JPH06508037A

JPH06508037A - 免疫不全ウイルス組換えポックスウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH06508037A
Application number: JP5501091A
Authority: JP
Inventors: パオレッティ，エンゾ; タータグリア，ジェームズ; コックス，ウィリアム　アイ
Original assignee: ヴァイロジェネティクス　コーポレイション
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 1994-09-14
Anticipated expiration: 2019-03-08
Also published as: AU6564596A; WO1992022641A1; EP0592546A1; DK0592546T3; AU712431B2; JP3504659B2; ATE241696T1; AU672581B2; AU2259792A; EP1156102A1; EP0592546B1; DE69233080T2; EP0592546A4; DE69233080D1; AU716480B2; AU6564696A; CA2110489A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】関連出願についての説明この出願は、参照文献としてここに含む、１９９１年６月１４日出願の同時系属出願第０７／７１５．９２１号の一部継続出願である。１９９２年３月６日出願の同時系属出願第０７／８４７．９５１号もまた参照文献としてここに含む。

産業上の利用分野本発明は修飾ポックスウィルスおよびその製造方法並びに使用方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、免疫不全ウィルス遺伝子の遺伝子産生物を発現する組換えポックスウィルス、および宿主に投与したときに免疫不全ウィルス感染に対して免疫応答を誘発する免疫組成物に関するものである。

いくつかの出版物をこの出願において参照する。これらの参照文献の全引用を請求の範囲の前で明細書の終りに示す。これらの参照文献は、本発明が属する従来技術を記載するものである。

発明の背景ワクシニアウィルスおよびより最近では他のポックスウィルスが、異種遺伝子の挿入と発現に用いられている。異種遺伝子の生感染ポックスウィルスへの挿入の基礎技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素をフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）するボックスＤＮＡ配列と治療（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ポックスウィルス中に存在する相同配列との間の組換えを含む（ピッチｍ＝等、１９８７）。

つまり、組換えポックスウィルスは、従来技術で知られ、米国特許第５．１１０．５８７号、第４．７６９．３３０号、第４．７７２．８４８号および第４．６０３．１１２号に記載されているワクシニアウィルスの合成組換え体の産生方法に相同な２工程で構成される。それらの開示を参照文献としてここに含む。この点に関して、１９９２年５月４日出願のものと１９９０年６月１４日出願の第５３７．８９０号の同時系属出願も、参照文献としてここに含む。

第一に、ウィルス中に挿入されるＤＮＡ遺伝子配列、特に非ボックス源からの読取り枠を、ポックスウィルスのＤＮＡの切片に相同なりＮＡが挿入されるＥ、ｃｏｌｉプラスミド構成物中に配する。個々に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに連結せしめる。プロモーター−遺伝子結合は、可欠座を含有するボックスＤＮＡの領域をフランキングするＤＮＡ配列に相同なりＮＡにより両端にフランキングされるように、プラスミド構成物中に位置している。産生じたプラスミド構成物は次いで、Ｅ、ｃｏｌｉ細菌内の成長により増幅せしめ（フレウェル、１９７２）、単離する（フレウェル等、１９６９；マニアチス等、１９８６）。

第二に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、ポックスウィルスとともに、細胞培地、例えば、ひな胚胎繊維芽細胞中にトランスフェクションせしめる。プラスミド中の相同ボックスＤＮＡとウィルスゲノムとの間の組換えはそれぞれ、そのゲノムの可欠領域における異種遺伝子ＤＮＡ配列の存在により修飾されたポックスウィルスを与える。「異種Ｊ　ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡかその中に配されるゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコードする外因性ＤＮＡ、特に非ボックス源からのＤＮＡを示す。

遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鏡開のＤＮＡの相同切片の交換である。あるウィルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡを置換する。核酸の相同切片は、ヌクレオチド塩基の同一配列を有する核酸切片（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。

遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新しいウィルスゲノムの複製または産生中に自然に生じる。それゆえ、ウィルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウィルスまたは他の遺伝子構成物により共感染せしめられた宿主細胞中で生しるウィルス複製周期中に生じ得る。第一のゲノムからのＤＮＡ切片は、ＤＮＡが第一のウィルスゲノムのＤＮＡと相同である第二の共感染ウィルスのゲノム切片を構成する際に交換可能に用いられる。

しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なったゲノム中のＤＮＡ切片の間にも生じ得る。そのような切片の１つか、例えば、遺伝子マーカーまたは相同ＤＮＡの部分に挿入される抗原決定因子をコードする遺伝子の第一の切片内の存在を除いて、別のゲノムの切片と相同な第一のゲノムからのものである場合、組換えはまだ生じ得てその組換えの産生物は次いで組換えウィルスゲノム中の遺伝子マーカーまたは遺伝子の存在により検出可能である。

修飾感染ウィルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の発現がうまくいくには２つの条件が必要である。第一に、挿入は、修飾ウィルスが生きたままでいるために、ウィルスの可欠領域に行なわなければならない。挿入ＤＮＡの発現の第二の条件は、挿入ＤＮＡに対して適切な関係にあるプロモーターの存在である。プロモーターは、発現されるＤＮＡ配列から上流に位置するように配されなければならない。

近年では、ウィルス医学の分野において、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）により生じた後天性免疫不全症候群（エイズ）の発生の上昇している点が注目を集めている。

ＨＩＶ−１は、ウィルス科、レトロウィルス科、より詳しくはレンチウィルス亜科の一員である。ＨＩＶ−２およびシミアン免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）のような他の関連ウィルスとともにこのウィルスシステムは、安全で有効であるワクチンおよび抗ウイルス療法を発達せしめる努力におけるその分子生物学、免疫学、および病原論に関して、綿密に検査されている。しかしながら、２つの主な障害により、ＨＩＶワクチンの候補者の設計が悩まされている。第−に、ＨＩＶ単離体の中に著しい配列異質性が存在し、第二に、防御免疫に属する情報が欠如する。感染した個体は、ＨＩＶに対する抗体（スターシチ等、１９８６；ウェイス等、１９８５）応答とＣＤ８′−丁細胞（ウォーカー等、１９８７　；ブラタ等、１９８７）応答を発達せしめるが、個体は徐々にエイズを発達せしめるので、防御されない。

多くのＨＩＶ遺伝子産生物を発現し、その生化学特性、機能特性および免疫学特性、特に細胞媒介応答を研究するために、ワクシニアウィルスが広く用いられてきた。これらの特異的試薬を用いることにより、エンベロープ（リビエレ等、１９８９　、ウォーカー等、１９８７　；クープ等、１９８９）、コアタンパク質（ｇａｇ）（リビエレ等、１９８９；クープ等、１９８９　；ニクソン等、１９８８）　ｐ　ｏ　ｌ　（ウォーカー等、１９８９　。

ウォーカー等１９８８）　、およびｎｅｆ（リビエレ等、１９８９）遺伝子産生物に対して血清陽性な個体に細胞媒介細胞障害活性が示されてきた。さらに、ＨＩＶ遺伝子を含有する枠ウィルス組換え体は、小さな実験動物（チャクラパーティ等、１９８６　、ツー等、１９８６　；ロートマン等、１９８９　、ミツシェル等、１９８８）、マカク（ツアーリング等、１９８６）　、チンパンジー（ツー等、１９８７）およびかなりヒト（コアグリー等、１９８８　；コツ等、１９８９）における細胞媒介応答および液性免疫応答を誘発することが分かっている。現在まで、霊長類における制限されたワクチン接種／防御研究が、ＨＩＶおよび関連ウィルスからの遺伝子産生物を発現するワクシニアウィルス組換え体に関して報告されている。

エイズが原因のレトロウィルスからのエンベロープ糖タンパク質を発現する組換えワクシニアウィルスによる霊長類のワクチン接種は、液性および細胞媒介免疫応答を誘発し、さらに著しくは、ＨＩＶ感染に対して防御した（コアグリー等、１９８８　；ツー等、１９８９）。ツー等に記載された結果において、シミアンエイズレトロウィルス（ＳＲＶ−２）からのエンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニアウィルス組換え体を用いてブタ尾（ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ）マカク（マカカ　ネメストリナ）をワクチン接種した。免疫化した全ての動物は、中和抗体および５ＲＶ−２感染細胞に対してＡＤＣＣを媒介する抗体を含む、５ＲＶ −特異細胞−媒介応答および液性免疫応答の両者を発達せしめた。動物に、５　ｘ１０３Ｔ　ＣＩ　Ｄ、ｏノＳ　ＲＶ　−２／Ｗヲ静脈＋：抗原投与り。

た。抗原投与した対照動物（非ワクチン接種）は、抗原投与から２週間後にウィルス血症となり、血清転換しなかった動物は抗原投与から７週間後に死亡した。

明らかに、以前にワクシニアウィルス−ｅｎｖ組換え体を接種して抗原投与した動物の全ては、健康で、ウィルスがなく、エンベロープ抗原に対してもっばら血清陽性であった。

ヒトにおける試験的な実験において、ＨＩＶ血清陰性の個体にワクシニアウイルス／ＨＩＶ−１エンベロープ組換え体をワクチン接種した。この初期の接種は、弱い免疫応答となった（コアグリー等、１９８８）。これらの初期応答に続いて様々なプロトコルを追加抗原投与した。しかしながら、ワクシニアウィルス−ＨＩＶ組換え体にｉｎ　ｖｉｔｒｏ感染したパラホルムアルデヒド固定自己細胞の静脈注射の使用により、最も著しい追加抗原投与の効果が得られた。この免疫化プロトコルに関して、群特異中和抗体、細胞障害Ｔリンパ球および遅延型過敏性からなるエンベロープ抗原に対して、既往免疫応答が行なわれた（コアグリー等、１９８８）。）（ＩＶ　ｅｎＶ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルス（ＨＩＶＡＶ−１ｅ　；ブリストルーメイヤース）を用いて米国で行なわれた臨床試験において、組換え体を受けた個体は、ＨＩＶに対するＴ細胞増殖性応答を開始した（コツ等、１９８９）。しかしながら、こらの応答の強度は、ワクシニアウィルスへの以前の露出により影響された。結果として、ワクシニアウィルスに対する個々の免疫は、弱く一過性のＴ細胞応答を開始したが、ワクシニアウィルスに対して免疫性ではない個体においては、ＨＩＶエンベロープ抗原に対して強い応答が観察された（コツ等により調査された、１９８９）。これらの結果は励みになり、免疫状態が、ポックスウィルスベースの免疫化ビヒクルを用いたＨＩＶ露出の前にヒトに得られるという証拠を提供した。

ＨＩＶ−１ワクシノロジーに関するおもしろい可能性は、単体またはエンベロープ糖タンパク質との組合せのいずれかのワクシニアウィルスによるＨＩＶ−ｔｇａｇタンパク質の発現により提供される。いくつかの研究所が、ワクシニアウィルスによるｇａｇまたはｇａｇ／ｐＯｆ配列の発現か非感染粒子の産生となることを示した（ツー等、１９９０　；ンオダ等、１９９０；カラコスタス等、１９８９）。これらのワクシニアウィルス組換え体感染細胞の電子顕微鏡による分析は、形質膜から出芽したレトロウィルス状粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に観察された粒子からは見分けの付かない細胞外形状を示した。生化学的に、これらの粒子はまた天然のＨＩＶ−１粒子に類似している。さらに、ワクシニアウィルス −ＨＩＶ　ｇａｇ組換え体を接種したげっし動物とチンパンジーは、ＨＩＶ−１コア抗原に対する液性免疫応答と細胞媒介免疫応答の両方を示した（ツー等、１９９０）。

ワクシニアウィルスによる哺乳綱細胞中のコアタンパク質とＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の共発現はまた、ＨＩＶ−１粒子の組立てと放出となった（ヘイファー等、１９９０）。これらの典型的な種類のＣ−レトロウィルス粒子は、エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０およびｇｐ４１）およびｇａｇタンパク質（ｐ２４、ｐ１７、ｐ５５、およびｐ３９）の両方を含んだ。これらのタンパク質はまた、ＨＩＶ−１ウィルス粒子中に観察されたのと同一の比重小これらの組換え体産生粒子中に存在するとして記載された。多価ワクシニアウィルス組換え体の接種によりワクシニー（ｖａｃｃｉｎｅｅ）中に合成されたまたは精製形状のいずれかのこれらの非感染ＨＩＶ粒子の産生は、ＨＩ■に対する価値のある「完全ウィルス」ワクチン接種剤を提供する。レンチウィルス、ＳＩＶに対する防御が、完全不活性化ウィルス標品を用いて示されたので、このことは特に魅力的である（マーフィーコープ等、１９８９；デロシアース等、１９８９）。

上述した調査実施例は、防御に必要である適切な免疫応答を誘発する、ＨＩＶ抗原を発現するワクシニアウィルス組換え体の潜在的な使用を示す。しかしながら、生ウイルスワクチンの使用に関する主な関心は、安全性の問題である。ワクシニアウィルスによる免疫化による合併症は、特に免疫無防備状態にある個々においてはほとんど証拠書類はなく、ワクチン候補としての容認に異論が出されている（ベーベハニ、１９８３　；レイン等、１９６９）。しかしながら最近では、免疫化ビヒクルとしての使用のための修飾菌株の望みのあるウィルス毒性因子を理解するにあたって、長足の進歩がなされている。（タータグリア等、１９９０）。エイズの免疫予防と免疫療法のためのワクシニアウィルスペースのＨＩ　Ｖワクチン候補の産生に関して、ヒト細胞系におけるワクシニアウィルスの産生複製の原因の遺伝子を同定した（ギラード等、１９８６　；パーカス等、１９９０）。これらの遺伝子が欠けているワクシニアウィルスベクターの潜在的な使用は、防御免疫応答を誘発する様式で、適切なＨＩＶ抗原を提供する非複製ベクターワクチン候補を提供する。

安全で効果的なボックスウイルスヘースのＨＩＶワクチン候補の産生への別の手法は、適切なＨＩＶ抗原を発現するアビポックスウィルスベクター（すなわち、カナリア痘ウィルスおよび鶏痘ポックスウィルス）を使用する。これらのウィルスは自然に宿主制限されており、アビアン種においてのみ豊富に複製する。それゆえ、ヒト、特に免疫無防備状態の個体においての使用のための本来備わった安全性因子が存在する。この点に関して、これらのウィルスは、狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現するように操作され、生狂犬病抗原投与からの様々な非アビアン種を防御するのが示された（ティラー等、１９８８ａ　；　１９９１）。

それゆえ、免疫不全ウィルス組換えポックスウィルス、および宿主に投与されたときに免疫不全ウィルス感染に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物、特に安全性の高められた組成物を提供することが、現在の技術状態に関して非常に望ましい進歩であることが分かる。

発明の目的それゆえ、本発明の目的は、免疫不全ウィルスの遺伝子産生物を発現する組換えポックスウィルスを提供すること、およびそのような組換えポックスウィルスを製造する方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、免疫不全ウィルス暗号配列、特にポックスウィルスベクター中のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）およびシミアン免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）暗号配列のクローニングおよび発現に備えることにある。

本発明の別の目的は、安全性か高められ、宿主に投与されたときに免疫不全ウィルス感染に対して免疫応答を誘発することのできる免疫原性組成物を提供することにある。

本発明のこれらと他の目的および利点は、以下を考慮することによりより容易に明確となる。

発明の構成一態様において、本発明は、ポックスウィルスゲノムの回天領域に、免疫不全ウィルス、特にＨＩＶまたはＳＩＶからのＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウィルスに関するものである。ポックスウィルスは好ましくは、鶏痘ポックスウィルスまたはカナリア痘ウィルスのような、ワクシニアウィルスまたはアビポックスウィルスである。

本発明によると、組換えポックスウィルスは異種免疫不全ウィルス遺伝子、特にＨＩＶまたはＳＩＶ遺伝子の遺伝子産生物を発現する。

別の態様によると、本発明は、ワクチンを接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンに関し１、該ワクチンはその回天領域中に免疫不全ウィルス、特にＨＩＶまたはＳＩＶからのＤＮＡを含有する組換えポックスウィルスおよび担体を含む。本発明によるワクチンに用いるポックスウィルスは好ましくは、鶏痘ウィルスまたはカナリア痘ウィルスのような、ワクシニアウィルスまたはアビポックスウィルスである。

添付した図面を参照することにより、本発明をよりよく理解する。

第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失したプラスミドｐｓＤ４６０の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ４１０の産生方法を示す概略図である。

第２図は、出血性領域が欠失したプラスミドｐＳＤ４８６の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ５５３の産生方法を示す概略図である。

第３図は、ＡＴＩ領域が欠失したプラスミドｐＭＰ　４９４Δの構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ６１８の産生方法を示す概略図である。

第４図は、血球凝集素遺伝子の欠失したプラスミドｐＳＤ４６７の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ７２３の産生方法を示す概略図である。

第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の欠失したプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δの構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ８０４の産生方法を示す概略図である。

第６図は、巨大サブユニットの欠失したプラスミドｐＳＤ５４８の構成方法および組換えワクシニアウィルスｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を示す概略図である。

第７図は、ワクシニアウィルスまたはカナリア痘ウィルスベクター（ＮＹＶＡＣＳＡＬｖＡＣ）で免疫化した、もしくはＨＩＶ　Ｉ　ＩＩ　Ｂ　ｅｎｖ　（ｖＰ９１１、ｖＣＰ１１２）を発現するワクシニアウィルスまたはカナリア痘ウィルス組換え体で免疫化した、マウスの肺臓の細胞障害応答を示すグラフである。

第８図は、ｇｐ１２０のＨＩＶ　１１　Ｂ超可変ｖ３ループのためであって、ＨＩＶ　ＭＮまたはＳＦ２のｖ３ループのためではない細胞障害Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を示すグラフである。

第９図は、ベクター（ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣ）またはＨＩＶ−１ｅｎｖを発現するカナリアボックス組換え体ｖｃＰ１１２または真ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ９１１で免疫化したマウスのＨＩｖ　ＩＩＩ　Ｂｇｐ１２０に対する抗体応答を示すグラフである。

第１０図は、細胞障害Ｔリンパ球細胞表面抗原’ｒｈｙ１゜２およびＬｙｔ２．２に対する抗体に対するｖｃＰ１１２で免疫化したマウスの肺臓からの細胞障害効果器細胞の感度を示すグラフである。

第１１図は、ＰＢＭＣのｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激に対する細胞障害のパーセントを示すグラフである。

発明の詳細な説明説明のための以下の実施例から、本発明とその利点がよく理解される。

実施例において、以下の方法と材料を用いる。

ＤＮＡクローニングおよび合成プラスミドを標準方法により構成し、スクリーニングし、成長せしめた（マニアチス等、１９８２；パーカス等、１９８５；ピッチｍ；等、１．９８７）。制限エンドグルカナーゼを、ＭＤ。

ケイサースフルク、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ　、ＭＡ、ビバージー、ニューイングランドバイオラボ；およびＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片をベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４　ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。

試薬は様々な供給者により指定されたものを用いた。

前述したように、バイオサーチ８７５０またはアプライドバイオシステムス３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーにより合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを産生じた（パーカス等、１９８９）。前述したように（グオ等、１９８８）シー乞ナーゼ（ティパー等、１９８７）を用いたジデオキシ−鎖終止方法（サンガー等、１９７７）によりＤＮＡ塩基配列決定を行なった。配列確認（エンゲルケ等、１９８８）のためのポリメラーゼ鎖反応（Ｐ　ＣＲ）によるＤＮＡ増幅を、自動パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラ−中で注文合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびジエネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（ＣＴ、ノルウオーク、パーキンエルマー）を用いて行なった。制限エンドヌクレアーゼ切断と、続いてのＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる制限切断と合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデツキ、１９８６）により、過剰のＤＮＡ配列をプラスミドから欠失せワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株の培養の起源と条件は以前に記載した（グオ等、１９８９）。組換え、ニトロセルロースフィルターのｉｎ　５ｉｔｕ雑種形成オよびＢ−ガラクトシダーゼ活性のイクリーニングによる組換えウィルスの産生は以前に記載した（パニカリ等、１９８２；パーカス等、１９８９）。

親カナリア痘ウィルス（レントシュラー菌株）はカナリアの接種菌株である。ワクチン菌株は、野生型単離体から得て、ひな胚胎繊維芽細胞の２００以上の系列継代により弱毒化した。マスターウィルス種子に、寒天の元の４連続のプラーク精製を施し、１つのプラーククローンを、１ｎｖｉｔｒｏ組換え試験における親ウィルスとして株ウィルスを用いた後の追加の５回の継代により増幅した。プラーク精製したカナリア痘単離体をＡＬＶＡＣと称する。

ＦＰ−１と称する鶏痘ウィルス（Ｆ　Ｐ　Ｖ）の菌株は前述した（ティラー等、１９８８ａ　）。この菌株は生後１日の鶏のワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン菌株である。親つィルス菌株デュベッティは、鶏からの鶏痘スケールとしてフランスで得た。鶏の感染幼虫包蔵卵中の約５０の連続継代と続いての鶏胚胎繊維芽細胞の２５の継代によりウィルスを弱１つのプラーク単離体をさらに主ＣＥＦ細胞中で増幅せしめ、ＴＲ０ＶＡＣと称する株ウィルスを確立した。

前述したように、ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲ０ＶＡＣウイルスベクターおよびその誘導体を増殖せしめた（ピッチー二等、１９８７　、ティラー等、１９８８ａ　Ｓｂ　）　ｏ　Ｐ　８１５マウスの肥満細胞種細胞（Ｈ−ｄ２）をＡＴＣＣ（＃ＴＩＢ６４）から得て、１０％の胎仔ウシ血清ＣＦＢＳおよび１００　Ｉ　Ｕ／ｍ　ｌのペニシリン並びに１０（１μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したイーグルスＭＥＭ中で保持した。

マウス雌のＢＡＬＢ／ｃ　Ｊ　（Ｈ−ｄ２）マウスをジャクソン研究所（ＭＥ、バーハーバ−）から購入し、不断給餌に保持した。全てのマウスは生後６から１５週間の年齢のものを用いた。

培地免疫アッセイのアッセイ培地は、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのし一グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’　−２−二タンスルホネート）、５Ｘ１０−’Ｍの２−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＲＰＭ１１６４０培地からなった。ステイム培地は、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのし一グルタミン、１０１Ｍの２−メルカプトエタノール、１００１　Ｕ／ｍ　ｌのペニシリン、および１００μｇ　／　ｍ　ｌのストレプトマイシンを補足したイーグルス最小必須培地からなった。

ラジオイムノプレシピテーション分析細胞単層を、修飾イーグルスメチオニン不含有培地（ＭＥＭ　ｍｅｔ−）中でｌ０ＰＦＵ／細胞で感染せしめた。

感染から２時間後、２０ｕ　Ｃｉ　７ｍ　ｌの［３５Ｓ］−メチオニンを、２％の透析胎仔ウシ血清（フロー）を含有するＭＥＭ（−ｍｅｔ）中に添加した。ジーシス緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣ１，１ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８，１０ｍ　Ｍのトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）　、０．２　ｍｇ／ｍ　ｌのＰＭＳＦ、１％（７）ＮＰ４０．０．０１％のＮａ　Ａｚｉｄｅ）および５０μｍのアプロチニン中に再懸濁せしめることにより、感染から１５時間後に細胞を収穫し、エッペノドルフ管中に削り取り、溶解産物を、４℃で２０分間回転することにより清澄化せしめた。６０ｍｍの直径のペトリ皿の上澄液の三分の−を、１μｌの正常ヒト血清と１００μｌのタンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４８（ＳＰＡ）（ファーマシア）により室温で２時間に亘り培養せしめた。１分間の回転後、上澄液をＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩｖタンパク質を特異的に認識する免疫血清および１００μｌのＳＰＡにより４℃で９０分間に亘り培養せしめた。

沈殿を、ジーンス緩衝液で４回、塩化リチウム／尿素緩衝液（０，２ＭのＬｉＣ１，２Ｍの尿素、１０ｍ　Ｍのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８）で２回洗浄し、沈殿タンパク質を６０μｌのラエムリ緩衝液（ラエムリ、１９７０）中で溶解せしめた。

１００℃での５分間の加熱と１分間の回転の後、タンパク質をＳ　Ｄ　Ｓ　１０％ポリアクリルアミドゲル上で再溶解せしめ、蛍光間接撮影せしめた。

接種マウスに、外側尾静脈により０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中の５Ｘ１０”のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を静脈内に接種した。

膵臓細胞産生頚部脱臼による安楽死後、マウスの肺臓を、ハンクス平衡塩類溶液を含有する殺菌プラスチックバッグに無菌の状態に移した。１つの実験群からの個々の肺臓またはプール肺臓をストマツチャーブレンダ−中において１分間の周期により１つの細胞懸濁液に処理した。膵臓細胞懸濁液を適切なアッセイ培地またはステイム培地のいずれかにより数回洗浄した。コルターカウンターの使用により、または血球計算盤と顕微鏡を用いたトリパンブルー色素排除により肺臓を数えた。

血清マウスにエーテルで軽く麻酔をかけ、血液を眼か後方叢から集積した。実験群からなるマウスからの血液をプールして、凝固せしめた。血清を集積し、使用まで一７０℃で貯蔵した。第２の細胞障害Ｔリンパ球（ＣＴ　Ｌ）の産生のためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激様々な実験群（応答動物）からのプールした膵臓細胞をステイム培地中で５×１０”／　ｍ　ｌに希釈した。同系で未経験のマウス（刺激要因）からの膵臓細胞を、Ｉ　ＸＩＯ’　／ｍｌに希釈し、２％のＦＢＳを含有する組織培養培地中で１時間に亘り２５ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で適切なポックスウィルスにより感染せしめた。感染後、刺激要因細胞をステイム培地中で数回洗浄し、ステイム培地により１×１０′′／ｍ’ｌに希釈せしめた。５ｍｌの刺激要因細胞と５ｍｌの応答動物細胞を２５ｃｍ’の細胞培養フラスコに加え、５％のＣＯ□中で５日間に亘り３７℃で直立して培養した。アッセイの日に、肺臓を、アッセイ培地で数回洗浄し、顕微鏡を用いてトリパンブルーの血球計算盤で数えた。

標的細胞の産生ポックスウィルス特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、２％のＦＢＳを含有する組織培養培地中で３７℃で１時間に亘り２５ＰＦＵ／細胞のｍ、０．　１．で１．Ｘ１０７細胞／ｍｌての培養により一晩感染せしめた。培養後、細胞を１０％のＦＢＳを含有する組織培養培地により１−２Ｘ１０５細胞／ｍｌの間に希釈し、使用するまで５％のＣＯ３中、３７℃でさらに培養した。ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、それぞれＨＩＶ−１単離体ｌ１１ｏ、ＳＦ２、およびＭＮのｇｐ１２０の■３ループ領域に対応する、２０ｕｇ／ｍｌのペプチドＨＢＸ２　（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジー）　、ＳＦ２　（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジー）またはＭＮ（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジー）で−晩培養した。アッセイの日に、標的をアッセイ培地中の遠心分離により数回洗浄した。最終の洗浄後、細胞を約１００、ｃｚｃｉのＮａ２”Ｃｒ０４　（”Ｃｒ）中で再懸濁せしめた。３７℃での１時間の培養後、遠心分離によりアッセイ培地中で少なくとも３回洗浄し、血球計算盤で数え、アッセイ培地によりｌＸＩＯ３／ｍｌに希釈した。

細胞障害アッセイ第１のＣＴＬアッセイに関して、新たに産生じた膵臓細胞をアッセイ培地で１　ｘｉｏ’　７ｍ　ｌに希釈した。第２のＣＴＬアッセイに関して（ｉ　ｎ　ｖ　ｉ　ｖｏ接種または１ｎｖｉｔｒｏ刺激のいずれかの後）、膵臓細胞をアッセイ培地で２　ｘｌＯ６／ｍ　１に希釈した。１／１０ｍ１の膵臓細胞懸濁液を、９６ウエル、丸底マイクロタイタ板（Ｅ　Ｘ　Ｐ）のウェル中で５１Ｃｒ標識標的細胞に加えた。はとんどの場合、第１のＣＴＬ活性についてアッセイした膵臓細胞を、標的細胞の添加前に、マイクロタイタ板のウェル中でさらに２倍に希釈した。”Ｃｒ　（ＳＲ）の自発的な放出の測定の際、標的細胞をアッセイ培地のみで培養した。”Ｃｒ　（ＭＡＸ）の最大放出を測定するために、０．１ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウムを適切なウェルに加えることにより、アッセイの初めに標的細胞を慎重に溶解せしめた。アッセイを開始するために、マイクロタイタ板を２００Ｘｇで２分間に亘り遠心分離し、５％のＣＯ２中、３７℃で４または５時間に亘り培養した。培養後、各ウェルの培養上澄液を、スカトロン上澄液集積システムを用いて集積した。ベックマン５５００Ｂガンマカウンターにより放出された’ＩＩｃ、を測定した。特異的細胞障害のパーセントは、以下の式による計算から決定した：細胞障害％＝　（ＥＸＰ　−ＭＡＸ　）　／　（ＭＡＸ　−３Ｒ）　Ｘ１００単クローン性抗−ＣＤ４および単りローン性抗−ＣＤ８を用いたＴヘルパー細胞と細胞障害Ｔリンパ球の除去膵臓細胞懸濁液を、１：５の抗−ＣＤ４の希釈溶液（単クローン性抗体１７２．４）または１：２００の抗−ＣＤ８の希釈溶液（単りローン性抗体抗−Ｌｙｔ２．２）および１：１６のセダーレインロウ−ドックスウサギ補体の希釈溶液を含有する細胞障害培地（０，２％のＢＳＡおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭｌ　１６４０）で１０７／ｍｌの濃度に希釈した。単一成分（補体、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８）のために適切な対照を含んだ。

抗−ＨＩＶ−１ｇｐＬ６０　ＥＬＩＳＡＥＬ　Ｉ　ＳＡ板のウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中の１００ｎＨの精製ＨＩＶ−１ｇｐ１６０（イムノ）により４℃で一晩被覆した。次いで板を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で洗浄した。次いて板を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴにより３７℃で２時間に亘り遮断した。ＰＢＳＴによる洗浄後、最初に血清を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ　（希釈緩衝′ｐｆＬ）でＪ：２０に希釈した。さらにＥＬＩＳＡ板のウェル中で連続して血清を２倍に希釈した。この板を３７℃で２時間に亘り培養し、ＰＢＳＴで洗浄した。ホースラディツシュペルオキシダーゼ接合ウサギ抗− マウスイムノグロブリン（ダコー）を希釈緩衝液で１　：　２０００に希釈し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ板のウェルに加え、１時間に亘り３７℃で培養した。ＰＢＳＴによる洗浄後、基質緩衝液中のＯＰＤ　（ｏ−フェニレンジアミン　ジヒドロクロライド）を加え、約２０分間に亘り周囲温度で色を発達せしめた。反応は、２．５ＭのＨ２ＳＯ４の添加により、停止せしめられた。バイオ−チックＥＬ−３０９ＥＬＩＳＡ読取機により４９０ｎｍでの吸収を測定した。血清の終点は、１．０の吸収値を与える希釈の逆数として定義した。

リンパ球増殖アッセイ個々のマウスの膵臓細胞の１つの細胞懸濁液をアッセイ培地で２　Ｘ　１０’　７ｍ　ｌに希釈し、０．１ｍｌを、アッセイ培地単体、１．５、または１０μｇのＨＩＶ−１ペプチドＴ１．１．５、また１０μｇのＨＩＶ−１ペプチドＴ２、および１＊たはＩＯμｇの精製ＨＩＶ−１ｇｐ１６０（イムノ）を含有する９６ウエルの平底マイクロタイタ板のウェルに加えた。細胞は、５％のＣＯ２中、３７℃で５日間に亘り培養した。最終の６時間の培養のために、■、０μＣｉの［ ″Ｈ］−チミジンを各ウェルに加え、ケンブリッジＰＨＤ細胞ハーベスタ−を用いてベックマンレディーフィルターに収穫した。フィルターディスクを液体シンチレーションカウンターでドライカウントした。

刺激指数−ＣＰ　Ｍ　Ｓ　＋１、ｐ　／　ＣＰ　Ｍ　Ｓ　Ｍｒｏ＋ｕＭ実施例１ −弱毒化ワクシニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ中しいワクシニアワクチン菌株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を発生せしめるために、既知のまたは潜在的な毒性因子をコートするゲノムの６つの回天領域の欠失によりワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株を修飾した。配列の欠失は以下に詳細に示す。ワクシニア制限断片、読取り枠、およびヌクレオチドの位置の全ての名称は、ゲーベル等に報告された用語法（１９９０ａＳｂ）に基づく。

異種遺伝子の挿入のための受容圧として、欠失塵を操作した。

ＮＹＶＡＣ中で連続して欠失した領域を以下に列記する。

また、欠失領域の省略形と読取り枠の名称（ゲーベル等、１９９０ａ、　ｂ）並びに特定された欠失の全ての欠失を含むワクシニア組換え体（ｖ　Ｐ）の名称を以下に列記する：（１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ　；　Ｊ　２Ｒ）ｖＰ４１０；（２）出血性領域（ｕ　；　Ｂ１３に＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３：（３）型金有体領域（ＡＴＩ　；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８　；（４）血球凝集素遺伝子（ＨＡ　；　Ａ３６Ｒ）ｖＰ７２３　；（５）宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ −ＫＩＬ）ｖＰ８０４；および（６）巨大ユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ　４Ｌ）ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）。

