JPH03216554A - 粒子標識免疫測定方法および装置 - Google Patents
粒子標識免疫測定方法および装置Info
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- JPH03216554A JPH03216554A JP1060990A JP1060990A JPH03216554A JP H03216554 A JPH03216554 A JP H03216554A JP 1060990 A JP1060990 A JP 1060990A JP 1060990 A JP1060990 A JP 1060990A JP H03216554 A JPH03216554 A JP H03216554A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、微粒子を用いた免疫測定方法およびその装置
に関するものである。
に関するものである。
微粒子を使用した免疫測定方法として、表面に抗体を結
合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ、抗原抗体
反応によって生成するラテックス粒子の凝集状態を吸光
度または散乱光強度により測定して抗原濃度を測定する
方法が知られている（ぶんせき，川， ６０５（１９８
７））。しかし，ラテックス粒子の凝集状態は一定では
なく分布を持つため，反応液全体の平均値を測定するこ
れらの方法では、抗原濃度の算出に精度的な問題があり
，極低濃度の抗原量の定量等が困難であった。 そこで、反応液をフローセルに導いて、セル内を流れる
微粒子の散乱光または蛍光強度を測定する方法が開発さ
れた（検査と技術， １６， ６０７（１９８８）、特
開昭６２−８１５６７、ジャーナル オブ イムノロジ
カル メソッズ（Ｊ． Ｉｎ＋＋＋ｕｎｏｌ． Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ） ， ＩＬ３３（１９７７））。この方法に
よれば、個々の凝集塊の大きさを計測することができる
ことから、抗原濃度の算出精度を向上させることができ
る。 また、蛍光微粒子を用いて抗原抗体反応を起こさせ、そ
の凝集像を画像処理することにより凝集状態を解析し、
抗原濃度を算定する方法もある（特開昭６４−３５３７
３） ， 上記従来方法は、ホモジニアス系でラテックス粒子表面
の抗体（または抗原）と抗原（または抗体）とが反応し
て凝集をおこすことを利用している。そのため、抗原過
剰領域で抗原抗体反応が抑制される現象、いわゆるプロ
ゾーン現象が避けられない。また、試料中に共存する散
乱体や，色素等の吸収体・蛍光体の影響を完全に除去す
ることは困難である。さらに、抗原と抗体とが１対１に
結合するとは限らないため、凝集塊の数を計数する従来
方式では特に極低濃度領域での計数値の誤差が発生しや
すいという問題がある。 プロゾーン現象や共存物質の影響を受けない方法として
、特開昭５６−１５１３５７のようなヘテロジニアス系
の反応がある。しかし、この方法では簡便性・多項目測
定が可能になるが、非特異吸着について考慮されておら
ず、高感度化に対する配慮が成されていない。
合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ、抗原抗体
反応によって生成するラテックス粒子の凝集状態を吸光
度または散乱光強度により測定して抗原濃度を測定する
方法が知られている（ぶんせき，川， ６０５（１９８
７））。しかし，ラテックス粒子の凝集状態は一定では
なく分布を持つため，反応液全体の平均値を測定するこ
れらの方法では、抗原濃度の算出に精度的な問題があり
，極低濃度の抗原量の定量等が困難であった。 そこで、反応液をフローセルに導いて、セル内を流れる
微粒子の散乱光または蛍光強度を測定する方法が開発さ
れた（検査と技術， １６， ６０７（１９８８）、特
開昭６２−８１５６７、ジャーナル オブ イムノロジ
カル メソッズ（Ｊ． Ｉｎ＋＋＋ｕｎｏｌ． Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ） ， ＩＬ３３（１９７７））。この方法に
よれば、個々の凝集塊の大きさを計測することができる
ことから、抗原濃度の算出精度を向上させることができ
る。 また、蛍光微粒子を用いて抗原抗体反応を起こさせ、そ
の凝集像を画像処理することにより凝集状態を解析し、
抗原濃度を算定する方法もある（特開昭６４−３５３７
３） ， 上記従来方法は、ホモジニアス系でラテックス粒子表面
の抗体（または抗原）と抗原（または抗体）とが反応し
