JPH03219876A - ラツトプロラクチン生産用組み換えｄｎａ、菌株及びラツトプロラクチンを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、デオキシリボ核酸（以下、これをＤＮＡと
いう）の組み換え技術により作成されたラットプロラク
チン生産用ＤＮＡに関するものである。また、この発明
は、こうして作られたラットプロラクチン生産用ＤＮＡ
を、細菌に導入して得られた形質転換された細菌に関す
るものである。

さらに、この発明は、こうして得られた細菌を培養して
、ラットプロラクチンを生産する方法に関するものであ
る。

（従来の技術） ヒトプロラクチンは、脳下垂体から分泌される分子量的
２２０００のペプチドホルモンである。

ヒトプロラクチンは、ルテオトロピン、黄体刺激ホルモ
ン、乳腺刺激ホルモンとも呼ばれている。

ヒトプロラクチンは、乳腺発育促進及び乳汁分泌の開始
と維持、及び前立腺及び精のう腺の発育促進を司る作用
を持つと推定されているが、不明なところが多い。その
理由は、ヒトプロラクチンが微量しか得られないためだ
とされている。

一般に、哺乳動物のプロラクチンは互いに作用が似てい
ると考えられている。そこで、ラットのプロラクチンを
研究することは、ヒトプロラクチンを研究するのに大い
に役立つ。ところが、ラットプロラクチンも得られる量
が微量であるため、その特性を調べることが困難であり
、またその作用がよくわからない。そこで、ラットプロ
ラクチン（以下、ｒＰＲＬという）をより多く取得でき
る方法の出現が要望された。

他方、ｒＰＲＬの遺伝子のクローニングについてはＥ、
Ｊ、Ｇｕｂｂｉｎｓらによってヌクレイツク、アミド、
リサ−−１−（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　
６゜９１５−９３（１（１９７９）：）に報告され、ま
たＮ、　Ｅ、　Ｃｏｏｋｅらによってジャーナル、オブ
、バイオロジカル、ケミストリ（Ｊ、Ｂｉｏｌ　　Ｃｈ
ｅｍ、）２５５゜６５０２−６５１０　（１９８０）に
報告されている。それによれば、ｒＰＲＬは第１表に示
したようなヌクレオチド配列を持つものとされている。

（発明が解決しようとする課題） この発明は、上述のようにｒＰＲＬが、ヒトプロラクチ
ンの研究を遂行する上で有用な物質であることまでは予
測されても、その取得量が微量であるため、現実の有効
性も生理活性も確かめ得なかった事実に着目し、組み換
えＤＮＡ技術により、ｒＰＲＬを細菌に生産させること
を目的とするものである。そのために、この発明は、細
菌に導入したとき、菌体内でｒＰＲＬを生産できるよう
な組み換えＤＮＡを提供することを第１の目的とするも
のである。

（課題を解決するための手段） この発明者は、まずラットの脳下垂体からの抽出物を材
料として、これから大腸菌内で増殖できるプラスミドｐ
ｒＰＲＬｌ　を合成した。次いで、このプラスミドｐｒ
ＰＲＬｌの上流にプロモーターシャインダルガルノ配列
及び翻訳開始コドンをこの順序に組み込んで新たな遺伝
子を作り、これを大腸菌内に導入して形質転換された大
腸菌を作った。その後、この大腸菌を培養すると、そこ
にｒＰＲＬが生産されることを確認した。この発明は、
このような確認に基づいてなされたものである。

（発明の要旨） この出願における第１の発明は、第１表に示したｒＰＲ
Ｌをコードする遺伝子の上流に、プロモーター、シャイ
ンダルガルノ配列及び翻訳開始コドンをこの順序に組み
込んで作られたｒＰＲＬ生産用組み換えＤＮＡに関する
ものである。

この出願における第２の発明は、上記の組み換えＤＮＡ
を細菌に導入することによって作られた形質転換菌株に
関するものである。

この出願における第３の発明は、上記の形質転換菌株を
培養してｒＰＲＬを生産させるｒＰＲＬの生産方法に関
するものである。

（ｒＰＲＬ遺伝子の取得） この発明者は、まずラットの脳下垂体組織からポリＡ末
端を有するメツセンジャーＲＮＡを分離した。ポリＡ末
端を有するＲＮＡとは、３′末端にアデニンのポリマー
鎖を持ったＲＮＡを意味している。次いで、この発明者
は、オカヤマバーグ法に従い、このＲＮＡの相補的ＤＮ
Ａの合成とベクタープラスミドへの組み込みを行い、こ
うしてラットプロラクチン相補ＤＮＡを含んでいて、大
腸菌体内で増幅されるプラスミドｐｒＰＲＬｌ　を作つ
た。さらに、プラスミドｐｒＰＲＬｌが、第２表に示し
たような塩基配列を有するものであることを確認した。

