
化し、脱リン酸したｐＰＶ−Ｎｈｅに挿入した。該ＤＮ
Ａを連結したブラスミドをＥ．　ｃｏｌｉ株ＸＬ−ＩＢ
ｌｕｅに導入して形質転換した。

クローンを普通ブイヨン中で高密度まで培養し、キメラ
蛋白の発現を、Ｉ　ＰＴＧを培地に添加することによっ
て誘導した。３７℃で６−８時間インキユベートした後
、細胞を収穫し、標準法で溶解し、発現した蛋白を｝）
　Ａ　Ｇ　Ｄ、ウエスターンプロット及び／またはエリ
ヂによって分析した。粒子構造の存在は、蔗１ｓ密度勾
配遠心分離によって決定した。

以下のエピトープをもっているキメラ蛋白か、この方法
で得られた。各場合において、エピトープはクローニン
グの手順のため、Ａ−Ｓ残基が横に接して並んでいる。

１　　Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｐｒｅ−８１領域
からのＱＥ１−アミノ酸残基１５から４７。この領域は
、ウイルスと細胞の相互作用に関っている。本配列はａ
ｄｗ血清型から由来した。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド ＴＡＧＧＴＡＣＡＣＧ　　ＡＴＣ （ハ）コーディング配列 Ａ．］Ｎ　　Ｌ　　Ｓ ＶＰＮＰＬＧＦＬＰＤＨＱＬ ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡ
ＡＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＧ
ＴＧＣＴＡＧＰＡＦＧＡＮＳＴＮＰＤＷＤＦＮＰＣ　　
しへ−一ｆし２．　　ＨＢＶのｐ　ｒ　ｅ　−　Ｓ　２
領域からのＱＭ２１３３−１４４。この領域は、トＩＢ
Ｖにおける一連のエピトープであり、チンパンジーを感
染から守ることができる。本配列は、ａｄｗ而清型から
由来している。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド ■コーディング配列 ３．　　ＨＢＶのｐｒｅ−Ｓ２領域からのＱＥ２−１　
２Ｃ）−１　５３。これは２の大型判である。配列は、
ａｄｗ血液型から由来していた。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド 飴三￥圧築ノのロ （ハ）コーディング配列 ｐＰＤ１−１ １０−１　４８、 トＩＢＳＡ　　ｑ からの複合エピトープ ■合成オリゴヌクレＡチド ０コーディング配列 ＯＰＡ１−ＶＰ１ １０｝イＡ ■ （Ａ型肝炎ウィルス） （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ハ）コーディング配列 ｐＰＡ２−ＶＰＩ １３−２４｝−ＩＡＶ （■合成オリゴヌクレオチド （ヘ）コーティング配列 ？ ｐＰＡ３−ＶＰ３ ８３ＨＡＶ （ａ）合成オリゴヌクレオチド ＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＡＴＣコー
ディング配列 ８。

ｐＰＡ４−ＶＰ１ ８２）−１ＡＶ （ａ）合成オリゴヌクレオヂド （ハ）コ ディング配列 Ａ Ｌ Ｓ Ｉ Ｄ Ｙ　Ｌと． ｐＰＡ５−ＶＰ２ ６　０　Ｈ　Ａ　Ｖ （ａ）合成オリゴヌクレオチド ＣＴＡＧＣＧＴＴＧ入ＡＣＣＴＣＴＡＣＧ入入ＣＣＴＣ
ＧＧＴＴＧ八Ｃ入入ＡＣＣＣＧＧＧＴＣ入入入Ｇ八ＧＡ
ＡＣＴＣＧＣＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧ
ＣＣＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴ
ＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧ Ｈ Ｉ ｖ−ｉのｇｐ４１からのアミノ酸７３ エピトープである。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド （ハ）コーディング配列 Ｒ Ｓ 困一辷 中和抗体の誘導に関与するネコ白血病ウイブ （ａ）合成オリゴヌクレオチド ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＣ　ＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧ　　ＣＡ
ＧＴＴＣＧＡＴＣ（ヘ） コーディング配列 例２において示されているＨＲＶ２　　ＶＲ２をコード
するオリゴヌクレオチドを、その例において詳述したよ
うに、ｐＰＶ−Ｎｈｅベクター中に挿入した。その組換
え体ベクターをＥ．ＣＯＲＩとＢａｍＨＩで消化した。