て凝集をおこすことを利用している。そのため、抗原過
剰領域で抗原抗体反応が抑制される現象、いわゆるプロ
ゾーン現象が避けられない。また、試料中に共存する散
乱体や，色素等の吸収体・蛍光体の影響を完全に除去す
ることは困難である。さらに、抗原と抗体とが１対１に
結合するとは限らないため、凝集塊の数を計数する従来
方式では特に極低濃度領域での計数値の誤差が発生しや
すいという問題がある。 プロゾーン現象や共存物質の影響を受けない方法として
、特開昭５６−１５１３５７のようなヘテロジニアス系
の反応がある。しかし、この方法では簡便性・多項目測
定が可能になるが、非特異吸着について考慮されておら
ず、高感度化に対する配慮が成されていない。
本発明の目的は、丘記従来技術の問題点を解決し、微粒
子を利用した高感度測定ができる免疫測定方法およびそ
の装置を提供することにある。 ［１１題を解決するための手段】 上記目的は、測定試料中の被測定物質と特異的に結合す
る物質を固定化した反応容器と，該被測定物質と特異的
に結合する物質を固定化した微粒子（微粒子ａ）と、該
被測定物質と特異的に結合する物質を固定化しない種類
の異なる微粒子（微粒子ｂ）を使用し、該反応容器と測
定試料と該微粒子（微粒子ａおよび微粒子ｂ）を接触さ
せることにより、微粒子を反応容器に捕捉し，捕捉した
微粒子の種類毎の微粒子数を計数し、微粒子ｂ数から、
微粒子ａ数中の非特異吸着によって反応容器に捕捉され
た微粒子数を推定することで、被測定物質のみに依存し
た微粒子数を算定することで達成できる， 微粒子を複数の種類に区別するには，蛍光性の微粒子ま
たは非蛍光性の微粒子を使用することで達成でき、粒径
の違い，または／および蛍光の有無、蛍光波長のちがい
によって識別することができる．例えば、直径が０．５
μｍの非蛍光性の微粒子と直径が０．５μｍの緑色蛍光
を発する蛍光微粒子を使うことで，２種類に微粒子を分
類することができる。また、０．４μｍと０．８μｍの
直径の非蛍光性の微粒子を使うことで，または、０．５
μｍの直径の緑色蛍光を発する蛍光微粒子と０．５μｍ
の直径の赤色蛍光を発する蛍光微粒子とを使うことでも
２種類に微粒子を分類することができる． 反応容器に捕捉した微粒子の種類と数を計測するには、
微粒子の像を画像化し、画像処理することで達成するこ
とができ，顕微鏡、画像入力装置（ＴＶカメラ等）、お
よび画像処理装置から成る装置によって達成できる。ま
ず、画像入力装置により得られた画像をもとに、個々の
微粒子の大きさを測定する。次に、目的の蛍光を検出す
るためのフィルター（例えば干渉フィルター）を通して
各微粒子の蛍光を識別する。このようにして粒径と蛍光
の違いにより複数の微粒子群に分類し、各分類毎の微粒
子数を計数する。 反応容器に捕捉した微粒子の種類と数を計測する別の方
法には、フローサイトメータを使用する方法がある。反
応容器に捕捉された微粒子の結合をはずして反応容器か
ら脱離し、フローサイトメータで微粒子の大きさと蛍光
強度等を測定し、微粒子の種類毎の微粒子数を計数する
。反応容器に捕捉された微粒子の結合をはずすには、機
械的な方法として、振動を与える方法やへら等で削り採
る方法、化学的な方法とレて、尿素で抗体等を変性させ
解離させる方法がある。 測定試料中の被測定物質および被測定物質と特異的に結
合する物質の組合せとしては、抗原（または抗体）と抗
体（または抗原）が代表的な組合せである。その他に、
例えばホルモンとレセブタ、糖とレクチン等の組合せも
可能である。 計数される微粒子としては、ボリスチレン，アクリル、
スチレンーブタジエン共重合体、スチレンーアクリル酸
共重合体等の比重が１〜１．４程度の材質の微粒子が適
当である。比重が１〜１．４程度の粒子のとき、反応が
効果的に行われる。 またその粒径は、５μｍ以下、特に０．１〜１μｍの範
囲が適当である。この粒子の表面に抗体（または抗原）
等を結合させるには、通常知られている物理吸着、化学
結合等が利用できる。 本発明によりヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ），癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、風疹抗体、エイズ
ウィルス抗体，ヒト絨毛性ゴナドト口ピン（ＨＣＧ）等
種々の抗原、抗体，ホルモン等が測定できる。
子を利用した高感度測定ができる免疫測定方法およびそ
の装置を提供することにある。 ［１１題を解決するための手段】 上記目的は、測定試料中の被測定物質と特異的に結合す
る物質を固定化した反応容器と，該被測定物質と特異的
に結合する物質を固定化した微粒子（微粒子ａ）と、該
被測定物質と特異的に結合する物質を固定化しない種類
