JPH03216187A - Ｃ末端アミド化に関与する酵素ならびにその製造方法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｃ末端グリシン付加体のＣ末端アミド化に関
与する新規酵素、その調製方法および使用ならびに該酵
素の活性の測定方法およびその方法を用いる該酵素の探
索方法に関する。

〔従来の技術〕

Ｃ末端がアミド化されて初めて生理活性を示すペプチド
、例えばカルシトニン、ガストリン、セクレチン血管作
用性小腸ベプチド（ＶＩＰ）　、成長ホルモン放出因子
、副腎皮質刺激ホルモン放出因子等は、生体内で酵素反
応によりグリシン付加体から生成されることが知られて
いる。これらの生理活性ペプチドの多くは、医薬品とし
て有用であり、現在、カルシトニン、セクレチンなどは
医薬品として市販されている。

これらのべブチドの入手は、従来主として生体からの分
離精製によって行われており、工程が煩雑でまた、起源
の生体も入手しにくい。従って、現在市販の上記ペプチ
ドは非常に高価なものとなっている。

そこで、近年、組換えＤＮＡ技術を用いて、これらの生
理活性ペプチドを生産しようとする試みが行われている
。しかしながら、大腸菌、酵母、枯草菌などを宿主とし
た組換えＤＮＡ技術では、生産したペプチドのＣ末端ア
ミド化ができず、上記ベプチドの生産をおこなう際の障
害となっている。そこで、生体外でＣ末端アミド化を容
易に、しかも、安価におこなえる技術が望まれている。

一方、前述の生体内酵素反応、すなわちペプチド類Ｃ末
端グリシン付加体のＣ末端アミド化に関与する酵素は、
ベプチジルグリシンーα−アミデーティングモノオキシ
ゲナーゼ（Ｃ末端アミド化酵素）（ＥＣ．１．１４．１
７．３）と呼ばれており（Ｂｒａｄｂｕｒｙら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，　２９８，　６８６．　１９８２　：ＧＩｅｍ
ｂｏｔｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２５９
，　６３８５．　１９８４）　、次のような反応を触媒
していると考えられている。

生体内でのアミド化機構の解明、ならびに組換えＤＮＡ
技術によって生産されるベブチドの生体外におけるＣ末
端アミド化を目的に、本酵素を精製する試みがなされて
いる。今までに比活性を出発原料に比し１００倍以上に
高めた精製例としては、ウシ脳下垂体中葉（Ｍｕｒｔｈ
ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２Ｅ江，１８１５
．　１９８６）　、ブタ脳下垂体（Ｋｉｚｅｒら、Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，月８．　２２６２，　　１９
８６　：　Ｂｒａｄｂｕｒｙら、Ｅｕｒ．　Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，　１６９，　５７９．　１９８７）、ブタ
心房（Ｘｏｊ　ｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１
０５，　４４０．　１９８９）、アフリカッメガエル体
皮（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｌｌｕｎ．，　１３７，　９８４．　
１９８６）、ラット甲状腺腫瘍（Ｍｅｈｔａら、Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｂｉｏｐｈｙｓ．＋　２６１＋
　４４，１９８８）由来のものが報告されている。

これらの精製酵素は、いずれもその活性発現に酸素、銅
イオンを要求し、アスコルビン酸素の還元剤添加により
、活性が上昇する性質を持つことが知られている。最近
では、精製酵素を用いる反応機構の解明に関する研究も
進められてきており、反応中間体の存在が示唆されてき
ている（Ｂｒａｄｂｕｒｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，　１６９，　５７９−５８４（Ｉ９８７）、Ｒ
ａｗｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　，月．０
．　８５２６−８５３２（Ｉ９８８）　　、Ｙｏｕｎｇ
　　ら、　Ｊ．八ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，　　１１１
．　　１９３３−１９３４（Ｉ９８９）　）。

しかし、現在のところ、中間体の単離ならびにその中間
体とアミド化酵素との関係を明らかにした例はない。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述のように、Ｃ末端アミド化酵素は、生体内で非常に
興味深い作用を示し、特定の生体器官に由来する一定の
純度を有する組成物も知られている。しかし、これらの
組成物を生体外におけるＣ末端アミド化物の生産に用い
るには、その純度および安定性ならびに製造原価の面で
十分なものとはいえない。これらの課題を解決するには
当該酵素に関する基礎的知見の収集、すなわち、Ｃ末端
アミド化反応をおこなう反応機構の解明をおこなうこと
が必要と考え、中間生成物の単離を試みたところ、中間
体を単離し構造決定することに成功した。この結果から
、Ｃ末端アミド化反応は、従来考えられていたような１
段階の反応ではなく、中間体（対応するＣ末端α−ヒド
ロキシルグリシン付加体）を介した２段階の反応である
ことがわかった。そこで、それぞれの反応を触媒する酵
素の探索について鋭意検討したところ、目的の酵素活性
を有する新規物質を見い出し、本発明を完成した。すな
わち、本発明の目的はＣ末端アミド化に関与する新規酵
素群、その調製方法および使用、ならびに該酵素の活性
測定方法およびこの方法を用いる該酵素活性を有する物
質の探索方法を提供するにある。

〔課題を解決するための手段〕

従って、本発明によれば前述の課題を解決すべく、次式
（Ｉ） （上式中、Ａは、天然のα−アミノ酸に由来するα−ア
ミノ基もしくはイミノ基およびα一カルボキシル基以外
の残基を表しており、Ｘは、水素原子またはカルボニル
基を介してＮ原子と結合するアミノ酸誘導体の残基を表
す）で示されるＣ末端グリシン付加体に作用して、次式
（ＩＩ）（上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）
で示されるＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加俸を生
成し、かつ、ゲル濾過を用いる分子量決定法により約２
５，０００ダルトンの分子量を有するＣ末端グリシン付
加体のＣ末端アミド化に関与する酵素（以下、「酵素−
■」という場合もある）が提供される。

なお、式（Ｉ）および（ＩＩ）ならびに下記式（Ｉ［Ｉ
）のカツコ内の水素原子（Ｈ）は、Ａがα一イミノ基を
有するα−アミノ酸に由来する場合には水素原子を有し
ないことを意味する．本発明における式（Ｉ）で示され
るＣ末端グリシン付加体、すなわち本発明の酵素の基質
として（Ｈ） は、一般的に、前記式のＸ−Ｎ−Ａ−ＣＯ一　部が天然
または合成のアミノ酸誘導体類、特に、ベプチドまたは
蛋白質類に由来し、そのＣ末端アミノ酸残基（　−Ｎ（
Ｈ）　−　Ａ−ＣＯ−で示される〕にグリシンがペブチ
ド結合した化合物が挙げられる。Ｃ末端アミノ酸残基と
しては天然のα−アミノ酸、特にタンパク質構成アミノ
酸、例えばグリシン、アラニンのような脂肪族アミノ酸
；バリン、ロイシン、イソロイシンのような分技アミノ
酸；セリン、スレオニンのようなヒドロキシアミノ酸；
アスパラギン酸、グルタミン酸のような酸性アミノ酸；
アスパラギン、グルタミンのようなアミド；リジン、ヒ
ドロキシリジン、アルギニンのような塩基性アミノ酸；
システイン、シスチン、メチオニンのような含硫アミノ
酸；フェニルアラニン、チロシンのような芳香族アミノ
酸；トリブトファン、ヒスチジンのような複素環式アミ
ノ酸；プロリン、４−ヒドロキシプロリンのようなイミ
ノ酸に由来する残基が挙げられる。また、このアミノ酸
残基のα−アミノ基もしくはイミノ基に結合する水素原
子またはアミノ酸誘導体の残基〔Ｘ一で示される〕の該
残基としては、単一のアミノ酸またはαーアミノ基を介
してペブチド結合し得るペプチド類であれば、その構成
アミノ酸残基の種類およびペプチドの鎖長に制限はなく
、さらにその構成アミノ酸残基にリン酸もしくは糖また
はその他の置換基が共有結合していてもよく、また脂質
と複合体を形成していてもよい．前記置換基の具体的な
ものとしては、それぞれのアミノ酸残基に対応して、ア
ルギニン残基のグアニジノ基に置換する基、例えば、メ
チル基もしくはエチル基などのアルキル基またはアデノ
シンニリン酸リボース、シトルリンもしくはオルニチン
に由来する残基；リジン残基のε−アミノ基に置換する
基、例えば、グルコシル基、ビリドキシル基、ビオチニ
ル基、リポイル基もしくはアセチル基またはリン酸、δ
一水酸基を有する化合物、δ−グリコシル基を有する化
合物、グルタルアルデヒドもし《は無水シトラコン酸に
由来する残基；ヒスチジン残基のイミダゾール基に置換
する基、例えば、メチル基、リン酸基もしくはヨード原
子またはフラビンに由来する残基；プロリン残基に置換
する基、例えば、水酸基、ジ水酸基もしくはグリコシル
オキシ基；フェニルアラニン残基のベンゼン環に置換す
る基、例えば、水酸基もしくはグリコシルオキシ基；チ
ロシン残基の水酸基に置換する基、例えば、グリコシル
オキシ基、スルホン酸基、沃素原子、臭素原子もし《は
塩素原子または水酸基を有する化合物、ビスエーテル、
アデニン、ウリジンもしくはＲＮＡ　（リボ核酸）に由
来する残基；セリン残基の水酸基に置換する基、例えば
、メチル基、グリコシル基、ホスホバンテテイン基、ア
デノシンニリン酸リボシルもしくはリン酸基；スレオニ
ン残基の水酸基に置換する基、例えば、グリコシル基、
メチル基もし《はリン酸基；システイン残基のＳＨ基に
置換する基、例えば、グリコシル基、シスチニル基、デ
ヒドロアラニル基もしくはセレン原子またはヘムもしく
はフラビンに由来する残基；アスパラギン酸またはグル
タミン酸残基のカルポキシル基に置換する基、例えば、
メチル基、リン酸基もしくはＴ一カルボキシル基；アス
パラギンまたはグルタミン残基のアミド基に置換する基
、例えば、グリコシル基、ビロリドニル基もしくはイミ
ノ基などが挙げられる。