第２表に示したプラスミドｐｒＰＲＬｌは、その中に第
１表に示された塩基配列を含んでいる。第１表は、遺伝
子の塩基配列を単一の鎖で示してこれを上段に配置し、
下段に対応するアミノ酸を付加するという遺伝子の表示
方法に従っているが、第２表は、塩基配列を上下２段の
二重鎖で示すという遺伝子の表現方法に従っているので
、第１表と第２表とは全く別物を示しているように見え
るが、実際はそうでない。第２表における上段と下段と
を一組にして数えると、第２表の上から８組目における
上段の右端から１１番目に位置するｒＡＪから始まる「
ＡＧＴＧＧ・・」の塩基配列は第１表の塩基配列と完全
に一致している。だから、第２表に示されるプラスミド
ｐｒＰＲＬｌは、第１表に示された塩基配列を含んでい
ることになる。

第２表に示されたｐｒＰＲＬｌは、ｒＰＲＬをコードし
たクローン化遺伝子であって、大腸菌内で増殖可能であ
るに過ぎない。すなわち、ｐｒＰＲＬｌは、これを大腸
菌内に導入しても、大腸菌にｒＰＲＬを生産させること
ができない。この発明は、ｐｒＰＲＬｌに、プロモータ
ー、シャインダルガルノ配列及び翻訳開始コドンをこの
順序に組み込んで組み換えＤＮＡを作り、これを細菌内
に導入したとき、細菌がｒＰＲＬを生産できるようにし
たのである。

（プロモーターの説明） この発明において組み込むべきプロモーターとしては、
タック（ｔａｃ）系のプロモーターが適している。タン
ク系プロモーターは、ｄｅＢｏｅｒ、Ｈ。

Ａ、がＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ。

７８、２１（１９８３）に記載しているもので、次に示
すような塩基配列を持っている。

（シャインダルガルノ配列の説明） シャインダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列という）は、
一般に蛋白質の生合成の開始に重要な役割を果す、とさ
れている領域である。ＳＤ配列は、プリン塩基に富んで
おり、３−９塩基の長さを持っている。

（翻訳開始コドンの説明） 翻訳開始コドンは、蛋白質合成の開始を指定する遺伝暗
号である。この遺伝暗号は、３個の核酸塩基の配列から
成り、ＡＴＧの順序に配列された３個のヌクレオチド結
合から成る部分である。

プロモーター、ＳＤ配列及び翻訳開始コドンは、何れも
ラットｒＰＲＬポリペプチドをコードする遺伝子の上流
に、こめ順序で組み込まれていることが必要とされる。

しかも、それらの組み込み位置は、ｒＰＲＬポリペプチ
ドをコードする遺伝子から適当な距離にあって、相互に
適当な距離を置いていなければならない。すなわち、プ
ロモーターは、ｍＲＮＡの転写開始点より−１０から−
３５の位置にあり、ＳＤ、配列と翻訳開始コドンとの間
には、６−１８個の塩基対が介在するようにする。

ＳＤ配列及び翻訳開始コドンが、組み込むべきプロモー
ター含有のベクターＤＮＡ中に含まれていない場合には
、ＳＤ配列及び翻訳開始コドンを組み込まなければなら
ない。しかし、ＳＤ配列及び翻訳開始コドンが組み込・
むべきプロモーター含有のベクター中に既に含まれてい
る場合には、格別にＳＤ配列及び翻訳開始コドンを組み
込む必要がない。

ＳＤ配列及びプロモーター含有のベクターＤＮＡとして
は、プラスミドｐＫＫ２２３−３を使用することができ
る。プラスミドｐＫＫ２２３−３は、ｄｅ　　Ｂ。

ｅｒ、Ｈ，Ａ、がＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ７８．２１（１９８３）に記載した
ものである。

（組み込み） ｒＰＲＬをコードするＤＮＡにプロモーター等を含有す
るベクターＤＮＡを組み込むには、制限酵素を用いて両
ＤＮＡを適当な位置で切断してのち、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを月いて結合させるという、−船釣なりＮＡ組み換え
技術によってこれを行うことができる。

こうして、プロモーター、ＳＤ配列及び翻訳開始コドン
を、ｒＰＲＬをコードする遺伝子に組み込んだＤＮＡは
、例えば次のような塩基配列のものとなる。

ｔａｃプロモーターの例 （組み換え方法） 組み換え技術の一例として、プラスミドｐｒＰＲＬｌ、
ｐＫＫ２２３−３からプラスミドｐＫＫ’ＲＰＩＯを作
る方法について、以下にそのあらましを説明するＯまず
、プラスミドｐｒＰＲＬｌより成熟ｒＰＲＬポリペプチ
ドＣ末端付近をコードするＡｃｃＬＲｓａｌ断片を得る
。そして、この断片のＲｓａＩ（ａＩｌにＨｉｎｄｌｌ
ｌリンカ−を結合する。