の異なる微粒子（微粒子ｂ）を使用し、該反応容器と測
定試料と該微粒子（微粒子ａおよび微粒子ｂ）を接触さ
せることにより、微粒子を反応容器に捕捉し，捕捉した
微粒子の種類毎の微粒子数を計数し、微粒子ｂ数から、
微粒子ａ数中の非特異吸着によって反応容器に捕捉され
た微粒子数を推定することで、被測定物質のみに依存し
た微粒子数を算定することで達成できる， 微粒子を複数の種類に区別するには，蛍光性の微粒子ま
たは非蛍光性の微粒子を使用することで達成でき、粒径
の違い，または／および蛍光の有無、蛍光波長のちがい
によって識別することができる．例えば、直径が０．５
μｍの非蛍光性の微粒子と直径が０．５μｍの緑色蛍光
を発する蛍光微粒子を使うことで，２種類に微粒子を分
類することができる。また、０．４μｍと０．８μｍの
直径の非蛍光性の微粒子を使うことで，または、０．５
μｍの直径の緑色蛍光を発する蛍光微粒子と０．５μｍ
の直径の赤色蛍光を発する蛍光微粒子とを使うことでも
２種類に微粒子を分類することができる． 反応容器に捕捉した微粒子の種類と数を計測するには、
微粒子の像を画像化し、画像処理することで達成するこ
とができ，顕微鏡、画像入力装置（ＴＶカメラ等）、お
よび画像処理装置から成る装置によって達成できる。ま
ず、画像入力装置により得られた画像をもとに、個々の
微粒子の大きさを測定する。次に、目的の蛍光を検出す
るためのフィルター（例えば干渉フィルター）を通して
各微粒子の蛍光を識別する。このようにして粒径と蛍光
の違いにより複数の微粒子群に分類し、各分類毎の微粒
子数を計数する。 反応容器に捕捉した微粒子の種類と数を計測する別の方
法には、フローサイトメータを使用する方法がある。反
応容器に捕捉された微粒子の結合をはずして反応容器か
ら脱離し、フローサイトメータで微粒子の大きさと蛍光
強度等を測定し、微粒子の種類毎の微粒子数を計数する
。反応容器に捕捉された微粒子の結合をはずすには、機
械的な方法として、振動を与える方法やへら等で削り採
る方法、化学的な方法とレて、尿素で抗体等を変性させ
解離させる方法がある。 測定試料中の被測定物質および被測定物質と特異的に結
合する物質の組合せとしては、抗原（または抗体）と抗
体（または抗原）が代表的な組合せである。その他に、
例えばホルモンとレセブタ、糖とレクチン等の組合せも
可能である。 計数される微粒子としては、ボリスチレン，アクリル、
スチレンーブタジエン共重合体、スチレンーアクリル酸
共重合体等の比重が１〜１．４程度の材質の微粒子が適
当である。比重が１〜１．４程度の粒子のとき、反応が
効果的に行われる。 またその粒径は、５μｍ以下、特に０．１〜１μｍの範
囲が適当である。この粒子の表面に抗体（または抗原）
等を結合させるには、通常知られている物理吸着、化学
結合等が利用できる。 本発明によりヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ），癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、風疹抗体、エイズ
ウィルス抗体，ヒト絨毛性ゴナドト口ピン（ＨＣＧ）等
種々の抗原、抗体，ホルモン等が測定できる。
被測定物質と特異的に結合する物質を固定化した微粒子
と，被測定物質と特異的に結合する物質を固定化しない
別の微粒子を同一容器内で反応させることにより、被測
定物質と特異的に結合する物質を固定化した微粒子の非
特異吸着等によるバックグランド微粒子数を容器毎に算
定することができ、被測定物質の量のみに依存した微粒
子数を正確に測定することができ、高感度に被測定物質
を測定することができる。
と，被測定物質と特異的に結合する物質を固定化しない
別の微粒子を同一容器内で反応させることにより、被測
定物質と特異的に結合する物質を固定化した微粒子の非
特異吸着等によるバックグランド微粒子数を容器毎に算
定することができ、被測定物質の量のみに依存した微粒
子数を正確に測定することができ、高感度に被測定物質
を測定することができる。
以下、本発明の実施例を、ＡＦＰの測定を例にして説明
する。 ［実施例１］ （固定化抗体の調製） マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にＡＦ
Ｐに対する抗体を固定化する。平底のマイクロプレート
のウェルに濃度４μｇ ／ ｍ Ｑの抗ヒトＡＦＰ抗体
溶液５０μＱ注入し、２時間間欠的に攪拌して反応させ
て抗ヒトＡＦＰ抗体固定化した。 （微粒子の調製） 標識用微粒子として、表面にカルボキシル基を有し、直
径が０．５μｍで蛍光性（最大蛍光波長が５４０ｎｍ）