以下の実施例に記載したように、これらの領域のいずれかまたはいずれの組合せは、単体または組合せのいずれかて、免疫不全ウィルスからの外因性ＤＮＡおよび他の外因性ＤＮＡを挿入して有用な組換え体を得るための部位であここで第１図を参照する。プラスミドｐｓＤ４０６はｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩＪ（位置８３３５９−８８３７７）を含有している。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄＩＩＩとＰｖｕｌｌで切断し、ＨｉｎｄｌｌＩ　Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＵＣ８にクローニングし、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐ　ＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置８３８５５− ８４３８５）の全遺伝子を含有している。開始コドンはＮｌａｌｌｌ部位内に含まれ、終止コドンは５ｓｐ１部位内に含まれる。転写の方向は第１図の矢印により示す。

左の側腹アームを得るために、０．８ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ／ＥｃｏＲ１断片をｐＳＤ４４７から単離して、次いでＮ１ａ１１１で切断し、０．５ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ／Ｎ１ａｌｌｌ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４　Ｃ配列認ｍ番号１／配列認識番号２）を０．５ｋｂのＨｉｎｓＩＩＩ／Ｎ１ａＩＩ　Ｉ断片により、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１８ベクタープラスミドに連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を産生じた。

ワクシニア右側腹アームとｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るために、ｐＳＤ４４７をワタシニア配列内の５ｓｐＩ　（部分的）とｐＵＣ／ワクシニア接合部のＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２．９ｋｂのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６　（配列認識番号３７′配列認識番号４）と連結し、ｐＳＤ４５９を産生じた。。

１つのプラスミド中に左と右の側腹アームを結合するために、０．５ｋｂのＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ断片をｐＳＤ４４９から単離し、Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉで切断したｐＳＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミドｐｓＤ４６０を産生じた。ｐｓＤ４６０を、野生型親ワタシニアウイルスコペンハーゲン菌株ＶＣ−２による組換えのための供与体プラスミドとして用いた。テンプレートとしてのＭＰＳＹＮ４５　（配列認識番号３）およびプライマーとしての相補２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＮＹＮ４７（配列認識番号５）（５’　ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３’）を用いたプライマー延長により３２ｐ標識プローブを合成した。組換えウィルスｖＰ４１０はプラーク雑種形成によりここで第２図を参照する。プラスミドｐ　ＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニア５ａｌｌ　Ｇ（位置１６０，７４４−１７３．３５１）を含有している。

ｐＳＤ４２２は、右側に隣接する５ａｉｌ断片である、ｐＵＣ８にクローニングされた５ａｉｌ　Ｊ（位置１７３゜３５１−１８２．７４６）を含有している。

出血性領域、ｕＳＢ　ｌ　３Ｒ−Ｂ　］、　４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３゜５５２）の欠失したプラスミドを構成するために、ｐＳＤ４１９を左側腹アームの供給源として用い、ｐＳＤ４２２を右側腹アームの供給源として用いた。Ｕ領域の転写方向を第２図の矢印により示す。

ｐｓＤ４１９から望ましくない配列を除去するために、ｐｓＤ４１９のＮｃｏＩ／Ｓｍａｌによる切断と、続いてＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片によるプラントエンドと連結により、Ｎｃｏ１部位（位置１７２．２５３）の左までの配列を除去し、プラスミドｐ　Ｓ　Ｄ　４．７６を産生じた。Ｂ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａｌによるｐＳＤ４２２の切断と０．３ｋｂ右のＮｒｕ　Ｉによる切断により、ワクシニア右側腹アームを得た。この０．３ｋｂ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から単離した３、４ｋｂのＨｉｎｃｌＩベクター断片で連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生じた。ｐＳＤ４７７中のワクシニアＵ領域の部分的欠失の位置を三角形により示す。ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒ暗号配列をＣ１ａｌ／Ｈｐａｌでの切断により除去し、生成したベクター断片を、アニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅ　ｒ／ＳＤ２０ｍｅ　ｒ　（配列認識番号６／′配列認識番号７）と連結し、ｐＳＤ４７９を産生じた。ｐＳＤ４７９は、開始コドン（下線）と続いてＢａｍＨ１部位を含有している。

Ｕプロモーターの制御下でＥ、ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを８１３−８１４　（ｕ）欠失塵に配するために、ベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３、２ｋｂＢａｍＨＩ断片（シャピラ等、１９８３）をｐＳＤ４７９のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＳＤ４．７９８Ｇを産生じた。ｐｓＤ４７９８Ｇを、ワクシニアウィルスｖＰ４１０による組換えのための供与体プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウィルスｖＰ５３３を、色素基質Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−８１４Ｒ領域を欠失せしめ、ベータガラクトシダーゼにより置換する。

ｖＰ５３３からベータガラクトシダーゼを除去するために、Ｕ欠失接合部には開始コドンを含まないがポリリンカー領域を含むｐＳＤ４７７の誘導体である、プラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に、上述のｐＳＤ４７７からのＣ１ａｌ／ＨｐａＩベクタ一断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅ　ｒ／ＳＤ４０ｍｅ　ｒ　（配列認識番号８／配列認識番号９）ｔと連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生じた。次に、ＥｃｏＲＩによりｐＳ０４７８の切断と続いてのＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片によるプラントエンドと連結により、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ，Ｉ部位を破壊し、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ−を産生じた。ｐＳＤ４７８Ｅ−をＢａｍＨＩとＨｐａｌで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６　（配列認識番号１０／配列認識番号１１）と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６を産生じた。ｐＳＤ４８６は、組換えワクシニアウィルスｖＰ５３３による組換えのための供与体として用い、ｖＰ５５３を産生じ、これをＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

ここで第３図を参照する。ｐｓＤ４１４はｐＵＣ８にクローニングされた５ａｉｌ　Ｂを含有している。Ａ２６Ｌ領域の左側までの望ましくないＤＮＡ配列を除去するために、ｐｓＤ４１４をワクシニア配列（位置１３７．０７９）内のＸｂａＩとｐＵＣ／ワクンニア接合部でのＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断し、次いでＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドし、連結し、プラスミドｐＳＤ４８３を産生じた。Ａ２６Ｌ領域の右側までの望ましくないＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置１４０．６６５およびｐｕｃ、、’ワクシニア配列内）で切断し、連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を産生じた。

Ａ２６Ｌ暗号頌域を除去するために、ｐＳＤ４８４をＡ２６Ｌ　ＯＲＦからやや上流のＮｄｅｌ（部分的）（位置１３９．００４）とＡ２６Ｌ　ＯＲＦからやや下流のＨｐａＩ　（位置１３７．８８９）で切断した。５．２ｋｂベクタ一断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＡＴ１３／ＡＴＩ４（配列認識番号１２／配列認識番号１３）ＡＣＴＣＡＴＴＧＡＡＴｒＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴｒＴＴＣＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡと連結し、Ａ２６Ｌから上流の領域を再構成し、Ａ２６ＬＯＲＦを、上述したような制限部位Ｂｇｌ　Ｉ　Ｌ　Ｅｃ。

ＲＩおよびＨｐａｌを含有する短いポリリンカー領域と置換した。産生じたプラスミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域におけるＢｇｌｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特異的ではないので、ＢｇｌｌＩ（位置１４０．１３６）とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃ。

Ｒ１での切断と、続いてのＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片によるプラントエンドと連結により、プラスミドｐＳＤ４８３　（上述）からＢｇｌｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位を除去した。産生じたプラスミドをｐｓＤ４８９と称する。

Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを含有するｐミＤ４８９からの１゜８ｋｂ　Ｃ１ａＩ　（位置１３７．１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９，０４８）断片を、ｐＳＤ４８５からの、対応する０、７ｋｂポリリン力−含有Ｃ１ａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置換し、ｐＳＤ４９２を産生じた。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域のＢｇｌｌｌおよびＥｃｏＲＩ部位は特異的である。

ワクシニア１１ｋＤａプロモーター（バートレット等、１９８５　、パーカス等、１９９０）の制御下でＥ、ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを含有する３、３ｋｂのＢｇｌｌＩカセット（シャピラ等、１９８３）をｐｓＤ４９２のＢｇｌ　Ｉ　Ｉ部位に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを産生じた。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧは治療ウィルスｖＰ５５３による組換えに用いた。Ａ２６Ｌ欠矢部位にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルス、ｖＰ５８１を、Ｘ −ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ワクシニア組換えウィルスｖＰ５８１からベータガラクトシダーゼを除去するためのプラスミドを産生ずるために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７　（配列認識番号１４）（５’　ＡＡＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴｒＧＴＴＡＡＣｆｆｒＡＴＡＴＡＡＣＴｒＡＴＴ’ｌＴＴ’ｒＧＡＡＴＡＴＡＣ３′）を用いた突然変異誘発により欠失せしめた。産生じたプラスミドｐＭＰ　４９４ Δにおいて、全Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを含有する、ワクシニアＤＮＡ包含位置［１３７，８８９−１３８，９３７］が欠失せしめられる。ｐＭＰ　４９４Δとワクシニア組換え体ｖＰ５８１を含有するベータガラクトシダーゼの間の組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８か産生せしめられ、この変異体はＸ−ｇａｌの存在下透明プラークとして単離した。

ここで第４図を参照する。ワクシニア５ａｌＩ　Ｇ制限断片（位置１６０，７４４−１７３，３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ　Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９）と交差している。ｐｓＤ４１９はｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニア５ａｌＩ　Ｇまを含有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図の矢印で示す。ワクシニア配列内とｐＵＣ／ワクシニア接合部のＨｉｎｄｌｌＩによるｐｓＤ４１９の切断と続いての連結により、Ｈｉ　ｎ−ｄ　ＩＩＩ　Ｂから誘導せしめられたワクシニア配列を除去した。

差産生したプラスミドｐＳＤ４５６は、右に０．４ｋｂのワクシニア配列と左に０．４ｋｂのワクシニア配列を側腹に有するＨＡ遺伝子、Ａ３６Ｒを含有している。Ａ３６Ｒ暗号配列から上流のＲｓａｌ（部分的；位置１６１，０９０）およびこの遺伝子の末端近くのＥａｇｌ　（位置１６２゜０５４）でｐＳＤ４５６を切断することによりＡ３６Ｒ暗号配列を除去した。ｐＳＤ４５６からの３．６ｋｂのＲｓａ　Ｉ　／　Ｅ　ａ　ｇ　Ｉベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列認識番号１５）、ＭＰＳＹ６２　（配列認識番号１６）　、ＭＰＳＹＮ６０　（配列認識番号１７）、およびＭＰＳＹＮ６１　（配列認識番号ＭＰＳＹＮ５９　−ＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＡＴｒＴ：ｌ’ＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴｒＴＡＴｒＴＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴｒＣＴＡＧＡ−と連結し、Ａ、５６ＲＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構成し、上述したようにＡ３６ＲＯＲＦをポリリンカー領域と置換した。産生じたプラスミドはｐＳＤ４６６である。

ｐＳＤ４６６中ノワクンニア欠失は位１ｃｔｓｔ、１８５−１６２，０５３］を包含している。ｐＳＤ４６６中の欠失部位を第４図の三角形により示す。

ワクシニア１１　ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレット等、１９８５　、グオ等、１９８９）　Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラ等、１９８３）を含有する３゜２ｋｂのＢｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩ　（部分的）カセットをｐＳＤ４６６のＢｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ部位に挿入シ、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを産生じた。治療ウィルスｖＰ６１８による組換えにプラスミドｐＳＤ０４６６ＫＢＧを用いた。Ａ３６Ｒ欠失部位にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ７０８を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ベータガラクトシダーゼ配列を、供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてｖＰ７０８から欠失せしめた。ＥｃｏＲ１／Ｂａｍ、ＨＩによるｐＳＤ４６６の切断と続いてのＥ。

ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片によるプラントエンドおよび連結により、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａｌおよびＢａｍＨ１部位がｐ　Ｕ　Ｃ／ワクシニア接合部から除去されたことを除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同一である。

ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７の間の組換えにより、組換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３が産生した。この変異体をＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

ここで第５図を参照する。以下のワクシニアクローンはｐ　Ｍ　Ｐ　ＣＳ　Ｋ　ｌΔの構成に用いた。ｐｓＤ４２０はｐｕｃ８にクローニングされた５ａｌｌ　Ｈである。ｐＳＤ４３５はｐＵｃ１８にクローニングされたＫｐｎｌ　Ｆである。

ｐＳＤ４３５を５ｐｂｌて切断し、再連結し、ｐＳＤ４５１を産生した。ｐｓＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩＭ中の５ｐｈ１部位（位置２７，４１６）の左までのＤＮＡ配列を除去した（パーカス等、１９９０）。ｐｓＤ４０９はｐＵＣ８にクローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍである。

ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−に、ＩＬ］遺伝子クラスターを欠失するための基質を提供するために、Ｅ、ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを以下のようにワクシニアＭ２Ｌ欠失座に最初に挿入した（グオ等、１９９０）。ｐｓＤ４０９中のＢｇｌ１１部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列中のＢｇｌｌｌ（位置２８，２１２）およびｐｔｒｃ／′ワクシニア接合部でのＢａｍＨ，Ｉで切断し、次いで連結し、プラスミドｐＭＰ　４０９　Ｂを産生じた。ｐＭＰ４０９Ｂを特異的Ｓｐｎ　１部位（位置２７，４１６）で切断した。

合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ８２　（配列認識番号１比Ｕエエを用いた突然変異誘発（グオ等、１９９０　；マンデツキ、１９８６）により除去した。産生じたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上述したようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された特異的ＢｇｌＩｉ部位を含有している。１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレット等、１９８５）　Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉベータガラクトシダーゼを含有する３、２ｋｂのＢａｍＨＩ　（部分的）／ＢｇＩＩＩカセットを、ＢｇｌＩＩで切断したｐＭＰ４０９Ｄに挿入した。産生じたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオ等、１９９０）を、治療ワクシニアウィルスｖＰ７２３による組換えのための供与体プラスミドとして用いた。Ｍ２　Ｌ欠失塵に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する句か見えワクシニアウィルスｖＰ７８４を、Ｘ −ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の欠失したプラスミドを、Ｓｍａ　ＩとＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断し、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドしたｐＵＣ８中に組み込んだ。ｐｓＤ４２０のＸｂａＩ（位置１８゜６２８）の切断と続いてのＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのりルノウ断片によるプラントエンドとＢｇｌｌＩ（位置１−９゜７０６）での切断により、ワクシニアＨｉｎｄｌｌＩ　Ｃ配列からなる左側腹アームを得た。ＢｇｌＩＩ（位置２９゜０６２）とＥｃｏＲＶ（位置２９，７７８）でのｐＳＤ４５１の切断により、ワクシニアＨ１ｎｄＩＩＩ　Ｋ配列からなる右側腹アームを得た。産生じたプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｃ中のＢｇ１１１部位（位ｉｌｌ、９．７０６）とＨｉｎｄｌｌｌ、に中のＢｇｌ１１部位（位ｔｉ１２９，０６２）の間のワクシニア配列が欠失している。プラスミドｐＭＰ５８１ｃＫ中のワクシニア配列の欠失部位を第５図中の三角形で示す。

ワクシニア欠失接合部での過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ　５８１　ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏ１部位（位置１８，８１１；１９．６５５）で切断し、Ｂａ１−３１エキソヌクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３　（配列認識番号２０）５’　ＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＡＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴ　３’ を用いた突然変異誘発（マンデツキ、１９８６）を施した。産生じたプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δは、１２ワクシニア読取り枠［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］を包含する、ワクシニア配列位置１８．８０５−２９，１０８が欠失している。ワクシニア組換え体ｖＰ７８４を含有するベータガラクトシダーゼとｐＭＰｃｓＫ１Δの間の組換えにより、ワクシニア欠失接合部ｖＰ８０４が産生せしめられた。この変異体を、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

ここで第６図を参照する。プラスミドｐｓＤ４０５はｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄｌｌｌＩ　（位置６３．８７５−７０．３６７）を含有している。

ｐｓＤ４０５を、ワクシニア配列内のＥｃｏＲＶ（位置６７．９３３）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＳｍａ■で切断して連結し、プラスミドｐｓＤ５１８を産生じた。

ｐＳＤ５４８の構成に用いた全てのワクシニア制限断片の供給源としてｐｓＤ５１８を用いた。

真ワクシニア１４Ｌ遺伝子は位置６７．３７１−６５゜０５９に亘り延びている。Ｉ４Ｌの転写方向を第６図中の矢印により示す。１４Ｌ暗号配列の部分が欠失したベクタープラスミド断片を得るために、ｐｓＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５，３１８）およびＨｐａＩ（位置６７．００１）で切断し、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンドした。この４．８ｋｂのベクター断片を、ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレット等、１９８５　、パーカス等、１９９０）　Ｅ、ｃ　ｏ　１１ベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラ等、１９８３）を含有する３、２ｋｂのＳｍａｌカセットと連結し、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを産生じた。ワクシニアウィルスｖＰ８０４による組換えのための供与体プラスミドとしてｐＳＤ５２４ＫＢＧを用いた。

１４Ｌ遺伝子が部分的に欠失したベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ８５５を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ｖＰ８５５から残りのＩ４Ｌ　ＯＲＦとベータガラクトシダーゼを欠失するために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構成した。上述し、第６図に概略を示したように、左右のワクシニア側腹アームをｐＵＣ８中で別々に組立てた。

左ワクシニア側腹アームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１１５１８Ａ２（配列認識番号２１／配列認識番号２２）ＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＭＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＴＩ’ＡＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＧＡＧＴＡと連結し、プラスミドｐｓＤ５３１を産生じた。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分的）とＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂのベクター断片を単離した。ｐｓＤ５１８をＢｇｌｌ■　（位置６４．４５９）／Ｒｓ　ａ　Ｉ　（位置６４．９９４）で切断し、０．５ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３７を産生した。このｐＳＤ５３７は、Ｉ４Ｌ暗号配列の左に完全なワクシニア側腹アームを含有している。

右ワクシニア側腹アームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１１５１８Ｂ２（配列認識番号２３／配列認識番号２４）ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡ〜υす講ＡＴＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＴＴ５１ＢＢ２　’３１ＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＡと連結し、プラスミドｐＳＤ５３２を産生じた。ｐｓＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂのベクター断片を単離した。ｐｓＤ５１８をワクシニア配列内のＲｓａＩ（位置６７．４３６）およびワクシニア／　ｐ　Ｕ　Ｃ接合部でのＥｃｏＲＩで切断し、０．６ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３８を産生じた。このｐＳＤ５３８は、１４Ｌ暗号配列の右゛に完全な側腹アームを含有している。

右ワクシニア側腹アームをｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌｌＩで切断したｐＳＤ４３７ベクター断片に連結した。産生じたプラスミドｐＳＤ５３９において、ｌ４ＬＯＲＦ（位５１６５．０４７−６７．３８６）は、ポリリンカー領域により置換されている。この領域は、全てｐＵＣ背景において、左には０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡと右には０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡを側腹に有する。

ワタシニア配列内の欠失部位を第６図中の三角形で示す。

ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分におけるベータガラクトシダーゼ配列の組換えワクシニアウィルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列により起こり得る組換えを避けるために、ワクシニア１４Ｌ欠失カセツトをｐＳＤ５３９からｐＲｃｌｌ中に除去した。全てのベータガラクトシダーゼ配列はｐＵＣ誘導体から除去し、ポリリンカー領域と置換した（コリナス等、１９９０）　。ｐ　ＳＤ５３９をＥｃｏＲ１／Ｐｓｔｌで切断し、１．２ｋｂの断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲｃｌｌ　（２゜３５ｋｂ）中に連結し、ｐＳＤ５４８を産生じた。ワクシニア組換え体ｖＰ８５５を含有するベータガラクトシダーゼとｐＳＤ５４８との間の組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が産生せしめられた。この変異体を、Ｘ−ｇａ　ｌの存在下で透明プラークとして単離した。

組換えワタシニアウイルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断と続いてのアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限模様は予期したものであった。

テンプレートとしてのｖＰ８６６と上述した６つの欠失塵を側腹に有するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケ等、１９８８）により、予期したサイズのＤＮＡ断片を産生じた。欠失接合部の区域辺りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、接合部は予期されたものであることが確認された。上述したような６つの操作欠失を含む組換え株ｒＮＹＶＡｃＪと称した。

この実施例は、ＨＩＶ遺伝子産生物を発現する宿主制限ポックスウィルスの産生を記載する。用いたベクターは、ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲ０ＶＡＣである。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｂ）Ｖ３ループおよびエピトープ８８を含有するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ組換え体ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）のｖ３ループ（アミノ酸２９９−３４４．ジャブヘリアン等、１９８９　、ラローザ等、１９９０）を包含する１５０ｂｐ断片を、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ５　（配列認識番号２５）（５’　−ＡＴＧＧＴＡＧＡＡＡＴｒＭＴＴＧＴＡＣ−３’　）およびＨＩＶ３ＢＬ３　（配列認識番号２６）（５’−ＡＴＣＡＴＣＧＭＴＴＣＭＧＣＴｒＡＴＴＡＴ’ｒＴｒＧＣＴＣＴＡＣＴＭＴＧＴｒＡＣ−３１）をテンプレートとしてのｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）（ＭＤ１ヘセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガロにより提供された）とともに用いたＰＣＲにより誘導せしめた。オリゴヌクレオチドＥ（ＩＶ８８Ａ　（配列認識番号２７）およびＨＩＶ８８Ｂ　（配列認識番号２８）をともにアニールして、ＨＩＶ−１エピトープ８８を含有する二本鎖断片（アミノ酸９５−１０５、シャファーマン等、１９８９）を産生じた。エピトープを含有する１５０ｂｐのｖ３含有ＰＣＲ断片および８８工ピトープ配列を含有する４２ｂｐ断片を、相補配列に存在のためＰＣＲにより、ともに融合せしめた。反応は、オリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃ（配列認識番号２９）（５’　−ＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴｒＴＡＡＣ−３’　）およびＨＩＶ３ＢＬ３を用いて行なった。１９２ｂｐのＰＣＲ誘導断片は、ｖ３ループ配列の上流に融合されたエピトープ８８配列を含有している。終止コドンはオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３Ｐ中に含まれ、読取り枠の翻訳を終止し、開始コドンはオリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃ中に含まれ、エピトープ８８／Ｖ３ループ融合タンパク質を発現する翻訳の開始のときに作用した。さらに、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３は、ＥｃｏＲＩ部位が１９２ｐｂ　ＰＣＲ断片の３′ 末端に存在するように合成された。

エントモポックスウィルスプロモーター、４２ｋＤａ（初期）は、テンプレートとしてのプラスミドｐＡＭ１２とともにオリゴヌクレオチドＲＧ２７３　（配列認識番号３（５’　−ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣ店店ＭＴＡＴＡＡＡＴＧＡＴＩＴＣ−３’　）およびＲＧ２７４　（配列認識番号３１）（５’　−ＴＴＴＡＴＡ’１ＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＩ’ＴＴＣ−３’　）を用いたＰＣＲにより産生じた。４２ｋＤａプロモーターを含有する１０８ｂｐ断片を、５′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するように合成した。分節を含有する４２ｋＤａプロモーターを、ＥｃｏＲＩで切断したエピトープ８８／Ｖ３断片およびＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐ　ＲＷ８３１に連結する前に、キナーゼし、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。産生じたプラスミドはｐｃ５ＨＩＶＬ８８と称した。このプラスミドを治療ウィルスとしてのＣＰｐｐによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えに用いてｖＣＰ９５を産生した。ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ９５は、ＣＰｐｐのｄｅ −ＯＲＦｅｄＣ５座にエピトープ８８／Ｖ３を含有している。

プラスミドｐｃ５ＨＩＶＬ８８をＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩとＥｖｏＲＩで切断し、上述したエピトープ８８／Ｖ３発現カセットを含有する３００ｐｂ断片を遊離せしめた。この断片をＬＭＰ−アガロースゲルから切除して、フェノール抽出（２× ）とエーテル抽出（ＩＸ）により単離した。単離断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンドした。

プラントした断片をＳｍａ　Ｉで切断したｐｓＤ５５０Ｖｃに連結し、プラスミドｐＨＩＶＬ８８Ｖｃを産生した。このプラスミドを治療ウィルスとしてのｖＰ８６６とともに用いてｖＰ８７８を産生じた。ｖＰ８７８は、ｖＰ８６６のｄｅ −ＯＲＦｅｄ　Ｉ４Ｌ座にエピトープ８８／Ｖ３ループカセツトを含有している。

ワクシニアウィルスＨ６プロモーターに対して３′が並列したＨＩＶ−１（ＩＩ　ＩＢ）ｅｎｖ遺伝子からなる発現カセット（グオ等、１９８９　、ティラー等、１９８８ａ、　ｂ）を、Ａ、　Ｌ　Ｖ　Ａ　ＣおよびＮＹＶＡＣベクターによるＨＩＶ−１からのｇｐ１６０の発現のために操作した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂｌ　（配列認識番号３２）（５’　−ＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴｒＣＴＴＣＴＡＣＴＧＴＡＡＴＴＣ−３’　）およびＨＩＶ３Ｂ５　（配列認識番号３３）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣ−３’　）を用いて、１，４ｋｂの断片をｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）（ＭＤ　、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨＳＤｒ、Ｒ，Ｃ，ガロにより提供された）から増幅せしめた。この断片は、ｅｎＶ遺伝子の３′部分を含有している。これらのプライマーによるＰＣＲ増幅により、暗号配列の後にワクシニアウィルス初期転写終止Ｔ５ＮＴ配列モチーフを配し、アミノ酸配列を変更することなく位置６１４６から６１５２に位置したＴ５ＮＴモチーフ（ラトナー等、１９８５）を除去した。

この変更（ＴからＣ）により、この位置にＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を産生じた。この１．４ｋｂの断片をＥｃｏＲＩ　（５’　−末端）とＸｂａＩ（３ ’　−末端）で切断し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−３Ｋに挿入した（ＣＡ、ラジョラ、ストラタンエネ）。産生じたプラスミドをｐＢｓＨＩＶＥＮＶｌ、５と称した。この断片のヌクレオチド配列の分析により、位置７０４８でのＴからＣへの転移以外は、配列は完全に正確であったことが示された。この転移は以下のように正された：テンプレートとしてのｐＨＸ８．２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号３２）（５’ 　−ＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴｒＣＴＡＣＴＧＴＡＡＴＴＣ−３’　）およびＨＩＶ３Ｂ１７　（配列認識番号３４）（５’　−ＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＧＧＴＴＣ−３’　）を用いたＰＣＲにより２５０ｂｐの断片を誘導した。この断片をＢｇｌｌＩとＥｃｏＲｌで切断した。この断片をＢａ１ｌｌとＥｃｏＲＩで切断したｐＢｓＨＩＶ３Ｂ１．５に挿入し、そして不正確なヌクレオチドを有する領域と置換してプラスミドｐＢＳＨＩＶ３Ｂ３Ｐを産生した。テンプレートとしてのｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ９　（配列認識番号３５）（５’　−ＣＡＴＡＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧ−３’　）およびＨＩＶ３Ｂ１０　（配列認識番号３６）（５’　−ＡＴＧＡＭＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧ−３’　）を用いたＰＣＲにより、ｅｎｖ遺伝子の５′部分を含有する１５０ｂｐの断片を誘導した。オリゴヌクレオチドｖ■（５’−ＡＴＣＡＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣ−コｔ）およびＶＶＨ６３Ｐ　（配列認識番号３８）（５’　−ＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧ−３’　）を用いたＰＣＲにより、ｐＣ３ＦＧＡＧからワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有する１２８ｂｐ断片を産生じた。ＫｐｎＩで切断したｐＢＳ−３Ｋにこれらの断片をともに挿入する前に、両方の断片をＫｐｎｌで切断し、１５０ｂｐの断片を、キナーゼした。産生じたプラスミドをｐＢＳＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐと称シタ。

オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２　（配列認識番号３９）（５’−ＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＣ−３′）− およびＨＩＶ３Ｂ７　（配列認識番号４０）（５’　−ＣＭＴＡＧＡＴＡＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣ−３’　）を用いたＰＣＲにより、ｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）から６ｏｏｂｐの断片を産生じた。この断片をＥｃｏＲＩで切断し、キナーゼした。同一のテンプレートであるが、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ６　（配列認識番号４１）（５’　−ＧＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＡＧＴｒＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣＡＴ’ＡＴＴＣ−３１）およびＨＩＶ３Ｂ８　（配列認識番号４２）（５’−ＧＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＧＣ−３１）を用いたＰＣＲにより、５００ｂｐの断片を誘導した。この断片をＫｐｎＩて切断した。これらの断片はヌクレオチド５８７８から６３６８にともに対応している（ラトナー等、１９８５）。これらのプライマーによるこれらの断片の操作により、アミノ酸配列を変更することなく、ヌクレオチド６３２２から６３２８に位置するＴ５ＮＴ配列を除去する。これらの２つの断片をＫｐｎｌとＥｃｏＲＩで切断したｐＢｓＨＩＶ３Ｂ３Ｐに挿入した。このプラスミドをｐＢＳＨＩＶ３ＢＰ２７６８と称した。

プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ３Ｂ５ＰをＫｐｎｌで切断し、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の５′部分（１５０ｂｐ）と１４６プロモーターを含有する３６０ｂｐの断片を遊離せしめた。このＫｐｎＩ断片をＫ　ｐ　ｎ　Ｉて切断したｐＢＳＨＩ　Ｖ　３８３　Ｐ　２７６　ｓ　ニ連結し、プラスミドｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＩＩを産生した。Ｘｂａｌての切断と部分的なＫｐｎｌての切断により、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＩ　［から２．８ｋｂの断片を誘導した。この断片をプラントエンドし、Ｓｍａｌで切断したｐｓＤ５５０に挿入した。プラスミドｐ１４ＬＨ６ＨＩＶ３Ｂを産生じ、治療ウィルスとしてのＶＰ８６６による組換え実験に用いた。これにより、ＮＹＶＡＣゲノムのＩ４Ｌ座にＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を含有するＶＰ９１１を産生じた。

ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子をＡＬＶＡＣベクター中に挿入するために、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＡＩ　ＩをＮｒｕ　ＩとＸｂａｌて切断した。誘導した２、７ｋｂの断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドした。この断片は、ワクシニアＨ６プロモーターの３′ −側２１ｂｐまで（Ｎ　ｒ　ｕ■部位まで）３′が並列する全ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を含有している。この断片を、Ｎｒｕ　ＩとＥｃｏＲＩでのｐ　ＲＷ８３８の切断と続いてのフレノウによるプラントエンドにより誘導した３、ｌｋｂの断片に連結した。ｐＲＷ８３８誘導断片は、０５座に対して異種遺伝子を向けるカナリアボックスから誘導した相同アームを含有している。

また、Ｈ６プロモーターの５′側の１００ｂｐも含有している。それゆえ、これらの断片の連結により、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の発現カセットを含有する挿入プラスミドが産生せしめられ、これをｐｃ５ＨＩＶ３ＢＥと称した。

このプラスミドを、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣにょろりｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、ｖｃＰ１１２を産生した。

ＨＩＶ−１（ｌ　ｌ　ＩＢ）ｇｐ１２０を発現するＮＹＶＡＣ−ベースの組換え体プラスミドｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＡＩ　ＩをＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断し、４．３ｋｂの断片を遊離せしめた。この断片は、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子からヌクレオチド６９４６に結合したワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有している（ラトナー等、１９８５）。４．３ｋｂの断片を、ｇｐ１２０暗号配列の３′部分に対応する３００ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ切断ＰＣＲ誘導断片に連結した。テンプレートとしてのｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶＩ−１２０Ａ　（配列認識番号４３）（５’−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＭＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴｒＴＴＴＡＣＴＡＣＴＴＴＩ’ＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴｒＴＣ−３’）およびＨＩＶＩ−１２０Ｂ　（配列認識番号４４）（５’　−ＣＡＡＴＡＡＴＣＴｒＴＡＡＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣ−３’　）を用いて、３００ｂｐのＰＣＲ断片を誘導した。４．３ｋｂのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片と３００ｂｐのＸｂａＩ／ＥｃｏＲ１断片の連結により、プラスミドｐＢｓＨＩＶＢ１２０が産生せしめられた。

最初にプラスミドをＸｂａｌにより線状化し、続いて部分的なＫｐｎｌ切断により１．６ｋｂのＫｐｎｌ／Ｘｂａ１［Ｔ片をｐＢＳＨＩＶＢ１２０から誘導した。ｌ、５ｋｂの断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片による処理によりプラントエンドした。この断片をＳｍａ　Ｉで切断したｐＳＤ５４１に挿入し、ｐＡＴＩＨＩＶＢ１２０を産生した。このプラスミドをｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いてｖＰ９２１を産生じた。この組換え体は、ＮＹＶＡＣＯＡＴＩ座中のｇｐ１２０をコードするＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の部分を含有している。

ｖＰ９１１、ｖＰ９２１およびｖｃＰ１１２により表されるＨＩＶ−１遺伝子産生物の確実性を決定するために、イムノプレシビテーション分析を行なった。

感染細胞から誘導した溶解産物を、ＨＩＶ−１血清陽性個体からプールした血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ　−Ｎ　ＩＨＳＤｒ、ジェノベファ　フランチ一二から得た）を用いてＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清は、ｖＰ８６６感染Ｖｅｒｏ細胞で予備吸着せしめた。予備吸着ヒト血清を４℃での一晩の接種によりタン、＜り質Ａセファロースに結合せしめた。ある場合には、ｇｐ１２０に特異的な単クローン性抗血清（デュポン）を第１血清として用い、ラット抗マウスを第２抗体として用いた。この培養期間に続いて、材料をＩ×緩衝液Ａで４回洗浄した。