上記基質としてのＣ末端残基にグリシンがペプチド結合
したべブチドまたはその誘導体は天然から抽出したもの
でも、化学合′成によって生産したものでもまた組換え
ＤＮＡ技術を用いて生産したものでもよい。従って、本
発明の基質、式（Ｉ）で示される化合物としては、ペプ
チド類、例えば、アミノ酸残基数２〜１００程度のペプ
チド、カゼイン、プロテインキナーゼ、アデノウイルス
ＥＩＡ蛋白質、ＲＡＳ　１蛋白質などで代表されるリン
酸ペプチドおよびその加水分解物、スロンボプラスチン
、α１　リボ蛋白質、リボビテリンなどで代表されるリ
ポ蛋白質およびその加水分解物、ヘモグロビン、ミオグ
ロビン、ヘモシアニン、クロロフィル、フイコシアニン
、フラビン、ロドブシンなどで代表される金属蛋白質お
よびその加水分解物、コラーゲン、ラミニン、インター
フェロンα、セログリコイド、アビジンなどで代表され
る糖蛋白質およびその加水分解物ならびにその他のＣ末
端力ルポキシル基がアミド化されて成熟型の生理活性ペ
プチド、例えばカルシトニン、セクレチン、ガストリン
、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）　、コレシストキ
ニン、セルレイン、膵ポリペプチド、成長ホルモン放出
因子、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺
伝子関連ペブチド等を形成するペプチド類各々のＣ末端
グリシン付加体（すなわち、Ｃ末端力ルポキシル基とグ
リシンのアミド結合化合物）が挙げられる。これらのう
ち、本発明の酵素組成物の酵素活性を確認するために好
ましい基質としては、例えば、Ｄ−チロシルバリルグリ
シン、Ｄ−チロシルトリプトファニルグリシン、グリシ
ルフエニルアラニルグリシン、フエニルアラニルグリシ
ルフエニルアラニルグリシン、Ｄ−チロシルロイシルア
スパラギニルグリシン、アルギニルフェニルアラニルグ
リシン、アルギニルアラニルアルギニルロイシルグリシ
ン、ロイシルメチオニルグリシン、グリシルロイシルメ
チオニルグリシン、フエニルアラニルグリシルロイシル
メチオニルグリジン、アスパラギニルアルギニルフエニ
ルアラニルグリシン、トリブトファニルアスパラギニル
アルギニルフェニルアラニルグリシン、アラニルフェニ
ルアラニルグリシン、リジルアラニルフェニルアラニル
グリシン、セリルリジルアラニルフェニルアラニルグリ
シン、アルギニルチ口シルグリシン、グリシルメチオニ
ルグリシン、グリシルチ口シルグリシン、グリシルヒス
チジルグリシン、ヒスチジルグリシルグリシン、トリブ
トファニルグリシルグリシン、およびグリシルシステイ
ニルグリシン等が挙げられる（なお、グリシンを除きＤ
一と特に示さないものはＬ一型を示す）。一方、本酵素
組成物の有効利用（後述する第五の本発明）に好ましい
基質としては、前記Ｃ末端カルボキシル基がアミド化さ
れて成熟型の生理活性ベプチドを形成する、そのＣ末端
カルボキシル基にグリシンがペブチド結合したペプチド
類が挙げられる。

本発明の酵素−■は、前記基質に作用して次式（ｎ） （Ｈ） 〔上式中、Ｘ−Ｎ−Ａ−ＣＯ部の具体例は前記式（Ｉ）
について定義したような意味を有する〕で示されるＣ末
端α−ヒドロキシルグリシン付加体を生成することがで
きる。

部に悪影響を及ぼさない条件下で加水分解するか、後述
する本発明の第二の酵素で処理することにより対応する
Ｃ末端アミド化物に転化することができる。

また、前記酵素＝１は、ゲル濾過を使用する分子量決定
法により約２５，０００ダルトンの分子量を有する。す
なわちこの分子量は、それ自体公知のゲル濾過法〔例え
ば、゛生化学実験講座５、酵素研究法、上巻、２８３〜
２９８頁゜′、東京化学同人（Ｉ９７５）に従い決定す
ることができる。具体的には、１００ｍＭの塩化カリウ
ムを含む５０ｍＭのトリスー塩酸（ｐＨ７．４）を平衡
化および溶出液として用い、トヨバールＩ−　５５Ｓ　
（東ソー社製）上でゲル濾過を行い、β−アミラーゼ（
Ｍ．Ｗ．２００，０００）　、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ（Ｍ．Ｗ．１５０，０００）　、ＢＳＡ（Ｍ．Ｗ．
６６，０００）　、カルボニックアンヒドラーゼ（Ｍ．
Ｗ．２９．ＯＯＯ）およびチトクロームＣ　（Ｍ．Ｌ１
５，　４００）を指標として決定した。

本発明の酵素−■は、さらに以下の理化学的性質により
特定される。すなわち、 （ｉ）至適ｐＨが約５〜７でかつ安定ｐＨが４、〜９に
あり、 （ｉｉ）作用適温が２５〜４０゜Ｃの範囲にあり、（ｉ
ｉｉ）金属イオンおよびアスコルビン酸を補因子とする
。

上記（ｉ）および（ｉｉ）の性質は、通常使用される緩
衝液、具体的には、トリスー塩酸、メスー水酸化カリウ
ム、テスー水酸化ナトリウム、ヘベスー水酸化カリウム
緩衝液を用いて測定したものである。なお、本発明の酵
素組成物は、１℃〜５５゛Ｃの温度範囲内で前記反応を
触媒するが、５６℃では約１０分で失活し、４０゜Ｃ付
近でも若干の失活がみられる。