のラテックス微粒子と、直径が同じ０．５μｍで非蛍光
性のラテックス微粒子を使用する６蛍光性の微粒子の表
面に抗ヒトＡＦＰ抗体をカルボジイミド法により固定化
した（固定化量約０．７ｍｇ／ｇ）−また、非蛍光性の
微粒子には特に何も固定化しないものを使用した。 （反応手順） 測定抗原であるＡＦＰを含む試料血清５０μＱを抗ヒト
ＡＦＰ抗体を固定化した反応容器（ウェル）に注入して
、２時間反応させ，測定抗原（ＡＦＰ）を反応容器（ウ
ェル）に捕捉する．その後、０．５％ＢＳＡを含むりん
酸緩衝液（０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄する。次に
，抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した蛍光微粒子溶液（微粒
子濃度０．３％）６０μΩと何も固定化しない非蛍光性
の微粒子溶液（微粒子濃度０．３％）６０μＱを注入し
、５時間静置して反応させる。次に，０．５％ＢＳＡ−
ＰＢＳで静かに洗浄し、未反応の微粒子を除去する。 このときの抗原と抗体および微粒子の結合状態は、第１
図のような模式図で表すことができる．反応容器（ウェ
ル）１上に固定化された抗ヒトＡＦＰ抗体２に抗原のヒ
トＡＦＰ３が抗原抗体反応により結合し、さらにヒトＡ
ＦＰ３には，抗ヒトＡＦＰ抗体４を介して蛍光性微粒子
５が結合する．また、抗原を介さないで微粒子が反応容
器（ウェル）上に結合する現象、すなわち非特異吸着も
おこる。例えば、蛍光性微粒子５や非蛍光性微粒子６が
直接、反応容器（ウェル）１または反応容器（ウェル）
１上に固定化された抗ヒトＡＦＰ抗体２等に結合すると
考えられる。抗原に依存する微粒子数は，全体の粒子数
から非特異吸着の粒子数を減じた数になる。 （粒子計測手順） 第２図に平底のマイクロプレートのウェルに捕捉した微
粒子の径と数を計測する装置の概略図を示す。装置は、
（倒立型の）蛍光顕微鏡７、顕微鏡像を読み取るＴＶカ
メラ８、像を解析する画像処理装置９，蛍光顕微鏡の蛍
光検出用フィルタを測定対象に応じて切り替えるフィル
タ変換装［１０、画像処理装置９とフィルタ変換装置１
０等を制御するコントローラー１１、画像を出力するモ
ニターテレビ１２、処理結果を出力する出力装置１３と
で構成される。 微粒子の捕捉されたマイクロプレートのウェル１を蛍光
顕微鏡７のステージに載せ，ウェル１内の微粒子１５の
顕微鏡像をＴＶカメラ８で観察し，画像処理して粒子の
種類を識別し、粒子数を計数する。 まず、透過光でウェル内の粒子像をｉ［する。 ＴＶカメラ８で検出している像を８ビットにディジタル
化して、画像処理装置９の画像メモリに蓄積する。この
操作を６４フレーム行い，像のＳ／Ｎを良くする。得ら
れた画像データから微粒子を識別する。径が０．４μｍ
〜０．６μｍの範囲の像を微粒子として認識し、その総
数を測定する。 なお、０．４μｍより小さいものおよび０．６μｍより
大きいものは、ゴミ等と判断して計数から除外した。測
定された微粒子の総数は蛍光性および非蛍光性の微粒子
の総数であり、抗原と結合した微粒子と非特異吸着によ
って結合している微粒子の総数である。この総数をＮ１
とする。 次に、５４０ｎｍの蛍光を発する顕微鏡像を測定する。 フィルタ変換装置１０で、５４０ｎｍの光を透過し、そ
れ以外の光を遮断する干渉フィルターを顕微鏡にセット
する。そのときの蛍光像をＴＶカメラ８で検出し、像の
強度を８ビットにディジタル化して画像処理装置９の画
像メモリに蓄積する。なお、この操作を６４フレーム行
い、蛍光像のＳ／Ｎを良くした。この画像より，蛍光を
発している微粒子の総数を計算する。この総数をＮ２
とする。Ｎ２は、測定抗原ヒトＡＦＰに結合している蛍
光微粒子（総数をＮ，とする）と非特異吸着で結合して
いる蛍光微粒子（総数をＮ４とする）の和であり， Ｎ２＝Ｎ，＋Ｎ４ となる。 また、 ？，＝Ｎ■−Ｎ２ は、非特異吸着によって結合している非蛍光性微粒子の
総数となる。Ｎ４ （非特異吸着で結合している蛍光微
粒子の総数）はＮ５と強い相関があり、あらかじめＮ４
とＮ，との関係を測定抗原ヒトＡＦＰがＯのときの値か
ら求めておくことで、Ｎ，＝ｋＸＮ， （ｋは定
数） と計算できる，つまり、測定抗原であるヒトＡＦＰに結
合している蛍光微粒子の総数Ｎ，は，Ｎｆｆ ＝ Ｎ！
ｋ ｘ （ ＮＩ Ｎ，）となり、このようにす
ることで、非特異吸着の影響を受けずに、測定抗原量の
みに依存する微粒子数を測定することができる， 本方法により測定抗原（ヒトＡＦＰ）濃度を定量するに
は、あらかじめ濃度が既知の試料で検量線をつくり、そ
れぞれの粒子数から濃度を算定すれば良い。 ［実施例２］ 実施例１と同じようにして、固定化抗体を調製し、微粒