通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合せしめられた血清陽性の個体からのヒト血清により４ ℃で一晩培養せしめた。−晩の培養期間に続いて、試料を、１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ２／尿素緩衝液で２回洗浄した。２Ｘラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２ −メルカプトエタノール）の添加と、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）上で分画し、固定化し、蛍光光度法のためにＬＭ−Ｎａ− サリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からプールした血清を用いたイムノプレシピテーションの結果は、ｖＰ９１１感染細胞溶解産物からのｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１成熟形状の特異的沈殿を示した。親ウィルス（ＮＹＶＡＣ；　ｖ　Ｐ　８６６）感染細胞溶解産物においては、そのような特異的遺伝子産生物は検出されない。

ｇｐ１２０の特異的沈殿はまた、ｖＰ９２１感染細胞溶解産物中にも発見された。

同一血清の免疫蛍光分析は、それぞれｖＰ９１１およびｖ　Ｐ　９２１．により発現せしめられたｇｐ１６０およびｇｐ１２０種は、感染細胞の表面に存在したことを説明した。

ｖｃＰ１１２感染ＣＥＦ細胞に関してもイムノプレシピテーションを行なった。

ＡＬＶＡＣ親ウィルスに感染した細胞および未感染ＣＥＦ細胞からのｇｐ１２０細胞外部分に対して群れられた単クローン性抗体により、ＨＩ　Ｖ−特異的ポリペプチドはまったく沈殿しなかった。しかしながら、ｖｃＰ１１２感染細胞からは、２つのＨＩＶ−特異的ポリペプチド種が沈殿した。これらの種は、それぞれ前駆体ｅｎｖ遺伝子産生物および成熟細胞外形状に対応する、１６０ｋＤａおよび１２０　ｋ、　Ｄ　ａの明確な移動度により移動した。

ＨＩＶ　ｇｐ１２０を発現する組換えワクシニアウィルスは主要ＨＩＶ−特異的細胞障害Ｔリンパ球活性を誘発する５Ｘ１０’ＰＦＵのワクシニアウィルス組換え体ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１、もしくは、対照としてのベクターＮＹＶＡＣのｉｖ投与に続いて、ペプチドＨＢＸ２て一晩培養した合成Ｐ８１５細胞に対する、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺臓ＣＴＬ活性を評価した（表１）。

あまり多くないが、顕著な（Ｐ　＜　０．０５）第１ＣＴＬ活性がｖＰ９２１を投与したマウスの肺臓中に生成され、ＨＩＶ　ｇｐ１２０を発現した。他の組換えワクシニアウィルスまたはベクターは、第１ＨＩＶ−特異的ＣＴＬ活性を誘発できなかった。ワクシニアウィルスを投与したマウスの各群が第１ワクシニア− 特異的ＣＴＬ活性に応答したので、これは不適切な感染のためではない。対照の免疫化していないマウスも標的に応答しなかった。

ＨＩＶ　ｅｎｖペプチドを発現する組換えポックスウィルスはＨ［Ｖ−特異的記憶細胞障害Ｔリンパ球を産生ずる１つの組換えワクシニアウィルスの１回の接種から少なくとも１か列後、マウスの肺臓細胞を、ＮＹＶＡＣまたは各ＨＩＶ組換えワクシニアウィルスを事前に感染せしめた同系で未経験の肺臓細胞によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激せしめた（表２）。同一のワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体（ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１）の１つに感染せしめた細胞によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで再刺激せしめた、ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、およびｖＰ９２１で免疫化したマウスの牌象細胞培養中のみで強いＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性が検出サレタ。ＨＩＶ　ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を発現するワクシニアウィルス組換え体は、８８エピトープに融合されたＶ３ループのみを発現するワクシニアウィルス組換え体よりも良好に記憶ＣＴＬを産生できた。

ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性は、未免疫化対照またはＮＹＶＡＣ免疫化牌象細胞からは誘発できなかった。ワクシニア特異的記憶ＣＴＬ活性は、使用したワクシニアウィルスのいずれかに感染せしめた肺臓細胞によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激後に明確となったので、ベクター免疫化マウスにＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性のないことは、乏しい免疫化に帰するものではなかった。

同様な研究において、ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬを生成する、８８エピトープに融合されたｖ３ループ領域を発現するカナリアボックス組換え体（ｖＣＰ９５）の能力を実験した（表３）　。ｔｏ’　ＰＦＵのｖＣＰ９５またはカナリアボックスベクター、ＣＰｐｐの１回の接種から３週間後、ＨｔＶ特異的記憶ＣＴＬ応答を、組換えワクシニアウイル−ス類似体、ｖＰ８７８により誘発せしめられた応答と比較した。ワクシニアおよびカナリアボックスＣＴＬ応答は、適切な免疫化の対照として含まれた。ｖＰ８７８およびｖＣＰ９５で免疫化したマウスからの肺臓細胞のみが、ｖＰ８７８により刺激できたＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性を生成した。機能的細胞溶解ＣＴＬに対して存在する記憶ＣＴＬを刺激しないｖＣＰ９５の能力は、ワクシニアウィルス組換え体の使用に基づいて最大とされる、使用したｉｎ　ｖｉｔｒｏ条件に関連したかもしれない。

Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ刺激細胞障害細胞の特徴付けＨＩＶペプチド瞬間標識標的細胞に対する細胞媒介細胞障害が、ナチュラルキラー細胞のような、ＣＴＬに関連しない非特異的エフェクター細胞の個体群を示すことが考えられる。これを試験するために、ｖＰ９２１で免疫化し、ｖＰ９２１感染牌臓細胞によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで再刺激′したマウスの肺臓細胞を、Ｔヘルパーリンパ球（ＣＤ、４）または細胞障害リンパ球（ＣＤ８）に特有のＴリンパ球結実表面抗原が枯渇していた（表４）。前述のように、ｖＰ９２１で免疫化したマウスのみが、ｖＰ９２１感染同系牌臓細胞によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激しえた記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性を生成した。補体産生（Ｃ′）および単クローン性の抗−ＣＤ４と抗−ＣＤ８はある程度の毒性効果を生成したけれども、ＣＤ８結実細胞、（抗−ＣＤａ十Ｃ ”）もまた、ＨＩＶ特異的細胞障害エフェクター細胞が枯渇していた。それゆえ、ＨＩＶペプチド瞬間標識標的細胞に対する細胞媒介細胞障害活性は、ＭＨＩクラスＩ制限ＣＴＬの特徴である、細胞膜上のＣＤ８抗原を有した。

ＨＩＶ　ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体認識の特異性Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の第１アミノ酸配列における小さな変化に対して極めて感度が高い。ＨＩＶ　ｇｐ１２０のＶ３ループ領域は、超可変性であり、ＨＩＶ単離体の中で免疫学的に異なる。超可変性は、いくつかのアミノ酸の置換と添加にある。ＨＩＶワクシニアウィルス組換え体により産生された細胞障害の特異性を実験するために、ＨＩＶ単離体ＩＩ１．３、ＳＦ２、およびＭＮのＶ３ループ領域に対応するペプチドで標識したＰ８１５標的細胞の中で、ＣＴＬ活性に対する感受性を比較した。

ｖＰ９１１およびｖＰ９２１による免疫化のみが、ＨＩＶ特異的第１ＣＴＬ活性を誘発した（表５）。さらに、ＨＩ■特異的ＣＴＬ活性は、ＨＩＶ単離体■ｌｌ１１のＶ３ループに対応するペプチドで標識したＰ８１５標的細胞のみに限られた。同様の結果か、ワクシニアウィルス組換え体ＶＰ８７８、ｖ　Ｐ　９　］、　１、およびｖＰ９２１による免疫化で誘発された、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激の、ＨＩＶ特異的第２ＣＴＬ活性に関して得られた（表６）。それゆえ、ＨＩＶ単離体ｉ　ｒ　ｔ　、、のｅｎｖ遺伝子の様々な部分を発現する組換えワクシニアウィルスにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗原単離体から誘導せしめられた標的エピトープのみを認識する。

ワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体にによる免疫化後のＨＩＶエピトープに対するリンパ球増殖抗原に対するリンパ球の増殖は、細胞媒介免疫性の１ｎｖｉｔｒｏ相関関係である。適切な抗原の提示により、抗原のための受容体を発現する細胞の免疫個体群における細胞増殖を誘発する。増殖の開始と継続には可溶性媒介物質によるＴヘルパーリンパ球を含有することが必要である。

ＨＩＶ抗原を発現する組換えワクシニアウィルスで免疫化したマウスにおけるＨＩＶ抗原に対する細胞媒介免疫性を評価するために、２７日前に免疫化したマウスからの膵臓細胞を、Ｔ１およびＴ２と称するＴヘルパーリンパ球エピトープに関連するペプチド、並びに精製ＨＩＶ　ｇｐ１６０で５日間に亘って培養した（表７）。Ｔヘルパー細胞エピトープＴ１およびＴ２に対する増殖応答は、どの膵臓細胞培養物にも観察されなかった。しかしながら、ｖＰ９２１で事前に免疫化したマウスの膵臓細胞は、［３Ｈ］−チミジンを含有することにより測定されたように、ＨＩＶ　ｇｐ１６０に活発に応答した。２．０より大きな刺激指数（Ｓｌ）は、免疫を示すものと考えられる。それゆえ、ｖＰ９２１によるマウスの接種は、ＨＩＶ　ｇｐ１６０に対する細胞媒介免疫を誘発した。

ＨＩＶに対する液性応答を評価するために、ワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体の１つでマウスを免疫化した日を０日とし、５週目に第２の免疫化を行なった。

最初の免疫化後９週間に亘り、様々な間隔で、マウスから採血した。

各処理群からプールした血清を、抗原としての精製ｇｐ１６０を用いたＥＬＩＳＡによりＨＩＶに対する抗体についてアッセイした（表８）。第１の抗体応答は一般的にあまり大きくないが、ｖＰ９１１により誘発された最高水準に関しては検出できた。第２の免疫化後、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１により免疫化したマウスの抗体価は増大し、９週目にやや衰える前に、それぞれ４．６００および３．２００を超える力価で７週目にピークとなった。それゆえ、２つのワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１は、著しい抗体応答を誘発することができた。

表１．ワクシニアウィルス感染標的およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｖ３ループ領域に対応するペプチドで標識した標的に対するワクシニアウィルス組換え体で免疫化したマウスからの膵臓細胞の第１ＣＴＬ活性Ｅ　：　Ｔｍ２Ｏ３：　１＊　Ｐ＜０．０５対適切な対照、スチューデント、検定表２．ワクシニアウィルス組換え体によるｉｎ疫化したマウスからのＢＡＬＢ／ｃＪ牌臓細胞を、肺臓間に亘り感染した同系膵臓細胞で培養し、２０：１の標的細胞に対するエフェクター細胞の比率で細胞障害についてア・ソ表３．　ＨｊＶｇｐ１２０のｖ３ループを発現するカナリアボックスウ免疫化から２３日後、５日間に亘り膵臓細胞をウィルス感染またはペプチド瞬間標識同系膵臓細胞によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激し、次いで２０・１の標的細胞に対するエフェクター細胞の比率でウィルス感染またはペプチド瞬間標識Ｐ８１５標的細胞に対する特異的細胞障害についてアッセイした。

＊　Ｐ＜０．０５を適切な対照、スチューデント、検定と比較。

表４．　ＣＤ８−補体に対する単クローン性抗体による細胞障害活性の涸渇表５．ＨＩＶ組換えワクシニアウィルスによる１回の接種後のＨＩＶ−１単離体ＩＩＩ。のｖ３ループに関する第１　ＣＴＬ活性の特異体マウスに１回のｉｖ接種により表示したワクシニアウィルス組換え体を投与し、７日後にＰ８１５標的およびＨＩＶ−１単離体ＩＩＩ。、ＳＦ２　、およびＭＮのｖ３ループ領域に対する３つのペプチドのうち１つで瞬間標識したＰ８１５標的に対するＣＴＬ活性についてアッセイした。１００　：　１．５０：１、および２５：１の標的細胞に対するエフェクター細胞の比率でアッセイしたが、１００：１のデータのみを示す。

＊　Ｐ＜０．０５対適切な対照、スチューデント、検定表６．１（ＩＶ組換えワクシニアウィルスの１回の接種後におけるＨＩＶ単離体ｌｌｌ１ｌの■３ループに関する第２　ＣＴＬ活性の特異性細胞障害パーセントＮＹＶＡＣＯ，４０，５−０，６−０，３ｖＰ８７８　０．２　０．２　−０．５　−１．０ｖＰ９１１　−１．５　０．３　−０．５　０．２ｖＰ９２１　− ０．６　１．４　０．１　−０．５ＮＹＶＡＣな　し　−２，２０，２０，５− １，０ＮＹＶＡＣ３，２２，２３，９２，５ｖＰ８７８　４．４　５．９　５．０　６．１ｖＰ９１１　５．８　１１．１　５．０　５．３ｖＰ９２１　５．０　６．５　２．９　２．９ｖＰ８７８　な　し　０．１　−０．２　−０．９　−１．０ＮＹＶＡＣ３，０４，８４，４４，５ｖＰ８７８　７．９　２０．２　７．８　８．６ｖＰ９１１　４．８　７．８　４．５　４．７ｖＰ９２１　２．７　６．９　２．８　３．０ＶＰ９１１　な　し　０．９　１．８　１．４　０．５ＮＹＶＡＣ８，８８，３８，１６，６ｖＰ８７８　６．６　５７．２　６．８　８．２ｖＰ９１１　４．６　６３．７　２．９　４．２ｖＰ９２１　７．２　６３．６　４．１　４．９ｖＰ９２１　な　し　０．５　０．８　１．２　０．６ＮＹＶＡＣ４，４７，９７，５６，０ｖＰ８７８　８．１　５９．０　７．１　７．５ｖＰ９１１　６．４　７１．４　７．９　６．６ｖＰ９２１　９．３　６３．４　９．０　８．Ｌ実施例３−ＡＬＶＡＣ，ＴＲ０ＶＡＣおよびＮＹＶＡｃべ全ＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２またはＦＳ−２菌株）ゲノムを含有するラムダクローンをＪ、レビーから得て、前に記載している（サンチェズーペスカドール等、１９８５）。ｅｎＶ配列をｐＵｃ１３中にサブクローニングし、プラスミドｐＭＰ７ＭＸ３７３を産生した。プラスミドｐＭＰ７ＭＸ３７３は、ｅｎｖ遺伝子産生物の開始コドン（ＡＴＧ）に相対的な−１からｅｎｖ遺伝子の終止コドン（Ｔ　Ａ　Ａ）の７１５ｂｐ下流までの配列を含有している。これらのｅｎＶ配列は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌの切断によりｐＭＰ７ＭＸ３７３から切除し、プラスミドベクター、ｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）に挿入し、プラスミドｐＩＢＩ２５ｅｎｖを産生した。

組換えプラスミドｐＩＢＩ２５ｅｎｖを用いてコンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＣＪ２３６（ｄａｔ−ｕｎｇ−）細胞を形質転換した。１本鎖ＤＮＡを、形質転換Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＪ２３６細胞のへルバーファージ、ＭＧ４０８による感染により誘導したファージから単離した。この１本鎖テンプレートを、オリゴヌクレオチドＭＵＥＮＶＴ１２（配列認識番号４５）（５／−ＡＧＡＧＧＧＧＭＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＭＴＡＣＡ−：ｌ’）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発反応（クンケル等、１９８５）に用いた。このオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発により、ＴからＣの転移が行なわれ、ＡＲＶ−２ゲノムのヌクレオチド位置６９２９−６９３５でのＴ５ＣＴモチーフを分断する（サンチェズーペスカドール等、１９８５）。

この変異体はｅｎｖ遺伝子のアミノ酸配列を変更せずにＥｃｏＲ１部位を産生ずる。ＥｃｏＲ１部位を突然変異誘発プラスミドクローンのスクリーニングに用いた。ジデオキシヌクレオチド鎖終止法により配列確認を行なった（サンガー等、１９７７）。産生じた突然変異誘発プラスミドをｐｌＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖｌｌと称した。

１．４５ｋｂのＢｇｌＩＩ断片をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖｌｌから誘導した。

この断片は変異体ｅｎｖ配列を含有した。この断片は、ｐｌＢＩ２５ｅｎｖ中の対応する未変異断片を置換するのに用いた。産生じたプラスミドをｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８と称した。さらに、ｐｌＢＩ２５ｍｕ　ｔ　ｅｎｖ８に修飾を行なった。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を行なって、遺伝子の３′末端からし・ツクスタンバク質をコードする配列とＬＴＲ配列（ＬＴＲ領域）を除去し、推定の免疫抑制（Ｉｓ）領域アミノ酸５８３から（配列認識番号４５　：　Ｌｅｕ− Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｑ− ＴＹｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｑ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌａｕ）を削除した（クラッセ等、１−９１３８　）。これらの反応は、オリゴヌクレオチドＬＴＲＩ　（配列認識番号４７）（５’　−ＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴ’ｒＴＧＧＣＡＴＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣ−３’　）およびＭＵＥＮＳＶＩ　ＳＲ（配列認識番号４８）（５’　−ＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧＡＴＩＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴ−３’　）によりｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８から誘導した１本鎖テンプレートに関して行なった。突然変異誘発したクローンは、雑種形成および制限分析により同定した。ＩＳおよびＬＴＲ領域の両方が削除されるように、そしてもう一方はＬＴＲが削除されるように突然変異誘発されたクローンは、ヌクレオチド配列分析により確認し、それぞれｐＩＢＩ２５ｍｕｔ３ｅｎｖ４０およびｐＩＢＩ２５ｍｕｔ２ｅｎｖ２２と称した。

全ｅｎｖ遺伝子を含有する３、４ｋｂのＳｍａｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ断片をｐＩＢＩ２５ｍｕｔ３ｅｎｖ４０とｐｉＢＩ２５ｍｕｔ２ｅｎｖ２２とから誘導し、ｐｃｐｃｖｔとｐＦＰＣＶ２に挿入し、Ｓｍａ　Ｉ／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで切断した。プラスミドｐｃＰｃＶｌは１．０３座に生じる挿入によりＡＬＶＡＣ組換え体の産生を可能にする挿入プラスミドである。プラスミド、ｐＦＰＣＶ２は、Ｈ７座に生じる挿入によりＴＲ０ＶＡＣ組換え体の産生を可能にする挿入プラスミドである。プラスミドｐｃＰｃＶ１およびｐＦＰＣｖ２は、１９８９年４月２０日ニ発行されたＰＣＴ国際公報第８９１０３４２９号に記載されている。

オリゴヌクレオチドＰＲＯＶＥＣＮＳ　（配列認識番号４（５’　−ＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧ− ３’　）をマンデツキ（１９８６）の方法によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発反応に用いて、ＶＶＨ６プロモーターおよびｅｎＶ配列に関する正確なＡＴＧ　：　ＡＴＧ構成を産生じた。潜在的な変異体をＳｍａ１部位の損失に関してスクリーニングした。Ｓｍａ　Ｉ部位が欠失しているプラスミドクローンを、ヌクレオチド配列分析により同定し、確認した。正確に突然変異誘発したプラスミドクローンを同定し、ｐＣＰｅｎｖｌｓ＋またはｐＣＰｅｎｖ　Ｉ　Ｓ−およびｐＦＰｅｎｖｌｓ＋またはｐＦＰｅｎｖ　Ｉ　Ｓと称した◇Ｎｒｕ　ＩとＨｉｎｄｌｌＩでの切断により、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子をｐｃＰｅｎｖｌｓ−から切除した。それぞれ２．５ｋｂ　（ｅｎｖｌｓ＋）と２．４ｋｂ　（ｅｎｖＩＳ−）の２つのｅｎｖ断片を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片の反応によりプラントエンドした。これらの断片をｐＳＩＶｅｎｖＶＶのＮｒｕｌとＰｓｔＩでの切断により誘導された３、５ｋｂの断片と連結し、続いて２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドした。プラスミドｐＳＩＶｅｎｖｖ■ は、ＡＴＩ挿入座においてワクシニアウィルスＨ６プロモーターにより調節されたＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子発現カセットを含有している。ｐＳＩＶｅｎｖＶＶのＮｒｕＩとＰｓｔｌでの切断によって、全ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子暗号配列およびプロモーター要素の３′側の２０ｂｐを切除する。ｅｎｖ　Ｉｓ−およびｅｎｖ　Ｉｓ十断片への連結により、Ｈ６プロモーターの２０ｂｐを修復し、ＡＴＩ挿入プラスミド中にＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を挿入する。産生じたプラスミドを、それぞれｅｎｖ　ＩＳ＋およびｅｎｖｌｓ（７）７’ｌ：めのｐＡＲ５ＶＶ＋およびｐＡＲ６ＶＶ−と前述したように、ＡＬＶＡＣおよびＴＲ０ＶＡＣ組換え体の両方のリン酸カルシウム沈殿により、プラスミドＤＮＡを感染細胞に導入する組換えを行なった（ピッチｍ＝等、１９８７）　。プラスミドｐＣＰｅｎｖ　Ｉ　Ｓ＋およびｐＣＰｅｎｖｌｓ−を用いて、それぞれ組換え体ｖＣＰ６１およびＶＣＰ６０を産生じた。プラスミドｐＦＰｅｎｖｌｓ＋およびｐＦＰｅｎｖｌｓ− により、それぞれ組換え体ｖＦＰ５３およびｖＦＰ６２を産生した。プラスミドｐＡＲ５ＶＶ＋およびｐＡＲ６ＶＶ−を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９３９およびｖＰ９４０を産生した。組換えプラークを、前述したように、３２ｐ標識ｅｎｖ特異的プローブによる雑種形成後のオートラジオグラフィーにより選択し、連続３回の継代を行なって純度を確認した（ピッチｍ＝等、ＡＲＶ−２または５Ｆ−２菌株のＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子がワクシニア早期晩期プロモーター、Ｈ６から下流に挿入された場合に、６つの異なる組換えウィルスを産生じた。

単純化するために、２つのＡＬＶＡＣベースの組換えウィルス、ｖＣＰ６１およびｖｃＰ６０を、ＣＰＩＳ＋およびＣＰＩＳ−と称し、２つのＴＲ０ＶＡＣベースの組換え体、ｖＦＰ６３およびｖＦＰ６２を、ＦＰＩＳ＋およびＦＰＩＳ−と称し、２つのＮＹＶＡＣベースの組換え体、ｖＰ９３９およびｖＰ９４０を、それぞれ■Ｖ−およびＶｖ＋と称する。

全ての構成概念は、ＨＩＶ−４ｅｎｖ遺伝子のＡＴＧ開始フトンがワクシニアＨ６プロモーターのＡＴＧに重ねられているという点て正確であった。さらに、全ての異質の遺伝情報３′から終止コドンが除去された。ＣＰＩＳ−１ＦＰＩＳ− １およびＶＶ−は全て、ｇｐ４１遺伝子産生物の５′部分の近くに位置するアミノ酸５８３−５９９に対応する、５１ｇｐ領域の欠失により得られた。この領域は、他のレトロウィルス糖タンパク質の膜内外ポリペプチド（シアンシオロ等、１９８５　、ルーダ等、１９８９ａ、　ｂ）に生じる推定の免疫抑制領域（クラッセ等、１９８８　；ルーダ等、１９８８ａＳｂ）と相同性がある。

全ての６つの組換えウィルスに関する発現分析を、ＣＥＦＳＶｅｒｏ、およびＭＲＣ−５細胞単層において行なった。ＨＩＶ血清陽性個体からプールした血清を用いたラジオイムノプレシピテーション実験を前述したように行なった。６つの組換え体の全てが、ＨＩＶ−１ｇｐ１６０エンベロープ前駆体の合成を指向した。しかしながら、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対するｇｐ１６０の処理能率は、細胞の種類により変化し、免疫抑制領域の欠失によっても影響を受ける。ＨＩＶ血清陽性個体からのプールした血清によるｇｐ４１の認識はまた、ウィルスのバックグラウンドと細胞の種類により変化する。

オリゴヌクレオチドＨＩＶ２５ＰＡ　（配列認識番号５０）（５’−ＡＴＧＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＴＡＧＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡ−３′）およびＨＩＶ２５ＰＢ　（配列認識番号５１）（５’　−ＴＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＧＴｒＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣｒＧＡＡゴＡＣＣＡＣＴＣＡＴ−３’　）をアニールしてＨＩＶ−２１ＳＳＹ菌株（フランチｍ；等、１９８９）　ｅ　ｎ　ｖ暗号配列の最初の５４ｂｐを構成した。

この断片を、テンプレートとしてのｐＴＰ１５　（グオ等、１９８９）を用いたオリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号５２）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴｒＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣ−３１）およびＨ６３ＰＨＩＶ２　（配列認識番号５３）（５’　−ＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＣＡＣｒＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴｒＡＡＣＧ−３’　）によるＰＣＲによって誘導した１２９ｂｐの断片に３′を融合せしめた。これらの２つの断片の融合は、オリゴヌクレオチドＨＩＶ２５ＰＣ（配列認識番号５４）（５’−ＴＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＧＴＴＡＧ−３’）およびＨ５５ＰＨ（配列認識番号５２）を用いたＰＣＲにより行なった。Ｌ７４ｂｐのＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄｌＩＩと５ａｃｉで切断し、Ｈｉｎｄｌ　ｌ　Ｉと５ａｃｌで切断したｐＢＳ−３ｋ　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に挿入した。産生じたプラスミドをｐＢＳＨ６ＨＩＶ２と称した。挿入は、ヌクレオチド配列分析により確認した。

ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の３′部分をまたＰＣＲにより誘導した。この反応において、テンプレートとしてｐＩＳ　５Ｙ−ＫＰＮ　（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ− ＮＩＨ，Ｄｒ。

ジエノベファ　フランチー二により提供された）を用いてオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｂ１　（配列認識番号５５）（５１−ＣＣＧＣＣＴＣＴｒＧＡＣＣＡＧＡＣ−３’　）およびＨＩＶ２Ｂ２　（配列認識番号５６）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴｒＴＣＴＧ−３ ’　）により増幅した。この断片をＢａｍＨＩとＸｂａｌで切断した。この切断から誘導した１５０ｂｐ断片は５’　ＢａｍＨｌおよび３’Ｘｂａｌ粘着末端を含有した。この断片は、終止コドン（Ｔ　Ａ　Ａ）の後に、ワクシニアウィルス早期転写終止信号（ユエン等、１９８７）として認識されることが知られているＴ５ＮＴ配列モチーフを含有するように操作せしめられた。

ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の大部分は、５ａｃｌとＢａｍ１の切断によりｐｌｓｓＹ−ＫＰＮから得られた。この切断により産生された２、７ｋｂの断片を、遺伝子の３′末端に対応する１５０ｂｐのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片とともに、５ａｃｌとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに共挿入した。産生じたプラスミドをｐＢＳＨＩＶ２ＥＮＶと称した。

ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２からの１７４ｂｐのＳ　ｐ　ｅ　Ｉ　／Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片およびｐＢＳＨＩ　Ｖ２ＥＮＶからの２．５ｋｂの５ｐｅｌ／Ｘｂａｌ断片を、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉとｘｂａｌで切断したｐＢＳ−８Ｋに連結し、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶを産生した。ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶかラノ２゜７ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＸｂａＩ挿入体を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドした。プラントエンドした断片をＳｍａ　Ｉ切断ｐｓＤ５４１Ｖｃ挿入ベクター中に挿入した。産生じたプラスミドをｐＡＴＩＨＩＶ２ＥＮ■と称した。このプラスミドを治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、ｖＰ９２０を産生じた。

イムノプレシピテーション分析を行なって、ｖＰ９２０が真正ＨＩＶ−２ｇｐＬ６０を発現するか否かを決定した。

ＨＩＶ−２血清陽性個体（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ　−ＮＩＨ，Ｄｒ、ジエノベファ　フランチｍ＝から得た）からプールした血清を用いて、ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子発現に関して、感染細胞からの溶解産物を分析した。血清をＶＰ８６６感染Ｖｅｒｏ細胞で予備吸着せしめた。予備吸着せしめたヒト血清を、４℃での一晩の培養によりタンパク質Ａ−セファ０−スに結合せしめた。この培養期間の後、物質を１×の緩衝液Ａで４回洗浄した。通常のヒト血清とタンパク質入−セファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質入−セファロースに結合した血清陽性個体からのヒト血清により４℃で一晩培養せしめた。−晩の培養期間後、試料を１×の緩衝液で４回、Ｌ　Ｉ　Ｃｌ　２　／尿素緩衝液で２回洗浄した。

２×のラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐ　Ｈ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、沈殿タンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を、１０％のドリフアメゲルシステム上で分画しくドリファス等、１９８４）　、固定化し、蛍光光度法のためにＩＭのサリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９２０感染細胞からのＨＩＶ− ２ｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた。さらに、ｇｐ１６０ポリタンパク質が成熟ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質種に処理されるので、発現したＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子産生物の真正が確認された。どのＨＩＶ特異的タンパク質種は、疑似感染細胞または親つィルスｖＰ８６６感染した細胞からは沈殿しなかった。また、遺伝子産生物がｖＰ９２０感染細胞の表面上に発現されるという蛍光抗体法アッセイによる観察で、ｖＰ９２０によるＨＩＶ− ２ｅｎｖの適切な発現が支持された。

ｇｐ１２０の発現ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の５′末端に融合されたワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有するプラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ２を５ｐｅｌとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これらの配列を含有するｔｓｏｂｐの断片を遊離せしめた。

この断片を、ｐＢｓＨＩＶ２１２ＯＡの１．４ｋｂの５ｐｅＩ／ＸｂａＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩとＸｂａｌで切断したｐＳＢ−３Ｋ１１１ｍ連結し、ｐＢｓＨＩＶ２１２０Ｂを産生じた。

最初にＰＣＨによりｇｐ１２０暗号配列の３′部分を誘導することにより、プラスミドｐＢｓＨＩＶ２１２ＯＡを誘導した。ＰＣＲは、テンプレートとしてのｐＩＳＳＹ−ＫＰＮとともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ２１２ＯＡ　（配列認識番号５７）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴｒＡＴＧＴＣＴＣＣＣｒＧＧ−３’　）およびＨＩＶ２１２０Ｂ　（配列認識番号５８）（５’−ＭＴＴＡＡＣＴ’ｒＴＡＣＡＧＣＡＣＣ−３’）を用いて行なった。ＰＣＲ誘導断片をＥｃｏＲｌとＸｂａＩて切断して、５’　−］：ｃｏＲＩ粘着末端と３’　−ＸｂａＩ粘着末端を含有する３００ｂｐ断片を産生じた。この断片を、Ｘｂａ１部位に対してちょうど５′のＴ５ＮＴ配列モチーフと翻訳終止配列（ＴＡＡ）に関して操作した。３００ｂｐのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＩＳＳＹ−ＫＰＮから誘導した１、４ｋｂのＳ　ａ　ｃ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　。

Ｒ１断片とともに５ａｃＩ／Ｘｂａｌ切断したｐＢＳ−３Ｋ１．：連結Ｌ、ｐＢｓＨＩＶ２１２０Ａを産生じた。

プラスミドｐＢｓＨＩＶ２１２０ＢをＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＸｂａＩで切断し、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターに対して３′に並列したＨＩＶ−２ｇｐ１２０暗号配列を含有する１、８ｋｂ断片を産拒した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在化でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドした。プラントエンドした断片をＳｍａ　Ｉ切断ｐｓＤ５４１Ｖｃに連結し、ｐＡＴＩＨＩＶ２１２０を産生じた。このプラスミドを１ｎｖｉｔｒｏ組換え実験を用いてｖＰ９２２を産生じた。

ｖＰ９２２感染細胞によるイムノプレシピテーション実験を、全ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の発現に関して上述したように行なった。疑似感染またはｖＰ８６６感染Ｖｅｒ０細胞からは、どのＨＩＶ特異的種も沈殿しなかった。しかしながら、１２０ｋＤａのタンパク質種が、ｖＰ９２２に感染した細胞から誘導した溶解産物より沈殿した。

ＳＩＶ　（ｍａｃ１４２）ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドｐｓ３１１ＥをＤｒ、ジエノベファ　フランチーノ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔｌで切断し、ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド２２０から翻訳終止コドンから１６０ｂｐ下流の領域までを含有する２、２ｋｂｐの断片を遊離した。この断片を含有する発現カセットはｇｐ１６０種よりもむしろｇｐ１４０タンパク質種の発現となることに注意すべきである。膜内外領域のこの４０％の欠失は、ゲノムのヌクレオチド７．９３４での未熟な終止から生じる（フランチー二等、１９８７）。そのようなｅｎｖ遺伝子産生物の未熟終止は、培養中のＳＩＶの増殖後に認められる。

（コダマ等、１９８９）。

遺伝子のアミノ酸部分は、テンプレートとしてのｐＳＳｌｌＥとオリゴヌクレオチド５ＩＶＥＮＶＩ　（配列認識番号５９）（５’　−Ｃ（：ＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＡＡＴＣ−３１）およびＳ　ＩＶＥＮＶ２　（配列認識番号６０）（５’　−ＣＡＡＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＴＣＴＣ−３’　）を用いたＰＣＲにより誘導した。産生じた２５ｏｂｐの断片は、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの３′側の２０ｂｐ（Ｎｒｕ１部位の３′末端）から下流に並列したＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子の５′側２３０ｂｐを含有している。

１７０ｂｐの断片を、ＳＩＶ　ｅｎｖ配列の５ｏｂｐを除去する、２５０ｂｐの断片のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉでの切断により得た。