他方で、以下に示すＤ　Ｎ　Ａ　’Ｊンカーを作成する
。

５’−ＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＴＴＧＴＴ３’
−ＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡ
ＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣＧＴＣＩＣＴＣＣＴＣＴＡ
ＡＣＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＴＴＡＣ−３’ （Ｎｏ、１） ＧＴＡＡＴＧＧＣ−５′ （Ｎｏ、２） ５’−ＣＧＧＡＧＣ！ＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧ３
’−ＣＴＣＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴ
ＧＣＴ’ｌ”ＴＣＴＣＡＣ！ＴＡＣＡＴＯＣＡＧＴＡＣ
ＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＴ
−３’　　　　（Ｎｏ、３）ＧＴＡＴＧＧＧＡＣＡＴＡ
−５’　　（Ｎｏ、４）コレラの合成りＮＡクリンカは
、翻訳開始コドン及びそれに続く成熟ｒＰＲＬのＮ末端
付近をフードするＤＮＡ配列を含んでいる。

次に、プラスミドｐＫＫ２２３−３よりｔａｃプロモー
ター及びＳＤ配列を含んだＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［［
断片を得る。

上記２つのＤＮＡ断片及び２対の合成り　Ｎ　Ａ　ＩＪ
ンカー煮１〜４をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、第
２図に示した組み換え体プラスミドｐＫＫＲＰＩＯを得
る。このプラスミドは、ｔａＣブロモータ−の下流に成
熟ｒＰＲＬをコードする領域が連結した形を持っている
。

組み換え技術の別例として、プラスミドｐ　ＫＫＲＰＩ
ＯからプラスミドｐＫｃＲＰ１２を作る方法について、
以下にそのあらましを説明する。まず、プラスミドｐＫ
ＫＲＰ１０よりｔａｃブｏ−ｖ−一ター、ＳＤ配列及び
ｒＰＲＬをコードする領域を含む５ｓｐＩ断片を得る。

別に、プラスミドｐＵＣ１９よＦ）　Ｌ９ＫｂｐのＰｖ
ｕ　Ｉ［−８ｓ　ｐ　Ｉ断片を得る。

上記２つのＤＮＡ断片をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガー
ゼにより結合し、第３図に示した組み換え体プラスミド
ｐＫＣＲＰ１２を得る。このプラスミドは、プラスミド
の複製開始点が多コピープラスミドであるＩ）ＵＣｌ３
に由来するものである。

（組み換え反応条件） 上記組み換え技術における反応は、−船釣に下記のとお
りに行うことができる。

以下で述べる制限酵素及び’Ｌ’４ＤＮＡ！Ｊガーゼと
しでは全酒造社製を使用し、活性の単位の定義は、同社
のテキストＣＴａｋａｒａ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆ。

ｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ（１９８７））に従った。

ＤＮＡの制限酵素による切断反応は、通常０．１〜２０
ｐｙのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくはｌＯ〜４０
　ｍＭ）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−
ＨＣＩ（以下、トリス−ＨＣｌという）（ｐＨ６，０〜
９．５好ましくはｐＨ７，０〜８．０）　、Ｏ〜２００
　ｍＡＩのＮａＣ１，２〜３０ｍＭ（好ましくは５〜１
０　ｍＭ）のＭｇ０＋２を含む反応液中で、制限酵素０
．１〜１００単位（好ましくはｌｐ９のＤＮＡに対して
１〜５単位）を用い、２０〜７０″Ｃ（各々の制限酵素
の至適温度）において、１〜２４時間行う。

反応の停止は、通常５５〜７０’Ｃで、５〜３０分間加
熱することによるか、あるいはフェノールなどの試薬に
より制限酵素を失活させる方法も用いることができる。

制限酵素処理により生じたＤＮＡ断片の抽出及び精製は
、ポリアクリルアミド電気泳動法や低融点アガロース法
などの方法によって行うことができる。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００　ｍＭ（好ましく
は１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣ１（ｐＨ（３，ｌ　
〜９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０　）、２〜２
０ｍＭ（好ましくは５〜１０　ｒｎＭ）　（７）　Ｍｇ
　Ｃ＋２．０．１〜１０ｍＭ（好ましくは０．５〜２．
０　ｍＭ）のアデノシン５′−三リン酸（以下、ＡＴＰ
という）１〜５０　ｍＭ　（好ましくは５〜１０　ｍＭ
）のジチオスレイトールを含む反応液中で、’Ｉ’４Ｄ
ＮＡリガーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７°Ｃ（
好ましくは３〜２０′ｃ）で１５分間〜７２時間（好ま
しくは２〜２４時間）行う。