約４，４ｋｂのバンドは低融点アガロースゲル電気泳動
によって精製した。

Ｈ　Ｒ　Ｖ　２　７’ｌ”３　（７）　Ｖ　Ｐ　２　ノ
？　ミ／酸１５６から１７０を表す合成オリゴヌクレオ
チドを、標準手順によってＴ４リガーゼを用いて組換え
体ベクターに連結した。合成オリゴヌクレオチド、それ
らがどのようにともにアニールするか、及びＮ一末端延
長部のコーディング配列は以下の通りであった。

ＡＡＴＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＴ
ＴＧＡＡＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＣＧＡＣＣＧＡ
ＡＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＣＧ
ＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣ；ＴＴＣＡＡＡＣＧＣＧ
ＴＴＴＣＣＧＣＴＴＴＡＡＣＴＧその結果得られたブラ
スミドは、Ｅ．　ｃｏｌｉ株ＸＬ　−　１　　Ｂｌｕｅ
ｌ．：４人して形質転換された。クローンを普通ブイヨ
ン中で＾密度に培養した。キメラ蛋白の発現は、例２に
おいて記述された如く行われた。発現蛋白は、ＰＡＧＥ
、ウエスターンプロット及びエリザで分析した。粒子Ｍ
４造の存在は蔗糖濃度勾配遠心分離によって決定された
。

全Ｈ　８　ｃ　Ａ　ｏ遺伝子を１本ＥｆＤＮＡを産生す
ることができるベクター中にナブクローンニングを１１
っだ。これは、特に句着足突然変異（Ｓ日Ｃハｙｆｏｏ
ｔ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）として知られて０る
技術を使用して実行された。最初に、ｐＰＶ−ＮＩ１ｅ
Ｉ（例１）からのコア遺伝子、以下に示づように、２つ
のオリゴヌクレオチドを使用して増幅させた。

したがって、その結果得られた断片（６００４２基対）
は各末端にｆ！ａｃ　　Ｚ相補性配列を有する。

平行的に、１本鎖のウラシルに富んだＤＮＡを完全な１
ａｃ　　Ｚ”ＩＩ仏子を含む市販ベクタＤ　Ｂ　Ｓ　−
　Ｓ　Ｋ　（　＋　）　　（　Ｓｔｒａｔａｇｃｎｅ）
から１１した。

この１本ＩＤＮ△をＰＣＫ断片と混合した。その過程を
通じて、新たに導入したｊ！ａｃ　　Ｚを横にもつ領域
か、１本鎮ベクターとアニールした。このアニールした
重複体は、次にＤＮＡポリメラーゼを使用して２重鎖化
し、Ｅ．　ｃｏｌｉ株ＸＬ１Ｂｇｕｅにトランスフエク
トした。コロニーは正しい組換え体ブラスミドの存在に
ついて制限酵素地図作成によって検定した。

それゆえ、このブラスミド（Ｑ９）、ｊ！ａｃプロモー
ターの転写調節の下にあるＰＶ−ＮｈｅＩ　　ＨＢＣＡ
Ｑの全コピーを担っている。それはまたｐＢＳに由来し
ているので１本鎖ＤＮＡを生産することができる。それ
ゆえ、このような１本１１ＤＮ△（ウラシルに冨んだ）
を調製し、ＨＢｃＡｇ蛋白のアミノ酸６８と６９の部位
において、さらにＮｈｅＩ制限酵素部位を造るために使
用された。これは、合成オリゴヌクレオチドを、Ｑ９か
らの１本鎖ＤＮＡでアニールし、重合させ、前と同様に
、親のテンプレートを除くことによって行われた。突然
変異誘発のために使用された副リゴヌクレオチドは、以
下の通りであった。：ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴ
ＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＮｈｅ工 組換え体ＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉＸ　Ｌ　−　１　Ｂｌ
ｕｅ内にトランスノエクトし、コ〇二−は、結果として
生じたＤＮＡのブライマーエクステンション法による直
接配列決定によって分析した。ｐＰＮ２による突然変異
を起こさせた領域の配列はＦ線を引０た２つのＮｈｅＩ
部位について示されている如くである。２つの制限醇素
部位の間の領域は、必要とされるエピトープをコードす
る合成オリゴヌクレオヂドで置換ずることができる。