金属イオンとしては、Ｃｕ”　，　Ｚｎ”　，　Ｎｉ”
　．　Ｃｏ”Ｆｅ３＋等が適当であり、特にＣｕ　”　
”　ｒ　Ｚｎ　”　”が好ましい。

本発明はさらに、次のもう一種の酵素も提供する。すな
わち、前記式（ｎ）で示されるＣ末端α一ヒドロキシル
グリシン付加体に作用して、次式（ＩＩＩ）（Ｈ） Ｘ−Ｎ−Ａ−ＣＯＮＨｚ　　　　　　　　　（ＩＩＩ）
（上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
るＣ末端アミド化物とグリオキシル酸を生成し、かつゲ
ル濾過を用いる分子量決定法により約４０．０００ダル
トンの分子量を有するＣ末端グリシン付加体のＣ末端ア
ミド化に関与する酵素（以下「酵素一■」という場合も
ある）が提供される。

（Ｈ） この酵素の特定に使用されるχ−Ｎ−Ａ−Ｃｏ部の意義
および分子量決定法は、酵素−■の特定に用いたのと同
一である。なお、酵素一■の酵素活性を確認するために
好ましい基質としては、前記酵素一■について具体的に
列挙した基質に対応するα−ヒドロキシルグリシン化物
が挙げられる。また酵素一■はその他の理化学的性質と
して酵素＝■とほぼ同一の性質を有すことにより特定さ
れる。

すなわち、 （ｉ）至適ｐＨが約５〜６でかつ安定ｐｕが４〜９にあ
り、 （ｉ：）作用適温が１５〜３５゜Ｃの範囲にあり、（山
）金属イオンを補因子とする。

上記（ｉ）および（ｉｉ）の性質は、通常使用される緩
衝液、具体的には、トリスー塩酸、メス水酸化カリウム
、テスー水酸化ナトリウム、ヘペスー水酸化カリウム緩
衝液を用いて測定したものである。なお、本発明の酵素
組成物は、１゜Ｃ〜５５゜Ｃの温度範囲内で前記反応を
触媒するが、５６゜Ｃでは約１０分で失活し、４０゜Ｃ
付近でも若干の失活がみられる。

金属イオンとしては、Ｃｕ”　．　Ｚｎ”　，　Ｎｉ”
　，　Ｃｏ”Ｆｅ”″等が適当であり、特にＣｕ”　，
　Ｚｎ”が好ましい。

算聚夏胤製 以上で説明した本発明の酵素−■および酵素一■は、該
酵素活性を有する原料からそれ自体公知の酵素の分離精
製法により調製することができるが、好ましくは、本明
細書に開示する以下の本発明の調製方法により得ること
ができる。すなわち、酵素−■または酵素−■の酵素活
性含有物を、前記式（Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付
加体をリガンドとする基質親和性クロマトグラフィー、
および陰イオン交換クロマトグラフィーで処理すること
を特徴とする酵素−■または酵素一■の調製方法が利用
できる。

この方法に用いる原料は、本発明の酵素を含むものであ
ればすべて対象にすることができるが、後述する酵素−
■の探索方法に準じて探索される高含有量の酵素−■ま
たは酵素−■を有する生物体由来のものが好ましい。一
般に、これらの酵素活性を有する生物としては、ヒト、
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラットおよ
びマウスなどの噛乳類、ニワトリ、ヤケイおよびカワラ
バトなどの鳥類、イシガメ、マムシ、ガラガラヘビおよ
びコブラなどの爬虫類、イモリ、アフリカツメガエル、
ウシガエルおよびヒキガエルなどの両生類、ヤツメウナ
ギ、メクラウナギ、アブラザメ、シビレエイ、チョウザ
メ、ニシン、サケ、ウナギ、トラフグおよびタイなどの
魚類、ワモンゴキブリ、カイコ、ショウジョウバエおよ
びミツバチなどの昆虫が挙げられる。また、好適な抽出
対象物としては、脳、下垂体、胃、心臓および肝臓など
の器官に由来する均質化物ならびに血液およびリンパ液
などの体液などを含む生物学的流体が挙げられる。

すなわち、前述のような本酵素を有する生物学的流体を
、次式（Ｉ） （上式中、ＡおよびＸは前記の意味を有する）で示され
るＣ末端グリシン付加体をリガンドとする基質類似体親
和性クロマトグラフィーを用い、必要により、酵素の精
製に常用される （Ｉ）沈澱による分画、 （２）ヘバリン親和性クロマトグラフィー、（３）透析
、ゲル濾過等により分子量分画方法、および／または （４）イオン交換クロマトグラフィーとを組み合せて使
用することにより本発明の酵素（酵素−■および酵素−
■）を得ることができる。

前記のリガンドとしては、前述の式（Ｉ）で示されるＣ
末端グリシン付加体であればすべて使用できるが、前記
酵素活性を確認するために好ましいものとして具体的に
列挙したグリシンを含め２〜６個のアミノ酸残基からな
るペブチド類が挙げられる。これらのうち、Ｄ−Ｔｙｒ
−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ，　Ｐｈｅ−ＧｌｙＰｈｅ−Ｇｌｙお
よびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙがより好ましいものである
が、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙをリガンドとする
ものが、本発明の酵素（本酵素ともいう）に強い親和性
を有することから特に好ましい。

これらのりガンドは、通常、水不溶性担体に結合せしめ
て使用されるが、リガンドとして用いられるペブチドの
Ｃ末端グリシン残基のカルボキシル基は、遊離の状態で
あることが本酵素との結合に重要であり、Ｎ末端のアミ
ノ酸残基のアミノ基を介して担体と結合させる必要があ
る。すなわち、担体としては、ペプチドのアミノ基と結
合可能なものであれば何でもよ《、またアミノ基と反応
する活性基を担体に化学的に導入しても、また、既に導
入された市販の担体を使用してもよい。化学的に導入す
る方法は、一般に使用されている方法でよく、例えば、
“生化学実験法第５巻上巻２５７頁〜２８１頁“゜笠井
著　東京化学同人（Ｉ９７５）に記載されているように
、例えばアガロースに臭化シアンを用いて、イミドカル
ボキシル基を導入する。

市販されている活性化された担体は、基材を指標とする
と、例えばアガロース系、セルロース系、親水性ポリビ
ニール系等があるが、これらどれを用いても構わない。

アガロース系担体としては、リガンドのアミノ基との結
合方法にＣＮＢｒ法を用いるＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社製）、カルボジイミド法を用い
るＣＨ−セファロース４Ｂ，ＥＣＨ−セファロース４Ｂ
（以上、ファルマシア社製）、アフィゲル１０、アフィ
ゲル１５（以上、バイオランド社製）、トレシルクロラ
イド法を用いるトレシル活性化セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア社製）等が挙げられる。セルロース系担体とし
ては、ホルミル法を用いるホルミルセル口ファイン（チ
ッソ社製）が挙げられる。親水性ポリビニール系担体と
しては、カルボジイミド法を用いるＡＦ一カルポキシト
ヨパール６５０、ホルミル法を用いるＡＦ−ホルミルト
ヨパール６５０、トレシルクロライド法を用いるＡＦ−
１−レシルトヨパール６５０、エポキシ活性化法を用い
るＡＦ−エボキシトヨパール６５０（以上東ソー社製）
等が挙げられる。リガンドとの結合反応はそれぞれの担
体の使用説明書に従い反応させれば良い。

このうち、アフィゲル１０について作製方法を記載する
。アフィゲル１０とペプチドとの反応は０．００１〜Ｉ
Ｍ好ましくは０．　１　Ｍのモツプスー水酸化カリウム
等の緩衝液中で行う。反応条件はＯ〜２０″Ｃ、１０分
〜２４時間、ｐＨ３〜１１程度が可能であるが、好まし
くは４゜Ｃ、４〜２４時間、ｐＨ５〜９の条件で行う。

アフィゲル１０と結合に用いるベプチドの混合比は、ア
フィゲルＩＦＲｌに対し、ペプチドが約２５μｍｏｌま
では多く加える程多く結合するので、その範囲内でいく
らでもよいが、結合効率の点から１〜２０μＩｌｉｏ２
程度が好都合に用いられる。反応後、反応時に用いた緩
衝液で十分に洗浄後、トリス塩酸（ｐＨ８．０）を最終
濃度５０ｍＭになるように添加し、４　”Ｃで１時間振
盪させる等の方法で未反応の活性基をブロックする。以
上で基質類似体親和性ゲルが作製される。