未熟終止信号の後のＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子の残りを含有する配列をｐＳＳ３５Ｅ　（Ｄｒ、ジエノベファ　フランチｍ＝から得た）からのＰＣＨにより誘導した。このプラスミドは、ｅｎｖ遺伝子から下流のＬＴＲ領域中に５ＩＶｅｎｖ遺伝子のＣ末端部分を含有する配列を含有している。

３６０ｂｐの断片を誘導するのに用いたオリゴヌクレオチドは、５ＩＶＥＮＶ３（配列認識番号６１）（５’　−ＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＡＧ−３Ｌ　）およびＳ　ＩＶＥＮＶ４Ａ　（配列認識番号６２）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＣＣＴＭＴＣＣＴＣＣ−３’　）てあった。この断片をＰｓｔＩとＥｑｏＲＩで切断し、５’Ｐｓｔｌ粘着末端と３’　ＥｃｏＲ１粘着末端を有する２６０ｂｌ）の断片を産生じた。

ｐｓ３１１Ｅからの２．２ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩ／Ｐｓｔｉ断片、遺伝子の５′ 末端を含有する１７０ｂｐのＮｒｕｌ／ＨｉｎｄｌＩＩ断片、および遺伝子の３ ′末端を含有する２６０ｂｐのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩを、ｐＲＷ８３８から誘導した３、１ｋｂのＮ　ｒ　ｕ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片に連結した。ｐ　ＲＷ８３８は、遺伝子の０５座への挿入を可能にするカナリアポックスウィルス配列を側腹に有する狂犬病Ｇ遺伝子に連結したワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有している。Ｎｒｕ　ＩとＥｃｏＲＩでの切断により、狂犬病Ｇ遺伝子を遊離し、Ｈ６プロモーターの３′側２０ｂｐを除去する。ワクシニアＨ６プロモーターに連結したＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有する、産生じたＣ５挿入プラスミドをｐｃ５ｓＩＶＥＮＶと称した。

プラスミド、ｐｃ５ｓＩＶＥＮＶをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド１５０から全遺伝子の末端までを含有する２、２ｋｂの断片を遊離せしめた。ＰＣＲを用いて、オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ８２８６　（配列認識番号６３）（５’　−ＣＣＣＣＣＣＭＧ！ＡＴｒＣＴＡＴＡＣＴＴ−３’　）および５ＩＶＥＮＶ２（配列認識番号６４）（５’　−ＣＭＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＴＣＴＣ−３’　）によりｐｃ５ｓＩＶＥＮＶからワクシニアＨ６プロモーター／ＳＩＶ　ｅｎｖ連結を誘導した。３２０ｂｐの断片をＨｉｎｄｌｌｌで切断し、２４０ｂｌ）の断片を誘導した。

２．２ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩおよび２４０ｂｐのＨｉｎｄｌｌＩ断片を、ＨｉｎｄｌｌｌとＥｃｏＲＩで切断したｐｃ３１に共連結した。ＳＩＶ　ｅｎｖ暗号配列に関連して適切な配位にＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片を含有する産生じたプラスミドをｐｃ３ｓＩＶＥＭと称した。プラスミドｐＣ３Ｉを以下のように誘導した。２．５ｋｂのＢｇＩＩＩカナリアポックスウィルスゲノム断片のヌクレオチド配列分析により、全Ｃ３読取り枠および５′　と３′の側腹領域が明らかにされた。Ｃ３読取り枠を完全に切除したＣ３座への異種遺伝子のための供与体プラスミドを構成するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に関連する５′および３′配列を増幅した。５′配列のためのプライマーはＲＧ２７７　（配列認識番号６５）（５’　−ＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴ”ＩＴｒＡＴｒＴＣＡＧ− ３’　）およびＲＧ２７８　（配列認識番号６６）（５’　−ＴＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＡＴＡ　ＴＴＡＧ−３’　）であった。

３′配列のためのプライマーは、ＲＧ２８９　（配列認識番号６７）（５’　−ＴＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＩ’ ｒＴｒＡＴにＡＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＴＭ刃ｖＧ　ＣＡＴＡ　ＣＡＡＧＣ −３’　）およびＲＧ２８０（配列認識番号６８）（５’　−ＴｒＡＴＣＧＡＧＣＴＣ′ｒＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＴＡＴＣＴＡＡＣ−３’　）であった。このプライマーは、ワクシニア転写および翻訳終止信号を側腹に有する多重クローニング部位を含有するように設計された。また、左アームと右アームの５′末端と３ ′末端には、２つのアームをＡＳＩ）７１８／５ａｃｌ切断ｐＢＳ−８Ｋプラスミドベクターに連結可能にする適切な制限部位（左アームにはＡｓｐ１７８およびＥｃｏＲ１１右アームにはＥｃｏＲＩおよび５ａｃｌ）を含む。生成したプラスミドをｐＣ３Ｉと称した。

プラスミドｐＣ３Ｓ　ＩＶＥＭをＥＣ０ＲＩでの切断により線状とした。続いての部分的なＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、２，７ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片を遊離せしめた。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片の処理によりプラントエンドした。この断片を、ＳｍａＩで切断したｐｓＤ５５０Ｖｃに連結せしめた。産生じたプラスミドをｐｓＩＶＥＭＶｃと称した。このプラスミドを、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、ｖＰ８７３を産生じた。ｖＰ８７３は、ＩＪＬ座にＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有している。

ＮＹＶＡＣ／ｇａｇ／ｐｏ　ｌおよびｇａｇ組換え体の産生ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を包含するＳＩＶ　ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐｓＩＶＡＧｓｓｌｌＧをＤｒ、ジェノベファ　フランチｍ＝（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣ１−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、ワクシニアｔｋ側腹アームの間のワクシニアＩ３Ｌプロモーターに３′が並列していた。ｇａｇおよびＩ３Ｌプロモーターに対応するオリゴヌクレオチド５ＩＶＬＩ（配列認識番号６９）および５ＩＶＬ２（配列認識番号７０）（５’−ＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＴＡＴＡＴｒＴＴＣＡＣＴＴ　ＴＡＴＣＴＣＡＣ−３’　）を含有するｐｓＩＶＧＡＧｓ３１１Ｇの４，８００ｂｐのＣｆｏｌ／Ｔａｇｌ断片を、ｐｓＤ４６０の誘導体である、ｐＳＤ５４２の４．０７０ｂｔ）のＸｈｏｌ／Ａｃｃｌ断片にクローニングすることによりこのことを行なった（第１図）。この操作により産生じたプラスミドを、ｐｓＩＶＧｌと称した。

ｐＯ１遺伝子を除去するために、２１５ｂｐのＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド５ＩＶＰ５（配列認識番号７１）（５’−ＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴ −３′）および５ＩＶＰ６（配列認識番号７２）（５’　−ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴ−３’　）を用いてｐｓＩＶＧＡＧ３１１Ｇから誘導した。ＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩと５ｔｕＩで切断し、５ＩＶＧＩの５゜３７０ｂｐ部分的ＢａｍＨＩ／５ｔｕＩ断片に連結した。

これにより、ｐｓＩＶＧ２を産生じた。ｐＳＩＶＧ２を、治療ウィルスとしてのｖＰ８７３によるｉｎ　ｖｉｔｒ。

組換え実験に用いてｖＰ９４８を産生じた。

ｇａｇとｐｏｌの両者をＮＹＶＡＣベースのベクター中に挿入するプラスミドを以下のように操作した。上述したｐｓＩＶＧｌは、ｌｋｂのＰＣＲ断片を用いて除去された外因性３′非暗号配列を含有している。この断片を、オリゴヌクレオチド５ＩＶＰ５および５ＩＶＰ６を有するプラスミドｐｓＩＶＧＡＧｓｓ１１Ｇかう産生じり。ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有するこのＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩとＨｐａｌで切断した。ｌｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ断片をｐｓＩＶＧｌの７，４００ｂｐ部分的ＢａｍＨＩ／Ｈｐａｌ断片に連結し、ｐＳＩＶＧ４を産生じた。

ｐｓＩＶＧ４の配列分析により、ｐｏｌ遺伝子内の１つの塩基対欠失が認められた。この誤りを修正するために、ｐｓＩＶＧｌからの２．３１）ＯｂｐのＢｇｌｌｌ／５ｔｕＩ断片を、ｐｓＩＶＧ４の６．１００ｂｐの部分的ＢｇｌＩＩ／５ｔｕＩ断片に挿入し、ｐｓＩＶＧ５を産生じた。

このプラスミド、ｐＳＩｖＧ５を、治療ウィルスとしてのｖＰ８７３によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、ｖＰ９４３を産生じた。

ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｐｌ６およびｐ２８組換え体の産生ｐ２８、ｐ２、ｐ８、ｐｌ、およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子部分とｐｏｌ遺伝を、ｐｓＩＶＧｌから除去した。これは、オリゴヌクレオチド５ＩＶＬＩＯ（配列認識番号７３）および５ＩＶＬＩＩ　（配列認識番号７４）（５’　−ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＣ′ｒＣＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴ−３’　）をｐｓＩＶＧｌの４，４３０ｂｐのＡｃｃｌ／ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることによりｐｓＩＶＧ３を産生ずることにより行なった。このプラスミドは、ワクシニア１３Ｌプロモーターにより発現されたＳＩＶ　ｐ１６遺伝子産生物の発現カセットを含有している。

エントモポックスウィルス４２ｋＤａプロモートしたＳＩＶ　ｐ２８遺伝子（５ ′末端のみ）をＩ３Ｌプロモートしたｐ１６遺伝子の下流に挿入した。これは、ｐ２８遺伝子の５′末端を含有する、ｐｓ　ＩＶＧＩ＋７）３６０ｂｐ（７）ＢｓｐＭＩ／ＢａｍＨＩ断片、エントモボックス４２ｋＤａプロモーターを含有する、オリゴヌクレオチドｐＳＩＶＬ１４（配列認識番号７５）（５’−ＴＡＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴｒＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＴＧ　ＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴ−：ｌ　’　）および５ＩＶＬ１５（配列認識番号７６）（５’　−ＧＣＴＴＭＴＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＡＧ’ＩＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＴｒＧＴＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴｒＡＴＡＴＴＧ　ＴＡＡＴｒＡＴＡＴＡｆｆｒＴＣＡＡ、Ｉ’ｒＴＴＧＴ−３’　）を、ｐｓＩＶＧ３の、４．４７０ｂｐ部分的Ｘｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。産生じたプラスミドをｐｓＩＶＧ６と称した。

次いてｐ２８遺伝子の３′部分をｐｓＩＶＧ５に挿入した。ＳＩＶ　ｐ２８遺伝子を含有する、２９０ｂｐ　ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド５ＩＶＰ１２（配列認識番号７７）（５’　−ＴＧＧＡＴＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣ−３’　）および５ＩＶＰ１３（配列認識番号７８）（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＭＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣ−３’）を用いてｐｓＩＶＧＩから誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐｓＩＶＧ６の４．８３０ｂｐのＢａｍＨＩ断片に連結した。産生じたプラスミド、ｐｓＩＶＧ７を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６およびｖＰ８７３によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９４２およびｖＰ９５２を産生した。

発現分析ＳＩＶ　ｇｐ１４０　ｅｎｖ遺伝子産生物は、感染細胞の形質膜に関連する典型的な糖タンパク質である。この産生物は、１１２ｋＤａの細胞外種および２８ｋＤａの膜内外領域にタンパク質分解的に開裂した１４０ｋＤａのポリタンパク質として発現される（フランチｍ＝等、１９８７）。

フルオレセイン接合ウサギ抗サルＩｇＧの後でＳＩＶに血清陽性なアカゲサルマカクからの血清を用いた免疫蛍光抗体分析は、組換え体感染Ｖｅｒｏ細胞の表面上にｅｎｖ遺伝子産生物の発現を示した。表面発現は、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）親ウィルスに感染した細胞の表面には検出されなかった。

さらに、ｇａｇ遺伝子のみを含む組換え体に感染した細胞は、表面にいかなるＳＩＶ成分も発現しなかった。ｖＰ８７３、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２に感染した細胞中の表面発現はすべて表面発現を示し、意味ありげに、全てＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有している。

全ての試料が、１ｍｌの３×緩衝液への添加による感染から１７時間後に収穫したことを除いては、ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ組換え体に感染したＶｅｒｏ細胞中の発現ＳＩＶ遺伝子産生物（ｅｎｖおよびｇａｇ）の真正は、前述したようにイムノプレシピテーションにより分析した。感染細胞からの溶解産物を、ＳＩＶ血清陽性アカゲサルマカクからのプール血清またはｇａｇ　ｐ２４遺伝子産生物に特異的な単クローン性抗体（両者とも、ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄｒ、ジエノベファ　フランチｍ＝から得た）により分析した。

ＳＩＶ血清陽性マカク血清によりイムノプレシピテーションを以下のような方法で行なった。マカク血清を４℃で１６時間に亘りタンパク質Ａセファロースで培養した。緩衝ｔＡによる洗浄後、タンパク質Ａセファロースに結合した血清を、通常のサルの血清とタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物に加えた。４℃での一晩の培養後、沈殿物を緩衝液Ａで４回、ＬｉＣ１：］／尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を抗体から分離するために、試料を８０μ ｌの２×ラエムリ緩衝液中で５分間に亘り沸騰せしめた。ドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）を用いて、試料を１２．５％のゲル上で分画した。ゲルを固定化し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。ＳＩＶ遺伝子を含有する全ての組換え体は、関連する遺伝子産生物を発現した。ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ８７１、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２は全て、真正ｇｐ１４０を発現した。しかしながら、１１２ｋＤａおよび２８ｋＤａの熟成形状に対するｇｐ１４０タンパク質の加工を評価することは困難である。１４０ｋＤａのみかけの分子量を有する種はどの種も、疑似感染Ｖｅｒｏ細胞、ｖＰ８６６感染Ｖｅｒｏ細胞およびＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有しないＮＹＶＡＣ組Ｓ　ＩＭ組換え体に感染したＶｅｒｏ細胞からのマカク抗ＳＩｖ血清によっては沈殿しなかった。ＳＩＶに感染したマカクからのプール血清およびｐ２８　ｇａｇ成分に特異的な単クローン性抗体を用いて、ｖＰ９４２、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８、およびＶＰ９５２によるＳＩＶｇａｇコード遺伝子産生物の発現が示された。プロテアーゼ機能を含む、ｐａｌ領域のない全ｐ５５　ｇａｇタンパク質の、Ｖｅｒｏ細胞中のＮＹＶＡＣ（ｖＰ９４８）による発現は明確である。これらの結果は、ＳＩｖプロテアーゼ発現の欠如がｐ５５の成熟形状への完全なタンパク質分解を拒むことを示す。このことは、ｐ２８に特異的な単クローン性抗体を、ｖＰ９４８感染Ｖｅｒｏ細胞からのｇａｇ特異的遺伝子産生物を沈殿せしめるのに用いたときに、より明確に示される。この結果に反して、ｐｏｌ遺伝子によるＳＩＶ　ｇａｇの発現（ｖＰ９４８感染Ｖｅｒｏ細胞中のプロテアーゼを含む）は、発現されたｐ５５　ｇａｇ前駆体ポリペプチドがタンパク質分解的に開裂せしめられて成熟形状となることを可能にする。

ｖＰ９４２およびＶＰ９５２感染Ｖｅｒｏ細胞中のｐ１６およびｐ２８　ＳＩＶ遺伝子タンパク質の両方の発現は、ＳＩＶに感染したマカクからのプール血清を用いて示された。ｐ２４に特異的な単クローン性抗体を使用することは、ｐ２８発現成分のみを明確に認識した。

生後６週間の雌のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに、５Ｘ１０’ｐｆＵのワクシニアウィルス（ＮＹＶＡＣ）　、ＨＩＶ−１（１１１Ｂ）ｅｎｖを発現する組換えワクシニアウィルス（ＶＰ９１１）、カナリアボックスウイ／ｌ、ス（ＡＬＶＡＣ）、またはＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｂ）ｅｎｖを発現する組換えカナリアポックスウィルス（ｖｃＰ１１２）を静脈に接種した。７日後、ＨＩＶ−１（Ｉ　ＩＩＢ）ｇｐ１２０（７）超可変Ｖ３ループ領域に対応するペプチドで一晩培養（７た未修飾Ｐ８１５細胞またはＰ８１５細胞に対する第１　ＣＴ　Ｌ活性について、膵臓細胞をアツーセイした。最初の免疫化から２２日後、実験マウスの膵臓をワクシニア感染刺激要因膵臓細胞で培養し、前述したようにペプチド瞬間標識標的に対する記憶ＣＴＬ活性についてアッセイした。第２ＣＴＬ活性を測定するために、第１の免疫化から２９日後、最初と同一の投与量と内容物の第２の接種をマウスに投与した。

５日後、膵臓細胞を、ペプチド瞬間標識標的に対する細胞溶解性活性についてアッセイした。細胞障害アッセイのために、Ｈ−２’　Ｐ８１５マウス肥満細胞種細胞を、２０μｇ／ｍｌ　Ｖ３ペプチド（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＧＫ、アメリカンバイオテクノロジー社）（配列認識番号７９）とともにまたはこれを含まず、培地（イーグルス塩を含有し、１０％の給仕ウシ血清、２ｍＭのし一グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍ１のストレプトマイシンを補給した最少必要培地）中で一晩培養した。翌朝、遠心分離によりＰ８１５細胞を洗浄し、２Ｘ１０６細胞当り１００μＣｉのＮ　ａ　１　”　Ｃｒ　Ｏ４中、３７℃で１時間に亘り標識した。無傷膵臓を、安楽死せしめたマウスから無菌状態で除去し、水冷したハンクス平衡塩溶液中に浸し、ストマツチャーブレンダ−を用いてタンパク質の細胞懸濁液に粉砕せしめた。膵臓細胞懸濁液を低速遠心分離により数回洗浄し、アッセイ培地（１０％の給仕ウシ血清、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのし一グルタミン、５Ｘ］、Ｏ−５の２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ　／　ｍ　ｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭ１１６４０）中に再懸濁せしめた。

記憶ＣＴＬ活性に関して、免疫化マウスからの膵臓細胞を、刺激培地（１０％の給仕ウシ血清、２ｍＭのし一グルタミン、１０−４の２−メルカプトエタノール、１００　Ｕ／ｍ　ｌのペニシリン、および１００μｇ　／　ｍ　ｌのストレプトマイシンを含有し、イーグルス塩を有する最少必要培地）中で再懸濁せしめ、ポックスウィルスまたはポックスウィルス組換え体の１つに感染せしめられた同系刺激器膵臓細胞を有する直立した２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中においてｉｎ　ｖｉｔｒ。

刺激せしめた。３７℃での５日後、細胞を洗浄し、数え、アッセイ培地中で再懸濁せしめた。″クロム標識標的細胞を、９６ウエルマイクロタイタ板中の滴定エフェクター細胞に加え、４時間の５１　Ｃｒ放出アッセイを行なった。３つのアッセイに関して標的細胞に対するエフェクターの比率（Ｅ：Ｔ）は１００　：　１　（第１）、２０：１（記憶）、および５０：１（第２）であった。細胞障害パーセントは前述のようにして計算した。すなわち、（実験９　＋　（ｒ放出− 自発５ＩＣｒ放出）／（最大５１　Ｃｒ放出−自発’ｌ　Ｉ　Ｃｒ放出）Ｘ１００．最大放出は、５％のドデシル硫酸ナトリウムを標的細胞に添加することにより測定し、一方自発放出は、エフェクター細胞が不在の状態で標的細胞を培養することにより測定した。

どの実験においても、標的細胞からのνＣｒの自発放出は、最大”Ｃｒ放出の２０％を超えることはなかった。第７図における誤差のバーは、平均からの１標準偏差を示す。Ｐく０．０５、適切なワタシニアまたはカナリアポックスウィルス免疫化マウスに比較したスチューデントを検体。

細胞障害エフェクター細胞の細胞表面表現型マウスの牌象細胞を、ワタシニアまたはカナリヤポックスウィルスベクター（ＮＹＶＡＣＳＡＬＶＡＣ）　、もしくはＨＩＶ　Ｉ　Ｉ　ＩＢ　ｅｎｖ　（ｖＰ９１１、ｖｃＰ１１２）を発現するワクシニアウィルスまたはカナリアワクシニア組換え体で免疫化せしめた。２回目の接種は、最初の接種から３０日後に投与した。Ｖ３ペプチド瞬間標識標的に添加する前に、膵臓を、２段階プロトコルにおけるマウスＴリンパ球表面抗原に対する単クローン性抗体または同種異系抗血清で処理した。手短に言うと、膵臓細胞を、同種異系抗”ｒｈｙ−ｉ、２　（セダーレイン）、単りローン性抗−ＣＤ４（デューク大学医学センター、Ｋ、Ｊ、ワインホールド、１７２．４）、または単りローン性抗Ｌｙｔ２．２（セダーレイン）が加えられた細胞障害培地（０，２％のＢＳＡおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭ１１６４０）の１ｍｌ当り１０７の生菌数で再懸濁せしめた。５℃に保持して３０分後、細胞を洗浄し、細胞障害培地の元の量に再懸濁せしめた。補体（ウサギＬｏ−ＴｏｘＭ、セダーレイン）を有するものと有さないものと２つの等量に分け、４５分間に亘り３７℃で培養した。次いで細胞をアッセイ培地で洗浄し、予備処理細胞密度に基づいて、’ｉ　ｌ　Ｃｒ放出アッセイに添加する前に、１００　：　１　（第１）、１０：１（記憶）、および８０：１（第２）の標的細胞に対するエフェクターの比率のアッセイ培地の容量中で再懸濁せしめた。第１０図における誤差のバーは平均からの１の標準偏差を示す。

前述したようにマウスにｖｃＰ１１２を接種せしめることにより、細胞障害１９２８球および細胞１９２８球の記憶前駆体を産生じた。Ｐ８１５標的細胞をＨＩＶ−１１１Ｂ（ＣＮｉＲＫＲより工ＱＪ３ＧＰＧＲＡＦＶＴｊ；１Ｋ）（配列認識番号７９）、ＭＮ（ＣＮｌｉＲＫＲＩｌｉＩＧＰＧＲＡＦＩＴｘＫＮ）（配列認識番号８０）、または５ＦＩ（ＣＮＩＲＫｆｉ工ＩＩＧＰＧＲＡＦｌｌＴｘＧＲ）（配列認識番号８１）からのｖ３ペプチドで一晩瞬間標識せしめたことを除いては、前述したように細胞障害１９２８球のアッセイを行なった。標的細胞に対するエフェクターの比率は、１００　：　１．　（第１）、２０＋１（記憶）、および５０：１（第２）であった。

ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）　ｐ１２０に対する抗体応答ＥＬ　Ｉ　ＳＡ板のウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中の０．５ｕｇ（Ｄ部分的精製ＨＩＶ−１（Ｉ　ＩＩＢ）ｇｐ１２０　（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨＳＦＤｒ、Ｇ、フランチｍ＝）により４℃で一晩培養せしめた。

次いで板を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０　（ＰＢＳＴ）を含有する食塩加リン酸緩衝液で洗浄した。次いで板を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴにより３７℃で２時間に亘り阻止した。ＰＢＳＴによる洗浄後、血清を最初に、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ　（希釈緩衝液）で１：２０に希釈せしめた。血清をＥＬＩＳＡ板のウェルでさらに２倍に連続希釈した。板を２時間に亘り３７℃で培養し、ＰＢＳＴで洗浄した。ホースラディツシュペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコー）を希釈緩衝液で１　：　２０００に希釈し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ板のウェルに加え、１時間に亘り３７℃で培養した。ＰＢＳＴによる洗浄後、基質緩衝液中の０ＰＳ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）を加え、約２０分間に亘り周囲温度で色を呈させた。

２．５ＭのＨ２ＳＯ４の添加により反応を停止させた。４９０ｎｍの吸収を、バイオチックＥＬ−３０９ＥＬＩＳＡリーダーにより測定した。血清終点を、０，４の吸収値を与える希釈の逆数として定義した。

クスウイルスはＨＩＶ特異的細胞障害ＴリンパＨＩＶカナリアポックスウィルス組換え体（ｖｃＰ１１２：実施例２で定義した）の最初の接種から７日後、ＨＩＶ　Ｖ２ペプチド瞬間標識標的細胞に対する肺臓細胞の細胞障害応答は、５Ｘ１０７ｐｆｕの、同一のＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を発現するＮＹＶＡＣ組換え体、ｖＰ９１１（実施例２）の同一投与量により誘発せしめられた細胞障害応答と等しかった（第７図）。適切なｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激または第２の接種後、カナリアポックスウィルス組換え体を投与したマウスの肺臓細胞の細胞障害の水準は増大し、同様にＮＹＶＡＣ組換え体を投与したマウスからの肺臓細胞と匹敵した。そのような細胞障害応答は、非組換えＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣベクターを接種したマウスからは検出されず、ＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を発現するポックスウィルス組換え体による免疫化の必要を確認した。さらに、細胞障害反応性は、接種養生にかかわらず、いかなるマウスの肺臓細胞からも未修飾Ｐ８１５細胞に対して検出されなかった。それゆえ、組換えＮＹＶＡＣ，またはより著しくは、ＨＩＶ −１からのｅｎｖ暗号配列を発現する組換えＡＬＶＡＣを接種したマウスのみが、ｖ３特異的細胞障害応答を示した。

実施例７−細胞障害エフェクター細胞の特徴付けＨＩＶ−Ｉ　Ｖ３ペプチド瞬間標識標的細胞の溶解に関連する肺臓細胞の同一性を決定するために、マウスをｖＣＰ１１２で免疫化した。各免疫化後、または最初の接種から２１日後のｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激において、２段階欠失方法を行なって、肺臓細胞を、ｖ３ペプチド瞬間標識Ｐ８１５細胞に対する細胞障害性について評価した。カナリアボックスベクターＡＬＶＡＣを接種したマウスは、ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできない肺臓細胞を産生じなかった。１回の免疫化後、ｖｃＰ１１２誘導牌臓細胞は、Ｖ３ペプチド瞬間標識標的を殺すことができる。溶解エフェクター細胞は、補体を加えた抗マウス’ｒｈｙｔ、２またはＬ７ｔ２．２による処理に対して感受性があり、抗−ＣＤ４に対して抵抗があった。第１０図は、細胞障害Ｔリンパ球細胞表面抗原’ｒｈｙｔ、２およびＬｙｔ２．２に対する抗体に対しての、ｖＣＰ１１２で免疫化したマウスの肺臓細胞からの細胞毒性エフェクター細胞の感受性を示す。補体または単クローン性抗体もしくは同種異系抗血清のいずれも１つでは、これらの細胞の細胞障害反応に影響しなかった。３００回目投与した２回目の免疫化から５日後に、同様の結果が得られた。ｖｃＰ１１２感染同種牌臓細胞による１回の接種、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激から２１日後、抗−ＬＹｔ２．２に対して完全に感受性であり、抗−ＣＤ４に対する抵抗を有する溶解エフェクター細胞が生じた。これらのＴｈｙｌ、２−１ＣＤ４−１Ｌｙｔ２．２＋エフエクター細胞は、ｖＣＰＩＬ接種マウスからの牌象細胞のｖＰ９１１によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激後には見られない。言うまでもなく、ＨＩＶ　Ｖ３ループ特異的細胞障害性は、ＣＤ４ではなく、’ｒｈｙｉ、２およびＬｂｙ２．２を発現せしめる１９２８球の個体群により介在せしめられたことが明確である。この細胞表面表現型は、古典的細胞障害Ｔ　ＩＪンパ球の特徴である。

ＨＩＶカナリアポックスウィルス（ＡＬＶＡＣ）組換え体により産生せしめられた細胞障害細胞の特異性を実験するために、ＣＴＬ活性に対するｖｃＰ１１２の感受性を、ＨＩＶ単離体Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｂ、、ＭＮ、またはＳＦ２のｇｐ１２０のｖ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞のなかで比較した。第８図に示すように、ＨＩＶ特異的第１ＣＴＬ活性は、ＨＩＶ単離体ＭＮまたはＳＦ２のｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識した標的細胞ではなく、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢのＶ３ループに対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞のみに限定した。この第８図は、ＨＩＶ　ＭＮまたハＳ　Ｆ　２　ノＶ　３　／Ｉ、−プノテハなく、ｇｐ１２０＋７）ＨＩＶ１１１Ｂ超可変Ｖ３ループの細胞障害Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を説明している。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激した、ＨＩＶ特異的規約ＣＴＬ活性およびＡＬＶＡＣ組換え体ＶＣＰ１１２による免疫化によって誘発せしめられた第２のＣＴＬ活性に関して、同様の結果が得られた。それゆえ、ＨＩＶ単離体１１１Ｂのｅｎｖ遺伝子を発現する組換えカナリアポックスウィルスにより誘発せしめられたＨＩＶ特異的ＣＴＬが、同一の抗原単離体から誘導せしめられた標的エピトープのみを認識する。これらの結果は明確に、ＨＩＶカナリアポックスウィルス組換え体の免疫化により産生されたリンパ球エフェクター細胞の鋭敏な特異性を示し、ナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ）細胞活性のような非特異的エフェクター機構を除外する。

ＨＩＶに対する体液性応答を評価するために、０回目にマウスにＮＹＶＡＣＨＩＶ組換え体またはカナリアポックスウィルス（ＡＬＶＡＣ）組換え体を接種し、４週目に２回目の免疫化を行なった。最初の免疫化から２０週間に亘り、様々な間隔でマウスから採血した。各処理群からのプール血清を、抗原としての精製ｇｐ１２０を用いたＥＬＩＳＡによりＨＩＶに対する抗体についてアッセイした；結果を第９図に示すが、この図は、ベクター（ＮＹＶＡＣ。

ＡＬＶＡＣ）またはＨＩＶ−１ｅｎｖを発現するＡＬＶＡＣ組換え体（ｖｃＰ１１２）もしくはＮＹＶＡｃ組換え体ｖＰ９１１で免疫化したマウスのＨＩＶ　ＩＩＩＢ　ｇｐ１２０に対する抗体応答を提供するものである。ここで逆三角形は、２回目の接種の投与の時間を示している。第１の抗体応答は一般的に僅かであるが、検出可能であった。

２回目の免疫化後、ｖＰ９１１およびｖｃＰ１１２の両方で免疫化したマウスの抗体価は増大し、１０．０００を超える価で６週目にピークに達した。これらの抗体価は、研究の期間中ずっと、はぼ同一水準で保持された。それゆえ、ＡＬＶＡＣＨＩＶ組換え体、ｖｃＰ１１２は、著しい抗体応答を誘発できた。

ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣのマウスへの接種は、細胞障害Ｔ　ＩＪンパ球の特徴：免疫化、細胞表面表現型、記憶、およびエピトープ特異性の必要条件を有する肺臓細胞反応性を誘発する。さらに、このＡＬＶＡＣ組換え体の接種により、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対する抗体応答が誘発せしめられる。

実施例１Ｏ−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースノＨＩＶ−１組換え体の誘導およびＡＬＶＡＣとＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ配列は、それぞれ、ＨＩＶ− １（ＭＮ）のゲノムｃＤＮＡクローンからの１７７４ｂｐおよび１８０３ｂｐサブ断片を含有するプラスミドｐＭＮ１．８−９およびｐＭＮｌ、８−１０から誘導せしめられた。これらのプラスミドは、Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガロ（ＮＣ１−ＮＩＨ）の研究所により提供された。オリゴヌクレオチドＮＩＶＭＮ６（配列認識番号８２）（５ｔ　−ＧＧＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧ−３〆）およびＨＩＶ３Ｂ２　（配列認識番号３９）を用いたＰＣＲによりｐＭＮｌ、８−９からのこれらの配列を増幅し、続いてＫ　ｐ　ｎ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩでの切断により、１．０２８ｂｐのＫ　ｐ　ｎ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片を誘導した。この断片を、ＫｐｎｌとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳ−８Ｋに挿入し、ｐＢｓＭＩＤＭＮを産生じた。

オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列認識番号８３）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＴＣＣＴＩ’ＧＧＧＴＴＣＴｒＡＧ−３’　）およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号８４）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴｒＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’　）を用いたＰＣＲと続いての５ａｃＩとＸｂａＩでの切断により、ｐＭＮｌ、８−１０から１，０２８ｂｐの５ａｌＩ／ＸｂａＩ断片を誘導した。この断片を、４０４ｂｐのＥｃｏＲＩ／５ａｃＩ断片と共にＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断したｐＢＳ−３Ｋに共挿入した。４０４ｂｐの断片は、テンプレートとしてのｐＭＮｌ、８−９およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号３２）とＨＩＶＭＮ４（配列認識番号８５）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＣＧＣＴＧＣＴＣ−３’　）を用いたＰＣＲにより誘導した。産生じたプラスミドをｐＢＳ３ＭＮと称した。

ｐＢｓＭＩＤＭＮからの１，０２６ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ断片をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断した４、３１５ｂｐのｐＢＳ３ＭＮに挿入し、ｐＢＳＭＩＤ３ＭＮを産生じた。このプラスミドは、５′側領域を除いてほとんどのｅｎｖ遺伝子を含有している。ｐｓＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐから（実施例２で定義した）３１８ｂｐのＫｐｎｌ断片を単離することにより、ワクシニアウィルスＨ６プロモーター（ゲーベル等、１９９０ａＳｂ）およびｅｎｖ遺伝子の５′側領域を得た。