子を調製し、反応させて、反応容器上に微粒子を結合さ
せる。 微粒子は、フローサイトメータで計測する。そこで、微
粒子の結合している反応容器に濃度８Ｍの尿素０．２ｍ
ｌを注入して微粒子の結合をはがし、微粒子懸濁液を得
る。この微粒子懸濁液をフローサイトメータで解析する
。散乱光強度と蛍光？度を同時に測定することで、微粒
子の有無，微粒子の大きさ、および微粒子が蛍光性か非
蛍光性かを識別する。散乱光強度より計算された微粒子
径が０．３μｍ相当以下のものは、ゴミ等の可能性が高
く、計数から除外した。本実施例で使用した標識用の微
粒子の大きさは蛍光性と非蛍光性のどちらも０．５μｍ
径であるため、微粒子の種類の判別はその蛍光強度で行
う。 第３図は、検出された微粒子の蛍光強度に対する数量を
示すヒストグラムである。ヒストグラムは２つの分布を
示す。蛍光強度の小さい方が非蛍光性の微粒子を示して
おり、その総数をＮ■とする。蛍光強度の大きい方が蛍
光微粒子を示し，その総数をＮ２ とする。実施例１と
同じように、測定抗原であるヒＩ− Ａ Ｆ Ｐのみに
結合している蛍光微粒子の総数（Ｎ．とする）は、 Ｎ，＝Ｎ２−ｋＸ （Ｎ，−Ｎ２） となり、このようにすることで、非特異吸着の影響を受
けずに、測定抗原量のみに依存する微粒子数を測定する
ことができる。 本方法により測定抗原（ヒトＡＦＰ）濃度を定量するに
は、あらかじめ濃度が既知の試料で検量線をつくり，そ
れぞれの粒子数から濃度を算定すれば良い。 なお、実施例エないし実施例２での微粒子標識抗体溶液
の微粒子の濃度は、０．０１％から５％程度が適当であ
る。比重のやや大きいアクリル系等の微粒子を使用した
場合は、その微粒子濃度は、０．０１％から１％程度が
適当となる。その他の微粒子についても、微粒子濃度は
微粒子の比重の大きさや粒径等によって決定される． 本実施例によれば、測定抗原と標識物である微粒子との
結合比率が一定となるため、精度が高く、高感度な定量
が可能になる。また、抗原過剰領域で抗原抗体反応が抑
制される現象、いわゆるプロゾーン現象が生じないため
、高濃度の抗原濃度域での定量も可能である。
する。 ［実施例１］ （固定化抗体の調製） マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にＡＦ
Ｐに対する抗体を固定化する。平底のマイクロプレート
のウェルに濃度４μｇ ／ ｍ Ｑの抗ヒトＡＦＰ抗体
溶液５０μＱ注入し、２時間間欠的に攪拌して反応させ
て抗ヒトＡＦＰ抗体固定化した。 （微粒子の調製） 標識用微粒子として、表面にカルボキシル基を有し、直
径が０．５μｍで蛍光性（最大蛍光波長が５４０ｎｍ）
のラテックス微粒子と、直径が同じ０．５μｍで非蛍光
性のラテックス微粒子を使用する６蛍光性の微粒子の表
面に抗ヒトＡＦＰ抗体をカルボジイミド法により固定化
した（固定化量約０．７ｍｇ／ｇ）−また、非蛍光性の
微粒子には特に何も固定化しないものを使用した。 （反応手順） 測定抗原であるＡＦＰを含む試料血清５０μＱを抗ヒト
ＡＦＰ抗体を固定化した反応容器（ウェル）に注入して
、２時間反応させ，測定抗原（ＡＦＰ）を反応容器（ウ
ェル）に捕捉する．その後、０．５％ＢＳＡを含むりん
酸緩衝液（０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄する。次に
，抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した蛍光微粒子溶液（微粒
子濃度０．３％）６０μΩと何も固定化しない非蛍光性
の微粒子溶液（微粒子濃度０．３％）６０μＱを注入し
、５時間静置して反応させる。次に，０．５％ＢＳＡ−
ＰＢＳで静かに洗浄し、未反応の微粒子を除去する。 このときの抗原と抗体および微粒子の結合状態は、第１
図のような模式図で表すことができる．反応容器（ウェ
ル）１上に固定化された抗ヒトＡＦＰ抗体２に抗原のヒ
トＡＦＰ３が抗原抗体反応により結合し、さらにヒトＡ
ＦＰ３には，抗ヒトＡＦＰ抗体４を介して蛍光性微粒子
５が結合する．また、抗原を介さないで微粒子が反応容
器（ウェル）上に結合する現象、すなわち非特異吸着も
おこる。例えば、蛍光性微粒子５や非蛍光性微粒子６が
直接、反応容器（ウェル）１または反応容器（ウェル）
１上に固定化された抗ヒトＡＦＰ抗体２等に結合すると
考えられる。抗原に依存する微粒子数は，全体の粒子数
から非特異吸着の粒子数を減じた数になる。 （粒子計測手順） 第２図に平底のマイクロプレートのウェルに捕捉した微
粒子の径と数を計測する装置の概略図を示す。装置は、
（倒立型の）蛍光顕微鏡７、顕微鏡像を読み取るＴＶカ
メラ８、像を解析する画像処理装置９，蛍光顕微鏡の蛍