基質親和性クロマトグラフィーは、バッチ式でもカラム
に充填して連続式に行ってもよい。試料とゲルを接触さ
せる時間は、本酵素が十分に吸着する程度であればよい
が、通常、２０分〜２４時間である。ゲルの平衡化に用
いたものと同じ組成の低イオン強度でｐＨが６．０〜１
１．０好ましくは７．０〜９．０の緩衝液、例えば１０
ｍＭヘペスー水酸化カリウム（ｐＨ７．０）で非吸着成
分を十分に洗い出す。そのうち、本酵素活性の存在する
両分を溶出する。

溶出液は、本酵素が効率良く得られる組成であれば何で
もよいが、好ましいものとしては、１〜４０％程度のア
七ト二トリルと共に０．１〜ＩＯＭ塩化ナトリウムを含
むｐＨ７．０〜９．０の間の緩衝液、例えば２０％アセ
トニトリル、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭヘ
ペスー水酸化ナトリウム（ｐＨ７．０）が挙げられる。

また、溶出はカラムに充填した場合、濃度勾配をかけて
も構わない。

また、場合により、前記基質類似体親和性クロマトグラ
フィー〔以下、（５）で表す〕工程を実施する前または
後、あるいは前後両方に先に掲げた沈澱による分画〔以
下、（Ｉ）で表す〕、ヘバリン親和性クロマトグラフィ
ー〔以下、（２）で表す〕透析、ゲル濾過等による分子
量分画〔以下、（３）で表す〕及び／または、イオン交
換クロマトグラフィー〔以下、（４）で表す〕工程を実
施してもよい。こうして本酵素（酵素−■および酵素−
■）は他の夾雑物から分離することができるが、その酵
素−■と酵素−Ｈの分離には、（３）および／または（
４）の工程を実施することが有効である。一般的に、こ
れらの総数１〜６工程を実施し、さらに上記（５）また
は（３）工程を最終段階に実施することが好ましい。各
工程の組み合わせの具体例としては、（５）のみ、（Ｉ
）→（５）．（５）→（３），（２）→（５），（Ｉ）
→（３）→（５），（２）→（３）→（５）．（Ｉ）→
（５）→（３）．（２）→（５）→（３），（２）→（
Ｉ）→（５），（Ｉ）→（２）→（３）→（５），（Ｉ
）→（２）→（５）→（３），（Ｉ）→（３）→（５）
→（３），（Ｉ）→（２）→（Ｉ）→（５），（Ｉ）→
（２）→（Ｉ）→（３）→（５）．（２）→（Ｉ）→（
５）→（３Ｌ（２）→（Ｉ）→（３）→（５）．（２）
→（Ｉ）→（３）→（５）→（３），（Ｉ）→（２）→
（３）→（５）→（３）．（Ｉ）→（３）→（２）→（
３）→（５），（Ｉ）→（３）→（２）→（３）→（５
）→（３），（４）→（３）→（５）．（５）→（３）
→（５）→（３），（Ｉ）→（５）→（３）→（５）→
（３），（４）→（５），（Ｉ）→（３）→（５）→（
４）→（３）．（Ｉ）→（３）→（４）→（３）→（５
）．（Ｉ）→（２）→（３）→（５）→（３）→（４）
，（Ｉ）→（２）→（３）→（５）→（４）→（３）、
または（４）→（５）→（３）、等が挙げられる。これ
らのうち、　（Ｉ）→（２）→（３）→（５）．（Ｉ）
→（２）→（３）→（５）→（３），（Ｉ）→（３）→
（２）→（３）→（５）または（Ｉ）→（３）→（２）
→（３）→（５）→（３）．（Ｉ）→（２）→（３）→
（５）→（４）→（３）、の順に工程を進めるのがより
好ましい。

以下、前記（Ｉ）〜（４）工程についても詳細に説明す
る。なお、これらはすべてＯ″Ｃ−１０″Ｃ、好ましく
は４℃で行う。

（Ｉ）の沈澱による分画に使用される物質としては、硫
酸アンモニウム等の塩類、エタノール、アセトンなどの
有機溶媒、ポリエチレングリコール等のポリマー類が挙
げられる。添加する濃度は、特に制限はないが、本酵素
が収率良く回収でき、しかも他の蛋白質成分と分離でき
る条件が好ましい。例えば、３０〜５０％飽和硫酸アン
モニウム、１０〜１５％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコ
ール６０００の添加では、本酵素は沈澱画分に来るのに
対し、多くの蛋白質は上澄部分に存在するので、効率よ
く精製される。なお添加は、スターラーで撹拌しながら
序々に行うのが好ましい。添加終了後少なくとも１時間
以上静置したのち、遠心分離により、本酵素の存在する
画分を回収する。沈澱画分を回収した時には、これを適
当な緩衝液に溶解する。

緩衝液、ｐＨ６．０〜Ｉ１．０、好ましくはｐＨ７．０
〜９．　０であれば組成は何でもよく、例としては、ト
リスー塩酸、ヘペスー水酸化カリウム、テスー水酸化ナ
トリウム等が挙げられる。また濃度は、緩衝能を保てる
範囲であれば特に制限はないが、５〜５０１程度が好ま
しい。

（Ｉ）によって得た活性画分は、次に、再度（Ｉ）を行
っても（２）〜（５）のうちの１つの工程いずれに進ん
でもよいが、（Ｉ）の分画に硫酸アンモニウム等の塩類
を使用し、（２）か（４）または（５）に進む時は、（
３）の工程か、あるいは適当な緩衝液を添加して次の工
程で用いるゲルに本酵素が結合可能な塩濃度に下げる必
要がある。また、沈澱を溶解して１時間以上静置した場
合や、透析を行った場合には、不溶性の物質が生じるこ
とがあるので、これを例えば、遠心分離や濾過を行って
除去する。

（２）のヘパリン親和性クロマトグラフィーについては
、バッチ式でもカラムにゲルを充填して連続式に行って
もよい。ヘパリンをリガンドとしたゲルは、市販されて
いるものとして、ヘバリンセファロースＣＬ−６Ｂ（フ
ァルマシア社製）、アフィゲルヘパリン（バイオランド
社製）、ヘパリンアガロース（シグマ社製）、ＡＦ−ヘ
バリントヨバール６５０（東ソー社製）等がある。

生体抽出液を直接、あるいは（Ｉ）に示した沈澱による
分画の処理を行ったのち、ヘパリン親和性ゲルと接触さ
せる。接触時間は、本酵素が十分に吸着する程度であれ
ばよいが、通常は２０分〜１２時間である。ヘパリンに
親和性のない成分を、本酵素が溶出されない程度にイオ
ン強度が低く、９Ｈが６．０〜１１．０好ましくは７．
０〜９．０の緩衝液、例えば、１０ｍＭのヘペスー水酸
化カリウム（ｐＨ７．０）で十分に除去する。そののち
、本酵素を含む画分を溶出する。溶出液としては、本酵
素活性の回収率が高いものがよく、例えば、０．５Ｍ−
２Ｍの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウ
ム等一般に酵素精製に用いられる塩類を含むｐＨ６．０
〜１１．０を有するものが好ましい。溶出は、カラムに
充填してある場合、塩濃度勾配によっても一段階溶出を
行っても構わない。例えば、０．　３　−　２．　０Ｍ
の塩化ナトリウムを含む１０ａ＋Ｍヘペスー水酸化カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出する。

（２）の工程で得た活性画分は、次に（Ｉ）〜（４）い
ずれの工程に供してもよいが、再度（２）を行ったり、
（４）または（５）に進む場合には、（３）を先に行う
か、多量の５０ｍＭ以下の低イオン強度のｐｎｓ．ｏ〜
１１．０、好ましくは７．０〜９．０の緩衝液、例えば
５ｓＭヘペスー水酸化カリウム（ｐＨ７．０）等を加え
て（２），（４）または（５）で使用するゲルに本酵素
が吸着できるイオン強度にまで下げる必要がある。