この断片を、ｐＢｓＭＩＤ３ＭＮからの２゜９ｂｐのＫｐｎＩ／Ｘｂａｌ断片とともにＫ　ｐ　ｎ　Ｉ　／　Ｘ　ｂａｌ切断したｐＢＳ−３Ｋに連結せしめた。

産生じたプラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥと称した。

Ｈ６プロモーターの３′側２６ｂｐに３′が並列した全ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＨ６８ＭＮＥからの２．７ｋｂのＮｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片をプラントエンドし、Ｎｒｕｌ／ＳｍａＩ切断したｐ　Ｓ　ＰＨＡＨ６に挿入した。これによりプラスミドｐＨＡＨＩＶＭＮＥを産生じた。プラスミドｐＳＰＨＡＨ６は以下のようにして誘導した。プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ　（ＫＩＬ宿主範囲遺伝子の上流のワクシニア配列ないのポリリンカー領域を含有する）をポリリンカー領域内のＨｉｎｄｌｌｌとｘｈＯＩて切断し、アニールしたオリゴヌクレオチド５ＰＨＰＲＨＡ　ＡからＤに連結し、（ＳＰＨＰＲＨＡΔ（配列認識番号８６）　５’−５ＰＨＰＲ）ＬＡ旦（配列認識番号８７）　（５’−ＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＭＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＣ−３’　）ＳＰＨＰＲ）ＬＡ　Ｑ　（配列認識番号８８）　（３’−ＴＴＡＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＧＣＴＡＴＡＧＧＣＭ’Ｉ’ｒＣＭＡＣＡＴＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴ−５′）ＳＰＨＰＲ）ＬＡ　Ｑ　（配列認識番号８９）　（３’−ＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＡ’ＩＴｒＴＴＣＡＣＴｒＴｒＡＴＴｒＡＴＧＴｒＴＣＣｊ五ＧＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＡＴＴＴＭＣＴＴＴＣＧＣＴＣＴ−５’　）ＨｉｎｄＩ１１部位、Ｈ６プロモーター−１２４から−１（パーカス等、１９８９）　、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉ。

５ａｃｌおよびＥｃｏＲ１部位を含有するｐｓＰ１２６を産生じた。

プラスミドｐＳＤ５４４　（６つの読取り枠内のポリリンカー領域と翻訳終止コドンにより置換されたＨＡ遺伝子の部位を囲うワクシニア配列を含有する）をポリリンカー内のＸｈｏｌで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片で満たし、アルカリホスファターゼで処理した。５ＰＩ２６をＨｉｎｄｌｌｌで切断し、フレノウで処理し、Ｓｍａｌでの切断によりＨ６プロモーターを単離した。Ｈ６プロモーター断片のｐＳＤ５４４への連結により、ポリリンカー領域中にＨ６プロモーターを含有する（ＨＡ転写の方向）ｐＳＰＨＡＨ６を産生した。この挿入プラスミドにより、異種遺伝子材料によりワクシニアＨＡ遺伝子（Ａ５６；ケーベル等、１９９０ａＳｂ）の置換を可能にする。

Ｃ５Ｌ挿入プラスミドを以下のように誘導した。コスミドベクターｐＶＫ１０２を用いて（ノーテおよびネスター、１９８２）　、ｖＣＰ６５のゲノミックライブラリー（Ｃ５座に狂犬病を有するＡＬＶＡＣ−ベースの狂犬病Ｇ組換え体）を構成した。このライブラリーを、ｐＲＷ７６４．５内に（Ｃ５座）含まれる０、９ｋｂのＰｖｕ　Ｉ　Ｉカナリアポックスウィルスゲノム断片でプローブした。

これらのカナリアボックスＤＮＡ配列は、超厚挿入座を含有している。２９ｋｂの挿入物を含有するクローンを成長せしめ、ｐＨＣ０８１と称した。Ｃ５配列を含有するこのコスミッドがら、３．３ｋｂ　Ｃ１ａ断片をサブクローンした。このＣ１ａ■断片からの配列分析を用いて、１−１３７２の０５座の地図を拡張した。

Ｃ５挿入ベクター、ｐＣ５Ｌを２段階で構成した。１５３５ｂｐの左アームを、オリゴヌクレオチドＣ５Ａ　（配列認識番号９０）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＧ−３’　）およびＣ５Ｂ　（配列認識番号９１）（５／−ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴｒＴＧＡＧＡＧＴＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧ−３’　）を用いてＰＣＲ増幅により産生じた。テンプレートＤＮＡはカナリアポックスウィルスゲノムＤＮＡであった。この断片をＥｃｏＲＩ／Ｓｍａｌで切断したｐＵＣ８にクローニングした。標準配列プロトコルにより配列を確認した。

オリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（配列認識番号９２）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧ−３’　）およびＣ３ＤＡ　（配列認識番号９３）（５ｒ　−ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＧＭＴＡＧＡＴＧ−３）を用いたＰＣＲ増幅により４０４ｂｐの右アームを産生じた。次いでこの断片を、Ｓｍａｌ／ＰｓｔＩで切断した左アームを含有する、前に産生じたベクター中にクローニングした。標準配列分析により全構成物を確認し、ｐＣ５Ｌと称した。この挿入プラスミドにより、異種遺伝子のＣ５座への挿入を可能にする。

ｐＨ６８ＭＮＥからの２．８ｋｂのＸｂａＩ／部分的Ｋｐｎｌ断片を単離し、ＸｂａｌとＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌ中に挿入した。産生じたプラスミドをＩ）Ｃ５ＨＩＶＭＮＥと称した。

プラスミドｐＨＡＨＩＶＭＮＥおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥを、治療ウィルスとして、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）によりｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いた。これらは、標準方法（ピッチー二等、１９８７）により行なった。組換えウィルスから誘導したプラークは、放射線標識ｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより同定した（ピッチｍ＝等、１９８７）。３回のプラーク精製後、組換えウィルスを増幅せしめた。ＮＹＶＡＣ−ベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ組換え体をｖＰ１００８と称し、ＡＬＶＡＣ−ベースの組換え体をｖｃＰ１２５と称した。

前述した方法を用いた蛍光抗体法およびイムノプレシピテーションにより、ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ遺伝子の発現に関して、組換えウィルス、ｖｃＰ１２５およびｖＰ１００８を分析した（ティラー等、１９９０）。ＨＩＶ−血清陽性個体からのプールヒト血清（ＣＡ、エメリービル、チロン社、Ｄｒ、に、ステイマーから得た）をこれらのアッセイに用いた。蛍光抗体法の結果により、ｖｃＰ１２５またはｖＰ１００８のいずれかに感染した細胞は、その表面にＨＩＶ−１（ＭＮ）遺伝子産生物を発現することが示された。ｖＰ１００８およびｖｃＰ１２５感染細胞から調製した溶解産物からのイムノプレシピテーションにより、それぞれ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、および４１ｋＤａのみかけの分子量を有する３つの主要なＨＩＶ−１特異的タンパク質の存在が示された。これらのことは、前駆体エンベロープ糖タンパク質（Ｌ６０ｋＤａ）およびタンパク質分解誘導成熟形状（１２０ｋＤａおよび４１ｋＤａ）の発現と一致する。

実ｍ例１１−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣにょるＨＩＶ−ｉ　（ＭＮ）　ｇｐ１２０（７）発現オリゴヌクレオチドＴ７（配列認識番号９４）（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）およびＨＩＶＭＮ１２０（配列認識番号９５）（５’　− ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＴ！ＴＴｒＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＣ−３’　）を用い、続いてのＥｃｏＲＩとＸｂａｌでの切断により、ｐＢ３３ＭＮから３９１ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片を増幅せしめた。この断片を、ｐＨ６ＨＭＮＥ　（実施例１０で定義した）から誘導した４、２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片に連結せしめた。産生じたプラスミドは、ｐＢＳ−８Ｋ中＋：ＨＩＶ−ｉ　（ＭＮ）　ｇｐ１２０のポックスウィルス発現カセットを含有しており、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０と称した。

１．７ｋｂのＸｂａｌ／部分的Ｋｐｎｌ断片を単離し、Ｋｐｎｌ／Ｘｂａｌで切断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生じたプラスミドをｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０と称した。ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０遺伝子をＮＹＶＡＣ中に組み込む挿入プラスミドは、最初に１．６ｋｂのＮ　ｒ　ｕ　Ｉ　／　Ｓｍａｌ断片をｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０がら単離することにより得た。この断片を、ＮｒｕｌとＳｂａ　Ｉで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を産生した。

挿入プラスミド、ｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０およびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰ　ｐ　ｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とともに組換え実験に用いた。これらのアッセイおよびプラーク同定と精製を、標準方法により行なった（ピッチｍ＝等、１９８７）０ハイブリダイゼ一シヨン分析を、放射線標識ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０特異的プローブにより行なった。精製した組換え体を増幅せしめた。Ａ　Ｉ、　Ｖ　Ａ　Ｃ−ベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０組換え体をｖｃＰ１２４と称し、ＮＹＶＡＣ−ベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０組換え体をｖＰ１００４と称した。

ｖｃＰ１２４とｖＰ１００４に感染した細胞を、蛍光抗体法およびイムノプレシビテーションにより、ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇ　ｐ　１２０を発現する組換え体の存在について分析した。これらのアッセイは、ＨＩＶ血清陽性個体からのプールヒト血清（ＣＡ、エメリービル、チロン社、Ｋ。

ステイマーから得た）を用いて、前述したように行なった（ティラー等、１９９０）。これらの研究による結果は明確に、ｖｃＰ１２４およびｖＰ１００４のいずれかに感染した細胞１ｔＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０を含有するが、ｇｐｌ　２０　ハ、親ウィルス、ＡＬＶＡＣおよびＮＹｖＡＣに感染した細胞および未感染細胞には観察されなかったことをＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｇｐ１６０の非開裂可能形状を発現するために、スレオニンに対するアルギニンの突然変異を、グオ等（１９９０）により示されたように、アミノ酸５１１で操作した（ラトナー等、１９８５）。これらの修飾は、感染細胞の表面からのｇｐ１２０の放出を減少せしめるために行なった。これらの操作は以下のように行なった。最初にオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ　（配列認識番号９（５’　−ＧＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴＣ−３’　）オヨびＨＩＶＥＣＢ　（配列認識番号９７）（５’　−ＧＣＴＣｃ’ｒＡＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧ’ｒｒＴＴＴＴｃＴｃ’ｒＣＴＧＣＡＣ−３ｔ　）を用いてｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＩＩ　（実施例２に記載した）からの配列を増幅し、続いてＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断により３７６ｂｐのＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。この断片を、１，０６１ｂｐのＰｓｔｌ／Ｘｂａｌ断片およびｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＩ　Ｉから（７）４．５ｋｂ（７）ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片と連結した。

ハシターンウィルスＳセグメントの中央領域を、オリゴヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ　（配列認識番号９８）（５’ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣ−３’）およびＨＴＳ５５ＰＮ　（配列認識番号９９）（５’　−ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＡＡＣＴＡＣＣＡＡＧＧ−３’　）並びにテンプレートとしてのＳ−特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣＲにより産生じた。５８１ｂｐの断片は、その３′末端にＰｓｔ１部位を含み、５′末端は、Ｓセグメントの位置４９９にＮｃｉ１部位を含む（シュマルジョン等、１９８６）。

さらに、オリゴヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ（配列認識番号９８）を使用することにより、アミノ酸配列を変更することなく、位置１０２９から１０３５でのＴ、ＮＴ要素を除去する。次いでこの断片をＮｃｉｌとＰｓｔｌで切断した。Ｈ６プロモーターに融合した暗号配列の５′末端を含有するＰＣＲ断片（上述したようにＨｉｎｄｌｌｌ／ＮｃｉＩで切断）を、Ｓセグメントの中央領域を含有する５８１ｂｐのＮｃｉｌ／Ｐｓｔｌ断片とともに、Ｈ４ｎｄｌｌＩとＰＳｔｌで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結した。産生じたプラスミドをｐＢｓＨＴｓＨ６５Ｐと称した。

オリゴヌクレオチドＨＴＳ３ＰＸＢＡ　（配列認識番号１＋５　’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＴＴｒＣＡＡＡＧＧＣ−３’　）およびＴ５ＨＴ５ＰＳＰ　（配列認識番号１ｏ１）（５’　−ＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣ−３’　）並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣＴにより、Ｓセグメントの３′側４３８ｂｌ）を誘導した。この断片の５′末端は、Ｓセグメントの位置１０３９に位置するＰｓｔ１部位（シュマルジョン等、１９８６）を含有し、３′末端は、ＰｓｔＩ／Ｘｂａｌ切断ｐＢＳ−ＳＫへの挿入前に特有なＸｂａｌおよびＴｓＮＴ配列モチーフを含有し、ｐＢＳＨＴＳ３Ｐを産生ずる。

全Ｓセグメント発現カセットを産生ずるために、１１２２ｂｐ　Ｐｓｔｌ／部分的ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片をｐＢＳＨＴＳ）（５６Ｐから誘導した。コノ断片を、ｐＢｓＨＴｓ３Ｐからの２９０ｂｐのＰｓｔｌ／ＸｂａＩ断片とともにＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ切断したｐＢＳ−３Ｋに共挿入した。Ｘｂａｌでの線状化と続いての部分的なＨｉｎｄｌ　Ｉ■切断し、産生じたプラスミドをｐＢｓＨＶｓと称した。

ｇｐ１６０カセットに連結せしめられたＨ６プロモーターの３′側２６ｂｐを含有する、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣからの２．６ｋｂのＮｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片を単離し、ｐＢＳＨＶＳの３．０ｋｂのＮｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片に連結し、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＥｃＭを産生した。ＮｒｕｌとＸｂａｌでの切断により、Ｈ６プロモーターの３′側２６ｂｐおよびハンターンウィルスＳ配列を切除する。３．０ｋｂのＮｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片は、ｐＢＳ−３Ｋプラスミド中にＨ６プロモーターの５′側１００ｂｐを含有している。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＥｃＭからの２．８ｋｂのＸｂａｌ／′部分的Ｋｐｎｌ断片をＸｂａｌ／Ｋｐｎｌ切断したｐＣ５Ｌに連結し、ｐＣ５ＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭからの２．７ｋｂのＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片をＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドし、Ｎｒｕｌ／Ｓｍａｌ切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。

挿入プラスミド、ｐｃ５ＨＩＶ３ＢＥＥｃおよびｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥＣを用いて、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を用いた標準方法（ピッチｍ＝等、１９８７）によりｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験を行なった。ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子に特異的な放射線標識プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション分析（ピッチｍ＝等、１９８７）により、組換えプラークを同定した。３回の精製による組換えウィルスを増幅した。組換えＡＬＶＡＣ −ベースのＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｇｐ１６０（非開裂可能）をｖｃＰ１２６と称し、ＮＹＶＡＣ−ベースのものをｖＰ１０２０と称した。

ＨＩＶ血清陽性個体からのプールしたヒト血清（ＣＡ。

エメリービル、チロン社、Ｋ、スティマーから得た）を用いてｖＰ１０２０およびｖＣＰ１２６に感染した細胞について、前述した方法により蛍光抗体法およびイムノプレシビテーション分析を行なった。蛍光抗０体法の結果は明確に、ｖｃＰ１２６またはｖＰ１０２０のいずれかに感染した細胞ｃｙ：を表ｉ上ｉ、：、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）　ｇｐ１６０（非開裂可能形状）の表面発現を示した。

さらに、イムノプレシピテーションの結果は、成熟ｇｌ）１２０およびｇｐ１４０枠にタンパク質分解的に開裂されなかったこれらの感染細胞中＋、：ＨＩＶ− １（Ｉ　Ｉ　ｒＢ）　ｇｐ１６０の存在を示した。

ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１６０の非開裂可能形状もまた追跡し、組換えウィルスを以下のように得た。

オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号１０（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＪｉＡＡＴｒＡＴＡＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＴｒＣＣＡＡＧＣＣ−３’　）およびＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号１０３）（５’−ＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＣ−コｌ）を用いたｐ　Ｈ６ＨＭＮ　ＥからのＰＣＲ増幅と続いてのＰｓｔｌおよびＸｂａｌでの切断により、Ｐｓｔｌ／Ｘｂａｒ断片を得た。この１０６１ｂｐの断片をｐＢｓＨＩＶＭＮＴ（実施例１３に記載）からの３９１ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔｌおよびｐＨ６ＨＭＮＥ　（実施例１０に定義）からの４．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌと連結した。産生じたプラスミドをｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃ’　と称した。

ＨＩＶ　ｅｎｖ挿入物の配列分析により１．１つのヌクレオチドが失われた（ＳａｃＩおよびＸｂａ１部位の間）ことが示された。これを修正するために、以下の操作を行なった。

ｐ　Ｈ６ＨＭＮ　Ｅからの１．０２８ｋｂのＳ　ａ　ｃ　Ｉ　／　Ｘ　ｂ　ａＩを、ｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃからの対応断片を置換するのに用いて、ｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃを形成せしめた。

ｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃからの２．６ｋｂのＮｒｕＩ／Ｘｂａｌ断片を単離し、フレノウでプラントエンドし、Ｎｒｕｌ／Ｓｍａｌ切断したｐｓＰＨＡＨ６（実施例１０で定義）に挿入した。産生じたプラスミドをｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥＣと称した。ｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃからの２．６ｋｂのＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片もまたＮｒｕｌ／ＸｂａＩ切断したｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６　（下記）に挿入し、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを産生した。

挿入プラスミド、ｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥＣおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを、治療ウィルスとして、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖ　Ｐ　８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）による標準組換え実験（ピッチｍ＝等、１９８７）に用いた。放射線標識ＨＩＶ　ｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチｍ＝等、１９８７）により、組換えウィルスを同定し、プラーク精製した。精製した組換えウィルスを増幅せしめた。ＨＩＶ−１（ＭＮ）非開裂可能ｇｐ１６０を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０７８と称し、ＡＬＶＡＣベースのものをＶＣＰ　ｉ−４４と称した。

ｖＣＰ１４４およびｖＰ１ｏ７８の発現分析を上述したように行なった。これらの結果は、発現は質的に、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）封部、ｖＰ１０２０およびｖｃＰ１２６と等しいことを示した。

１　ｅｎｖの非開裂可能、分泌形状の発現タンパク質分解的に開裂されず、遺伝子産生物のカルボキシ末端の近くの膜内外配列の削除により分泌されるＨＩＶ− １（ＭＮ）　ｅｎｖを発現するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣベースの組換えウィルスを産生じた。オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号１ｏ３）およびＨＩｖＭＮＴＩ（配列認識番号１０４）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＴＣＣ−３’　）を用いてｐＨ６ＨＭＮＥ　（実施例１ｏで定義）がらのこれらの配列を最初に増幅し、続いてＰｓｔｌ（５’末端）とＸｂａＩ（３’末端）での切断により、５０２ｂｐのＰｓｔＩ／Ｘｂａｉ断片を得た。この断片はヌクレオチド７２１９から７８０８に対応する（ラトナー等、１９８５）。この断片は、ｅｎｖ発現カセットの３′末端として機能する。

それ自体、ｅｎｖ遺伝子産生物は、膜内外領域を欠き、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮＴＩ　（配列認識番号１ｏ４）により提供された終止コドンにより終止され、オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号１０３）を用いて提供された５１１でのアミノ変化（実施例１２で定義）により開裂されない。この５０２ｂｐ断片を、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号３２）およびＨＩｖＥＣＢ（配列認識番号９７）を用いたｐ　Ｈ６ＨＭＮ　ＥからのＰＣＲによる３９１ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ断片に連結せしめ、４．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片をｐＨ６ＭＮＥに連結せしめた。産生じたプラスミドをｐＢｓＨＩＶＭＮＴと称した。

ｐＢＳＨＩＶＭＮＴからの２．２ｋｂのＸｂａＩ／部分的Ｋｐｎｌ断片を単離し、ＸｂａｌとＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生じたプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＭＮＴと称した。ｐＢｓＨＩＶＭＮＴから２．１ｋｂ（７）ＮｒｕＩ／Ｘｂａｌ断片を単離することにより、ＮＹＶＡＣ挿入プラスミドを誘導した。

この断片を２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片によりプラントエンドし、ＮｒｕｌとＳｍａ　Ｉで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮＴを産生した。

挿入プラスミド、ｐｃ５ＨＩＶＭＮＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮＴを、治療ウィルスとして、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）による標準組換え実験（ピッチｍ＝等、１９８７）に用いた。放射線標識ＨＩＶ　ｅｎｖ特異的プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーションアッセイ（ピッチｍ＝等、１９８７）により組換えウィルスを同定した。増幅の前に、組換えウィルスに３回の精製を行なった。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ　（非開裂可能；分泌）をｖｃＰ１２０と称し、ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ９９４と称した。

ＨＩＶ血清陽性個体からのプールしたヒト血清を用いて、ｖｃＰ１２０およびｖＰ９９４感染細胞について、前述したようにイムノプレシピテーション分析を行なった。ｖＣＰ１２０およびｖＰ９９４の両者が、非開裂可能、トランケート遺伝子産生物と一致する分子量を有するＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ特異的遺伝子産生物を発現した。さらに、ｖｃＰ１２０およびＶＰ９９４感染細胞培養物からの無細胞培地のイムノプレシピテーションは、このｅｎｖ遺伝子産生物の分泌を示した。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｅｎｖについて同様の構成を操作した。このことを達成するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ　（配列認識番号１０３）およびＨＩｖ３ＢＴ（配列認識番号１０５）（５’　− ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴｒＧＣＣＣＡＴＴＴＡＴＣＴＡＡＴｒＣＣ−３’　）を用いてこれらの配列をｐＢｓＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐ　（実施例２で定義）から最初に増幅し、続いてＰｓｔｌとＸｂａｌでの切断により、４８７ｂｐのＰ！５ｔｌ／Ｘｂａｌ断片を得た。３９７ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣから単離し、４．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片をｐＨ６８Ｉ　Ｉ　Ｉ　ＢＥＭから単離した。これらの３つの断片をともに連結し、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＴ１を産生した。プラスミドｐＨ６ＨＩＩＩＢＥＭまを、ＫｐｎＩでの切断によりｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＩ　Ｉ　（実施例２で定義）から誘導し、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）　ｅｎｖ遺伝子の５′部分に連結したＨ６プロモーターの２番目のコピーを遊離せしめた。次いで５．４ｋｂのＫｐｎｌを再連結し、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＩ　Ｉを形成した。

ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＸｂａＩ切断により誘導した２、１ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＴ１からの１０５ｂｐのＨｉｎｄｌＩＩ／Ｘｂａｌ断片に連結し、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＴを産生じた。

このプラスミドをＮｒｕ　ＩとＸｂａｌで切断し、２．１ｋｂの断片を切除した。この断片をプラントエンドし、ＮｒｕｌとＳｍａｌで切断したｐｓＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを産生じた。

プラスミドｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを、治療ウィルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）により上述したような組換え実験に用いた。組換えウィルスを上述したように同定し精製し、産生じたプラスミドをｖＰ１０３６と称した。この組換え体は、ｖｃＰ１２０およびｖＰ９９４について上述した発現特徴の全てを有した。

列により固定されたＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０の発現ｇｐ１２０をコードするｅｎｖ領域を親水性膜内外配列をコードする領域に融合するために、以下の操作を行なった。ｇｐ１２０暗号配列の３′側領域に対応する２００ｂｐの断片を、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号３２）およびＨＩＶＭＮ１８（配列認識番号ｌ　０６）（５’−ＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧ−３′）を用いたＰＣＲによりｐＨ６ＨＭＮＥ　（実施例１ｏで定義）から誘導した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号３２）およびＨＩＶＴＭ３（配列認識番号１ｏ９）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴ’ｒＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＴＴＣＡＣ−３’　）を用いたＰＣＲにより、アニールしたオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭＩ（配列認識番号１０７）（５′− ＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＧＧＴＴＴＭＧＭＴＡＧＴＴｒＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴにＴＡＧＴＧＭＴＡＧＡＧＴＴＡＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡ−３’　）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号１０８）（５’−ＴＴＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＴＴＣＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＣλＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＭＴＭ−３’）にこの断片を融合せしめた。オリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１．（配列認識番号１０７）およびＨＩＶＴＭ２　（配列認識番号１０８）はヌクレオチド７８５０から７９３４に対応しくラトナー等、１９８５）　、ＨＩＶ　ｅｎｖ親水性アンカー配列をコードする領域を示す。ＨＩＶＴＭ３　（配列認識番号１０９）による融合により、終止コドンと３ ’Ｘｂａ１部位を有する、結果として生じたカセットの３′末端を操作する。誘導断片をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断したｐ　Ｈ６ＨＭＮ　Ｅに連結し、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０Ｔを産生した。

Ｈ６プロモーターの３′側２６ｂｐおよび全ＨＩＶ−１カセットを含有する、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０Ｔからの１゜７ｋｂのＮｒｕｌ／ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６からの５．ｌｋｂのＮｒｕＩ／Ｘｂａｌ断片に挿入し、ｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０Ｔを誘導した。プラスミドｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６を以下のように誘導した。

ｐＣ５Ｌ　（実施例１０で定義）をポリリンカー内のＡｓｐ７１８とＮｏｔｌで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２６　（配列認識番号１１０）（５’−ＧＴＡＣＧＴＧＡＣＴＡＡＴＴＡＧＣＴＡＴＡＪｌＩＡＭＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣαＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴＣＣＣにＧＧＴｒＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣＡＣ−３’　）およびＣＰ２７　（配列認識番号１１１）（５Ｉ− ＧＧＣＣＧＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴｒＴｒＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＣ−３’　）（不能Ａｓｐ７１８部位、６つの読取り枠中の翻訳停止コドン、ワクシニア初期転写終止信号（ユエンおよびモス、１９８７）　、ＢａｍＨＩＳＫｐｎｌ、ＸｈｏＩ、ＸｂａｌＳＣｌａＩ、およびＳｍａ　Ｉ制限部位、ワクシニア初期転写終止信号、６つの読取りワクシニア中の翻訳停止コドン、および不能Ｎｏｔ１部位を含有する）に連結し、プラスミドｐＣ５ＬＳＰを産生じた。

ｐＣ５ＬＳＰをＢａｍＨＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ３２　（配列認識番号１１２）（５ｒ− ＧＡＴＣＴＴＡＪｋＴｒＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＣＴＡＴＣＴＧＣＴＣＧＴｒＡＡＴＴＭＴＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧ−３ ’　）およびＣＰ３３　（配列認識番号１１３）（５′− ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣにＡＧＣＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＴＣＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＡＡＴＴＭＴＴＭ−：ｌ　Ｉ　）に連結し、ｐＶＱｃ５ＬｓＰ６を産生した。

ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０Ｔからの１．７ｋｂのＮｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片もまたプラントエンドし、Ｎｒｕ　ＩとＳｍａｌで切断したｐｓＰＨＡＨ６に挿入した。

産生じたプラスミドをｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔと称した。

挿入プラスミド、ｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０ＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔを、治療ウィルスとしての、それぞれＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによる標準組換え実験（ピッチ一二等、１９８７）に用いた。放射線標識したＨＩＶ−１ｇｐ１２０特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチ一二等、１９８７）により組換えウィルスを同定し、精製した。純粋個体群を増幅し、ＡＬｖＡＣベースの固定ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０組換え体をｖｃＰ１３８と称した。ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ１０３５と称した。

標準方法（上記）により蛍光抗体法およびイムノプレシピテーション分析を行なって、ｖＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞中のＨＩＶ−１（ＭＮ）個体ｇｐ１２０の発現を評価した。このアッセイは、ＨＩＶ血清陽性個体からのプールしたヒト血清（ＣＡ、エメリービル、チロン社、Ｄｒ、に、　ステイマーから得た）を用いて行なった。表面蛍光抗体の調査により、ｖｃＰ１３８およびＶＰ１０３５感染細胞は、形質膜中にＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０を含有することが示された。特に、ｖｃＰ１３８およびＶＰ１０３５感染細胞の表面染色は、ｇｐ１６０または非固定ｇｐ１２０を発現する組換えウィルス（すなわち、ｖＣＰ１２５、ｖｃＰ１２４、ｖＰ１００４、およびｖＰ１００８）に感染した細胞と比較して増大した。イムノプレシピテーション分析の結果により、ｖｃＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞中のｇｐ１２０の発現を確認し、発現された産生物は予期した分子量であった。

実施例７に記載したように、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成することにより、プラスミドｐＳＤ５４２（ＮＹＶＡＣＴＫ座供与体プラスミド；実施例５参照）をプラスミドｐｓＤ４６０から誘導した。ｐｓＤ５１３中のポリリンカー領域を、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８８　（配列認識番号１１４）（５’ＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴ　：ｌ’）およびＭＰＳＹＮ２８９　（配列認識番号１１５）（５’　ＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ　３’）と連結して修飾し、プラスミドｐＳＤ５４２を産生じた。

１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ、　Ｒ，Ｃ。

ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワタシニアウイルスｔｋ側原アームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の５′末端ヲ含有スル、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐ（７）ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＳＤ５４２の４．０７５ｂｐのＢｇｌｌｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称する。

ｇａｇ遺伝子の３′末端をｇａｇ遺伝子の残りからの下流にクローニングした。

これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する、２８０ｂｐのＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片を、プラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドＨＩＶＰ５　（配列認識番号１１６）（５’ 　−ＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＣ−３’　）およびＨＩＶＰ６　（配列認識番号１１７）（５’　−ＴＴＧＧＡＴＣｃＴＴＡＴｒＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣ−３ｔ　）により産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称する。

１３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＨＩＶＬ１７　（配列認識番号１１８）ＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴｒＴＡＡＴＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴ−３”１およびＨＩＶＬ１８　（配列認識番号１１９）（５Ｉ− ＣＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡｌｒＴＴＴｃＡＣ１１′ｒＴＡＴσＣ晶−３′ ）を、ｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐの部分的Ｂｇｌｌｌ−Ｃ１ａＩ断片に挿入することにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。

ｐＨＩＶＧ４を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）による組換え実験に用いてｖＰ９６９を産生じた。

イムノプレシピテーション分析を行なって、ｖＰ９６９が真正ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質を発現するか否かを決定した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からのプールした血清（ＣＡ。

エメリービル、チロンから得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ− １ｇａｇ前駆体発現に関して行なった。血清をｖＰ８６６感染Ｖｅｒｏ細胞により予備吸着せしめた。予備吸着した血清を４℃で一晩培養せしめてタンパク質Ａセファロースに連結せしめた。この培養期間後、材料をＩ×の緩衝液Ａで洗浄した。通常ヒト血清およびタンパク質Ａセファロースにより予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４ ℃で一晩培養した。−晩の培養期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣ１，／尿素緩衝液により２×洗浄した。沈殿したタンパク質を、２Ｘのラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ。

２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により免疫複合体から分離した。

タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス等１９８４）上に分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａサリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９６９感染細胞からのＨＩＶ− １ｇａｇ前駆体タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染細胞からのＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１゜６２５ｂｐのＢｇｌＩＩ断片を、ｐＳＤ５４２　（、実施例１５で定義）の４．０７５ｂｐのＢｇｌＩＩ断片に挿入することにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称する。

次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＨＩＶＧ２にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する、２８０ｂｐのＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ２の５．６２０ｂｐのＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＨＩＶＰ５　（配列認識番号１１６）およびＨＩＶＰ６　（配列認識番号１１７）により、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称する。

Ｉ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７　（配列認識番号１１８）およびＨＩＶＬ１８（配列認識番号１１９）を、ｐＨＩＶＧ３の５゜５４０ｂｐの部分的ＢｇｌｌＩ−Ｃ１ａｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。

次いでｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１９　（配列認識番号１２０）（５ ′− ＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＴＡＡＴＴＴＴｒＡＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＧ−コｒ）およびＨＩＶＬ２０　（配列認識番号１２１）（５′− ＧＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＡＡＴ”ＩＴｒＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＴｒＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＧＴＣＡＧ−３’）を、ｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐ部分的ＰｖｕｌＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ５と称する。

次いで、ｇａｇ遺伝子の残り、並びにｐｏｔ遺伝子をｐ１７「遺伝子」の下流にクローニングした。これ番よ、大分のｇａｇ遺伝子および全てのｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの４．９５５ｂｐのＣ１ａｌ−８ａｉｌ断片を、ｐＨＩＶＧ５の４．１５０ｂｐのＣ１ａｌ−３ａｌｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ６と称する。

次いで外来性３′非暗号配列を除去した。これＧｉ、ｐＯ１遺伝子の３′末端を含有する、３６０ｂｐのＡｆｌｌｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ６の８．０３０ｂｐのＡｆ　ｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片に断片−ニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、第１ノゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ７　（配列認識番号１２２）（５’　−ＡＡＧＭＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＣ−３’　）およびＨＩＶＰ８　（配列認識番号１２３）（５’　−ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＭＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴ−３１）により、プラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ７と称する。

ｐＨＩＶＧ７は、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）による組換え実験に用いて、ｖＰ９８９を産生じた。

ｖＰ９８９感染細胞によるイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。ＨＩＶ−１特異的種は、疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からは全く沈殿しなかった。

しかしながら、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂産生物は、ｖＰ９８９感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例１６参照）、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を産生することにより行なった。

ｐＨＩＶＧ７を、治療ウィルスとしてのｖＰ９２１による組換え実験に用いてｖＰ９９１を産生じた。

ｖＰ９９１感染細胞のイムノプレシピテーション分析を、ＨＩＶ　ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように行なった。ＨＩＶ特異的種は、疑似感染Ｖｅｒ。