光検出用フィルタを測定対象に応じて切り替えるフィル
タ変換装［１０、画像処理装置９とフィルタ変換装置１
０等を制御するコントローラー１１、画像を出力するモ
ニターテレビ１２、処理結果を出力する出力装置１３と
で構成される。 微粒子の捕捉されたマイクロプレートのウェル１を蛍光
顕微鏡７のステージに載せ，ウェル１内の微粒子１５の
顕微鏡像をＴＶカメラ８で観察し，画像処理して粒子の
種類を識別し、粒子数を計数する。 まず、透過光でウェル内の粒子像をｉ［する。 ＴＶカメラ８で検出している像を８ビットにディジタル
化して、画像処理装置９の画像メモリに蓄積する。この
操作を６４フレーム行い，像のＳ／Ｎを良くする。得ら
れた画像データから微粒子を識別する。径が０．４μｍ
〜０．６μｍの範囲の像を微粒子として認識し、その総
数を測定する。 なお、０．４μｍより小さいものおよび０．６μｍより
大きいものは、ゴミ等と判断して計数から除外した。測
定された微粒子の総数は蛍光性および非蛍光性の微粒子
の総数であり、抗原と結合した微粒子と非特異吸着によ
って結合している微粒子の総数である。この総数をＮ１
とする。 次に、５４０ｎｍの蛍光を発する顕微鏡像を測定する。 フィルタ変換装置１０で、５４０ｎｍの光を透過し、そ
れ以外の光を遮断する干渉フィルターを顕微鏡にセット
する。そのときの蛍光像をＴＶカメラ８で検出し、像の
強度を８ビットにディジタル化して画像処理装置９の画
像メモリに蓄積する。なお、この操作を６４フレーム行
い、蛍光像のＳ／Ｎを良くした。この画像より，蛍光を
発している微粒子の総数を計算する。この総数をＮ２
とする。Ｎ２は、測定抗原ヒトＡＦＰに結合している蛍
光微粒子（総数をＮ，とする）と非特異吸着で結合して
いる蛍光微粒子（総数をＮ４とする）の和であり， Ｎ２＝Ｎ，＋Ｎ４ となる。 また、 ？，＝Ｎ■−Ｎ２ は、非特異吸着によって結合している非蛍光性微粒子の
総数となる。Ｎ４ （非特異吸着で結合している蛍光微
粒子の総数）はＮ５と強い相関があり、あらかじめＮ４
とＮ，との関係を測定抗原ヒトＡＦＰがＯのときの値か
ら求めておくことで、Ｎ，＝ｋＸＮ， （ｋは定
数） と計算できる，つまり、測定抗原であるヒトＡＦＰに結
合している蛍光微粒子の総数Ｎ，は，Ｎｆｆ ＝ Ｎ！
ｋ ｘ （ ＮＩ Ｎ，）となり、このようにす
ることで、非特異吸着の影響を受けずに、測定抗原量の
みに依存する微粒子数を測定することができる， 本方法により測定抗原（ヒトＡＦＰ）濃度を定量するに
は、あらかじめ濃度が既知の試料で検量線をつくり、そ
れぞれの粒子数から濃度を算定すれば良い。 ［実施例２］ 実施例１と同じようにして、固定化抗体を調製し、微粒
子を調製し、反応させて、反応容器上に微粒子を結合さ
せる。 微粒子は、フローサイトメータで計測する。そこで、微
粒子の結合している反応容器に濃度８Ｍの尿素０．２ｍ
ｌを注入して微粒子の結合をはがし、微粒子懸濁液を得
る。この微粒子懸濁液をフローサイトメータで解析する
。散乱光強度と蛍光？度を同時に測定することで、微粒
子の有無，微粒子の大きさ、および微粒子が蛍光性か非
蛍光性かを識別する。散乱光強度より計算された微粒子
径が０．３μｍ相当以下のものは、ゴミ等の可能性が高
く、計数から除外した。本実施例で使用した標識用の微
粒子の大きさは蛍光性と非蛍光性のどちらも０．５μｍ
径であるため、微粒子の種類の判別はその蛍光強度で行
う。 第３図は、検出された微粒子の蛍光強度に対する数量を
示すヒストグラムである。ヒストグラムは２つの分布を
示す。蛍光強度の小さい方が非蛍光性の微粒子を示して
おり、その総数をＮ■とする。蛍光強度の大きい方が蛍
光微粒子を示し，その総数をＮ２ とする。実施例１と
同じように、測定抗原であるヒＩ− Ａ Ｆ Ｐのみに
結合している蛍光微粒子の総数（Ｎ．とする）は、 Ｎ，＝Ｎ２−ｋＸ （Ｎ，−Ｎ２） となり、このようにすることで、非特異吸着の影響を受
けずに、測定抗原量のみに依存する微粒子数を測定する
ことができる。 本方法により測定抗原（ヒトＡＦＰ）濃度を定量するに
は、あらかじめ濃度が既知の試料で検量線をつくり，そ
れぞれの粒子数から濃度を算定すれば良い。 なお、実施例エないし実施例２での微粒子標識抗体溶液
の微粒子の濃度は、０．０１％から５％程度が適当であ
る。比重のやや大きいアクリル系等の微粒子を使用した
場合は、その微粒子濃度は、０．０１％から１％程度が
適当となる。その他の微粒子についても、微粒子濃度は
微粒子の比重の大きさや粒径等によって決定される． 本実施例によれば、測定抗原と標識物である微粒子との
結合比率が一定となるため、精度が高く、高感度な定量
が可能になる。また、抗原過剰領域で抗原抗体反応が抑