（３）の透析、ゲル濾過等による低分子物質の除去の工
程であるが、透析の場合、使用する膜は、本酵素が通過
できない程度の分画分子量のものであればよいが、１，
０００〜１０，０００が好ましい。透析の方法は、例え
ば、“生化学実験講座第５巻上巻２５２頁〜２５３頁”
左右田著　東京化学同人（Ｉ９７５）に記されているよ
うな一般に使用されるものでよく、数時間〜数日、イオ
ン強度の低い、ＰＨ６．０〜１１．０、好ましくはｐＨ
７．０〜９．０の緩衝液、例えば１　０ｍＭヘペスー水
酸化カリウム（ｐＨ７．　０　）　、１０ｍＭトリスー
塩酸（ｐＨ７．５）等に対して行う。また、透析の際、
不溶性の物質が析出した場合には、例えば遠心分離、濾
過等によって除去する。

ゲル濾過については、一般的にゲル濾過用担体として用
いられるものであれば何でも構わない。

例えばセ７アテックスＧ−１０，Ｇ−１５．Ｇ−２５，
Ｇ−５０．Ｇ−７５　，　Ｇ−１００　、セ７　ｙ　’
）リルｓ−２００，　Ｓ−３００　（以上ファルマシア
社製）トヨバールＨＷ−４０，　ｆ｛Ｌ５５　（東ソー
社製）、ハイオゲルＰ−２．　Ｐ−４，　Ｐ−６，　Ｐ
−１０，Ｐ−３０，　Ｐ−６０，　Ｐ−１００（以上バ
イオラッド社製）等が好ましい。なお、使用すべき緩衝
液は、透析の際に用いるべき組成と同様である。ただし
、イオン強度があまりに低いと本酵素のゲルへの吸着が
起こることが考えられるので、濃度を５〜２００＋ｎＭ
好ましくは１０〜２０ｍＭにする。ゲル濾過の方法は、
例えば、“生化学実験講座第５巻上巻２８３頁〜２９８
頁″左右田著東京化学同人（Ｉ９７５）に記載されてい
るように行えば良い。ゲル濾過担体のヘッド体積に対し
十分な分離能が得られる量の試料を添加後、溶出を行い
、本酵素活性の存在する画分を回収する。

（３）の工程によって得られた活性画分は、特別な処理
なしに（Ｉ）〜（５）の各工程に進めることができる。

イオン交換クロマトグラフィーについては、一般に市販
されているイオン交換クロマトグラフィー用担体であれ
ば何でも構わない。例えば、Ａｍｉｎｅｘ，　［ｌｏｗ
ｅｘ，　Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ，　ＳＰ−Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ　Ｍ＋八ｓａｈｉｐａｋ，　　ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ，　　ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ．ＣＭ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ．　ＤＥＡＥ，　Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　
Ａ＋　ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌ
ｕｌｏｆｉｎｅ，　Ｐａｒｔｉｓｉｌ　ＳＣＹ，　Ｍｏ
ｎｏ　ＱおよびＭｏｎｏ　Ｓ等が好ましい。なお、使用
すべき緩衝液および使用方法は、ヘパリン親和性ゲルの
項に記載した方法に準じれば良い。また、基本的な操作
方法は、「新基礎生化学実験法２、抽出・精製・分析Ｉ
Ｊ　　（丸善、１９８８　）などに記載された一般的な
方法に従えば良い。

（４）の工程で得た活性画分を、次に（Ｉ）〜（５）い
ずれかの工程に供しても良いが、再度（４）を行ったり
、あるいは（２）または（５）に進む場合には、（３）
を先に行うか、多量の５０ＩＩＩＭ以下の低イオン強度
のｐＨ５．０〜１１．０、好ましくは６．０〜８．０の
緩衝液、例えばヘペスー水酸化ナトリウム（ｐＨ７．０
）等を加えて、（２），（４）または（５）で使用する
ゲルに本酵素が吸着できるイオン強度にまで下げる必要
がある。以上の精製工程を経ることにより、本発明の酵
素の粗生成物が得られる。かかる、酵素の粗生成物は、
さらに、（３）のゲル濾過工程を用いるタンパク質分離
手段により、分子量約２５，０００および分子量約４０
，０００にそれぞれピークを有する両分に単離して、本
酵素標品とすることができる。

以上の各工程は、それぞれ後述のもう一つの本発明であ
る酵素の活性の測定方法に準じて、式（Ｉ）または式（
ｎ）の化合物を基質に使用して酵素−■および／または
酵素−Ｈの活性を追い、活性画分を得ることによって実
施される。

前Ｊｌｌ旧１ｑ侠月一 本発明の酵素を含む組成物の使用により次の、第４およ
び第５の本発明、すなわち、前記式（Ｉ）で示されるＣ
末端グリシン付加体を、前記酵素−■を含む組成物で処
理することを特徴とする前記式（Ｉ［）で示されるＣ末
端α−ヒドロキシルグリシン付加体の製造方法、ならび
に式（ｎ）で示される前記付加体を酵素−■を含む組成
物で処理することを特徴とする前記式（ＩＩＩ）で示さ
れるＣ末端アミド化物の製造方法が提供できる。またこ
れらの酵素−■および酵素−■は併用することにより単
一反応組成物中で式（Ｉ）の化合物を式（Ｉ［）の化合
物まで転化することができる。式（Ｉ）から式（Ｉｌｒ
）の化合物への転化の工程に酵素−■を使用することは
、酵素−■型の酵素のみの存在下では式（Ｉｔ）から式
（ＩＩＩ）の化合物への転化に際し、化学的加水分解条
件にさらす必要があるのに比べ、より緩和な酵素反応条
件下で前記転化が達成できるので有意であることが明ら
かであろう。

特に、アルカリ条件下で不安定な基質類の処理に適する
。

これらの製造方法は、本発明の酵素を含有するものであ
ればその濃度、純度を問うことなく使用できるが、反応
混合物からの生成物、式（ＪＴ）の化合物の単離精製を
考慮すると夾雑タンパク譬が大幅に除去された本発明の
酵素含有物を使用するのが有利である。なお、本酵素活
性を有する生体抽出液を使用するなら、そのまま、ある
いは単にそれらの濃縮物をも使用することができる。

式（Ｉ）の化合物としては、前述のものが全て含まれる
が、これらの製造方法での使用に適するものとしては、
特に式（Ｉ）の化合物、例えばアルギニンバソトシン（
ＡＶＴ）　、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−Ｒ
Ｈ）　、オキシトシン、ガストリン、ガストリン分泌促
進ペプチド（ＧＧＲＰ）、カルシトニン（ＣＴ）　、血
管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）　、甲状腺刺激ホルモ
ン放出ホルモン（ＴＲＨ）　、黒色素胞刺激ホルモン（
ＭＳＨ）　、Ｍ　Ｓ　Ｈ放出抑制ホルモン（ＭＩ｝ｌ）
　、コレシストキニンオクタペプタイド（ＣＣＫ−８）
　、サブスタンスＰ（ＳＰ）、脂肪動員ホルモン、膵ポ
リペプチド（ＰＰ）、成長ホルモン放出因子、セクレチ
ン、セルレイン、軟体動ｈ性心臓興奮性神経ペブチド、
バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、
変色ホルモン、ボンベシン、明順応ホルモン、モチリン
、アバミン、アリテシン、エレドイシン、カツシニン、
グラニュリベリンＲ１スコトホビン、ヒランベートセル
レイン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、フイサレミン、フィ
ロセルレイン、フィロメズシン、プロメリチン、ポンビ
ニン、マストパラン、マストノぐランーＸ、メリチン−
１、ラナテンシンおよびラナテンシンーＲ等に本製造方
法で転化することができる、それらの対応する式（Ｉ）
または式（ＩＩ）で示される化合物が好ましい。

前記処理は、通常の緩衝液中、特に酵素−■を用いる反
応では反応液にアスコルビン酸およびカタラーゼを添加
して実施することができるが、それぞれ適当量の金属イ
オンの存在下、次に示す酵素活性の測定方法の条件を考
慮して実施することが好ましい。

前述の本発明の酵素−■および酵素一■は、以下の活性
の測定方法により追跡することができ、またこの測定方
法は、前述の本酵素の調製方法を合理的に実施するのに
役立つ。