（形質転換菌） 結合反応によって生じた組み換え体プラスミドＤＮＡは
、必要によりＣｏｈｅｎ等の形質転換法〔ニス・エヌ・
コーエン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ）等：プロシーテイング
・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｆ；ｃｉ
、）、ＵＳＡ、６９，２１１０（１９７２）〕によって
、これを大腸菌に導入する。

形質転換の宿主として用いる大腸菌としては、とくに特
定の菌株を用いる必要はない。大腸菌の中では、Ｅ、ｃ
ｏＩｉＤＨＩ（ＡＴＣＣ３３８４９）、Ｅ、ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９．Ｅ、ｃｏＩｉＨＢｌｏｌ（ＡＴＣＣ３３６９
４）が適当である。組み換え体プラスミドＤＮＡを保持
する大腸菌から該ＤＮＡの単離は、バーンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）等の方法〔エイチ・シー・バーンボイム
（Ｈ，Ｃ，Ｂｉ　ｒｎｂｏ　ｉｍ）等：ヌクレイツク・
アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ
、）７．１５１３（１９７９）〕により行う。

プラスミドＤＮＡを１〜ｌＯ種類の制限酵素で切断後、
アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩
基配列を決定する必要がある場合はマキサム・ギルバー
ド法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミア・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、）、７４゜５６０（１９７７））または
Ｍ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法〔
サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．５４６３（１９７７））によっ
て決定する。

本発明によれば、ｒＰＲＬポリペプチドは以下のように
して、製造することができる。すなわち、プラスミド（
例えばｐＫＫＲＰｌｏ、ｐＫＣＲＰ１２）を用いて大腸
菌を形質転換させ、アンピシリン耐性のコロニーの中か
ら各々のプラスミドを保持する大腸菌を選び出す。形質
転換されたアンピシリン耐性の大腸菌のｒＰＲＬポリペ
プチドの発現の確認は、下記に示すコロニーイムノアッ
セイ法により行うことができる。すなわち寒天培地に生
育した形質転換菌株のコロニーをニトロセルロースフィ
ルターに移し、菌体をリゾチームにより溶菌し、ｒＰＲ
Ｌポリペプチドの存在をｒＰＲＬに対する抗体とプロテ
ィンＡ・ホースラデイシュ・パーオキシダーゼ・コンジ
ュゲート（Ｅ−Ｙラボラトリーズ）及び４−クロロ−１
−ナフトールを用いるエンザイム・イムノアッセイ法（
Ｐ、Ｂｕｃｌｅ　ａｎｄ　Ｅ、Ｚｅｈｅｌｅｉｎ：　Ｇ
ｅｎｅ、　１６．１４９（１９８１））により調べるこ
とができる。これらのプラスミドを保持する大腸菌を適
当な培地に培養することにより、培養物中にｒＰＲＬポ
リペプチドを生成させることができる。

（ｒＰＲＬの生産） ここで用いる培地としては、大腸菌の生育ならびにｒＰ
ＲＬポリペプチドの生産に好適なものならば、合成培地
及び天然培地のいずれも使用することができる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトール等が、
窒素源としては、ＮＨ２Ｏ１，（ＮＨ４）２８０４、カ
ザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バタ
トトリブトン、コーン・ステーブ・リカー等が使用でき
る。

培養は、ｐＨ５，５〜８．５、温度１８℃〜４０°Ｃで
、通気攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培
養菌体中にｒＰＲＬが蓄積するので、培養物から菌体を
集菌、破砕し、遠心分離して得られる上澄から通常の抽
出方法に従ってポリペプチドを採取する。菌体の破砕は
、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解する方法、超音
波処理による方法、浸透圧による方法により行うことが
できる。また、該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接
レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプルバッファー〔レム
リ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２２７，６８０（１９７０）：］に溶解後、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動〔レム！Ｊ（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ）の方法：同上文献〕を行い、クマシーブリリアン
トブルー染色によって行う。

また生産されたポリペプチドがｒＰＲＬと同一のポリペ
プチドであることを確認するには、上記に従って５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された
ポリペプチドを、電気的にニトロセルロースフイ／ｌ／
　ター　Ｃ，Ｗ、　Ｎ、　Ｂｕｒｎｅ　ｔ　ｔｅ：　Ａ
ｎａｌ、Ｅｉｏｃｈｅｍ、、１１２，１９５−２０３（
１９８１）〕を用いてブロッティングし、プロラクチン
のバンドをｒＰＲＬに対する抗体と、プロティンＡ・ホ
ースラデイシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲ）（Ｅ
−Ｙラボラトリーズ）及び４−クロロ−１−＋７トール
を用いるエンザイム・イムノアッセイ法ＣＰ、　Ｂｕｃ
ｌｅ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｚｅｈｅｌｅｉｎ：Ｇｅｎｅ。