細胞からは全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎＶおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂産生物は、ｖＰ９９１感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例１８−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａ　／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１６０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例１６参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を産生ずることにより行なった。

ｐＨＩ　ＶＧ７を、治療ウィルスとしてのｖＰ９１１　（上記）による組換え実験に用いてｖＰ９９０を産生じた。

ｖＰ９９０感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。ＨＩＶ−１特異的種は、疑似感染Ｖｅｒｏ細胞からは全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂産生物は、ｖＰ９９０感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄは、Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガ０（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。

これは、前述したように（実施例１６参照）、最初にｐＨＩＶＧ５を産生することにより行なった。

次いでｐ２４「遺伝子」の３′末端をｐＨＩＶＧ５ｉ、’７０−二レグした。これは、ｐ２４「遺伝子」の３′末端を含有する、６６０ｂｐのＳａｉｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ５の４，４５０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨ■断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ２５　（配列認識番号１２４）（５１−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＡＴＣＡαゴＡＧＡＡＣ−３’　）およびＨＩＶＰ２６　（配列認識番号１２５）（５’　−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＴＡＴ−３’　）によりプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ８と称する。

次いで昆虫ボックス４２ｋｄプロモーターをｐ２４「遺伝子」の上流にクローニングした。これは、昆虫４２ｋｄプロモーターおよびｐ２４「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２１　（配列認識番号（５ｔ− 丁ＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡ−３’ ）およびＨＩＶＬ２２　（配列認識番号１２７）〔５′− ＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＡＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴ’ｒＴＣＡＡＴｒＴＴＧＣ−３Ｉ　）を、ｐＨＩＶＧ８の５．０７０ｂｐ（７）Ｘｈｏｌ−ＮｓｉＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ９と称する。

ｐＨＩＶＧ９を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）にによる組換え実験に用いてｖＰ９７０を産生じた。

ｖＰ９７０感染細胞のイムノプレシピテーション分析を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。ＨＩＶ−１特異的種は、疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からは全く沈殿しなかった。しかしながら、Ｉ）２４に対応するタンパク質種は、ｖＰ９７０感染細胞の溶解産物からは沈殿した。

実施例２Ｏ−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１，ｐ１７８、ｐ２４およびｅｎｖ　（ｇｐ１２０）組換え体の産生ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄは、Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５ ′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。

これは、前述したように（実施例１９参照）最初にｐＨＩＶＧ９を産生ずることにより行なった。

ｐＨＩＶＧ９は、治療ウィルスとしてのＶＰ９２１による組換え実験に用いてｖＰ９７３を産生じた。

ｖＰ９７３感染細胞のイムノブレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように行なった。疑似感染Ｖｅｒｏ細胞からはＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｐ２４に対応するタンパク質種は、ｖＰ９７３感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例２ｌ−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ　（ｇｐ１６０）組換え体の産生ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ、　ＲｌＣ，ガｏ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′ 末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。

これは、前述したように（実施例１９参照）、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ１９を産生することにより行なった。

ｐＨ’ＩＶＧ９を、治療ウィルスとしてのｖＰ９１１による組換え実験に用いてｖＰ９７１を産生じた。

ｖＰ９７１感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように行なった。疑似感染Ｖｅｒｏ細胞からＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎＶおよびｐ２４に対応するタンパク貫挿は、ｖＰ９７１感染細胞の溶解産物からは沈殿した。

ＨＩ　Ｖ’　−１ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄは、Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガロ（ＮＣＩ　−Ｎ　ＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。

これは、前述したように（実施例１９参照）、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ９を産生することにより行なった。

次いでＨ６プロモートしたトランケートＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐ　ＨＩ　Ｖ　Ｇ　４に挿入した。これは、Ｈ６プロモートしたトランケートＨＩＶ− １エンベロープ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＥｌｏのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■　（フレノウ断片）充填１，６００ｂｐ　Ｘｈｏ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片を、ｐＨＩＶＧ４の充填ＢａｍＨ１部位に挿入した。この操作により産生じたプラスミドは、ｐＨＩＶＧＥＩＩと称する。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢｃＤＴ１からの５ａｃｌ／部分的Ｋｐｎｌ断片をｐＩＢＩ２４（ＣＴ１ニューハブン、ＩＢＩ）の多重クローニング領域に挿入することによりプラスミドｐＨＩＶＥＬＯを誘導した。プラスミドｐＢｓＨＩＶ３ＢＣＤＴＩは、ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）エンベロープの顕著なトランスケート形状を発現するＨ６プロモートしたカセットを含有している（アミノ酸１から４４７；ラトナー等、１９８５）。このカセットの発現を評価して、Ｖ３ループ領域およびＴＩエピトープを保持しつつＣＤ４結合を除去した。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢｃＤＴ１を構成するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ　（配列認識番号９６）およびＨＩＶＣＤ４Ａ　（配列認識番号１２（５’　−ＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＭＴＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＡＣ−：ｌ　’　）を用いて、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐ　（実施例２に定義）から２００ｂｐのＰＣＲ誘導断片を増幅せしめた。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ　（配列認識番号９６）およびＨＩ　ＶＴＭ３　（配列認識番号１０９）を用いたＰＣＲにより、この断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭＩ　（配列認識番号１０７）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号１０８）に融合せしめた。ＨＩＶ−１ｅｎｖ膜内膜内シアンカーミノ酸６９１から７１８；ラトナー等、１９８５）　、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）　、および３’Ｘｂａ１部位をコードする配列を配することにより、この操作でトランスケートｅｎｖカセットの３′末端を産生ずる。このＰＣＲ融合産生物をＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断し、２４３ｂｐの断片を産生じた。この断片をｐＨ６ＨＩ　Ｉ　ＩＢＥの４．５ｋｂのＥ　ｃ　ｏＲＩ／Ｘｂ　ａ　１．断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１を産生した。

ｐＨＩＶＧＥｌｌを、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）による組換え実験に用いて、ｖＰ９７９を産生じた。

ｖＰ９７９感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からは、ＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿は、ｖＰ９７９感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワタシニアウイルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは前述したように（実施例１６参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった。

次いでＨ６プロモートしたトランケートＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ７に挿入した。これは、Ｈ６プロモートしたトランケートＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＥｌｏのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片）充填１，６００ｂｐ　Ｘｈｏ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片を、ｐＨＩＶＧ７の充填ＢａｍＨ１部位に挿入した。この操作により産生じたプラスミドをｐ、ＨＩＶＧＥ１２と称する。

ｐＨＩＶＧＥ１２を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）による組換え実験に用いてｖＰ９７８を産生じた。

ｖＰ９７８感染細胞のイムノプレシビテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して前述したように行なった。疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からはＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。

しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂産生物は、ｖＰ９７８感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ｇａｇ遺伝子をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例１６参照）、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を産生することにより行なった。

次いで１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリアボックス挿入ベクター中に挿入した。これは、１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏ！遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４，３６０ｂｐの部分的Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＶＱＨ６ＣＰ３Ｌ、のＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４と称する。

次いでＨ６プロモートしたＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１２０）遺伝子をｐＨＩＶＧＥ１４１Ｊ！ｉ入した。

これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２９　（配列認識番とＨＩＶＬ３０　（配列認識番号１３０）（５’　−ＴＣＧＡＧＴＴＧＣ−３’　）並びにＨ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子を含有する、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０の１，６００ｂｐのＮｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１４の１１．５００ｂｐのＮｒｕ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片に挿入することにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１５と称する。

次いでＨ６プロモートしたエンベロープ（ｇ　ｐ　１２０）遺伝子およびＩ３Ｌプロモートしたｇａｇとｐｏｌ遺伝子をワクシニアウィルス挿入ベクター中に挿入した。これは、Ｈ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子およびＩ３Ｌプロモートしたｇａｇとｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧＴ１５の６．４００ｂｐのＮｏ　ｔ　ｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱの４，０００ｂｐのＮｏｔｌ−Ｂｇｌｌ■断片に挿入することにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１６と称する。

ｐＨＩＶＧＥ１６を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）による組換え実験に用いて、ｖＰ９８８を産生じた。

ｖＰ９８８感染細胞野イムノプレシビテーション実験を、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように行なった。疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染■ｅｒｏ細胞からはＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂タンパク質は、ｖＰ９８８感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例２４参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１６を産生することにより行なった。

次いでｇｐ１２０遺伝子をｇｐ１６０遺伝子により置換した。これは、全ＨＩ　Ｖ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐ　Ｈ６８ＭＮ　Ｅの２．６００ｂｐのＮｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１６の８゜ｏｏｏｂｐの部分的Ｎｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＨＩＶＧＲ１９と称する。

ｐＨＩＶＧＥ１９を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）による組換え実験に用いて、ｖＰ１００９を産生した。

ｖＰ１００９感染細胞のイムノプレシピテーション実験は、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して前述したように行なった。疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からはＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体と成熟ｇａｇ開裂産生物は、ｖＰ１００９感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例２６−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏ　ｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１２０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例２４参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１５を産生することにより行なった。

ｐＨＩＶＧＥ１５を、治療ウィルスとしてのＡＬｖＡＣ（ＣＰ　ｐ　ｐ）による組換え実験に用いて、ｖｃＰ１１７を産生した。

ＣＥＦ細胞単層についてイムノプレシピテーション分析を行なって、ｖｃＰ１１７が真正ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを決定した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体にューヨーク州、保健省から得た）を用いて、ＨＩＶ　ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して感染細胞からの溶解産物を分析した。血清をＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞に予備吸着せしめた。予備吸着せしめた血清を、４℃での一晩の培養によりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。この培養期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。正常ヒト血清とタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＭ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩培養した。−晩の培養期間後、試料を、１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ□／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間に亘り沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａサリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖｃＰ１１７感染細胞からＨＩＶ− １ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染またはＡＬＶＡＣ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例２４参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１５を産生することにより行なった。

次いでｇｐ１２０遺伝子をｇｐ１６０遺伝子と置換した。

これは、全ＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐ　Ｈ６ＨＭＮ　Ｅの２，６００ｂｐのＮｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１５の９．８００ｂｐのＮｒｕＩ−Ｎｏｔｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１８と称する。

前の段階において欠失したカナリアボックス側腹アームをｐＨＩＶＧＥ１８にクローニングした。これは、Ｃ３側腹アームヲ含有スル、ｐＨＩＶＧＥ１５の１．５００ｂｐのＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１８の１２．４００ｂｐのＮｏｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ２０と称する。

ｐＨＩＶＧＥ２０を、治療ウィルスとしてのＡＬｖＡＣ（ＣＰ　ｐ　ｐ）による組換え実験に用いて、ｖｃＰ１３０を産生した。

ＣＥＦ細胞単層に関してイムノプレシピテーション分析を前述したように行なって、ｖ　ＣＰ　１．３０が真正ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを決定した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からのプールした血清（ＣＡ。

エメリービル、チロンから得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ −１ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現について分析した。血清をＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞で予備吸着した。予備吸着した血清を、４℃の一晩の培養により、タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。この培養期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで正常ヒト血清とタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩培養せしめた。−晩の培養後、試料を、Ｉ×の緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ２／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）、４％のＳ　Ｄ　Ｓ、　２０％＋７）グＩＪ　−＋？クロール１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間に亘り沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａサリチル酸塩で処理した。ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖｃＰ１３０感染細胞からＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎ■タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染またはＡＬＶＡＣ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ、　Ｒ，Ｃ，ガｏ　（ＮＣＩ　−Ｎ　ＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例１６参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を産生することにより行なった。

次いでｇａｇおよびｐａｌ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４．４００ｂｐのＳｍａ　Ｉ　−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）（５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣ−：］’）およびＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）（５’　−ＴＣＧＡＧＴＴＴ−３ ’　）を、ｐＳＰＣＰ３ＬのＳｍａ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ２４と称する。

ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウィルスとして（７）ＡＬＶＡＣ（ＣＰ　ｐ　ｐ）による組換え実験に用いて、ＶＣＰ１５２を産生した。

ｖｃＰ１５２感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｅｎｖおよびｇａｇタンパク質の発現に関して上述したように行なった。疑似感染またはＡＬＶＡＣ感染細胞からは、ＨＩＶ＝１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体と成熟ｇａｇ開裂産生物は、ｖｃＰ１５２感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ、　Ｒ，Ｃ，ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例２８参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を産生ずることにより行なった。

ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウィルスとしてのｖｃＰ１２０による組換え実験に用いて、ｖｃＰ１５５を産生した。

ｖｃＰ１５５感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｅｎｖおよびｇａｇタンパク質の発現に関して上述したように行なった。疑似感染細胞からは、ＨｔＶ−を特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体と成熟ｇａｇ開裂産生物は、ＶＣＰ１５５感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例３Ｏ−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（膜内外アンカーを有するｇｐ１２０）組換え体の産生ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ、　Ｒ，Ｃ，ガロ（ＮＣＩ　−Ｎ　ＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例２８参照）最初にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を産生ずることにより行なった。

ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウィルスとしてのｖｃＰ１３８による組換え実験に用いて、ｖｃＰ１５６を産生した。

ｖｃＰ１５６感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ−１ｅｎｖおよびｇａｇタンパク質（ＣＥＦ細胞単層）の発現に関して上述したように行なった。疑似感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体と成熟開裂産生物は、ｖｃＰ１５６感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ワクシニアウィルスによるｅｎｖとの組合せまたは単体のいずれかのＨＩＶ−１ｇａｇ特異的遺伝子産生物の発現は、非感染ウィルス状粒子の産生となることが示された（ハフナー等、１９９０　、ツー等、１９９０）。この背景に関して、ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣベースの組換え体に感染した細胞もそのような粒子を産生ずるか否かを調査した。さらに、これらのＡＬＶＡＣベースの組換え体が非アビアン細胞（すなわち、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、等）を感染せしめるのに用いられた場合、ＨＩＶ−１ウィルス状粒子がいかなるポックスウィルス粒子不純物なく精製された。

ｖｃＰ１５６に感染したＶｅｒｏ細胞を用いて粒子形成を評価するために、以下の実験を行なった。約５ｐｆｕ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＶｅｒｏ細胞を感染せしめた。感染期間から２４時間後、上澄み液を収穫し、２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により浄化した。次いで上澄み液を３０．０００　ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルター（ＰＡ、ワリントン、ポリサイエンス社、セントリセル６０）を通じて遠心回転せしめた。それゆえ、小さな分子はこれらのフィルターを通過する。ＨＩＶ血清陽性個体からのプールしたヒト血清にューヨーク州、保健省、Ｄｒ、Ｊ、　コンロイから得た）を用いた標準ウェスタンプロット分析（マニアチス等、１９９０）により、フィルターで保持した物質を分析した。

ウェスタンプロット分析からの結果により、フィルターで保持された物質中の、主要コアタンパク質ｐ２４およびＨＩＶ−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０の存在が示された。

上述したサイズ除去に関して、ｐ２４は、高い構造配置（すなわち、ウィルス状粒子）にあるのでなければ、フィルターを通過する。それゆえ、これらの結果は、ｇｐ１２０エンベロープ成分を含有するＨＩＶ−１ウィルス状粒子はｖｃＰ１５６感染細胞中で産生されることを強く示唆する。

実施例３ｌ−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子のＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４゜１エピトープの発現個々のペプチドとしてのＨＩＶ−１ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４，１エピトープを発現する組換えポックスウィルスｖＰ１０６２およびｖｃＰ１４６を産生した（ホスマリン等、１９９１）。

プラスミドｐ７３１Ｔ１の構成プラスミドｐＭＰ　Ｉ　３Ｈは、ｐＵＣ８バックグラウンド中にワクシニアＩ３Ｌ早期／中間プロモーター要素（シュミットおよびスタネンベルグ、１９８８　；ホスおよびスタネンベルグ、１９８８）を含有している。テンプレートとしての、ワクシニアＨｉｎｄｌｌＩ　Ｉのサブクローン、ｐＭＰＶＣｌおよびプライマーとしての、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８３　（配列認識番号１３３）（５’−ＣＣＣＣＣＣＭＧＣＴＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣ−３’）およびＭＰＳＹＮ２８７　（配列認識番号１３４）（５’　−ＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴ’ｒＧＴ　−３’　）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりプロモーター要素を合成した。この反応からのＤＮＡをＨｉｎｄｌＩＩとＲｓａＩで切断し、プロモーター要素を過含有する０、１ｋｂの断片を精製した。補体合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３９８　（配列認識番号１３５）（５’　−ＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡ　−３’ 　）およびＭＰＳＹＮ３９９　（配列認識番号１３６）（５’　−ＧＴＴＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴ　−３’　）をアニールすることによりリンカ−領域を組み立てた。ＰＣＲ誘導プロモーター要素およびポリリンカー領域を、ＨｉｎｄｌＩＩとＰｓｔｌで切断したベクタープラスミドｐＵＣ８と連結せしめた。産生じたプラスミドｐＭＰ　Ｉ　３Ｈは、Ｈｐａ　Ｉ、Ｐｓ　ｔ　ＩＳ　Ｓａ　ｌ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲ１部位を含有するポリリンカー領域の後に、開始コドンに対して位置−１００から−６の１３Ｌプロモーター領域を含有している。ＨｐａＩによる開裂により、プロモーター中の位置−６で線状化した、プラントエシトしたＤＮＡを産生じた。

相補オリゴヌクレオチドＴｉｃ　（配列認識番号１３７）（５’　−ＴＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴｒＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＴＧＴＡＣＧＣＴＴＧＡＣＴＡＧＴＩ’ＡＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧ　 −３’　）およびＴＩＮ　（配列認識番号１３８）（５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＭＧＣＧＴＡＣＡＴＡＧＣＴｒＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＭＴＡＡＴｒＴＧＴＩＴＣＡＴＧＡＴＴＡ　−３７１を、ＨｐａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＭＰ　Ｉ３Ｈに連結し、ワクシニア１３Ｌプロモーターにより誘導したＴ１ペプチドを含有するカセットを産生じた。この連結により、プロモーターの最後の５塩基対を再構成し、Ｔ１ペプチドの完全な暗号配列を提供し、停止コドンとＢａｍＨ１部位の間にＸｈｏ１部位を産生じた。これがプラスミドｐ７３１Ｔ１である。断片の配列を、ヌクレオチド配列分析により確認した。

プラスミドｐＨ６Ｔ２の構成ワクシニアＨ６プロモーターにより誘導されたＴ２ペプチドを含有するカセットを２段階で産生じた：ＰＣＲとプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＨ６ＰＣＲ２（配列認識番号２０５）（５ｆ　−ＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧ−３’　１を用いて、５’ＨｉｎｄｌｌＩ部位を産生ずることにより、合成Ｈ６プロモーターを含有するプラスミド（パーカス等、１９８９）から、ＥｃｏＲＶ部位に通じるＨ６プロモーターを誘導した。この１２２ｂｐのＰＣＲ誘導断片’ｆ−ＨｉｎｄＩ２とＥｃｏＲＶで切断し、続いて同様に切断したｐＢＳ−８Ｋ＋　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に連結し、プラスミドｐＢＳＨ５を産生じた。ＥｃｏＲＶ部位がらＨ６プロモーターの３′末端を完成し、Ｔ２ペプチドをコードし、遺伝子の３′末端にＢａｍＨＩ部位を産生ずる相補オリゴヌクレオチド７２Ｃ（配列認識番号１３９）（５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧ？ｆＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴ’ｒＴＣＴＴＩ’ＧＴＧＧＧＡＴＣＡｊｄＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＡＧ−ＣＡＧ　−３’　）およびＴ２Ｎ　（配列認識番号１４ｏ）をアニールし、次いでＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断したｐＢＳＨ６と連結した。このプラスミドをｐＨ６Ｔ２と称し、ヌクレオチド配列分析により断片を確認した。

プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１の構成ＡｍＥＰＶ　４２にプロモーターにより誘導されたＴＨ４，１ペプチドを含有するカセットを、連続したＰＣＲ反応により産生じたニプライマー４２ＫＶＱ１　（配列認識番号１４１）および４２ＫＶＱ２　（配列認識番号１４２）を用いたＰＣＲにより、４２にプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質の遺伝子を含有するプラスミドである、プラスミドｐ４２ＫＲＡＢ　Ｉがら、５’　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　オ、Ｊ：ヒｓｍａ１部位を有する１０７ｂｐの４２にプロモーターを誘導した。このＰＣＲ誘導断片の１０７ｂｐのプロモーター領域の配列は（配列認識番号１４３）である。この断片と、テンプレートとしてのＴＨ４，ｌペプチドＴＨ４１Ｃ（配列認識番号１４４）およびＴＨ４１Ｎ（配列認識番号１４５）（５’　−ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴｒＧＴＡＣＴＡＣＴＴＣＭＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＡＴ　−３ｔ　）並びにプライマー４２ＫＴＨ４１（配列認識番号１４６）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴＡＧＣＴＣ−３’　）および４２ＫＶＱ１　（配列認識番号１４１）をコードする合成オリゴヌクレオチドとを用いた第２のＰＣＨにより、１５９ｂｐのＰＣＲ誘導断片をＴＨ４，１の暗号配列に融合した。プライマー４２ＫＴＨ４１（配列認識番号１４６）およびＢＡＭＶＱ　（配列認識番号１４９）（５’　−ＴＴＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴｒＡＡ？ｒＡＧＴｒＡＴｒＡＧＡＣ−３’　）を用いた第３のＰＣＲのために、テンプレートとして合成オリゴヌクレオチドＶＱＣ（配列認識番号１４７）およびＶＱＮ　（配列認識番号１４８）並びにこの断片を用いて、５′末端にＢａｍＨ１部位を含むように、この２１０ｂｐのＰＣＲ誘導断片を５′の方向に延長せしめた。続いてのヌクレオチド配列分析により、余分な塩基（Ａ）が４２ＫＴＨ４１の上述した配列の下線により示される位置２４の後に挿入されるという、オリゴヌクレオチド４２ＫＴＨ４１（配列認識番号１４６）の配列に誤りを示した。これは、テンプレートとして第３のＰＣＲにより誘導した２７２ｂｐの断片と、プライマーＢＡＭＶＱ　（配列認識番号１４９）および４２ＫＴＨ４１Ａ（配列認識番号１５０）（５／　−ＡＴＣＡＴＣにＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＴＭＣＴＡＧＴＣＡＴＣＴＭＴＡＧＣＴＣ−３’　）を用いた最終ＰＣＲにより修正した。最終ＰＣＲ後、このカセットは、ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩ部位３′を有する４２に−ＴＨ４，１に対してＢａｍＨＩＳＰｓ　ｔ　Ｉ、およびＳｍａ　１部位５′を含有した。この２７１ｂｐ（７）ＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐＢｓ−３Ｋ＋　（ＣＡ。

ラジョラ、ストラタジエネ）のＢａｍＨＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１を産生じた。

このプラスミドのヌクレオチド配列分析により、プロモーターの配列と暗号領域が正確であることを確認した。しかしながら、３ｂｐの欠失は、３’　ＢａｍＨＩ部位の損失となったことが分かった。

プラスミドｐＴＩＴ２ＴＨ４，１の構成これらの３つのカセットを、１３Ｌ−Ｔｌが以下のようにして他の２つの遺伝子に対して反対方向となるように、１つのプラスミドｐＴＩＴ２ＴＨ４，，１に結合せしめた＝１７０ｂｐのＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ断片をｐ７３１Ｔ１から単離し、同様に切断したｐＨ６７２に連結し、ｐＴＩＴ２を産生じた。ｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１からの２９０ｂｐのＢａｍＨＩ／５ａｃｌ断片を同様に切断したｐＴＩＴ２に連結し、ｐＴＩＴ２ＴＨ４，１を産生じた。挿入物の配列は、ヌクレオチド配列分析により確認した。

ｐｃ５ＬｓＰ　（実施例１４で定義）をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、Ｎｏｔｌで切断し自己連結後に線状精製した自己アニールオリゴヌクレオチドＣＰ２９　（配列認識番号１５１）（５’　−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−：］　’　）に連結した。この方法によりＮｏｔ１部位をｐｃ５ＬｓＰに導入し、ｐＮＣ５ＬＳＰ５を産生した。

プラスミドｐｓＤ５５０を、以下のようにしてｐＳＤ５４８から誘導した。プラスミドｐＳＤ５４８　（タータグリア等、１９９２）は、１４Ｌ、０ＲＦ（ゲーベル等、１９９０　ａ　。

ｂ）が、ＢｇｌＩＩとＳｍａ１部位からなるクローニング領域により置換されたワクシニアベクタープラスミドである。多重クローニング領域を拡大するために、ｐＳＤ５４８をＢｇｌｌｌとＳｍａ　Ｉで切断し、アニールした相補合成オリゴヌクレオチド５３９Ａ　（配列認識番号１５２）（５Ｉ− ＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴｒＡＧ’Ｉ’ｒＡＡＴＴｒＴＴＧＴ−３’）および５３９Ｂ　（配列認識番号１５３）（５ｔ− に連結した。産生じたプラスミドｐｓＤ５５０において、多重クローニング領域は、Ｂａ　１１　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉ、Ｘｈｏ、ＫｐｎｌおよびＢａｍＨＩ制限部位を含有している。

それぞれのプロモーターにより誘導させたエピトープのための遺伝子を含有するｐＴＩＴ２ＴＨ４，１からの６０２ｂｐのＸｈｏｌ断片を、それぞれのＸｈｏＩ部位で、供与体プラスミドｐＮＣ５ＬＳＰ５およびｐｓＤ５５０にクローニングした。ヌクレオチド配列分析を用いて、挿入物の配列と方向を確認した。産生じたプラスミドｐｃ５ＴＩＴ２ＴＨ４，１およびｐ１４ＴＩＴ２ＴＨ４，１を、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、それぞれ組換えウィルスｖｃＰ１４６およびｖＰ１０６２を産生した。これらの組換えウィルスは、ウィルスプラークに対して特異的なりＮＡプローブのハイブリダイゼーシヨンにより所望の遺伝子を含有することが示された。

実施例３２−ＨＩＶ−１，ｅｎｖからの膜内外アンカード組換えポックスウィルスｖＰ１０６０、ｖＰ１０６１、ｖｃＰ１５４およびｖｃＰ１４８を産生し、開裂可能リンカ−領域により、ＨＩＶ−１ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、ＴＨ４，１エピトープに対応する配列に結合したＨＩＶ−１ｅｎｖからの信号配列からなる融合ペプチドを発現した。

ｖＰ１０６０およびｖｃＰ１５４は、ＨＩＶ−１ｅｎｖの膜内外領域に対応する配列とともに融合ペプチドを発現するという点で、ｖＰ１０６１およびｖｃＰ１４８とは異なる。

両方の融合ペプチドは、ＨＩＶ−４（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）ｅｎｖの５１アミノ酸Ｎ末端部分を含み、残基１−５０　（開始ｍｅｔも加える）はラトナー等（１９８５）に基づく。この信号領域のアミノ酸配列（配列認識番号１５４）はＭ）（ＥＱＫＴＶＡＭＲＶＫＥ）ＣＹＱＨＬＷＲＷＧＷＲＷＧＴＫＬＬＧＭＬＭＸＣＳＡＴＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰである。

これに続いて、長さで５つのアミノ酸までの開裂可能リンカ−領域により、Ｔ１、Ｔ２、ＴＨ４，１エピトープ（ホスマリン等、１９９１）を、互いに信号配列から、そして存在する場合にはアンカー配列から分離する。ペプチドのこの領域のアミノ酸配列（配列認識番号１５５）は、［１３号　］−］ＰＦＲ−ＫＱエエ！１０ト嘔１−ＩＱ四ＧＫＡｊシ啜ＹＡＰＰＦ■−ＨＥＤエエ５ＬＷＤＱＳＬＫ −ＰＰＦＲ）Ｃ−ＤＲＶＩＥＶＶＱＧＡＹＰＬＡＩＲ−［ＰＰＦＲＫ−７ンｈ− ３である。アンカードメインは、ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）ｅｎｖの２８のアミノ酸膜内外領域、残基６９１−７１８である。この領域のアミノ酸配列（配列認識番号１．５６）は、ＬＦＩＭＩＶＧＧＬＶＧＬＲＩＶＦＡＶＬＳＷＮＲＶＲＱＧ−［停止］である。

融合ペプチドの両方のバージョンに関して、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）（５’　ＡＣＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧ−３’　）およびＰＣＲ３ＩＧＴＩ　（配列認識番号１５８）（５’−ＣＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴｒＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＴＧ　−３’）を用いたＰＣＲにより、プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐ（実施例２で定義）からＨ６プロモーターとＨＩＶ−１ｅｎｖ信号配列を誘導した。この３１４ｂｐのＰＣＲ誘導断片は、Ｈ６プロモーターと、信号、リンカ−１およびＴ１ペプチドの最初の６つのアミノ酸の暗号配列との後の５’Ｈｉｎｄｌ１１部位からなる。

膜内外領域のない構成物のための暗号領域の残りを、プライマーＰＣＲＴＩＴ２　（配列認識番号１６１）ＣＴＴＴＴＡＧＡＭＡＣＡＣＧＡＡＧ　−３〆）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ　（配列認識番号１６２）を用いた、オリゴヌクレオチドＴ２Ｔ４Ａ　（配列認識番号およびＴ２Ｔ４Ｂ　（配列認識番号１６０）（５’− ＧＴＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＭＡＡＧＧＡＧＧＴｒＴｒＡＭＧＡＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＡＪＩＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＴ’ｒＴＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣ−３’　）のＰＣＲ増幅により産生じた。この１７７ｂｐのＰＣＲ誘導断片は、３’Ｘｂａ１部位の後の、リンカ−領域、Ｔ２ペプチド、別のリンカ−領域、Ｔ２ペプチド、およびＴＨ４，１ペプチドをコードする。この断片を、プライマーＨ３ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番号１６２）を用いたＰＣＲにより、プロモーターと信号配列を含有する３１４ｂｐのＰＣＲ誘導断片と融合した。この４７３ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａｌでの切断後、４５５ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳ−８Ｋに連結し、挿入物の配列をヌクレオチド配列分析により確認した。

産生じたプラスミドをｐＢｓＴＩＴ２ＴＨ４，１と称した。

膜内外アンカーのバージョンの暗号領域の残りを、プライマーＰＣＲＴＩＴ２　（配列認識番号１６１）およびＰＣＲＴ４ＴＭ　（配列認識番号１６３）（５’　−ＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴｒＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＣｒＣＴＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡ’ｒＴＡＣＴＣ−３’　）を用いた、オリゴヌクレオチド、Ｔ２Ｔ４Ａ　（配列認識番号１５９）およびＴ２Ｔ４Ｂ　（配列認識番号１６０）のＰＣＲ増幅により産生じ、膜内外領域を収容する３′末端を変更した。この１９５ｂｐのＰＣＲ誘導断片を、プライマーＰＣＲＴＩＴ２　（配列認識番号１６１）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番号１６２）を用いたＰＣＲにより、アンカー、ＨＩＶＴＭＩ　（配列認識番号１０７）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号１０８）からなるオリゴヌクレオチドに融合した。この２７６ｂｐのＰＣＲ誘導断片を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ　（配列認識番号１６２）を用いたＰＣＲにより、プロモーターと信号配列を含有する３１４ｂｐのＰＣＲ誘導断片に融合した。この５７２ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄｌＩＩとＸｂａＩでの切断後、５５４ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳに連結し、挿入物の配列をヌクレオチド配列分析により確認した。産生じたプラスミドをｐＢｓＴＩＴ２ＴＨ４，ＩＡと称した。

ｐｃ５ＬｓＰ　（実施例１４で定義）をＢ　ａｍＨＩ　テ切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ３２　（配列認識番号１１２）とＣＰ３３　（配列認識番号１１３）に連結し、ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生した。ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、Ｎｏｔｌで切断して自己連結後に線状精製した、自己アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９　（配列認識番号１５１）に連結した。この方法によりＮｏｔＩ部位をｐＢＱＣ５ＬＳ　Ｐ　６１：導入し、ｐＮＶＱｃ５ＬｓＰ７を産生シタ。

両方のカセットを、挿入プラスミドｐＮｃＱｃ５ＬｓＰ７のＸｈｏｌとＸｂａＩ部位との間に個々に配した。これらのプラスミドｐｃ５ｓＴＩＴＩＴＨ４，１およびｐＣ５ＳＴＩＴ２ＴＨ４，ＩＡを用いて、それぞれカリナアボックスウイルス組換え体、ｖｃＰ１４８およびｖｃＰ１５４を産生した。ＢａｍＨＩ−８ｍａＩ断片をｐｃ５ｓＴＩＴＩＴＨ４，１およびｐｃ５ｓＴＩＴ２ＴＨ４，ＩＡから切除して、同様に切断したｐｓＤ５５０　（実施例３１で定義）に連結し、それぞれプラスミドｐ　ｌ４ＳＴＩＴ２ＴＨ４゜１およびｐＩ４ｓＴＩＴ２ＴＨ４，ＬＡを産生じた。これらのプラスミドを、治療ウィルスとしてのＮＹＶＡＣによる組換え実験に用いて、それぞれ組換え体ＶＰ１０６１およびｖＰ１０６０を産生した。これらの組換えウィルスは、ウィルスプラークに対する特異的ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示Ｃ中のＨＩＶ−１ｎｅｔ遺伝子の発現ＨＩＶ−１ｎｅ　ｆ　（ＭＮ）を発現する組換えポックスウィルスｖＰ１０８４、ｖＦＰ１０８４、およびｖｃＰ１６８を以下のように産生じたニブライ７−１３ＰＣＲ１（配列認識番号１６４）（５′−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧ　−３’）およびＰＩ　３ＮＥＦ２　（配列認識番号１６５）（５’−ＣＧＴＴｒＴＧＡＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡσ［”ｒＴＧ−３′）を用いたＰＣＲにより、プラスミドｐＭＰ１３ＨがらＩ３Ｌプロモーターを誘導した。ｎｅｆの暗号領域を、プライマーＰＩ３ＮＥＦ１　（配列認識番号１６６）（５’　−ＡＧＴＡＣＭＴＴＡＴｒＴＡＧＧＴＴＴＭＴＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＭＣＧ　−３’　）およびＰＮＥＦＢＡＭ　（配列認識番号１６７）（５’−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＭＣＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＧＧ　−３１）を用いたｐＭＮｌ、８−１０　（７７９２と９５９５での５ｓｔ１部位の間のＭＮゲノムの部分のクローン）のＰＣＲ増幅により産生じた。暗号領域とプロモーターとの融合は、プライマー１３ＰＣＲ１（配列認識番号１６４）およびＰＮＥＦＢＡＭ（配列認識番号１６７）を用いた前述のｐｃＲ産生物の増幅により行なった。この産生物のＢａｍＨＩでの切断後、０．７ｋｂの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳ−３Ｋ＋　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に連結し、プラスミドｐ　１３ＮＥＦを産生じた。配列異常か最初に観察されたのはこの時点であった。