無論、これらの測定方法は、Ｃ末端アミド化反応が従来
考えられていたような１段階の反応ではなく、中間体（
Ｃ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体）を介した２段
階反応であるとの知見に基づくものである。

まず最初に、酵素−■の活性は、（ｉ）その活性を有す
ることが予測される被験体をｐＨ５〜８に緩衝化する工
程、（　ｉｉ　）この緩衝溶液に前記式（Ｉ）で示され
るＣ末端グリシン付加体ならびにＬ−アスコルビン酸お
よびカタラーゼを添加してインキユベーションする工程
、ならびに（ｉｎ）式（ＩＩ［）で示される反応生成物
をアセトニトリル含有緩衝液（ｐＨ６〜１０）を使用す
るＨＰＬＣで検出する工程を含むことを特徴とする方法
により測定される。

また、酵素−■の活性は、（ｉ）その活性を有すること
が予測される被験体をｐＨ４〜８に緩衝化する工程、（
　ｉｉ　）この緩衝溶液に式（ｆｆ）で示されるＣ末端
α−ヒドロキシルグリシン付加体を添加してインキユベ
ーシゴンする工程、ならびに（ｉｊ）生成する式（ＩＩ
Ｉ）で示されるＣ一末端アミド化物を検出する工程、を
含むことを特徴とする方法により測定される。

これらの方法は、それぞれ本出願の第６および第７の発
明として提供される。

これらの発明にいう被験体としては、それらの酵素活性
を有する流体であればいずれも包含され、特に、それら
の活性を有する生物学的流体、すなわち生物の器官の均
質化物、ならびに体液、例えば血液およびリンパ液、さ
らにこれらの精製処理などの処理液が挙げられる。また
、微生物細胞に由来する処理液も生物学的流体に包含さ
れる。

これらの被験体の緩衝化に使用する緩衝剤は特に制限さ
れず通常使用されるものが用いられる。

例えばトリスー塩酸、ヘペスー水酸化カリウムがあげら
れる。緩衝溶液中の緩衝剤の濃度は緩衝作用が達成され
る限りいかなる濃度でもよいが、通常は２０〜２００ａ
＋Ｍが適当である。

それぞれの緩衝溶液は、第６の発明（「前者」という）
についてはｐＨ６〜８、好ましくはｐ｝１６．５付近に
調節し、第７の発明（「後者」という）についてはｐＨ
４〜８、好ましくはｐＨ６付近に調節する。こうして調
製した緩衝溶液に前者で添加されるＣ末端グリシン付加
体としては、当該酵素の基質であって、前述の酵素−■
の活性を確認するために好ましい基質として列挙した式
（Ｉ）で示されるものを用いるのが好ましい。この化合
物の濃度は、−ａに０．　１　ｍ〜２ｍＭ程度が適当で
ある。さらに、補因子として機能することが考えられる
し−アスコルビン酸、活性化剤としてカタラーゼの添加
が必要である。一般に、Ｌ−アスコルビン酸の濃度は、
０．５〜２ｍＭが好ましく、またカタラーゼの濃度は４
０〜１００ｘ／ｄが適当である。また、緩衝溶液に金属
イオンを添加してもよいが、この添加は本活性測定に特
に要求されるものでなく、添加により無添加の場合より
もより高い活性が得られることがあるので添加すること
が好ましい。

使用する金属イオンとしてはｚｎ２＋　，　ＣｕＺ＊．
　Ｈｉｌ＋Ｃｏ”　，　Ｆｅ”等が適当であり特にＣｕ
”およびＺｎ２＋が好ましい。金属イオンの緩衝溶液中
の濃度はＯ〜１０００禮、好ましくは０〜１０オが適当
である。限定されるものでないが、かかる金属イオンを
提供する化合物は、ＣＩＩＳＯ４１　ＣｕＣｆ，，　Ｚ
ｎＣｌｚ．　Ｎｉ（／！２，ＣｏＣｆｚ，　ＦｅＣｆ３
等があげられる。

このような反応組成物の具体的なものとしては、例えば
、後述の実施例２の組成が参考となろう。

一方、後者における反応組成物は、前記式（Ｉ）の化合
物に代え対応する式（ＩＩ）の化合物を使用して調製す
る。この場合、アスコルビン酸、カタラーゼ等の補因子
は必要でない。

両測定方法とも、被験体の使用量は特に限定なく種々変
化させることができるが、反応系に存在する基質の量（
ａナノモル（ｎｍｏ　ｌ　）とする）に対し、好ましく
はａｐｎ＋ｏｌ／ｈｒ以上、さらに好ましくは１０Ｘａ
　ｐｍｏｆ　／ｈｒ以上、もっとも好ましくはｌＱＸａ
　ｐｍｏｊ！　／　ｈｒ−ａ　ｍｏｌ　／ｈｒ　（単位
は酵素活性を示し、３７゜Ｃ１時間で反応しうる基質量
（例えばビコモル（ｐｍｏｆ）で表示する。〕の酵素活
性を含有するように調整するのが適当である。

インキュベーションは、１〜５５゜Ｃ、特に前者では好
ましくは２５〜４０゜Ｃ、特に好ましくは３０゜Ｃ付近
で振盪しながら２〜２４時間反応させ、後者では好まし
《は１５〜３５゜Ｃ、もっとも好ましくは２５゜Ｃ付近
で静置して１分〜４８時間行う。

以上の工程で、それぞれ生成する式（ＩＩ）の化合物お
よび式（ＩＩ［）の化合物の検出は、それらの基質と生
成物、例えば、前者では式（Ｉ）の化合物と式（ｆｆ）
の化合物、後者では弐（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩ［）
の化合物を分離測定できる方法であればどのような方法
でも使用できる。一般に分離測定は、以下のクロマトグ
ラフィーで分離、精製して行うことができる。上記に使
用できるクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロ
マトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、
アフィニティーク口マトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ−（Ｔ
ＬＣ）などが挙げられる。後者の反応系における式（Ｉ
Ｉ）で示される基質と式（Ｉ［［）で示されるアミド化
された生成物は、Ｃ末端がそれぞれカルボキシル基とア
ミド基であり、電荷が異なっている．この性質を用いた
イオン交換クロマトグラフィー逆相クロマトグラフィー
などが好適である。また、生成物の抗体を用いたアフィ
ニティーク口マトグラフィーも有効である。しかしなが
ら、前者の反応系における式（Ｉ）で示される基質と式
（ＩＩ）で示される生成物は、通常のクロマト処理では
分離がかなり困難であるが、本発明者らが初めて試みた
アセトニトリル含有緩衝液（ｐＨ　６〜１０、好ましく
はｐｏ９）を溶出液として用いる高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）によれば有利に分離測定できる。溶
出液は、特にアセトニトリル濃度の直線濃度勾配をかけ
て行うのがよい。｝ＩＰＬｃＯカラムとしては、本目的
に適するものであれば市販のどのような種類のカラムを
使用することもできるが、特に、カプセルパックＣ１８
３Ｇ，　３００人（資生堂製）を使用するのが有利であ
る。

かくして、それぞれ分離された基質と生成物はそれらの
（必要により結合された）いずれかの化学的または物理
的標識について測定すればよい。

この測定には、既知の標識、既知の測定法が使用でき、
一般には基質ペプチドを構造するアミノ酸に由来するＵ
Ｖ吸収を利用するのが好都合であろう。

以上の測定方法は正確かつ簡便であるので、これらを前
述の生物学的流体に適用することにより、それぞれ酵素
−１または酵素−Ｈの活性を有する酵素の探索を行うこ
とができる。かかる探索方法は、それぞれ本出願の第８
および第９の発明として提供される。

探索の対象となる生物学的流体は、前述の酵素活性を有
することが予測されるものは無論のこと、その他動植物
の生体細胞、組織、抽出液のいずれをも包含する。例え
ば、抽出液は、「実験生物学講座６、細胞分画法」　（
丸善、１９８４）、「生化学実験講座５、酵素研究法（
上）」（東京化学同人、１９７５）　、ｒ基礎生化学実
験法１、生物材料の取扱い方」　（丸善１９７４）　、
などに記載の一般的な抽出法に準じて調製すれば良い。