八ＣＧ　　ＣＴＡ　　ＧＣＴ　　ＡＣＣ　　ＴＧＧ　　
ＧＴＧ　　ＧＧＴ　　ＡＡＴ　　ＡＡＴ　　ＴＴＧ　　
ＧＡＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＡ　　旦旦工一Δ旦ΩＴＬＡ
ＴＷＶＧＮＮＬＥＤＰＡＳ 重さ約４００ｇの雌のＤｕｎｋｉｎ　Ｈａｒｔｌｅｙモ
ルモットに、それぞれ不完全Ｆｒｅｕｎｃｌの７ジュバ
ンド（　ｌ　ＦＡ）中に製剤された０．　５ａｉ！用憬
のキメラＨ　Ｂ　Ｃ　Ａ　Ｑ蛋白の調製物を、それぞれ
に筋肉内接種した。４匹ずつの！Ｉｌ物の群に特定用量
の精製コア粒子を接種し、最初と同じ用量で、５６日目
ｈＩら７０日目に１回強化接種を行った。実験期間を通
じて１４日間隔毎に血液検体を採取した。

ＥＬｆＳ△ 血清中の抗ペブチド、抗ウイルス及び抗一粒了活性を間
接的または２重抗体サンドウィッチＥｌＩＳＡ法の改変
法によって測定した。サンドウィッチＥＬ［ＳＡにおい
ては、ポリクローナル抗ベブチド血清（１　：　２００
）を、ＰＢＳと２％乾燥粉ミルク中の粒子の連続希釈を
捕捉するために使用した。間接的エリザにおいては、２
μｇ／Ｉｌｌのベブチド、粒子またはウイルスで、ミク
ロタイタープレート上に、直接的にコートした。それぞ
れの場合において、プレートを洗い、試験血清試料とと
もにインキユベートした。３７℃で１−２時間インキユ
ベーションした後、プレートを再び洗い、抗−１ａＧ−
ベルオキシダーゼ結合体を加えた。３７℃で、ざらに１
時間洗った後に、プレートを洗い、酵素基質（０．０４
％Ｏ−フエニレンジアミンとＯ、１Ｍホスフエート、０
．０５ＭクエンＩｌＩ＃Ａバツファ−中の０．０４％の
過酸化水素）を加えた。その結果得られた色素の発現を
、＠酸で停止させ、Ａ４９２を丁ｉｔｅｒ［ｅｋ　Ｈｕ
ｌｔｉｓｋａｎ（Ｆｌｏｗ　ｌａｂｓ　）において測定
した。

接種後の検体の希釈から得られたＡ４９２１定植を、血
液希釈度の逆数のＩＯｇ１０に対してプロットした。そ
して、抗体価を陰性対照（接種前の血清の１＝１０の希
釈）を参照して計算した。

結果 １　　モルモットに、ＰｒｅＳ１−ＨＢｃＡｇキメラ蛋
白で構成された例３・１において得られた２０μ９また
は２μびの粒子を筋肉内接種した。

規則的間隔で、血液を採取した。それぞれの場合におい
て、キメラＨ８ｃＡｑ蛋白（３９２）中のｐ　ｒ　ｅ　
−　３　１挿入部からなるベプチド、挿入部（対照）な
しのＨＢｃＡｇ、及びｐｒｅｓｉト＋ＢＣＡＱ粒子をエ
ンザイムリンクドイムノソルベントアツセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）のディッシュをコートし、次に集められた抗血清の
希釈に対して、検定を行った。結果は、表１に示されて
いる。極めて高水準の抗ベプヂド抗体価、抗Ｈ　Ｂ　Ｃ
　Ａ　Ｑ及び抗ＰｒｅＳ１−ＨＢｃＡ（Ｊ粒了抗体が達
成された。

２　手順は以下、すなわち モル七ットにＰｒｅＳ２エピトープ ＨＢｃＡｇ小キメラ蛋白から構成される例３・２におい
て得られる粒子を接種したこと ＰｒｅＳ２挿入部（３９３）、ｌ−ＩＢｃＡｇ、Ｐｒｅ
Ｓ２−ＨＢｃＡｑ粒ｆ及びＰｒｅＳ２エピトープが組込
まれた酵母由来のＨ　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｇ粒子からなるベブ
チドか、エリザデイッシ１上にコートされたこと を除いて、１にお番ブるのと同じであった。

結果は、表２において示されている。再び極めて高水準
の抗体か、モルモット中に誘導された。

３．　　ＨＲＶ２ＶＰ２のエピトープか本発明（゛イン
サート″、例２）にしたがって挿入されているキメラＨ
ＢＣＡＱ蛋白から成立つ粒子によって、モルモットとウ
サギに誘導された免疫応答と同Ｌ；ＨＲＶ２ＶＰ２のエ
ピｔ−−７か、ＨＢＣＡｑのアミノ末端（“ターミナル
”）に融合されているキメラ状蛋白から構成されている
粒子によつて誘導された免疫応答を比較した。該゛ター
ミナル″４−メラＨＢＣΔｑ蛋白は、ＪＰ−Ａ−１９６
２９９／８８において記載されている手順にしたがって
調製された。結果は、表３と表４においてエリザの終点
抗体価（１０ｇ１０）として示してある。エリザのプレ
ートは、ＨＲＶ２　　ＶＰ２ＩピトープまたはＨＢＶの
いずれかから構成されているベブチドでコートされた。