プラスミドｐＭＮ１．８−１０　（ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄｒ。

Ｒ，Ｃ，ガロにより提供された）中の異常のために、カセットの配列は、公表された配列（ガーゴ等、１９８８、ジエンバンクアセッション番号Ｍ１７４４９）とは異なると決定された。これらの違いは、公表された配列に対して以下のように要約されている。

塩基番号　ガーゴ等　ｐＭＮｌ、　８−１０結果　カセット８８３４　Ｔ　Ｔ　サイレント　Ｃ（ａａ＝Ａｒｇ）８８６３　Ｇ　Ａ　Ｌｙｓ−＞Ａｒｇ　Ａ（ａａ＝Ｊｙｓ）８８９０　Ｔ　ＣＰｒｏ−＞Ｌｅｕ　Ｃ（ａａ＝Ｐｒｏ）９０２８　Ａ　Ｇ　Ａｒｇ−＞Ｌｙｓ　Ｇ（ａａ＝Ａｒｇ）９１２７　Ａ　Ａ　サイレント　Ｇ（ａａ＝Ｇ１ｎ）９３３０−９３３１　ＧＧ　ＧＧＧ　フレーム　ＧＧシフトカセット中の２つのサイレント突然変異（位置８８３４と９１２７）はＰＣＲにおける明白な誤りであった。コードしたタンパク質には影響がないので、そのままにしておいた。９９３０でのフレームシフトは、他のＨＩＶ−１単離体に非常に似ている読取り枠を長くすることになった。ＭＮ単離体からのｎｅｆを公表されたサイズに保持するには、このカセットは、暗号領域のトランスケート３′末端を産生ずる第４のＰＣＲを必要とした。

９９３０での余分な塩基の除去は、プライマーｌ３ＰＣＲ１（配列認識番号１６４）およびＰＮＥＦＦＩＸＩ　（配列認識番号１６８）を用いた、ｐ　Ｉ　３ＮＥＦ中の挿入物のＰＣＲ増幅により行なった。この６７８ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＢａｍＨＩでの切断後、６６０ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳに連結し、プラスミドｐＢＳ　Ｉ　３ＮＥＦを産生した。この挿入物をヌクレオチド配列分析により確認した。

ｎｅｆ遺伝子を含有するｐＢＳ　Ｉ　３ＮＥＦからの６６０ｂｐのＢａｍＨＩ断片を挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７（実施例３２に定義）のＢａｍＨＩ部位に配した。産生じたプラスミドｐＣ５■３ＮＥＦをＡＬＶＡＣ（７）Ｃ５座への組換えに用いて、組換え体ＣＰ１６８を産生じた。同一の６６０ｂｐのＢａｍＨＩ断片もまた挿入プラスミドｐＳＤ５５０　（実施例３１で定義）のＢａｍＨ１部位に配し、プラスミドｐ１４１３ＮＥＦを産生した。このプラスミドのＮＹＶＡＣによる組換えによって、組換え体ｖＰ１０８４を産生した。

ＴＲ０ＶＡＣのＦ１６座のための挿入プラスミドを以下の方法により誘導した。

７．３ｋｂのＮａｅＩ／Ｎｄｅｌ断片を、タータグリア等（１９９０）により記載された鶏痘ウィルスの１０．５ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ断片から単離して、同様に切断したｐＵＣ９に連結し、プラスミドｐＲＷ８６６を産生じた。

ｐＵＣ９をＰｖｕ　Ｉ　Ｉで切断し、ＥｃｏＲＩリンカ−をＰｖｕ１１部位の間に連結し、プラスミドｐ　ＲＷ７１５を産生じた。鶏痘配列を側腹に有するクローニング部位を、プライマーＲＷ２６４（配列認識番号１６９）ＴＭＴＣＧＴＴＭＣＴＴＡＴＴＡＧ　−３’）およびＲＷ２６７（配列認識番号１７０）（５’ 　−ＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＴＧ　−３’　）を用いた、１０．５ｋｂの断片の一部のＰＣＲ増殖により産生じた。隣接する領域もまた、プライマーＲＷ２６６（配列認識番号１７１）（５’−ＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＭＴＣＴＧＡＴＣＡＴＡＧ　−３’）およびＲＷ２６５（配列認識番号１７２）を用いたＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ誘導断片を、プライマーＲＷ２６６（配列認識番号１７１）およびＲＷ２６７（配列認識番号１７０）を用いた第３のＰＣＲにより融合した。産生したＰＣＲ誘導断片は、５’Ｅｃ。

ＲＩ部位と３’ＮｄｅＩ部位を側腹に有する鶏痘配列からなる。この断片の中央は、Ｎｏｔｌと６つの読取り枠中の翻訳停止コドンを側腹に有する、Ｓｍａ　ＩＳＢａｍＨＩ。

およびＨｉｎｄｌ　Ｉ　１部位を含有するポリクローニング領域である。早期転写終止信号（ユエンおよびモス、１９８７）は、３’ＮｏｔＩ部位に隣接している。ＥｃｏＲＩとＮｄｅｌで切断した、ＰＣＲ誘導断片を、同様に切断したｐＲＷ７１５に連結し、プラスミドｐ　ＲＷ８６４を産生じた。

ＬＩＫプロモートしたｌａｃ　Ｚ遺伝子を、部分的ＢａｍＨ１，全体のＰｓｔｌの切断により、ｐＡＭｌから切除した。この断片をフレノウポリメラーゼ、でプラントエンドし、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐ　ＲＷ８６４に連結し、ｐ　ＲＷ８６７Ａを産生した。Ｉ）ＲＷ８６７ＡからのＮｏｔｌ断片を、Ｎｏｔ１部位がＦｓｐ１部位に連結される場合に再産生されるように、ｄＮＴＰの存在下でフレノウポリメラーゼによりプラントエンドし、タータグリア等（１９９０）により記載された位１１９５５に対応する挿入が行なわれるように部分的にＦｓｐｌで切断したｐＲＷ８６６に連結した。次いで産生じたプラスミドｐ　ＲＷ８６８をＮｏｔＩで切断し、ｌａｃ　Ｚカセットを除去し、ＮｏｔＩ切断により切除したｐ　ＲＷ８６４からの６６ｂｐのポリリンカー領域に連結した。産生じたプラスミドをｐ　ＲＷ６７３と称した。８１ｂｐのＳｍａ　Ｉ断片をｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１（実施例３１で定義）から誘導し、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐ　ＲＷ８７３に挿入し、プラスミドｐＶＱ８７３を産生じた。

ＴＲ０ＶＡＣのＦ１６座ヘノ組換え後のｐｖＱ８７３への挿入のために、６８４ＭのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片として、ｐＢｓＩ３ＮＥＦからｎｅｆカセットを切除し、ｖＦＰ１７４を産生した。

実施例３４−ＮＹＶＡＣ中ノＨＩ　Ｖ−２遺伝子ノ発現ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｇａｇ／ｐｏｔ組換え体の産生２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラスミドｐ　Ｉ　Ｓ　５ＹＥＧＰを、Ｄｒ、　Ｇ、　７ランチー二（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏＬ遺伝子を、１３Ｌプロモーターの下流と、ワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐ　Ｉ　５ＳＹＥＧＰの４，４００ｂｐのＢｓ　ｔＵＩ−Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ断片、および１３Ｌプロモーターを含有するオリゴヌクレオチド、５ＩＶＬＩ　（配列認識番号６９）およびＨＩＶ２Ｌ１　（配列認識番号１７（５Ｉ− ＣＧＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴｒＧＴＡＣＴＴｒＧＴＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴｒＣＡＣＴＴＴＡＴＣＴＣＡＣ−３’　）を、ｐＳＤ５４２　（実施例１５で定義）の４．０７０ｂｐのＸｈｏｌ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２１と称する。

次いで外因性の３′非暗号配列を除去した。これは、ｐｏ１遺伝子の３′を含有する、２８０ｂｐのＢｃｌＩ−８ｍａｌ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶ２１の８，１００ｂｐのＢｅ　Ｉ　Ｉ−Ｓｍａ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩｖ２Ｐ２（配列認識番号１７４）（５Ｆ　−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＡ’！ＴＧＣＡＴ−３’　）およびＨＩＶ２Ｐ３　（配列認識番号↓７５）（５１−ＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＴＩ’ｒＣＴＣＣＡＴ−３＃　）により、プラスミドｐ　Ｉ　５ＳＹＥＧＰから産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２２と称する。

ｐＨＩＶ２２を、治療ウィルスとして（７）ＮＹＶＡＣ（ｖＰ　８６６）による組換え実験に用いて、ｖＰ１０４５を産生した。

イムノプレシビテーション分析を行なって、ｖＰ１０４５が真正ＨＩＶ２　ｇａｇ遺伝子産生物を発現するか否かを決定した。

感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ２血清陽性個体からのプールした血清（Ｄｒ、Ｇ、フランチｍ＝（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、ＨＩＶ２　ｇａｇ発現に関して、分析した。血清を、ｖＰ８６６感染Ｖｅｒｏ細胞で予備吸着せしめた。予備吸着した血清を、４℃の一晩の培養によりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。この培養期間後、物質を１×の緩衝液Ａで４回洗浄した。正常ヒト血清およびタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ２血清陽性ヒト血清により４℃で一晩、培養した。−晩の培養期間後、試料を、■×の緩衝液Ａで４回、ＬｉＣ１：＋／尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、２Ｘのラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａサリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ１０４５感染細胞から、ＨＩＶ２　ｇａｇ前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂開裂タンパク生産生物異的に沈殿せしめたが、疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染細胞からは、ＨＩＶ２特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、プラスミドｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ、Ｇ、フランチー：（ＮＣ１−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を１３Ｌプロモーターの下流およびワタシニアウイルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例３４参照）、最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を産生ずることにより行なった。

ｐＨＩＶ２２を、治療ウィルスとしてのｖＰ９２０による組換え実験に用いて、ｖＰ１０４７を産生した。

ｖＰ１０４７感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＨＩＶ２　ｇａｇタンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２特異的特異全種沈殿しなかった。しかしながら、ＨＩＶ２　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂可能産生物は、ｖＰ１０４７感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、プラスミドｐ　Ｉ　５ＳＹＥＧＰをＤｒ、Ｇ、　７ランチー＝（ＮＣ１−Ｎ　Ｉ　Ｈ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を１３Ｌプロモーターの下流およびワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例３４参照）、最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を産生ずることにより行なった。

ｐＨＩＶ２２を、治療ウィルスとしてのｖＰ９２２による組換え実験に用いて、ｖＰ１０４４を産生した。

ｖＰ１０４４感染細胞のイムノプレシビテーション実験を、ＨＩＶ２　ｇａｇタンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２特異的特異全種沈殿しなかった。しかしながら、ＨＩＶ２　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂可能産生物は、ｖＰ１０４４感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例３７−ＡＬＶＡＣ中のＨＩｖ２遺伝子の発現ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ　（ｇｐ１６０）組換え体の産生プラスミド、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４で定義）は、Ｈ６プロモートしたＨＩＶ２　ｅｎｖ　（ｇｐ１６０）遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶの２゜７００ｂｐのＸｈｏ　ｌ−８ａｃ　Ｉ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ４　（配列認識番号１７６）（５＃　−ＧＧＴＴＧ−３’　）およびＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号１７７）（５’　−ｎ＝ＣＪＡＣＣＧＣ− ３’　）を、ｐＣ６Ｌ　（実施例５０で定義）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、■３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４．４５０ｂｐのＸｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３■）およびＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７，０ＯＯｂｐのＸｍａｌ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。

ｐ　ＨＩ　Ｖ　２５を、治療ウィルスとして（７）ＡＬＶＡＣＣＣＰｐｐ）による組換え実験に用いて、ｖＣＰＬ５３を産生した。ＣＥＦ細胞単層に関してであるが、前述したようにイムノプレシピテーション分析を行なって、ｖｃＰ１５３が真正ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現るか否かを決定した。

感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ２血清陽性個体からのプールした血清（Ｄｒ、Ｇ、フランチｍ＝（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いてＨＩＶ２　ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞で予備吸着した。予備吸着した血清を、４℃で一晩の培養により、タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。

この培養期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。正常ヒト血清およびタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩ■２ＩＭ陽性ヒト血清により４℃で一晩、培養した。−晩の培養期間後、試料を、Ｉ×の緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ２／尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａサリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖｃＰ１５３感染細胞から、ＨＩＶ２　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂開裂タンパク生産生物異的に沈殿せしめたが、疑似感染またはＡＬＶＡＣ感染細胞からは、ＨＩＶ２特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

実施例３８−ＮＹＶＡＣにおけるＳＩＶ遺伝子の発現ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｅｎｖ　（ｇｐ１２０−ｇｐ２８）およびｇａｇ　（プロテアーゼ−）組換え体の産生イムノプレシピテーション分析を行なって、ｖＰ９４８（実施例５で定義）が真正ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質を発現するか否かを決定した。

感染細胞からの溶解産物を、ＳＩｖ血清陽性マカクからのプールした血清（Ｄｒ、Ｇ、フランチｍ＝（ＭＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いてＳＩＶ　ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をＮＬＶＡＣ（ｖＰ８６６）感染Ｖｅｒｏ細胞で予備吸着した。予備吸着した血清を、４℃で一晩の培養により、タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。この培養期間後、物質をＩ×緩衝液Ａで４回洗浄した。正常マカク血清およびタンパク質Ａセファロースで予備浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＳＩＶ血清陽性マカク−血清により４℃で一晩、培養した。−晩の培養期間後、試料を、１×の緩衝液Ａで４回、１ｉｃ１．／尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス等、１９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａサリチル酸塩で処理した。

ＳＩＶ血清陽性個体からのマカク血清は、ＶＰ９４８感染細胞から、ＳＩＶｇａｇ前駆体タン前駆体タンパクンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞からは、ＳＩＶ特異特異的タンパ音質殿せしめなかった。

Ｓ　Ｉ　ＶＭＡＣＩ４２を含有する、プラスミドｐｓＩＶＧＡＧｓＳ１１ＧをＤｒ、Ｇ、フランチ−＝（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐａｌ遺伝子を１３Ｌプロモーターの下流およびワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、前述したように（実施例５参照）、最初にプラスミドｐｓＩＶ５を産生ずることにより行なった。

ｐＳＩＶ５を、治療ウィルスとして（７）ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）による組換え実験に用いて、ｖＰ１０４２を産生した。

ＶＰ１０４２感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からはＳＩＶ特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂可能産生物は、ｖＰ１０４２感染細胞の溶解産物がら沈殿した。

実施例４Ｏ−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇａｇ／ｐｏｔおよびｅｎｖ　（ｇｐ１２０　ｇｐ４１）組換え体の産生ｐｓＩＶＧ５（実施例５）を、治療ウィルスとしてのＶＰ１０５０による組換え実験に用いて、ｖＰ１０７１を産生した。

ｖＰ１０７１感染細胞のイムノプレシピテーション実験は、ＳＩＶ遺伝子の発現を示す。

実施例４ｌ−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１２０ −ｇｐ２８）組換え体のｐｓＩＶＧ５（実施例５）を、治療ウィルスとしてのＶＰ８７４による組換え実験に用いて、ｖＰ９４３を産生じた。

ｖＰ９４３感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染Ｖｅｒｏ細胞からはＳＩＶ特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク貫挿、並びに様々な中間体および成熟ｇａｇ開裂可能産生物は、ｖＰ９４３感染細胞の溶解産物から沈殿した。

ｖＰ９４２　（実施例５）感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染Ｖｅｒｏ細胞からはＳＩＶ特異的種は全く沈殿しなかった。

しかしながら、ｐ１６およびｐ２８に対応するタンパク貫挿は、ｖＰ９４２感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例４３−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｐ１６、ｐ２８およびｅｎｖ　（ｇｐ１２０　ｇｐ２８）組換え体の産生ｖＰ９５２　（実施例５）感染細胞のイムノプレシピテーンヨン実験を、ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染Ｖｅｒｏ細胞からはＳＩＶ特異的種は全く沈殿しなかった。

しかしながら、ｐ１６およびｐ２８に対応するタンパク貫挿は、ｖＰ９５２感染細胞の溶解産物から沈殿した。

プラスミド、ｐＳ　Ｉ　ＶＥＭＶＣは、Ｈ６プロモートしたＳ　Ｉ　Ｖ、Ａｈｔ：ｘ＝エンベロープ遺伝子（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択トランスケートバージョン）を含有している。未熟終止コドンを含有するエンベロープ遺伝子の領域をｐＢＳＫ十にクローニンクシタ。コレハ、ｐｓＩＶＥＭＶｃの１，１２０ｂｐのＣ１ａｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐ　Ｂ　Ｓ　Ｋ十のＣ１ａ１−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶｌｏと称する。

次いで上流の終止コドン、ＴＡＧを元のＣＡＧコドンに変更した。これは、オリゴヌクレオチド５ＩＶＬ２０　（配列認識番号１７８）（５を− ＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧＴＡＴＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴｒＣＴＣＴ’ｌ’ＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＭＣＡＧ−３１）および５ＩＶＬ２１　（配列認識番号１７９）（５′− ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＣＧＴＡＴＣＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡｋＴｋｋＧｋＧＧＧＴＧＧＧ　ＣＡＡＧＡＣｋｋＣＡＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴＴＭＣＴＴＡＧ−：ｌ／）をｐｓＩＶＩＱの４．ｏｏｏｂｐのＮｈ−ｅｌ−ＰｐｕＭＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作ににより産生じたプラスミドをｐｓＩＶｌｌと称する。

次いで修飾コドンを含有する領域をｐｓＩＶＥＭＶｃにクローニングして戻した。これは、修飾コドンを含有する、ｐｓｌＶｌｌの３８０ｂｐのＢｇｌｌＩ−Ｎｈｅｌ断片を、ｐｓＩＶＥＭＶｃの５，６００ｂｐの部分的ＢｇｌＩＩ−Ｎｈｅｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＳＩＶ１２と称する。

ｐＳＩＶ１２を、治療ウィルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）ｌ＝よるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いて、ｖＰ１０５０を産生した。

ｖＰ１０５０感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように行なった。疑似感染またはＮＹＶＡＣ感染Ｖｅｒｏ細胞からはＳＩＶ特異的種は全く沈殿しなかった。しかしながら、ｅｎｖに対応するタンパク貫挿は、ｖＰ１０５０感染細胞の溶解産物から沈殿した。

実施例４５−ＡＬＶＡＣ中のＳＩＶ遺伝子の発現ＡＬＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇａｇ／ｐｏｔ組換え体の産生Ｓ　Ｉ　ＶＭＡＣｌ、ｌ：！　ＣＤ　Ｎ　Ａ配列を含有する、プラスミドｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧをＤｒ、Ｇ、フランチ−＝（ＮＧＩ− ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウィルス側腹アームの間にクローニングした。

これは、前述したように（実施例５参照）、最初にプラスミドｐＳＩＶＧ５を産生ずることにより行なった。

次いてｇａｇ／ｐａｌ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐｓＩＶＧ５の４゜５００ｂｐのＳｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片を、ｐＣ５Ｌ　（実施例１０で定義）のＳｍａ　Ｉ　−Ｎｏ　ｔ　１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶＧｃ１３と称する。

ｐｓＩＶＧｃ１３を、治療ウィルスとして（７）ＡＬＶＡＣ（ＣＰ　ｐ　ｐ）による組換え実験に用いて、ｖｃＰ１７２を産生した。

ｖｃＰ１７２感染細胞のイムノプレシビテーション実験は、ＳＩＶ遺伝子の発現を示した。

シミアン免疫不全ウィルス（Ｓ　Ｉ　ＶＭＡＣ＋４□）ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐｓＩＶＧＡＧｓ３１１Ｇはジエノベファ　フランチｍ＝（ＮＣＩ　−Ｎ　Ｉ　Ｈ）から得た。

このプラスミドからのｇａｇ／ｐａｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウィルス側腹アームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ／ｐａｌ遺伝子を含有するｐｓＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧの４，８００ｂｐのＣｆ。

１−Ｔａｇｌ断片、およびワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターをコードする、オリゴヌクレオチド、５ＩｖＬ１（配列認識番号６９）および５ＩＶＬ２（配列認識番号７０）を、ｐＳＤ５４２ＶＣＶＱの４，０７０ｂｐのＸｈ。

Ｉ−ＡｃｃＩ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶＧｌと称する。

次いで外因性の３′非暗号配列を除去した。これは、ｐｏ１遺伝子の３′末端を含有する、１．ｏｏｏｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｐａｌ　ＰＣＲ断片を、ｐｓＩＶＧｌの７，４００ｂｐの部分的ＢａｍＨＩ−Ｈｐａｌ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、５ＩｖＰ５（配列認識番号７１）および５ＩＶＰ６　（配列認識番号７２）により、プラスミドｐＳ■ＶＧＡＧＳＳＩＩＧから産生じた。）この操作により産生じたプラスミドをｐＳＩＶＧ４と称する。

配列分析により、ｐｓＩＶＧ４にはｐｏｌ遺伝子内に１つの塩基対の欠失があることが分かった。このエラーを修正するために、ｐＳ　ＩＶＧｌの２．３２０ｂｐ（７）Ｂｇ　ｌ　ｌｌ−３ｔｕＩ断片を、ｐｓＩＶＧ４の６．１００ｂｐの部分的Ｂｇｌｌｌ−８ｔｕｌ断片にクローニングした。この操作によにり産生したプラスミドをｐ、５ＩＶＧ５と称する。

次いでｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、■３Ｌプロモートしたｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐ　Ｓ　Ｉ　ＶＧ５の４゜５ｏｏｂｐのＳｍａＩ−Ｎｏｔｌ断片を、ｐＣ５ＬのＳｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶＧｃ１３と称する。

次いてＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子をｐｓＩＶＧｃ１３にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたＳＩＶ　ｅｎＶ遺伝子を含有する、ｐｓＩＶ１２のＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片）充填２，７５０ｂｐの部分的Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片を、ｐｓＩＶＧｃ１３のＳｍａ　Ｉ部位にクローニングした。この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶＧｃ１４と称する。

ｐｓＩＶＧｃ１４を、治療ウィルスとしてのＡＬｖＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

プラスミドｐ　Ｓ　Ｉ　ＶＥＮＶＣは、Ｈ６プロモートしたシミアン免疫不全ウィルスエンベロープ遺伝子（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択トランスケートバージョン）を含有している。

未熟終止コドンを含有するエンベロープ遺伝子の領域をｐＢＳＫ十にクローニングした。これは、ｐ　Ｓ　Ｉ　ＶＥＭＶＣの１，１２０ｂｐのＣｌ　ａ　Ｉ−ＢａｒｎＨＩ断片をｐＢＳＫ＋のＣ１ａｌ−ＢａｍＨ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＩＯと称する。

次いで上流の終止コドン、ＴＡＧを、元のＣＡＧコドンに変更した。これは、オリゴヌクレオチド、５ＩＶＬ２０（配列認識番号１７８）および５ＩＶＬ２１（配列認識番号１７９）をｐｓＩＶｌｏの４．ｏｏｏｂｐのＮｈｅＩ−Ｐ　ｐ　ｕ　Ｍ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶｌｌと称する。

次いで修飾コドンを含有する領域を、ｐ　Ｓ　Ｉ　ＶＥＭＶＣにクローニングして戻した。これは、ｐｓＩＶｌｌの３８０ｂｐ（７）Ｂｇ　１１　Ｉ−Ｎｈｅ　Ｉ断片をｐＳ　ＩＶＥＭＶＣ（７）５．６００ｂｐの部分的Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ− Ｎｈｅ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶ１２と称する。

ｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子を含有する、２，７００ｂｐのＮｒｕＩ−Ａｓｐ７１８断片を、ｐＮＶＱＨ６ｃ５ｓＬＰ１８の７，４００ｂｐのＮｒｕｌ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＳＩＶＧＣ１５と称する。

ｐｓＩＶＧｃ１５を、治療ウィルスとしてのＡＬｖＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

実施例４７−ＡＬＶＡＣ中のＨＩＶＩ遺伝子の産生ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶＩ　ｇａｇ（＋ｐｒｏ）（ＩＩＩＢ）およびｇｐ１２０　（＋膜内外）（ＭＮ）組換え体の産生１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶＩ）ｃＤＮＡ配列（ＩＩＩＢ）を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ＣをＤｒ。

Ｒ，Ｃ，ガｏ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐのＢｇｌｌＩ断片をｐｓＤ５４２ＶｃＶＱの４．０７５ｂｐのＢｇｌｌＩ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称する。

ｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＨＩＶＧ２にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する、２８０ｂｐ（ＤＡｐｎｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ２の５，６２０ＭのＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ５　（配列認識番号１１６）およびＨＩＶＰ６　（配列認識番号１１７）により、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。）この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称する。

次いで１３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７（配列認識番号１１８）およびＨＩＶＬ１８　（配列認識番号１１９）を、ｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐの部分的ＢｇｌＩＩ−Ｃ１ａｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。

次いでｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分を除去する。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１９　（配列認識番号１２０）およびＨＩＶＬ２０（配列認識番号１２１）を、ｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐの部分的Ｐｖｕｌ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＨＩＶＧ５と称する。

次いでｇａｇ遺伝子の残り、並びにｐｏｔ遺伝子をｐ１７「遺伝子」の下流にクローニングした。これは、はとんどのｇａｇ遺伝子と全てのｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの４．９９５ｂｐのＣ１ａＩ−３ａｌＩ断片を、ｐＨＩＶＧ５の４，１５０ｂｐのＣ１ａｌ−３ａｌｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ６と称する。

次いで外因性３′非暗号配列を除去した。これは、ｐ。

１遺伝子の３′末端を含有する、３６０ｂｐのＡｆｌｌｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ６の８．０３０ｂｐのＡｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ７　（配列認識番号１２２）およびＨＩＶＰ８（配列認識番号１２３）により、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。）この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ７と称する。

次いで１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリアボックス挿入ベクター中に挿入した。これは、１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４．３６０ｂｐの部分的Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬのＢａｍＨ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４と称する。

次いでＨ６プロモートしたＨＩＶＩ　ｇｐ１２０　（生膜内外）遺伝子をｐＨ１ＶＧＥ１４にクローニングした。これは、ｇｐ１２０　（＋膜内外）遺伝子を含有する、ｐＣ５ＨＩＶＭＮｉ２０Ｔの１．７００ｂｐのＮｒｕＩ−８ｍａ■断片を、ｐＨＩＶＧＥ１４の１１．４００ｂｐのＮｒｕｌ−８ｍａ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。

産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４Ｔと称する。

次いでほとんどのｐｏｌ遺伝子を除去した。これは、ＨＩ　Ｖ　１プロテアーゼ「遺伝子」の３′末端を含有する、５４０ｂｐのＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１４Ｔの１０．０ＯＯｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨｒ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、Ｈｌ、ＶＦ６（配列認識番号１１６）およびＨＩＶＰ３７（配列ＪＪａｆｆｉ号１８０）（５’−人ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＡＡＡＴＩ’ｒＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣ−３′）により、プラスミドｐＨＩＶＧ７から産生じた。）この操作によりほとんどのｐｏｌ遺伝子は除去するが、プロテアーゼ「遺伝子」は無傷のままにする。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ３２と称する。

ｐＨＩＶ３２を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

実施例４８−ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ１遺伝子ノ産生ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶＩ　ｇａｇ　（＋ｐｒｏ）１形ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶｌ）ｃＤＮＡ配列（ＩＩＩＢ）を含有するプラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ。

Ｒ，Ｃ，ガｏ　（ＮＣＩ　−Ｎ　ＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ側腹アームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子ノ５′末端ヲ含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐのＢｇｌｌｌ断片を、ｐｓＤ５４２ＶｃＶＱの４．０７５ｂｐのＢｇｌ（Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称する。

次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＨＩＶＧ２にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する、２８０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ２の５．２６０ｂｐのＡｐａｌ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ５　（配列認識番号１１６）およびＨＩＶＰ６　（配列認識番号１１７）により、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。）この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称する。

次いで１３Ｌプロモーターを、ｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７　（配列認識番号１１８）およびＨＩＶＬ１８　（配列認識番号１１９）を、ｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐの部分的Ｂｇｌ　Ｉ　ｌ−Ｃ１ａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。

次いでｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１９　（配列認識番号１２０）およびＨＩｖＬ２０（配列認識番号１２１）を、ｐＨＩＶＧ４の４．４５０ｂｐの部分的Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　ＶＧ５と称する。

次いでｇａｇ遺伝子の残り、並びにｐｏｌ遺伝子を、ｐ１７「遺伝子」の下流にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子のほとんどおよびｐｏｌ遺伝子の全てを含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの４．９５５ｂｐのＣａ１ｌ−ＳａｌＩ断片を、ｐＨＩＶＧ５の４．１５０ｂｐのＣ１ａＩ−８ａｌＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ６と称する。

次いで外因性３′非暗号配列を除去した。これは、ｐ。

１遺伝子の３′末端を含有する、３６０ｂｐのＡｆｌｌＩ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ６の８．０３０ｂｐのＡｆ　ｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ７　（配列認識番号１２２）およびＨＩＶＰ８（配列認識番号１２３）によりプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。）この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ７と称する。

次いで１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリアボックス挿入ベクターに挿入した。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４．３６０ｂｐの部分的Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＶＱ８６ＣＰ３ＬのＢａｍＨ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４と称する。

次いでＨ６プロモートしたＨＩＶＩエンベロープ「ｇｐ１２０」遺伝子（ＭＮ）をｐＨＩＶＧＥ１４に挿入した。

これは、Ｈ６プロモートしたエンベロープｒｇｐ１２０Ｊ遺伝子を含有する、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０（７）１．６００ｂｐのＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２９　（配列認識番号１２９）およびＨＩＶＬ３０（配列認識番号１３０）を、ｐＨＩ　ＶＧＥ　１４（７）１１゜５００ｂｐのＮｒｕＩ−Ｘｈｏｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１５と称する。

次いでＨ６プロモートしたＨＩＶＩエンベロープ「ｇｐ１２０」遺伝子（ＭＮ）および１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｔ遺伝子（ＩＩＩＢ）を、ワクシニアウィルス挿入ベクターに挿入した。これは、Ｈ６プロモートしたＨＩｖ１エンベロー’ニア”　ｒ　ｇ　Ｉ）　１２０Ｊ　遺伝子（ＭＮ）　オにび１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子（ＩＩＩＢ）を含有する、ｐＨＩＶＧＥ１５の６，４００ｂｐ（７）Ｎｏ　ｔ　Ｉ−Ｂ　ａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ５４２　（実施例１５で定義）の４．０００ｂｐのＮ′ｏ　ｔ　Ｉ−Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１６と称する。

次いでｒｇ　Ｉ）　Ｌ　２０Ｊ遺伝子をｒｇｐ１６０Ｊ遺伝子により置換した。

これは、全ＨＩＶＩエンベロープ遺伝子（ＭＮ）を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥ　（実施例１０で定義）の２，６００ｂｐのＮｒｕｌ−Ｎｏｔ−Ｉ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１６の８，０００ｂｐの部分的Ｎｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１９と称する。

次いでｇｐ４１をコードするｅｎｖ遺伝子の部分を、ｅｎｖ膜内外領域により置換した。これは、Ｈ６プロモートしたｇｐ１２０　（＋膜内外）遺伝子を含有する、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０Ｔの１，７００ｂｌ）のＮｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１９の８，５００ｂｐの部分的ＮｒｕＩ−Ｎｏｔｌ断片にクローニングすることにより行なった。産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１９Ｔと称する。

次いでほとんどのｐｏｌ遺伝子を除去した。これは、ＨＩＶＩプロテアーゼ「遺伝子」の３′末端を含有する、５４０ｂｐのＡｐａＩ−３ｍａｌ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１９Ｔの７，０００ｂｐのＡｐａｌ−８ｍａｌ断片にクローニングすることにより行なった。（このＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド、Ｈ［’ Ｐ５（配列認識番号１１６）およびＨＩＶＰ３７　（配列認識番号１８０）により、プラスミドｐＨＩＶＧ７から産生じた。）この操作によりほとんどのｐｏｌ遺伝子を除去するが、プロテアーゼ「遺伝子」を無傷のままにする。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ３３と称する。