〔実施例〕

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。な
お、本発明はこれによって限定されるものではない。

５ｄのアフィゲル１０を、イソプロパノールを満たした
１〇一容エコノカラム（バイオラツド社製）に計り取っ
た。イソプロパノールを流し出したのち、５０１ＩＩｌ
のｌＯｎ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）、次
いで１０−の０．　１　Ｍモツプスー水酸化ナトリウム
緩衝液（８０ｍＭ塩化カルシウムを含む、ｐＨ７．５）
で洗浄した。ゲルを２０ｄ容のビンに移したあと、４０
■（約１００μｍｏｆ）のフエニルアラニルグリシルフ
エニルアラニルグリシン（Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ、シグマ社製）を溶解した上記モツプスー水酸化ナ
トリウム緩衝液１０−と混合し、４゜Ｃで１８時間振盪
反応させた。そののち、０．　５　ｄのＬＭ｝リスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて４゜Ｃで１時間振盪反
応し、未反応の活性基を不活化した。ゲルを前記モ冫プ
スー水酸化ナトリウム緩衝液、次いでイオン交換水で洗
浄後、０．０２％ＮａＮ．に懸濁し、カラムに充填、４
゜Ｃで保存した。なお、反応に供したベプチド（Ｐｈｅ
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の量と回収された溶液中の
ペプチド量から、ゲル１戚あたり約１０μｍｏｆ結合し
ていると算出された。

フェニルアラニルグリシルフェニルアラニルグリシン（
ＦＧＦＧ）　（シグマ社製）３■を測り取り、５０ｆｆ
ｌＭヘベスー水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ５．　５　）
　、３ｍＭアスコルビン酸、１０ｍＭヨウ化カリウム、
０．２５■／ｍｌ！カタラーゼ、０．２５ｎＭ硫酸銅、
７．５％アセトニトリル及び国際特許出願ＪＰ８９−０
０５２１号明細書の実施例２に記載するようなウマ血清
由来のアミド化酵素組成物を２００ＩＪ１添加し総量１
０ｄとし、３０゜Ｃで２０時間、好気的にアミド化反応
をおこなった。反応は１０％ギ酸添加で停止させ、高速
液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）を用いて、フエニ
ルアラニルグリシルフェニルアラニルヒド口キシルグリ
シン（ＦＧＦｈｙＧ）を分取した。ＨＰＬＣのカラムは
カプセルパックＣ１８ＳＧ，　３００人（資生堂製）を
用いた。溶出溶媒は、１ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐ
Ｈ９．０）およびアセトニトリルを使用し、アセトニト
リルを０％から４０％まで３０分で増加させる直線濃度
勾配をかけた。ベプチドは２１４ｎｍの吸収で検出した
。結果を第１図に示した。１０．７分のフエニルアラニ
ルグリシルフエニルアラニルグリシンのピークは、Ｃ末
端アミド化反応によりほとんど消滅した。それに伴ない
、９．９分のα−ヒドロキシグリシン誘導体および１４
．５分のアミド化体のピークが見られた。これらの物質
は、ＦＡＢ−ＭＳスペクトル分析およびＮＭＲ分析によ
り構造確認した。第２図に、グリセリン溶液中のＦＡＢ
−ＭＳスペクトルの結果を示した。親ピークは分子量４
４２をあらわしており、そしてフラグメンテーションの
結果、Ｃ末端に存在する一〇Ｈ基が１つまたは２つ飛ん
だ４２５および４０８ｍ／ｚのフラグメントが確認され
、α−ヒドロキシルグリシン付加体であることを示して
いた。

９．９分のピークを分取し、すみやかに１０％ギ酸溶液
とし、凍結乾燥することにより本発明の酵素■用の基質
を調製した。この基質は、前記アミド化酵素組成物に代
え、本発明の酵素一Ｉ含有物を用いても同様に調製する
ことができた。前述のごとく、α−ヒドロキシルグリシ
ン誘導体は酸性条件では安定であるが、アルカリ条件で
は不安定であり、酸素反応とは無関係にアミド化物とグ
リオキシル酸に分解する。従って、本実施例の最初にお
こなったＣ末端アミド化反応は、酸性条件で実施した。

このとき、ｐＨ７．５以上で反応させると、α−ヒドロ
キシルグリシン誘導体は確認できな《なる。公知のＣ末
端アミド化酵素が前述の式（Ｉ）で示されるＣ末端グリ
シン付加体から式（Ｉ［［）で示されるＣ末端アミド化
物とグリオキシル酸に変換すると考えられていたのは、
このアルカリ条件での非酵素的変換が含まれていたため
であり、酵素自体の触媒反応は、式（Ｉ）で示されるＣ
末端グリシン付加体から式（ＩＩ）で示されるＣ末端α
ヒドロキシルグリシン付加体への変換反応である。従っ
て、従来のＣ末端アミド化酵素による酸性条件下でのア
ミド化反応の収率は、一般に低いものであった。

遺１１例』−　ウマ血′からの　　−■の（Ｉ）市販の
ウマ血清（ギブコ社製）１００ｄに、ポリエチレングリ
コール６０００　（和光純薬）２５％水溶液（ｗ／ｖ　
）を１００−、すなわち最終濃度１２．５％になるよう
に撹拌しながら序々に添加した。なお、以下すべて４゜
Ｃにて操作を行った。１２時間静置後、遠心分離（Ｉ０
，ＯＯＯｘ　ｇ、１０分）し、得られた沈澱を１２０１
Ｒ１の１０ｍＭヘペスー水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７
．０）に溶解した、さらに２時間静置後、生成した不溶
性物質を再び遠心分離（Ｉ０，０００ｘ　ｇ、１０分）
で除き、酵素一Ｉを含む上澄（Ｉ２７ｄ）を得た。

（２）上記（Ｉ）で得た活性画分を、１０ｗＭヘペスー
水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヘパ
リンセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）を充
填したカラム（　１．　６　Ｘ１５Ｃ１ｍ）にかけた。

同緩衝液９６ｄで非吸着物質を洗い出した後、０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む１０ｎ＋Ｍヘペスー水酸化カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出を行った（流速３０ＩＲ
Ｉｌ／ｈｒ）第３図に溶出パターンを示した。０．５Ｍ
塩化ナトリウム含有緩衝液によって酵素一Ｉは溶出され
た〔フラクション番号Ｎｏ．１４〜ｌ６を集める（Ｉ０
０ｄ）　）（３）上記画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−
２５ファイン（ファルマシア社製）カラムクロマトグラ
フィー（　５　ｃｍφＸ２３ｃｍ）を用いてゲル濾過を
おこなった。

溶媒は、１　０ｎ＋Ｍヘペスー水酸化カリウム（ｐＨ７
．０）を用い流速２ｄ／ａ＋ｉｎで溶出した。蛋白質は
２８０ｎｍの吸光で検出し、蛋白質を含むフラクション
１００一を集めた。

（４）実施例１に従って作製したアフィゲル１０Ｐｈｅ
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙゲル５ｄをカラムに充填し（
Ｉ．ＯＸ６．３ＣＩ１）　、０．１Ｍ塩化ナトリウムを
含む１０ｍＭヘベスー水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化した。このカラムに上記（３）で得た試料
（Ｉ８．１ｄ）をかけた。酵素−■を十分にゲルに吸着
させるために、カラムを通過した液を何回もカラムを通
るように循環させた（流速２０ＩＩＩ１／ｈｒ）。

１２時間後、循環を止め、非吸着物質を３５戚の平衡化
に用いた緩衝液で洗い出したのち、０．　４　Ｍ塩化ナ
トリウム、２０％アセトニトリルを含む８ｍＭヘペスー
水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出を行った（
流速２０１ｄ／ｈｒ）。酵素−■の活性は溶出画分（Ｉ
０ｄ）にのみ認められた。

（５）上記（４）で得た精製物を、再び上記（３）の処
理を行った後、１０ｍＭヘペスー水酸化カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏ力ラム（ファルマ
シア製０．５Ｘ５ｃｍ）にのせ、同一緩衝液中でＮａＣ
　１の直線濃度勾酸を第３図のようにがけ、蛋白質を溶
出させた。このとき、流速は０．５ｉ１／ＩＩＩｉｎと
した。