１６．１４９（１９８１）〕により、検出することがで
きる。

（実　施　例） 以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ ｔａｃプロモーターによるｒＰＲＬの発現ｒＰＲＬをコ
ードするＤＮＡを含むプラスミドとして、第２表に示し
たプラスミドｐｒＰＲＬｌの２５可ををＩＯＩＩＩＭの
トリス−ＨＣｌ　（ｐ）１８．０）、５０ＩＩＩＭのＮ
ａＣｌ、７ｍＭのＭｇＣ１ｚ　、７ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む溶液３００μｌに溶解し、制限酵素
Ｒｓａ　ｒを１００単位加え、３７°Ｃで２時間消化を
行った。

この反応液をアガロースゲル電気泳動を行ったのち、電
気溶出法により１．６　ｉのＤＮＡ断片約５尾を得た。

次に、このＤＮＡの５１Ｉｇと、下記に示す１０ｍｅｒ
のリン酸化旧ｎｄｌｌｌリンカ−ＤＮＡ（宝酒造社製） ５’−ｐＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ−３’ ３’−ＣＧＴＴＣＧＡＡＣＣｐ−５’ ２尾を６６ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、６．
６ｍＭのＭｇＣｈ、１０＋Ｈのジチオスレイトール、１
ｍＭ（７）ＡＴＰを含む溶液２０ｐｌに溶解し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５０単位を加え、１２．５
°Ｃで１６時間結合反応を行うた。該反応液からエタノ
ール沈澱法によりＤＮＡを回収した。このＤＮＡを１０
ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７ｍＭのンｇｃ
１．．６０ｍＭのＮａＣ１を含む溶液（以下、これを旧
ｎｄｌｌｌ緩衝液という）１００ＩＩｆｆｉに溶解し、
制限酵素旧ｎｄＩ［を１００単位加え、３７°Ｃで２時
間消化を行った。

該反応液からエタノール沈澱法によりＤＮＡを回収した
。

次に、回収したＤＮＡを１０ｍＭのトリス−１（ｃＩ（
ｐＨ７，５）、７ＲＩＭのＭｇＣ１，，６０ｍＭのＮａ
Ｃ１，７ｄの２−メルカプトエタノール、０．０１％の
ウシ血清アルブミンを含む溶液３００　ｐＲに溶解し、
制限酵素Ａｃｃｒを５０単位加え、３７°Ｃで２時間消
化を行った。この反応液をポリアクリルアミドゲル電気
泳動処理に付したのち、電気溶出法により５２２ｂｐの
Ａｃｃｌ−ＨｉｎｄＴ［ｌＤＮＡ断片約２河を得た。

次にプラスミドｐＫＫ２２３−３　（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製）５犀を旧ｎｄｌ［［緩衝液１００パに溶解し、
制限酵素）１ｉｎｄｎＩを１０単位加え、３７°Ｃで２
時間消化を行った。この反応液からエタノール沈澱法に
よりＤＮＡを回収した。このＤＮＡをＥｃｏＲｒ緩衝液
１００μｌに熔解し、制限酵素ＥｃｏＲＩを１０単位加
え、３７°Ｃで２時間消化を行った。この反応液を低融
点アガロースゲル電気泳動処理に付して後、約４．５に
ｂの旧ｎｄ　ｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片約４尾を得た。−方
、成熟ｒＰＲＬをコードするＤＮＡに、その発現に必要
な翻訳開始コドンＡＴＧを付加する目的で、またベクタ
ーＤＮＡと上記ＤＮＡ断片を連結する目的で、ＤＮＡリ
ンカ−を合成した。合成したＤＮＡリンカ−は、固相ホ
スホアミダイト法により作られたもので、−末鎖Ｄ　Ｎ
　Ａ４７ｍａｒ（Ｎｏ、１）、４５ｍｅｒ（Ｎｏ、２）
、５１ｍｅｒ（Ｎｏ、３）、及び５１ａ＋ｅｒ（Ｎｏ、
４）の４種類あり、それぞれ下記の塩基配列を持つもの
であった。

５’−ＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡ
ＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＴＣＡ八＾ＣＡＣＣＡＴＴＡＣ
−３’（阻１） ３’−ＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＡへＣＡＡＧＴＣＣＴＣ
ＣＴＣＴＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＣ−５
’（Ｎα２） ５’−ＣＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴ
ＣＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣ
ＣＴＧＴ−３’（Ｎα３） ３’−ＣＴＣＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＴ
ＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡ
ＣＡＴＡ−５’（Ｎα４） このうち、Ｎα２とＮα３の５′−末端をリン酸化する
ために、下記のように処理した。