ｐＨＩ　Ｖ３３を、治療ウィルスとしてのＮＹＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

プラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４で定義）は、Ｈ６プロモートした２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｅｎｖ遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶの２．７００ｂｐのＸｈｏＩ−５ａｃＩＩ断片およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４　（配列認識番号１７６）およびＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号１７７）を、ｐＣ６Ｌ　（実施例５０で定義）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ２３と称スル。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、■３ＬプロモートしたＨｌ、Ｖ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４．４５０ｂｐのＸｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）およびＨ１Ｖ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７．０００ｂｐのＸｍａｌ−Ｘｈｏｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。

次いでｅｎｖ遺伝子を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ８　（配列認識番号１８１）（５’　−ＣＧＡＴＡＡＡＣＣＧＣ−３’　）およびＨＩＶ２Ｌ９　（配列認識番号１８２）（５Ｉ−ＧＧＴＴＴＡＴ−３！＞を、ｐＨＩＶ２５の８．８００ｂｐの部分的Ｃ１ａｌ−８ｓｔｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２７と称する。

ｐＨＩ　Ｖ２７を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いてｖｃＰ１９０を産プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４で定義）は、Ｈ６プロモートした２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｅｎｖ遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、ｐＢＡＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶの２．７００ｂｐのＸｈｏＩ−５ａｃＩＩ断片およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４　（配列認識番号１７６）およびＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号１７７）を、ｐＣ６Ｌ　（実施例５０で定義）のＸｉ＞ｏｆ−ＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐａｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、１３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４，４５０ｂｐのＸｍ、ａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）およびＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７，０００ｂｐのＸｍａ　Ｉ− Ｘｈｏ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。

次いでｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ１０　（配列認識番号１８（５’−ＧＧＧＡＡＡＧ−３’）およびＨＩＶ２Ｌ１１　（配列認識番号１８４）（５’　−ＧＡＴＣＣＴＴｒＣＣＣ−３’　）を、ｐＨＩＶ２５の７，０００ｂｐの部分的ＢａｍＨＩ−３ｍａ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２８と称する。

ｐＨＩＶ２８を、治療ウィルスとしてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いてｖｃＰ１８８ｅ産生した。

ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｇｐ１２０組換え体の産生プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶは、Ｈ６プロモートした２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｅｎｖ遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクロー　＝　：／　りり、　タ。コレハ、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４て定義）の２，７００ｂｐのＸｈｏ　ｌ −３ａｃ　Ｉ　１断片およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４　（配列認識番号１７６）およびＨＩＶ２Ｌ５　Ｃ配列認識番号１７７）を、ｐＣ６ＬのＸｈｏ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、１３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４，４５０ｂｐのＸｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）およびＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７，０００ｂｐのＸｍａ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。

次いでｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ１０　（配列認識番号１８３）およびＨＩＶ２Ｌ１１　（配列認識番号１８４）を、ｐＨＩＶ２５の７．０００ｂｐの部分的ＢａｍＨＩ−８ｍａ■断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２８と称する。

次いでｇｐ４１をコードするｅｎｖ遺伝子の部分を除去した。これは、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端を含有する、ｐＢｓＨＩＶ２１２ＱＢの３６０ｂｐのＰｓｔｌ−ＸｂａＩ断片、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１２　（配列認識番号１８５）（５′−ＣＴＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣ−３　′）およびＨＩＶ２Ｌ１３　（配列認識番号１８６）（ｓ　ｔ−ａａＴＴＴＴ−３ｔ　）を、ｐＨＩＶ２８の５，６００ｂｐのＰｓｔｌ−３ｓｔＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２９と称する。

ｐ−ＨＩＶ２９を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

プラスミ）’ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４で定義）は、Ｈ６プロモートした２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｅｎｖ遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶの２，７００ｂｐのＸｈｏＩ−３ａｃ　Ｉ　Ｉ断片およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４　（配列認識番号１７６）およびＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号１７７）を、ｐＣ６Ｌ　（実施例５で定義）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、Ｉ３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｔ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４．４５０ｂｐのＸｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）およびＨＩｖ２Ｌ７（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７，０００ｂｐのＸｍａ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。

次いでｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ１０　（、配列認識番号１８３）およびＨＩＶ２Ｌ１１　（配列認識番号１８４）を、ｐＨＩＶ２５の７．ｏｏｏｂｐの部分的Ｂ　ａｍＨＩ−８ｍａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２８と称する。

次いでｇｐ４１をコードするｅｎｖ遺伝子の部分を除去した。これは、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端を含有する、ｐＢｓＨＩＶ２１２ＯＢの３６０ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１２　（配列認識番号１８５）およびＨＩＶ２Ｌ１３　（配列認識番号１８６）を、ｐＨＩＶ２８の５．６００ｂｐのＰｓｔｌ−８ｓｔｌｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２９と称する。

次いでｇｌ）１２０遺伝子をｐＨＩ　Ｖ２５にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２９の１．５５０ｂｐのＮｒｕｌ−３ａｃｌＩ断片を、ｐＨＩ　Ｖ２５の９，０００ｂｐのＮｒｕＩ−８ａｃＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ３０と称する。

ｐＨＩＶ３０を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｐ１２０（＋膜内外）組換え体の産生プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４で定義）は、Ｈ６プロモートした２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｅｎｖ遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶの２．７００ｂｐのＸｈｏ　ｌ−３ａｃＩ　Ｉ断片およびオリゴヌクレオチド、ＨＩｖ２Ｌ４（配列認識番号１７６）およびＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号１７７）を、ｐＣ６Ｌ　Ｃ実施例５で定義）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、■３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４．４５０ｂｐのＸｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）およびＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７．０００ｂｐのＸｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ２５と称する。

次いでｇａｇおよびｐｏｔ遺伝子を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ１０　（配列認識番号１８３）およびＨＩｖ２Ｌ１１（配列認識番号１８４）を、ｐＨＩＶ２５の７．ｏｏｏｂｐの部分的Ｂ　ａｍＨＩ−Ｓｍａｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ２８と称する。

次いでｇｐ４１をコードするｅｎｖ遺伝子の部分を除去した。これは、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端を含有する、ｐＢｓＨＩＶ２１２ＯＢの３６０ｂｐのＰｓｔｌ−Ｘｂａ■断片、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１２　（配列認識番号１８５）およびＨＩＶ２Ｌ１３　（配列認識番号１８６）を、ｐＨＩＶ２８の５，６００ｂｐのＰｓｔｌ−３ｓｔＩ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨｉ　ｖ２　ｇと称する。

次いでＨＩＶＩ　ｅｎｖ膜内外領域をｇｐ１２０遺伝子の末端にクローニングした。これは、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端およびｅｎｖ膜内外領域を含有する、ｐＨＩＶ３１の５００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＨＩＶ２９の５゜６００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片にクローニングすることにより行ナツタ。（ｐＨＩＶ３１は、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端およびｅｎｖ膜内外領域を含有する、５００ｂｐのＰｓｔｌ−ＸｂａＩ　ＰＣＲ断片をｐＩＢＩ２５のＰｓｔＩ−Ｘｂａｌ断片にクローニングすることにより誘導した。）このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｐ１４（配列認識番号１８７）（ｓ　′−ＣＡＧＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＡＴＧＴ−３′）およびＨＩＶＴＭ３（配列認識番号１０９）により、ｐｃＲ断片、ＰＣＲＴＭＩ、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭＩ　（配列認識番号１０７）とＨＩＶＴＭ２（配列認識番号１０８）から産生じた。Ｐ　ＣＲＴＭ　１は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｐ１４　（配列認識番号１８７）およびＨＩＶ２Ｐ１５　（配列認識番号１８８）（５’　−ＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＴＣＴｒＡＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣ−３ｚ　）により、プラスミドｐＨＩＶ２８から産生した。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ３４と称する。

ｐＨＩＶ３４を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｇａｇ／ｐｏｌおよびｇｐ１２０（生膜内外）組換え体の産生プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶ　（実施例４で定義）は、Ｈ６プロモートした２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｅｎｖ遺伝子を含有している。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリアボックス側腹アームの間にクローニングした。これは、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶの２，７００ｂｐのＸｈｏＩ−８ａｃｌＩ断片およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４　（配列認識番号１７６）およびＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号１７７）を、ｐＣ６Ｌ　（実施例５で定義）のＸｈｏｌ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、Ｉ３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４．４５０ｂｐのＸｍａ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号１３１）およびＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号１３２）を、ｐＨＩＶ２３の７．０００ｂｐのＸｍａｌ、−Ｘｈｏｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。

次いでｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ１０　（配列認識番号１８３）およびＨＩＶ２Ｌ１１　（配列認識番号１８４）を、ｐＨＩＶ２５の７，０００ｂｐの部分的Ｂ　ａｍＨＩ　−３ｍａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２８と称する。

次いでｇｐ４１をコードするｅｎｖ遺伝子の部分を除去した。これは、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端を含有する、ｐＢｓＨＩＶ２１２０Ｂの３６０ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１２　（配列認識番号１８５）およびＨＩＶ２Ｌ１３　（配列認識番号１８６）を、ｐＨＩＶ２８の５．６００ｂｐのＰｓｔＩ−３ｓｔｌ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２９と称する。

次いでＨＩＶＩ　ｅｎｖ膜内外領域をｇｐ１２０遺伝子の末端にクローニングした。これは、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端およびｅｎｖ膜内外領域を含有する、ｐｉ−ｉ　Ｉ　Ｖ３１の５ｏｏｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＨＩＶ２９の５゜６００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片にクローニングすることにより行なった。（ｐＨＩＶ３１は、ｇｐ１２０遺伝子の３′末端およびｅｎｖ膜内外領域を含有する、５００ｂｐのＰｓｔｌ−Ｘｂａｌ　ＰＣＲ断片をｐｌＢＩ２５のＰｓｔＩ−Ｘｂａｌ断片にクローニングすることにより誘導した。）このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｐ１４（配列認識番号１８７）およびＨＩＶＴＭ３（配列認識番号１０９）により、ＰＣＲ断片、ＰＣＲＴＭＩ、およびオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭＩ　（配列認識番号１ｏ７）とＨＩＶＴＭ２　（配列認識番号１０８）から産生じた。ＰＣＲＴＭｌは、７ｉ　ＩＪゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｐ１４　（配列認識番号１８７）およびＨＩＶ２Ｐ１５　（配列認識番号１８８）により、プラスミドｐＨＩ　Ｖ２８から産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ３４と称する。

次いでｇｐ１２０　（＋膜内外）遺伝子を、ＨＩＶ２　ｇａｇ／ｐｏ＋遺伝子を含有するプラスミドにクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇｐ１２０　（＋膜内外）遺伝子を含有する、ｐＨＩ　Ｖ３４の２，７００ｂｐのＣ１ａｌ断片を、ｐＨＩＶ３０の６，８００ｂｐ（７）Ｃ１ａｌ断片にクローニングすることにより行なった。（ｐＨＩＶ３０は、Ｈ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子を含有する、ｐＨＩ　Ｖ２９の１．５５０ｂｐのＮｒｕｌ−３ａｃｌｌ断片を、ｐＨＩＶ２５の９，０００ｂｐのＮｒｕＩ−８ａｃＩＩ断片にクローニングすることにより誘導した。）この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ３５と称する。

ｐＨＩ　Ｖ３５を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験に用いる。

する場合と有さない場合のＨＩＶ−ｆｅｎニュ１上旦主璽ヱ且酉二ヱ五互上二１Ｓ勇童されたＨＩＶ−１ｇａｇのｐ２４ｘピトープを含有する２つの融合ペプチドの発現２つの発現カセットを、以下に記載する一連のポリメラーゼ連鎖反応により産生じた。これらのカセットは、一方のバージョンがエピトープに融合されたＨＩＶ−１ｅｎＶの信号配列をコードするが、もう一方はしないという点で異なる。

信号を有する融合ペプチドのバージョンは、開裂可能リンカ−領域の後に、ラトナー等（１９８５）に基づ＜ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｅｎｖの５１アミノ酸Ｎ末端部分、残基１−５０　（開始Ｍｅｔを加えた）に先行する。この領域のアミノ酸配列は（配列認識番号１８９）ＭＫＥＱＫＴＶＡＭＲＷＥＫＹＱＨＬＷＲＷＧＷＲＷＧＴＭＬＬＧＭＬＭＸＣ５ＡＴＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰ−ＰＦＲＫである。融合ペプチドの両方のバージョンは、ＨＩＶ−１（ＭＮ）ｅｎｖのｐ２４、ｖ３ループ（ＭＮ）　、およびＴ１の定義されたＴ細胞エピトープに基づくアミノ酸配列を含有している。ペプチドは、エピトープが互いと、存在する場合には配列（配列認識番号１８９）ＰＰＦＲＫによる信号から離れるように設計される。ペプチドのこの領域の配列は（配列認識番号１９０）［ｆ、７号　−ＰＦＲＫ］− である。信号配列を欠如したバージョンにおいては、［信号−ＰＦＲＫ］ににより示される領域は、開始メチオニンのみにより置換される。

信号を有するカセットに関して、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）（５’　−ＡＣＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣ？ｒＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧ　−３’）および５ＩＧＰＣＲ２４（配列認識番号１９１）を用いたＰＣＲにより、プラスミドｐＢｓＴＩＴ２ＴＨ４゜１（前記）からＨ６プロモーターと信号を誘導した。プライマーＨ６ＰＣＲ１およびＰ２４ＰＣＲ（配列認識番号１（５′−”ＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＴＡＣＴＴ’ｒＴＣＴＡＡＡＡＧＧＴＧＧ’ｒ’ｌ”ｒＡＴＡＡＡＡＴＣ−３’　）ヲ用いて、この３０７ｂｐのＰＣＲ誘導断片およびオリゴヌクレオチドＰ２４Ａ　（配列認識番号１９２）（５′ − ＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴｒＴＡＧＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡＴｒＴＴＡＴＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＩ’ｒＡＧＡＡＡＡ−：ｌ　’　）とＰ２４Ｂ　（配列認識番号１９３）（５を− ＴＴＴＴＣＴＡＡＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＧＧＴｒＣＴＴｒＡＧＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧｋＡＴＧＧ −３１）のＰＣＲ増幅によりｐ２４エピトープを信号配列に融合した。この３７７ｂｐのＰＣＲ誘導断片は、信号、ｐ２４エピトープおよびＶ３ループの最初の６つのアミノ酸の暗号配列に結合せしめられたＨ６プロモーターからなる。

信号を有さないカセットに関して、プライマー８６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＨ６Ｐ２４　（配列認識番号１９５）（５・− ＧＧＴＧＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＧＧＴｒＣＴｒＴＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＭＣＧＧ− ３’）を用いたＰＣＲにより、プラスミドｐＨ６Ｔ２　（上記）からＨ６プロモーターを誘導した。ｐ２４エピトープは、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＰ２４ＰＣＲ（配列認識番号１９４）を用いて、この１８７ｂｐのＰＣＲ誘導断片およびオリゴヌクレオチドＰ２４Ａ（配列認識番号１９２）とＰ２４Ｂ　（配列認識番号１９３）のＰＣＲ増幅によりプロモーターに融合せしめた。この２１４ｂｐのＰＣＲ誘導断片は、ｐ２４エピトープおよびＶ３ループの最初の６つのアミノ酸の暗号配列に結合せしめられたＨ６プロモーターからなる。

ｖ３ループ領域の暗号配列は、プライマーＶ３ＰＣＲ１（配列認識番号１９６）（ｓ　′−ＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＴＡＣＭＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣ−］　＃　）オヨびＶ３ＰＣＲ２Ｃ配列認識番号１９７）（５’　−ＣＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＡＣＧＧＴＧＧＴｒＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＭＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧ−］　’　）を用いたプラスミドｐＨＩＶＧＥ１６ＥＶ　（前記）がらのＳｍａ　Ｉ断片のＰＣＲ増幅により誘導した。Ｔ１エピトープを、プライマーＶ３ＰＣＲ１（配列認識番号１９６）およびＴＩＭＮＰＣＲ（配列認識番号２００）（”−ＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＴＡＣＡＴＡＧごゴ買Ｃ−３・）を用いた、テンプレートとしてのオリゴヌクレオチドＭＮＴＩＡ　（配列認識番号１９８）（５を− ＧＣＴＴＡＡ−３’　）とＭＮＴＩＢ（配列認識番号１９９）（５・− ＴＴＡＡＧＣＡＴＡＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＡＣＧＧＴＧＧ−３’　）およびこの１７１ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＰＣ，Ｒ増幅によりｖ３ループの暗号領域に結合せしめた。この２３９ｂｐのＰＣＲ誘導断片は、早期転写終止信！　（ＴＴＴＴＴＮＴ）およびＸｈｏｌとＨｉｎｄＩ１１部位の後の３′に、ｐ２４エピトープ、ｖ３ループ、およびＴ１エピトープの最後のコドンからなる。

信号を有するカセットに関して、プロモーター、信号およびｐ２４エピトープ暗号配列を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＴＩＭＮＰＣＲ（配列認識番号２００）を用いた３７７ｂｐと２３９ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＰＣＲ増幅により、ｖ３ループ／Ｔｌエピトープの暗号領域に結合せしめた。この５８１ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄｌＩＩての切断後、５６３ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢｓ（ＣＡ。

ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドｐＭＮＴＩＰ２４を産生した。挿入物は、ヌクレオチド配列分析により確認した。

信号を有さないカセットに関して、プロモーターおよびｐ２４暗号配列を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号１５７）およびＴＩＭＮＰＣＲ（配列認識番号２００）を用いた、１７　］、　ｂ　ｐと２３９ｂｐのＰＣＲ誘導断片のＰＣＲ増幅により、■３ループ／Ｔｌエピトープの暗号領域に結合せしめた。この４１８Ｍ１のＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄｌｌｌでの切断後、４００ｂｐの断片をアガロースゲルから単離は、同様に切断したｐＢＳ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に連結し、プラスミドｐＭＮ２４ＥＶ３ＴＩＮＳＡを産生じた。挿入物をヌ・クレオチド配列分析により確認した。

Ｃ６の上流の３７０ｂｐと、Ｓｍａ　Ｉ、ＰｓｔｌＳＸｈｏＩ、およびＥｃｏＲ１部位を含有するポリリンカーと、１１５６ｂｐの下流配列とを含有するＣ６挿入ベクターを以下のように誘導した。オリゴヌクレオチドＣ６Ａｌ　ＳＧ（配列認識番号２０１）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＴＣＴＴＡＡＴＧＡＧ’ｌ’ｌ’　−３’　）およびＣ６ＢＩＳＧ　（配列認識番号２０２）を用いた、精製ゲノムカナリアボックスＤＮＡから誘導したコスミドクローンのＰＣＲ増幅により、０．４ｋｂの上流配列を誘導した。オリゴヌクレオチドＣ６Ｃ１，３Ｇ（配列認識番号２０３）１５　’　−ＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴｒＡＴＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＭＴＧＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡ　−３’　）およびＣ６ＤＩＳＣ（配列認識番号２ｏ４）（ｓ′−ＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＴＭＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＴＴＧ　−３〆）を用いた、同一のテンプレートのＰＣＲ増幅により、１゜２ｋｂの下流アームを産生じた。これらの断片を、プライ７−　Ｃ６Ａ　Ｉ　Ｓ　Ｇ　（配列認識番号２ｏ１）およびＣ６ＤＩＳＣ（配列認識番号２０４）のためのテンプレートとしてのゲル精製０．４および０．２ｋｂの断片を用いた第３のＰＣＲにより融合した。産生じた１、６ｋｂの断片をアガロースゲルから単離し、５ａｃＩとＫｐｎＩで切断し、同様に切断したｐＢＳ　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、Ｃ６挿入プラスミドｐＣ６Ｌを産生じた。

両方の発現カセットを、ｐＭＮＴＩＰ２４およびｐＭＮ２４ＥＶ３ＴＩＮＳＡのＰｓｔｌ／ＸｈｏＩ切断により切除し、アガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＣ６Ｌに連結して、ＡＬＶＡＣのＣ６座への組換えのために、それぞれプラスミドｐＣ６Ｐ２４ＦＳおよびｐＣ６Ｐ２４ＦＮＳを産生じた。産生じた組換え体をそれぞれｖｃＰ１８９およびｖｃＰ１９５と称した。

ｐＭＮＴＩＰ２４およびｐＭＮ２４ＥＶ３ＴＩＮｓＡからのＢａｒｎＨＩ／ＸｈｏＩ断片を、同様に切断したｐＳＤ５５０ＶＣ（実施例３３で定義）に連結し、それぞれｖＰ１１１７およびｖＰｌｌｌｏを産生するＮＹＶＡＣのＨ４座への組換えのために、ｐ１４Ｐ２４Ｆｓおよびｐ１４Ｐ２４ＦＮＳを産生じた。

同種タンパク質（グツト等、１９８７）および異種タンパク質（フランシス等、１９８７）からの様々なＴｈエピトープの添加により、合成ペプチドワクチンに対する特異的Ｂ細胞応答のためにＴ細胞の援助を回復できるかもしれないことが提案されている。ＨＩＶ−１抗原に対して増大した免疫応答を誘発する努力において、ＨＩＶ−１から誘導した様々なＴ細胞エピトープを組換えポックスウィルスに含有せしめた。さらにこの戦略を追及するために、他の既知のヒトＴヘルパー細胞エピトープ（ホ等、１９９０）を含有する破傷風毒素断片ＣもＡＬＶＡＣ組換え体中のＨＩＶ−１抗原とともに共発現せしめる。破傷風毒素からのこれらのエピトープの存在は、非特異的Ｔ細胞の援助を提供することによりＨＩＶ−１に対する免疫応答を増大するかもしれない。

Ｐｓｔｌ／ＳｍａＩ切断ｐＣ６Ｐ２４ＦＳ　（上記）を、プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１（上記）からのＰｓｔＩ／Ｓｍａｌ断片と連結することにより修飾し、ｐＣ６Ｐ２４ＦＳＶＱを産生した。このプラスミドを、Ｈ６プロモーター内のＮｒｕ　Ｉおよび３′末端でのＸｈｏＩで切断し、同様に切断したｐＨ６ＴＥＴＣ（上記）から単離した１゜４ｋｂ断片に連結した。産生じたプラスミドｐＣ６ＶＱＴＥＴＣを、クローニング部位を囲む領域の制限切断およびヌクレオチド配列分析により確認した。確認の後に、ｐＣ６ＶＱＴＥＴＣを、ｖｃＰ１１２、ｖｃＰ１２５およびＶＣＰ１５６による組換え実験に用いた。

ヒトにおけるＮＹＶＡｃ／ＨＩＶ−１およびＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１構成物の免疫原性に関する広域の問題が臨床試験の状況内で最も扱われているが、多くの適切な洞察がｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞応答アッセイによりすでに収集されている。ヒトにおけるこれらのワクチン構成物の使用に関する主な問題は、細胞抗ＨＩＶ− １反応性、特に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答に強い影響を与える能力である。防止的なまたは治療上のワクチン方法の成分のいずれかとして、ヒトにおける多くのウィルス感染のＣＴＬのための有益な役割を示唆する十分な先例がある（マツクマイケル等、１９８３　、モス等、１９８７　、ポリシーウィッツ等、１９８８）。ウィルス感染の防止または制御における抗ＨＩＶ−ＩＣＴＬの正確な貢献は説明されたままであるが、ＳＩＶ／マカク動物モデルを用いたレトビンと協力者による研究は、抗５ＩＶ−Ｉ　ＣＴＬ、特にｇａｇ特異的ＣＴＬは、病気の経過を制御する主要な決定要因であることを示唆している（レトビンおよびキング、１９９０）。このことは、抗Ｈ１ｖ−ｉ　ＣＴｌ−活性が、比較的高率の無症候性患者の新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から直接測定できる（ウォーカーおよびブラタ、１９９０；オートラン等、１９９１において調査）という、多くの発明者の観察と結び付き、抗ＨＩＶ−ＯＩ　ＣＴＬ反応性の誘発は、予防および治療ワクチンの両者の主要目的として含むべきであると言う論点を支持している。

適切なＣＴＬ反応性に強い影響を与える、ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１およびＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１構成物の能力を試験するために、検出可能な直接の抗ＨＩＶ− １ｇＩ）ｉ６０　ＣＴＬ反応性のないＨＩＶ−１感染患者の同齢集団に関連する一連の実験を行なった。これらの患者からＰＢＭＣを得て、ＰＢＭＣの一部を、完全複製応答ワクシニア／　ｇ　ｐ　１６０構成物ｖＰＥ１６　（ウォーカー等、１９８７）、または複製弱毒化ＮＹＶＡＣ／ｇｐ１６０もＬ＜ｌ；！ＡＬＶＡＣ／ｇｐ１６０構成物のいずれかで感染せしめた。激しく感染したＰＢＭＣを洗浄し、１０日ｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激プロトコルにおける残りのＰＢＭＣの刺激器として用いた。対照は、未刺激培養物および対照ベクター（すなわち、ＨＩＶ− １遺伝子のない親ポックスウィルス）刺激培養物の両方を含んだ。外因性Ｉ　Ｌ −２の不在の１０日培養後、細胞を洗浄し、対照ワクシニアウィルス、ｖＳＣ８、またはワクシニア／ｇｐ１６０　ｖＰＥ１６構成物のいずれかに感染した自己由来の８９２８球細胞系統（Ｂ　Ｌ　ＣＬ）に対するＣＴＬ活性について評価したらさらに、マイクロスフイア選別を用いたＣＤＳ＋細胞の表現型欠失を平行して行なった。第１１図に示したこれらの研究の結果は、未刺激培養物または対照ベクター刺激培養物は、ＨＩ　Ｖ−１ｇｐ１６０標的ＢＬＣＬに対して検出可能なＣＴＬ活性を有さず、ＨＩＶ−１ｇｐ１６０構成物のいずれかで刺激した培養物は、高水準の抗ｇｐ１６０細胞障害活性を有し、その全てはＣＤＳ＋細胞の除去後になくなり、それゆえ、ＣＴＬ活性の出現と一致した。おそらく、これらの研究に見られた最も著しい観察は、ＮＹＶＡＣ／ｇｐ１６０およびＡＬＶＡＣ／ｇｐ１６０刺激培養物におけるＣＴＬ応答の大きさが、全複製応答ｖＰＥ１６感染ＰＢＭＣにより刺激された培養物におけるよりも大きいという矛盾のない発見であツタ。ＮＹＶＡＣ／ｇｐ　１６０およびＡＬＶＡＣ／ｇｌ）１６０によるＣＴＬ刺激におけるこの明らかな増大は、ｖＰＥ１６また１ｔＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベクターｃ７）弱毒特性と比較した組換え体による発現の差異によるものであるか否かは知られていない。

より完全に、誘発されたエフェクター細胞表現型を同定するために、様々な刺激培養物の延長流動血球計算分析を行なった。未刺激培養物または対照ベクター刺激培養物のいずれかと比較した場合、抗ｇｐ１６０細胞障害反応性の発生は一般的に、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋サブ個体における減少およびＣＤ３”／ＣＤ８＋細胞における代償上昇となる。

ＣＤ３“　／ＣＤ２５’　Ｓ　ＣＤ３＋　／ＨＬＡ−ＤＲ”　、ＣＤ８′／５６Ｆ１“、ＣＤ８＋／ＣＤ３８＋、およびＣＤ３＋／ＣＤ６９’細胞における著しい増大もまた注意されたい。各培養物の細胞障害活性を特定の細胞サブ個体における増大に対してプロットした場合、細胞抗ｇｐｉｓｏ反応性とＣＤ８°／３６Ｆ１“個体における増大との間に線形関係が見られた。この細胞表現型は大まかにＣＴＬを定義する（モリモト等、１９８７）。

ＨＩＶ−１感染患者からの細胞に関するこれらの初期の予備臨床研究は明確に、患者のＰＢＭＣプール内に含まれる前駆体個体群からの能力のあるＣＴＬ活性を誘発するＮＹＶＡＣおヨヒＡ　Ｌ　ＶＡ　Ｃ／ＨＩ　Ｖ−１ベクターノ能力ヲ説明している。さらに、これらの研究は、治療ワクチン方法の状況におけるこれらベクターの潜在的な臨床使用を強く例示している。これは、これらベクターによる１つの免疫化の形態を取るか、または細胞標的および再注入のｅｘｖｉｖｏ成分もしくは大規模の養子免疫伝達後のｅｘｖｉ−ｖｏＣＴＬ産生を含みえた。いずれの場合においても、非複製ベクターの共同安全性およびその固有の強い細胞免疫原性が、ヒトにおける免疫ベースの治療の理想の候補とする。

本発明の好ましい実施態様を詳細に記載したが、添付した請求の範囲に定義した本発明は、上記記載に述べた特定の詳細に限定されず、本発明の精神と範囲から逸脱せずに多くの変更が可能であることが理解されよう。

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８１、Ｗａｌｋｅｒ、　Ｂ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｐｌａｔａ、　Ｆ、、　ＡＩＤＳ　４．１７７−１８４　（１９９０１ＦＩＧ、　５Ｂｇｌｌｌ　ＳｍａｌＦＩＧ、６ＦＩＧ、１Ｏ −ｅｎｖ　−ｅｎｖＰＦ３ＦＶＬ丙　；ｈ　シｉｔト□　東１１Ｊχ、　−ＦＩＧ、ＩＩフロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲ（７２）発明者　タータグリア、ジェームズアメリカ合衆国　ニューヨーク州　１２３０３シエネクタデイ　クリスティーナ　ドライヴ　７（７２）発明者　コックス、ウィリアム　アイアメリカ合衆国　ニューヨーク州　１２１８０トロイ　ワシントン　プレース　１

Claims

【特許請求の範囲】

１．修飾組換えウイルスであって、該修飾組換えウイルスが、該ウイルスが弱毒化された毒性を有するように不活化された可欠ウイルスコード遺伝機能を有し、前記組換えウイルスゲノムの可欠領域中の免疫不全ウイルスからのＤＮＡよりなることを特徴とする修飾組換えウイルス。
２．前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。
３．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第２項記載のウイルス。
４．前記遺伝機能が、毒性因子をコードする読取り枠を欠失することにより不活化されることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス。
５．前記遺伝機能が、毒性因子をコードする読取り枠の挿入不活化により不活化されることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス。
６．前記読取り枠が、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−ＫｌＬ、１４しおよびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第４項記載のウイルス。
７．前記読取り枠が、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−ＫｌＬ、１４しおよびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。
８．前記免疫不全ウイルスからのＤＮＡが位置する組換えウイルスゲノムの可欠領域が、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−ＫｌＬ、１４しおよびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第４項記載のウイルス。
９．前記免疫不全ウイルスからのＤＮＡが位置する組換えポックスウイルスゲノムの可欠領域が、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ− Ｋ１Ｌ、Ｉ４Ｌおよびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。
１０．前記免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス。
１１．ｖＰ９１１、ｖＰ９２１、ｖＰ８７８、ｖＰ９３９、ｖＰ９４０、ｖＰ９２０、ｖＰ９２２、ｖＰ１００８、ｖＰ１００４、ｖＰ１０２０、ｖＰ１０７８、ｖＰ９９４、ｖＰ１０３５、ｖＰ９６９、ｖＰ９８９、ｖＰ９９１、ｖＰ９９０、ｖＰ９７０、ｖＰ９７３、ｖＰ９７１、ｖＰ９７９、ｖＰ９７８、ｖＰ９８８、ｖＰ１００９、ｖＰ１０６２、ｖＰ１０６０、ｖＰ１０６１、ｖＰ１０８４、ｖＰ１０４５、ｖＰ１０４７、またはｖＰ１０４４であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のウイルス。
１２．前記免疫不全ウイルスがシミアン免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス。
１３．ｖＰ８７３、ｖＰ９４８、ｖＰ９４３、ｖＰ９４２、ｖＰ９５２、ｖＰ１０４２、ｖＰ１０７１またはｖＰ１０５０であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のウイルス。
１４．弱毒化された毒性を有し、アビポックスウイルスゲノムの可欠領域中に免疫不全ウイルスからのＤＮＡを含有するすることを特徴とする組換えアビポックスウイルス。
１５．前記免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換えアビポックスウイルス。
１６．前記アビポックスウイルスがカナリアポックスであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の組換えアビポックスウイルス。
１７．前記アビポックスウイルスが鶏痘であることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の組換えアビポックスウイルス。
１８．ｖＣＰ９５、ｖＣＰ１１２、ｖＣＰ６０、ｖＣＰ６１、ｖＣＰ１２５、ｖＣＰ１２４、ｖＣＰ１２６、ｖＣＰ１４４、ｖＣＰ１２０、ｖＣＰ１３８、ｖＣＰ１１７、ｖＣＰ１３０、ｖＣＰ１５２、ｖＣＰ１５５、ｖＣＰ１５６、ｖＣＰ１４６、ｖＣＰ１４８、ｖＣＰ１５４、ｖＣＰ１６８、ｖＣＰ１５３またはｖＣＰ１７２であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のヒト免疫不全ウイルス組換えカナリアポックスウイルス。
１９．ｖＦＰ６２、ｖＦＰ６３、またはｖＦＰ１７４であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のヒト免疫不全ウイルス組換え鶏痘ウイルス。
２０．ワクチン接種した宿主動物中で免疫応答を誘発するワクチンであって、該ワクチンが担体と請求の範囲第３項記載の組換えウイルスとからなることを特徴とするワクチン。
２１．ワクチン接種した宿主動物中で免疫応答を誘発するワクチンであって、該ワクチンが担体と請求の範囲第１４項記載の組換えウイルスとからなることを特徴とするワクチン。