゛インサート″キメラＨ［３ＣＡｇ蛋白は、よりすぐれ
た結果をあたえた。すなわら、より高い抗ＨＲＶベブチ
ド抗体価と、より低い抗一ＨＢＶ抗体価 ４　　中和抗体応答を、上記３のモルモットとウサギに
ついて検べた。特に、゛インサート”粒子の２つの接種
に対する動物の応答を検定した。その結果は、表５に示
されている。

５．　ウサギとモルモットは、例２のキメラＨＢｓＡｇ
ｌ３９−１４７エピトープＨＢｃＡｇ蛋白で構成されて
いる粒子を接種した。抗−ベブチド１３９−１４７（α
ｐ　ｅ　ｐ　４　４’　８　）と抗一｝−ＩＢｓＡｇ（
α｝−ＩＢｓＡｇ）応答は、粒子の３つの投与を用いて
決定した。その結宋は、表６において示されている。示
されているデータは、４２日目の最初の強化接種以前、
及び最終採血日９８日目における抗体ＩＩＩ（１０ｇ１
ｏ）である。抗Ｈ　Ｂ　ｓ　Ａ　ａ活性によれば、ウサ
ギ、そして特にモルモットの最終血液中に良好な抗体水
準が観察された。

表　　１ ３９２　（　２μｇ／Ｉｌｌ》 ＨＢＣＡ（１（　　２μｇ／ＩＩＩ！）ＰｒｃＳ１−１
｛ＢｃＡｇ （２μｇｌｎｄ） ４．４８ ４．５４ ４．６３ ５．３９ ４．６９ ５．１５ ２．８９ ３，１３ ４．１６ ４，２４ ４．３２ ３．７８ ３．７９ ４，４４ ４．４６ ４．７３ ２．７３ ４．２０ ４．２２ ４．１６ ４．０２ ４．１５ ４．６０ ３．１５ ３，６９ ３．３９ ３．７７ ３．７１ ３，９５ ４．４１ ３，３０ ３，５７ ３，３９ ３，９３ ３．９４ ３．９０ ４．３１ エリザ終点抗体価 ９個々のグループの平均 １°ｇ１０ 表　２：モル七ットのｐｒｅＳ２　（ＱＭ２／ＰＥ３）
　コア（対する応答 （ａ）　２０μｇ　　ｄｏ鵠 エピトープ）に 最初の接種後の日数 接種 試験抗原 ベプブ下　　Ｈ８ｃＡｏ　　　ＱＭ　２３９３　　　　
　　　　　　コア ｌＩＢｓＡｇ　＋ ｐｒｅＳ２ （ｂ）２μび用量 最初の接種後の日数 接種 試験抗原 ベブチド　　ＨＢｃＡｇ　　　ＱＭ　２３９３　　　　
　　　　　コア ８８請Ｑ 十ｐｒｅＳ２ １０ｇ１ｏ終点抗体力価 接種 表　　５ （ａ）モルモット ベブチド用量 （μｇ） ７．５ ０．１５ ０．０１５ 中和抗体価 ９０％プラークの減少 ９０．３０，５０．２５ ２０，５ ＜５，　＜５ 一（μ３） １．５ ０，１５ ０．０１５ ９０％プラークの減少 ３００．　５ １０．１５ ＜５，　＜５ 表　　６ キメラ　　　　ウサギ　２０μび トＩＢＳＡＱ１３９− １４７　　８ＢＣＡＣ） 蛋白 ２μＪ ０．２μび ［ルモット ブタ　　２０μび ２μグ ０．２μＪ αｐｅｐ４４８ αｌ−ＩＢｓＡ（Ｊ αｐｅｐ４４８ αＨＢｓＡｇ αｐｅｐ４４８ αＨ８ＳＡｇ αｐｅｐ４４８ αＨＢｓＡｑ αｐｅｐ４４８ αＨＢｓＡｇ αｐｅｐ４４８ αＦ｛ＢＳＡｇ 図面の簡単な説明 第１図は、プラスミドｐＢｃ４０４を小す。