制される現象、いわゆるプロゾーン現象が生じないため
、高濃度の抗原濃度域での定量も可能である。
本発明によれば、反応容器毎に非特異吸着等に基づいて
結合する微粒子数を計数することができることから、非
特異吸着等に影響されずに測定物質に結合した微粒子数
を正確に計数することができ、高感度に抗原濃度を定量
することができる。
結合する微粒子数を計数することができることから、非
特異吸着等に影響されずに測定物質に結合した微粒子数
を正確に計数することができ、高感度に抗原濃度を定量
することができる。
第１図は本発明の一実施例における抗原と微粒子標識抗
体の結合状態を示す模式図、第２図は本発明の一実施例
になる顕微画像処理装置の構成のを示すブロック図、第
３図は本発明の他の実施例において、フローサイトメー
タで測定した微粒子の、蛍光強度に対する数量を示すヒ
ストグラムである。 符号の説明 １・・・反応容器（ウェル），２・・・抗ヒトＡＦＰ抗
体、３・・・ヒトＡＦＰ、４・・・抗ヒトＡＦＰ抗体、
５・・・微粒子、６・・・微粒子（例えば０．５μｍ径
の非蛍光性微粒子）、７・・（倒立型）蛍光顕微鏡，８
・・・ＴＶカメラ、９・・・画像処理装置、１０・・・
フィルタ変換装置． １１・・・コントローラー、ｌ２
・・モニターテレビ、第 躬 第 ？ 閉 ｌ．ダ
体の結合状態を示す模式図、第２図は本発明の一実施例
になる顕微画像処理装置の構成のを示すブロック図、第
３図は本発明の他の実施例において、フローサイトメー
タで測定した微粒子の、蛍光強度に対する数量を示すヒ
ストグラムである。 符号の説明 １・・・反応容器（ウェル），２・・・抗ヒトＡＦＰ抗
体、３・・・ヒトＡＦＰ、４・・・抗ヒトＡＦＰ抗体、
５・・・微粒子、６・・・微粒子（例えば０．５μｍ径
の非蛍光性微粒子）、７・・（倒立型）蛍光顕微鏡，８
・・・ＴＶカメラ、９・・・画像処理装置、１０・・・
フィルタ変換装置． １１・・・コントローラー、ｌ２
・・モニターテレビ、第 躬 第 ？ 閉 ｌ．ダ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、測定試料中の被測定物質と特異的に結合する物質を
固定化した反応容器と、該被測定物質と特異的に結合す
る物質を固定化した微粒子と、該被測定物質と特異的に
結合する物質を固定化しない該微粒子と種類の異なる微
粒子を使用し、該反応容器と測定試料と該微粒子を接触
させることにより、微粒子を反応容器に捕捉し、捕捉し
た微粒子の種類毎の微粒子数を計数し、該被測定物質と
特異的に結合する物質を固定化しない微粒子の数から、
該被測定物質と特異的に結合する物質を固定化した微粒
子の非特異吸着数を推定し、被測定物質濃度を定量する
粒子標識免疫測定方法。 ２、蛍光性の微粒子または非蛍光性の微粒子を使用する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の粒子標識
免疫測定方法。 ３、微粒子の大きさによって、または／および微粒子の
蛍光波長によって、複数の種類に識別することのできる
微粒子を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
項または第２項記載の粒子標識免疫測定方法。 ４、画像入力装置と、画像入力装置により得られる微粒
子の像を画像処理する装置とからなる粒子標識免疫測定
装置。 ５、フローサイトメトリにより、微粒子を解析処理する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項ま
たは第３項記載の粒子標識免疫測定方法。 ６、個々の微粒子の大きさ、または／および蛍光波長を
計測して複数の種類に分類し、同じ種類の微粒子毎にそ
の数を計数する処理を行うことを特徴とする特許請求の
範囲第４項または第５項記載の粒子標識免疫測定方法ま
たは装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1060990A JPH03216554A (ja) | 1990-01-22 | 1990-01-22 | 粒子標識免疫測定方法および装置 |
| DE19904036288 DE4036288A1 (de) | 1989-11-15 | 1990-11-14 | Verfahren und vorrichtung fuer immunologische tests unter nutzung messbarer teilchen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1060990A JPH03216554A (ja) | 1990-01-22 | 1990-01-22 | 粒子標識免疫測定方法および装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03216554A true JPH03216554A (ja) | 1991-09-24 |