Ｎα２とＮα３とのそれぞれの一本鎖ＤＮＡのｌ　ｎｍ
ｏｌを５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ９，５）、１０
ｍＭのＭｇｃｌ、、５１のジチオスレイトール、５０ｎ
ｍｏｌのＡＴＰを含む溶液１１ｄに加え、この混合液に
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を１００
単位加え、３７°Ｃで３０分間反応させ、５゛−末端の
リン酸化を行った。反応終了後エタノール沈澱によりリ
ンカ−ＤＮＡを集めた。

ｋｌとＮ［１２の一本鎖ＤＮＡを各々１００１００ｐ取
り、これを１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）と
、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと
呼ぶ）とを含む溶液１０ｐβに溶解した。また、Ｎｏ、
　３とＮｏ、　４の一本鎖ＤＮＡを各ｋ　ｌ　００ｐｍ
ｏ！取り、これを１０１のトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
）と、ＩＩＩＩＭのＥＤＴＡとを含む溶液１０μ！に溶
解した。こうして得られたものをそれぞれの合成ＤＮＡ
リンカー溶液と゛した。

上で得たプラスミドｐｒＰＲＬｌ由来のＡｃｃ　ｒ−旧
ｎｄｌｌＤＮＡ断片（５２２ｂｐ）と、プラスミドｐＫ
Ｋ２２３−３由来のＨｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩ断片（
約４．５Ｋｂ）の０．０２８ｐｍｏｌとを、６６ｍＭの
トリス−１１ｃＩ（ｐＨ７，６）と、６，６１のＭｇＣ
１，と、ｌ（１＋Ｍのジチオスレイトールと、ＩＩＩＩ
ＭのＡＴＰとを含む溶液２０ｔｔｌに溶解し、これに上
記の合成ＤＮＡリンカー溶液をそれぞれ１μｌずつ加え
た。この混合液にＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を
５０単位加え、１２，５”Ｃで１６時間結合反応を行っ
た。

この反応液を用いてＥ、ｃｏ旦ＪＭ１０９を形質転換し
、アンピシリン耐性の形質転換株を得た。これらの株の
中からｒＰＲＬを生産する株を、ｒＰＲＬに対する抗血
清と、プロティンＡ・ホースラデイツシュ・パーオキシ
ダーゼ・コンジュゲート（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）
と、４−クロロ−１−ナフトールとを用いるエンザイム
・イムノアッセイ法により選択した。ｒＰＲＬ生産株よ
りプラスミドＤＮＡを回収し、第２図に示したプラスミ
ドｐＫＫＲＰ１０を得た。

プラスミドｐＫＫＩ？Ｐ１０の構造は、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ、Ａｃｃｌ、旧ｎｄＩ［ｌで切断し、アガロース電
気泳動法により確認した。

実施例２ 複製開始点の変更 プラスミドｐＫＫＲＰ１０の５ｔ１ｇを１０ｍＭのトリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）と、７ＩＩＩＭの−ｇｃｌ□
と、１００ｍＭのＮａＣ１と、７ｍＭの２−メルカプト
エタノールとを含む溶液３００μ２に溶解し、制限酵素
ＳｓρＩを２０単位加え、３７°Ｃで２時間反応させた
。この反応液からエタノール沈澱法によりＤＮＡを回収
した。このＤＮ’Ａを１０ｍＭのトリス−ＭＣＩ（ｐｉ
（８，０）と、０．１ｗＭのＥＤＴＡとに溶解し、バク
チリアルアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を０．
４単位加え、６５°Ｃで２時間反応させ、５′−位のリ
ン酸基を除いた。

次に、プラスミドｐＵ０１９の５■を１０＋ｅＭのトリ
ス−１（ＣＩ　（ｐｌ（７，５）と、７１のＭｇＣ１，
と、６０＋ｎＭのＮａＣＩと、７ｍＭの２−メルカプト
エタノールとを含む溶液３００ｄに溶解し、制限酵素Ｐ
ｖｕ　ＩＩを２０単位及びＳｓｐ　ｌを２０単位を加え
、３７゛Ｃで２時間反応させた。この反応液をアガロー
ス電気泳動処理に付したのち、電気溶出法により１．９
　ＫｂｐのＤＮＡ断片約１尾を分離した。