第１表に、上記（Ｉ）〜（５）で行った精製の各工程で
の全蛋白質量、全酵素活性、比活性、収率および精製倍
率を示した。

以下余日 マ ゛の の 血清中に存在する董白質分解酵素の影響によるかも知れ
ないが、基質及び生成物が一部分解したため、相対的に
活性が低い。

活性測定法は、実施例２に記載のＦ（；ＦＧからＦｌ；
ＦｈｙＧの調製方法に準ずる反応を各精製物について実
施し、そこに記載のＨＰＬＣによりＦＧＦｈｙｆｌ；を
定量することで行った．酵素活性ＩＵは、ｌｎｍａｔｅ
のＦ（；ＦｈｙＧが３７℃１時間で生成する量とした。

なお、蛍白質量の測定は、ローリーの改良法（Ｂｅｎｓ
ａｄｏｕｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７０，
　２６５．　１９７６）を用い、標準曲線は牛血清アル
ブミン（フラクション■、シグマ社製）で作製した。

第１表で示したように本酵素は、収率２％で約５００倍
に精製できた。さらに精製が必要な場合には前記工程（
３）〜（５）を繰り返すか、それらのいずれかの工程を
繰り返せばよい。

ス」１例」ユ　ウマ血　か゛の　　−■の各精製工程を
酵素一■の活性を追いながら行った以外は実施例３と同
様にウマ血清を処理した。

各精製工程（Ｉ）〜（５）の全蛋白質、全酵素活性、比
活性、収率および精製位率を第２表に示す。

以下余白 ２ ウマ か゛の 一Ｈの 血 清 ７．５００ ２　　１００” ０．２８ 血清中に存在する蛋白質分解酵素の影響によるかも知れ
ないが、基質及び生成物が一部分解したため、相対的に
活性が低い。

活性測定は、１０ｍＭヘベスー水酸化カリウム（ｐＨ６
．５）中に実施例１で得たフエニルアラニルグリシルフ
ェニルアラニルヒド口キシルグリシン（ＦＧＦｈｙＧ）
を５１濃度に溶解し、各段階の試料を添加し、総量１０
０ｌｌｌとして３０゜Ｃで反応させた。１時間反応後１
０％ギ酸添加により反応を停止し、実施例２の条件を用
いＨＰＬＣで反応生成物を定量した。このとき、試料無
添加のコントロールの反応もおこない、非酵素的変換が
ほとんど進んでいないことを確認した。反応溶液のＨＰ
ＬＣパターンを第４図に示す（図中の反応条件は、３７
゜ＣｐＨ６．９で反応時間は図中に示した）活性はユニ
ット（Ｕ）で表示した。ＩＵは、１　ｎｍｏｌｅのＦＧ
Ｆ−ＮＨｚを３０゜Ｃ１時間で生成する酵素量と定義し
た。

なお、蛋白質量の測定は、実施例３と同様に行った。

第２表で示したように本酵素は、収率２％で、約１８０
０倍に精製できた。

〔発明の効果〕

本発明の酵素は、式（Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付
加体から式（ＩＩ［）で示されるＣ末端アミド化物の製
造に際し、使用可能である。また、酵素−■および酵素
−■を併用することにより、式（ＩＩ）で示されるＣ末
端α−ヒドロキシルグリシンは付加体が加水分解されな
いような温和な反応条件下で効率的に式（Ｉ［Ｉ）で示
されるＣ末端アミド化物を製造することが可能になる。

さらに、本発明の調製方法は、前記本発明の酵素組成物
を効率よくかつ高収率で調製できる効果を有する。

本発明のそれぞれの酵素活性測定方法は、Ｃ末端グリシ
ン付加体から式（ｎ）で示されるＣ末端α−ヒドロキシ
ルグリシン付加体へ変換する酵素活性および式（Ｉｆ）
で示されるＣ末端ヒドロキシルグリシン付加体からＣ末
端アミド化物へ変換する酵素活性を迅速かつ正確に定量
することを可能とする。また、これを用いた酵素探索方
法は、従来知ることのできなかった前記活性を有する酵
素の探索を可能にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＦＧＦＧを基質とし、本発明の酵素一Ｉを用
いて、ｐｃｐｈｙｒ；を製造するときのＨＰＬＣパター
ンである。 第２図は、調製したＦＧＦｈｙＧの分子構造を確認する
だめにおこなったＦＡＢ−ＭＳスペクトル分析の結果を
示す。 第３図は、Ｍｏｎｏ　Ｑ力ラムのクロマトグラフィーに
よる本発明の酵素−■と酵素一Ｈの分離を示したクロマ
トパターンである。白四角のプロットは酵素−■の活性
を示し、黒丸のプロットは酵素−■の活性を示し、破線
は食塩の直線濃度勾配を示す。 第４図は、ｐｃｐｈｙｃを基質とし、本発明の酵素一Ｈ
を用いてＦＧＦ−ＮＨｚを製造するときの経時的なＨＰ
ＬＣパターンである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （上式中、Ａは、天然のα−アミノ酸に由来するα−ア
   ミノ基もしくはイミノ基およびα−カルボキシル基以外
   の残基を表しており、Ｘは、水素原子またはカルボニル
   基を介してＮ原子と結合するアミノ酸誘導体の残基を表
   す）で示されるＣ末端グリシン付加体に作用して、次式
   （II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
   るＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体を生成し、か
   つ、ゲル濾過を使用する分子量決定法により約２５，０
   ００ダルトンの分子量を有するＣ末端グリシン付加体の
   Ｃ末端アミド化に関与する酵素。 ２、前記式（II）で示されるＣ末端α−ヒドロキシルグ
   リシン付加体に作用して、次式（III）▲数式、化学式
   、表等があります▼（III） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
   るＣ末端アミド化物とグリオキシル酸の生成し、かつゲ
   ル濾過を使用する分子量決定法により約４０，０００ダ
   ルトンの分子量を有するＣ末端グリシン付加体のＣ末端
   アミド化に関与する酵素。 ３、請求項１または２記載の酵素活性含有物を、前記式
   （ I ）で示されるＣ末端グリシン付加体をリガンドと
   する基質親和性クロマトグラフィー、および陰イオン交
   換クロマトグラフィーで処理することを特徴とする請求
   項１または２記載のＣ末端アミド化に関与する酵素の調
   製方法。 ４、前記式（ I ）で示されるＣ末端グリシン付加体を
   請求項１記載の酵素で処理することを特徴とする前記式
   （II）で示されるＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加
   体の製造方法。 ５、前記式（II）で示されるＣ末端α−ヒドロキシルグ
   リシン付加体を請求項２記載の酵素で処理することを特
   徴とする前記式（III）で示されるＣ末端アミド化物の
   製造方法。 ６、（ｉ）請求項１記載の酵素の活性を有することが予
   測される被験体をｐＨ５〜８に緩衝化する工程、 （ｉｉ）この緩衝溶液に前記式（ I ）で示されるＣ末
   端グリシン付加体、Ｌ−アスコルビン酸およびカタラー
   ゼを添加してインキュベーションする工程、ならびに （ｉｉｉ）生成する式（II）で示されるＣ末端α−ヒド
   ロキシルグリシン付加体をｐＨ６〜１０のアセトニトリ
   ル含有溶出液を使用するＨＰＬＣで検出する工程、を含
   むことを特徴とする前記酵素活性の測定方法。 ７、（ｉ）請求項２記載の酵素活性を有することが予測
   される被験体をｐＨ４〜８に緩衝化する工程、（ｉｉ）
   この緩衝溶液に前記式（II）で示されるＣ末端α−ヒド
   ロキシグリシン付加体を添加してインキュベーションす
   る工程、ならびに （ｉ）生成する式（III）で示されるＣ末端アミド化物
   を検出する工程、を含むことも特徴とする前記酵素活性
   の測定方法。 ８、請求項６記載の測定方法を被験体に適用することを
   特徴とする請求項１記載の酵素の探索方法。 ９、請求項７記載の測定方法を被験体に適用することを
   特徴とする請求項２記載の酵素の探索方法。