第２図は、ブラスミドｐ　Ｉ）　Ｖ Ｎ ｈｅの槙築を 示す。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）エピトープを含む外来アミノ酸配列が、コア抗原
   がＢ型肝炎コア抗原である場合は、６８から９０迄のア
   ミノ酸残基のアミノ酸配列、または別のヘパドナウイル
   スのコア抗原の場合には、相当するアミノ酸配列のすべ
   て、または１部の中に挿入されるか、すべてまたは１部
   を置換しているキメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白か
   ら構成される粒子。
2. （２）外来アミノ酸配列が、ＨＢｃＡｇ残基の７１から
   ９０の配列、または、別のヘパドナウイルスの相当する
   配列のすべて、または１部の中に挿入されるか、すべて
   または１部を置換している請求項（１）記載の粒子。
3. （３）外来アミノ酸配列が、ＨＢｃＡｇ残基８０と８１
   の間に、または、別のヘパドナウイルスのコア蛋白の相
   当する残基の間に挿入されている請求項（２）記載の粒
   子。
4. （４）外来アミノ酸配列が、ＨＢｃＡｇ残基７０から７
   ９迄、または別のヘパドナウイルスのコア抗原の相当す
   る残基を置換している請求項（２）記載の粒子。
5. （５）エピトープがＡ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィル
   ス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウィルス、ポリオ
   ウイルス、単純ヘルプスウイルス狂犬病ウィルス、ネコ
   白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス１型または２型
   サル免疫不全ウィルス、ヒトライノウイルス、デング熱
   ウィルスまたは黄熱病ウィルスのエピトープである請求
   項（１）から（４）のいずれか１項記載の粒子。
6. （６）請求項（１）から（５）のいずれか１項において
   明記されているキメラ蛋白をコードしているＤＮＡ配列
   を含み、適切な宿主中に用意されたとき、キメラ蛋白を
   発現することができるベクター。
7. （７）その中で、キメラ蛋白を発現することができるよ
   うな請求項（６）に記載されたベクターによる宿主形質
   転換体。
8. （８）その中でキメラ蛋白が発現される条件下で、請求
   項（７）に記載された宿主を培養し、このようにして形
   成されるキメラ蛋白から構成されている粒子を回収する
   ことを含む請求項（１）から（５）のいずれか１項にお
   いて記載されている粒子の調製方法。
9. （９）請求項（６）記載の適合性発現ベクターによつて
   、宿主を形質転換することを含む請求項（７）において
   記載されている宿主の調製方法。
10. （１０）ヘパドナウイルスコア抗原をコードするＤＮＡ
    配列を含み、ＨＢｃＡｇのアミノ酸残基６８から９０迄
    をコードする配列、または別のヘパドナウイルスのコア
    蛋白に相当する配列内に、（ａ）１つの制限酵素部位を
    有するか、または、（ｂ）該配列または該配列の１部の
    横に並んでいる２つの制限酵素部位をもつている発現ベ
    クター。
11. （１１）制限酵素部位（９）がＨＢｃＡｇアミノ酸残基
    ７１から９０、または別のヘパドナウイルスのコア蛋白
    の相当する配列内で用意されている請求項（１０）記載
    のベクター。
12. （１２）制限部位（ａ）が、ＨＢｃＡｇコドン８０と８
    １または別のヘパドナウイルスの相当するコア蛋白コド
    ンにある請求項（１１）記載のベクター。
13. （１３）２つの制限部位（ｂ）が、一方の側面において
    は、ＨＢｃＡｇコドン６８と６９か、または別のヘパド
    ナウイルスの相当するコア抗原のコドンが用意されてお
    り、他方の側面においては ＨＢｃＡｇコドン８０と８１か、または別のヘパドナウ
    イルスの相当するコア抗原コドンが用意されている請求
    項（１０）記載のベクター。
14. （１４）ｐＰＶ−Ｎｈｅ（ＮＣＩＭＢ４０２１０）また
    は、ｐＰＮ＿２（ＮＣＩＭＢ４０３１２）である請求項
    （１０）記載のベクター。
15. （１５）以下の工程を含む請求項（６）に記載されたベ
    クターの調製方法： （ｉ）適切な制限酵素で請求項（１０）から（１４）の
    いずれか１項において請求されている発現ベクターを制
    限酵素部位（ａ）または制限酵素部位（ｂ）で切断する
    ように消化すること； （ｉｉ）消化されたベクターを脱リン酸化すること；そ
    して、 （ｉｉｉ）エピトープを含む外来アミノ酸配列をコード
    するＤＮＡ配列を、該ベクター中に連結すること。
16. （１６）医薬または動物薬として許容し得ることができ
    る担体、または希釈剤、ならびに活性成分として、請求
    項（１）から（５）のいずれか１つに記載された粒子を
    含んでいる医薬または動物薬。