実施例１で得たプラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　Ｉｔ　Ｐ　、１
０由来のＳｓｐ　ｉ断片の０．０２８　ｐｍｏｌと、プ
ラスミドｐＵＣ１９由来のＰｖｕ　Ｕ　　Ｓｓｐ　Ｉ断
片の０．０２８　ｐｍｏｌとを、６６ｍＭのトリス−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，６）と、６．６ｍＭの１ＣＩ□と、１０
−門のジチオスレイトールと、１ｍＭのＡＴＰとを含む
溶液２０μ！に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを５０単位
加えて、１２．５°Ｃで１６時間結合反応を行わせた。

この反応液を用いてＥ、ｃｏ旦ＪＭ１０９を形質転換し
、アンピシリン耐性の形質転換株を得た。これらの株の
中からｒＰＲＬを生産する株を、ｒＰＲＬに対する抗血
清と、プロティンＡ・ホースラデイツシュ・パーオキシ
ダーゼ・コンジュゲート（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）
及び、４−クロロ−１−ナフトールを用いるエンザイム
・イムノアッセイ法により選択した。

ｒＰＲＬ生産株よりプラスミドＤＮＡを回収し、第３図
に示したプラスミドｐＫｃＩＩＰ１２を得た。プラスミ
ドｐＫｃＲＰ１２の構造は、制限酵素旧ｎｄＩ［、Ａｃ
ｃｌ、５ｓｐＩにより切断し、アガロース電気泳動及び
ポリアクリルアミド電気泳動法により確認した。

実施例３ この実施例は、プラスミドｐＫＫＲＰ１０を保持する大
腸菌によりｒＰＲＬの生産させたものである。その詳細
は下記のとおりである。

実施例１で得たプラスミドｐＫＫＲＰ１０を保持するＥ
、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を、５−のＬ−Ｂｒｏｔｈ　（
１，０χのＴｒｙｐｔｏｎ。

０．５！のＹｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、　１．０χの
ＮａＣ１，５０！１ｇ／ｄのアンピシリン）に接種し、
３７°Ｃで培養し、菌体の成育がＯＤ６６６ｎｍ＝　ｏ
、　２〜０．３になった時点で、ｔａｃプロモーターの
誘導剤であるβ−Ｄ−イソプロピルチオガラクトサイド
（ＩＰＴＧ）を２１の濃度になるように添加し、３７°
Ｃで１５時間培養を継続した。得られた培養液を１２０
０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した。こ
の菌体ヲＬａｅ１１１１１のサンプルパンファーに懸濁
して後、１００°Ｃで１０分間加熱し、その後Ｌａｅｍ
ｍｌｉの方法（Ｉｌ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ　；　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６８５　（１９７０）
］に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い
、次にＢｕｒｎｅｔｔｅの方法（Ｗ、　Ｎｅａｔ　Ｂｕ
ｒｎｅｔｔｅ：　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１
１２．１９５−２０３（１９８１））に従って分離され
たポリペプチドをニトロセルロースフィルターに電気的
にブロッティングした。次いで、このニトロセルロース
フィルターをｒＰＲＬに対スる抗体とプロティンＡ・ホ
ースラデイツシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲート
を用いるエンザイム・イムノアッセイ法により処理をし
て、分子量的２２０００の部位にプロラクチンのバンド
を検出した。このハンドは該プラスミドを保持しない大
腸菌には検出できなかった。この結果、プラスミドｐＫ
ＫＲＰ１０を保持する大腸菌はｒＰＲＬを生産している
ことがわかった。

プラスミドｐＫＫＲＰ１０を保持する大腸菌は、平成１
年１０月２０日にＦＥＲ門Ｐ−１１０６０として、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

実施例４ この実施例は、プラスミドｐＫｃＲＰ１２を保持するし
並旦ＪＭ１０９を培養してｒＰＲＬを生産させたもので
ある。その詳細は下記のとおりである。

実施例２で得たプラスミドｐＫｃＲＰ１２を保持するＥ
、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を、実施例３で用いたのと同し
Ｌ−Ｂｒｏｔｈに接種し、以後実施例３と全く同様に処
理して菌体を回収した。また、この菌体を実施例３と全
く同様に処理してｒＰＲＬの生産を確認した。

プラスミドρＫＣＩ？Ｐ１２を保持する大腸菌は、平成
１年１０月２０日にＦＥＲＭ　Ｐ−１１０６１として、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

（発明の効果） この発明によれば、微生物中においてｒＰＲＬポリペプ
チドをコードするＤＮＡを発現する組み換え体ＤＮＡが
得られ、またこの組み換え体ＤＮＡを保持する菌類が得
られ、これによってｒＰＲＬを大量に生産することがで
きる。　ｒＰＲＬを大量に生産すれば、ｒＰＲＬの生理
活性の解明に役立ち、産業動物としてのラットの研究に
役立てることができる。さらにｒＰＲＬの生理活性が解
明されると、哺乳動物のプロラクチンの作用が類似する
ところから、ヒトプロラクチンの生理活性の解明にも資
することになるので、その貢献は甚だ大きい。