Family
ID=11754986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1060990A Pending JPH03216554A (ja) | 1989-11-15 | 1990-01-22 | 粒子標識免疫測定方法および装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03216554A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011517775A (ja) * | 2008-04-02 | 2011-06-16 | アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド | 薄膜状体液試料において実施される血清学的凝集イムノアッセイ及び他のイムノアッセイのための方法 |
| WO2013146694A1 (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質の検出方法 |
| US20200378891A1 (en) * | 2017-12-04 | 2020-12-03 | Oxford University Innovation Limited | Method of determining lipoprotein concentration in solution using light scattering |
| JP2022521672A (ja) * | 2019-01-30 | 2022-04-12 | スチョウ アストラバイオ テクノロジー カンパニー リミテッド | 単分子定量検出方法及び検出システム |
-
1990
- 1990-01-22 JP JP1060990A patent/JPH03216554A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011517775A (ja) * | 2008-04-02 | 2011-06-16 | アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド | 薄膜状体液試料において実施される血清学的凝集イムノアッセイ及び他のイムノアッセイのための方法 |
| US8569076B2 (en) | 2008-04-02 | 2013-10-29 | Abbott Point Of Care, Inc. | Method for serologic agglutination and other immunoassays performed in a thin film fluid sample |
| WO2013146694A1 (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質の検出方法 |
| US9632081B2 (en) | 2012-03-28 | 2017-04-25 | Konica Minolta, Inc. | Detection method for biological substance |
| US20200378891A1 (en) * | 2017-12-04 | 2020-12-03 | Oxford University Innovation Limited | Method of determining lipoprotein concentration in solution using light scattering |
| US12298241B2 (en) * | 2017-12-04 | 2025-05-13 | Oxford University Innovation Limited | Method of determining lipoprotein concentration in solution using light scattering |
| JP2022521672A (ja) * | 2019-01-30 | 2022-04-12 | スチョウ アストラバイオ テクノロジー カンパニー リミテッド | 単分子定量検出方法及び検出システム |
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