（図面の簡単な説明〕 第１図は、ラントプロラクチン相補的ＤＮＡを含んだプ
ラスミドｐｒＰＲＬｌの制限地図である。第２図は、プ
ラスミドｐＫＫｌｌＰ１０の構築過程を示した図である
。第３図は、プラスミドｐＫｃＩＩＰ１２の構築過程を
示した図である。

第１表 ＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴ　ＣＣＡＡＡＧＧＧＣＴ　ＧＡＣ
ＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＴＣＧ　ＣＧＴＴＧＣＧ
ＴＴＡＡｓｎＡｓｎＣｙｓ＊＊＊ ＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡ
ＡＣＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴＡＴＡＡ
ＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡ
ＣＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧρｒ？Ｒ乙１（２） ρｒＰＲＬ１（３） ＡＣＡＡＧＡＡＴＴＴ　ＴＣＡＧＡＴＡＡＡＧ　ＡＡＧ
ＴＴＴＣＣＡＡ　ＧＡＴＡＡＡＣ（ｉ−１−Ａ　ＡＴ（
ｊ−１−１ｏＡＡＡ（ａＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴ　ＡＴＣ
ＧＣＧＴＡＧＴ　ＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧ　ＧＣＧＡＡＧ
ＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣｌ（ｊＡｐｒＰＲＬｌ（４） ｐｒＰＲＬｌ（５） ＡＣＧＡＴＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡ　　ＣＣＡ
ＣＣＧＧＡ−１−’ｌ’　　（ｊＡｌｔａｕＬｕＡＩｌ
、Ｊ　１ｕＡｉｔ−１１ｕｔ−１ＧＴＡＧＧＴＣＡＧＡ
　　ＴＡＡτＴＡＡＣＡＡ　　ＣＧＧＣＣＣＴＴＣＧ　
　ＡＴ、ＣＴＣＡＴＴＣＡ　　ＴＣＡＡ（ｊＵｌ、ｊｌ
ｊＬｌ；ｐｒＰＲＬｌ（６） ｐｒＰＲＬｌ（７） ＴＡＴＣＣＧＣＡＴＡ　　ＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧ　　Ａ
ＡＡ（ｊＬＰｌ、ＪＡＡｕ　　ｌｉＬｉＡＨｉｎｄＩｎ 第１図 第３Ｐ訂

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１表に示したラットプロラクチンポリペプチドを
   コードする遺伝子の上流に、プロモーター、シャインダ
   ルガルノ配列及び翻訳開始コドンをこの順序に組み込ん
   で作られたラットプロラクチン生産用組み換えＤＮＡ。 ２、第１表に示したラットプロラクチンポリペプチドを
   コードする遺伝子が、プラスミドｐｒＰＲＬｌから得ら
   れ、プロモーター、シャインダルガルノ配列及び翻訳開
   始コドンが、プラスミドｐＫＫ２３３−３と合成ＤＮＡ
   リンカーから得られ、これらを結合させてプラスミドｐ
   ＫＫＲ１０とした、特許請求の範囲第１項に記載するラ
   ットプロラクチン生産用組み換えＤＮＡ。 ３、第１表に示したラットプロラクチンポリペプチドを
   コードする遺伝子、プロモーター、シャインダルガルノ
   配列及び翻訳開始コドンが、プラスミドｐＫＫＲＰ１０
   から得られ、これらをプラスミドｐＵＣ１９と結合させ
   てプラスミドｐＫＣＲＰ１２とした、特許請求の範囲第
   ２項に記載するラットプロラクチン生産用組み換えＤＮ
   Ａ。 ４、第１表に示したラットプロラクチンポリペプチドを
   コードする遺伝子の上流に、プロモーター、シャインダ
   ルガルノ配列及び翻訳開始コドンを、この順序に組み込
   んで作られたラットプロラクチン生産用組み換えＤＮＡ
   を細菌に導入してなる、ラットプロラクチン生産用菌株
   。 ５、細菌がエッシェリヒア・コリである特許請求の範囲
   第４項に記載する菌株。 ６、第１表に示したラットプロラクチンポリペプチドを
   コードする遺伝子の上流に、プロモーター、シャインダ
   ルガルノ配列及び翻訳開始コドンを、この順序に組み込
   んでラットプロラクチン生産用組み替えＤＮＡを作り、
   このラットプロラクチン生産用組み替えＤＮＡを細菌に
   導入して形質転換された菌株を作り、この菌を培養して
   ラットプロラクチンポリペプチドを生産させ、これを採
   取することを特徴とするラットプロラクチンの生産方法
   。