JPH0759193B2

JPH0759193B2 - 外来性蛋白質発現用クロ−ニングベクタ−

Info

Publication number: JPH0759193B2
Application number: JP58092197A
Authority: JP
Inventors: ナンシ−・ゲイル・メイン; ジエイムズ・ポ−ル・バ−ネツト・ジユニア; ラマモ−ルシ−・ベレガ−エ; ハンセン・マクスウエル・シウング
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1982-05-25
Filing date: 1983-05-24
Publication date: 1995-06-28
Anticipated expiration: 2010-06-28
Also published as: JPH0673096A; AU1491283A; DE3380262D1; GB2121054B; HU197349B; CA1231068A; EP0095361B1; DK230683D0; DD210306A5; AU560965B2; DK230683A; IE831211L; EP0095361A1; GB8314183D0; IE55244B1; JPS58219199A; GB2121054A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、蛋白質生産物の製造に有用な新規なDNA配列
およびクローニングベクター（ビヒクル）に関する。

Masayori I nouyeおよびその協同研究者達は、グラム陰
性菌の外膜蛋白質、特にリポプロテインに関する広範な
研究を行なった。その結果、リポプロテインは細菌細胞
に多量存在することがわかった。例えばEscherichia co
li（大腸菌）の外膜には、細胞当たり約7.2×10⁵分子の
リポプロテインが存在している。このE.coli染色体に
は、リポプロテインの為の構造遺伝子が１個しか存在し
ていないので、その転写機構は著しく効率の良いものに
違いない。

I nouyeおよびその協力者達の最近の研究は、適当に組
み立てたプラスミドを使って、形質転換した微生物中で
リポプロテインを発現させ、種々のリポプロテイン遺伝
子（lpp）のDNA配列を分析することに向けられて来た。
例えば、Naka-muraおよびI nouyeのCe18、1109−11
17（1979）には、E.coliの外膜リポプロテインのDNA配
列が報告されている。この配列のプロモーター領域を分
析した結果、いくつかの興味ある特徴が見つかった。先
ず第１に、転写開始サイトの前の261塩基対（bp）（−
１〜−261）のセグメントにおけるAT含量が70％であ
り、これは、322bpmRNA領域の53％、転写終了サイトの
後の127bpのセグメントの44％およびE.coli染色体の平
均AT含量49％と比較して著しく高いことがわかった。次
に、転写開始サイトから上流のはじめの45bp（−１〜−
45）が、ＡまたはＴの36個の塩基対（80％）を含んでい
ることがわかった。第３番目に、転写開始サイトから８
塩基の所に、「プリブノー・ボックス（Pribnow bo
x）」と類似したヘプタヌクレオチド配列が存在してい
た。第４番目に−27および−39位の間の両鎖に、「RNA
ポリメラーゼ認識サイト」に類似した配列が存在してい
た。第５番目に、転写開始サイトにおいて、長い一対の
対称が中心をなしていた。

I nouyeおよびその協力者達は、lppプロモータの力が強
いのは、上記の特徴のいずれかまたはそれらの協力作用
によるものと考えた。特に、プロモータ配列中のAT含量
が高い為にDNAのヘリックス構造が不安定化する傾向に
あり、従って、転写の開始に必須である所の鎖の巻き戻
しが促進されると推論された。

I nouyeらの研究グループは、他の、多分全ての、グラ
ム陰性菌のリポプロテイン遺伝子配列についても、これ
と非常に類似した事実が存在することを示した。例え
ば、Serratia marcescensのリポプロテイン遺伝子のDNA
配列を分析し、E.coliのlpp遺伝子とそれと比較する
と、それらが極めて類似していることがわかった（Naka
muraおよびI nouye,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77 1369−1
373、1980年）。特に、プロモータ領域は高い（84％）
類似性（homo-logy）を備えており、E.coli（80％）と
同様、極めて高いＡおよびＴ含量（78％）を持ってい
た。さらに、リポプロテインmRNAの５′−非翻訳領域
も、高い類似性（95％）を備えていた。

極く最近、Yamagata,NakamuraおよびI no-uyeらは、Erw
inia amylovoraのリポプロテイン遺伝子のDNA配列を分
析し、E.coliおよびS.marcescensのそれらと比較した
（J.Biol.Chem.256、2194〜2198、1981年）。この研究
によっても、lpp遺伝子に高い類似性が確認された。即
ち、プロモータ領域（−45〜−１）は高い類似性を有し
ていた（E.coliに対して87％、S.marcescensに対して93
％）。ＡおよびＴ含量は、E.coli（80％）およびS.marc
escens（78％）と同様、極めて高かった（80％）。更
に、mRNAの非翻訳領域の配列は高い類似性を示した（E.
coliに対して97％、S.marcescensに対して92％）。

I nouyeの研究に基ずく、リポプロテイン遺伝子につい
て観察された高レベルの構成性（constitutive）転写
は、それが外来性DNAフラグメントの発現の為のビヒク
ルとして有用であることを示している。更に、I nouye
らの研究は、例えばEscherichia coli,Shigella dysen-
teriae,Salmonella typhimurium,Citro-bacter freundi
i,Klebsiella aerogenes,Enterobacter aerogenes,Edwa
rdsiella tarda,Erwinia amylovora,Serratia marcesce
nsなどを含むグラム陰性菌の広範囲のリポプロテイン遺
伝子のいずれも使用し得ることを示唆している。

更に最近、I nouyeらにより、生産物発現のためにリポ
プロテイン遺伝子が好適であることが立証された（C.Le
e,Nakamura,およびI nouye,J.Bacter.146 861−866、19
81年）。この研究では、S.marcescensのリポプロテイン
遺伝子がラムダ−ファージにクローンされ、次いでプラ
スミドベクターpBR322およびpSC101に再クローンされ
た。このS.marcescensのlpp遺伝子を持った両ベクター
は、E.coli細胞を形質転換するのに使用された。E.coli
のlpp遺伝を持ったベクターと比較すると若干低レベル
ではあるが、正常な発現が証明された。いずれにせよ、
この文献により、lpp遺伝子プロモータおよび５′−非
翻訳領域を含むベクターは、高いレベルのリポプロテイ
ン発現を達成するのに使用し得ることが確立された。

本明細書において、「ベクター」なる用語は、（１）宿
主細胞内で複製可能であり、（２）宿主細胞を形質転換
することができ、そして（３）形質転換された細胞を同
定するのに好適に使用し得るマーカーを含んでいるプラ
スミド、ファージDNAあるいはその他のDNA配列を意味す
る。

本発明に係る特異なクローニングベクターには２つの態
様がある。このクローニングベクターの態様のいずれを
用いても、極めて高いレベルで外来蛋白質を発現させる
ことができる。最初の態様では、クローニングベクター
は、縦列に、リポプロテインプロモータ領域を指定して
いるヌクレオチド配列、リポプロテイン５′−非翻訳領
域を指定しているヌレオレチド配列、および外来蛋白質
生産物を暗号化している配列を含む様に組み立てられて
おり、該蛋白質生産物を暗号化している配列は、翻訳開
始信号コドンを介して、リポプロテイン遺伝子の５′−
非翻訳領域の３′末端と結合している。第２の態様で
は、外来蛋白質生産物を暗号化している配列は、上記の
開始コドンおよびエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化
しているヌクレオチド配列を介して、リポプロテイン遺
伝子の５′−非翻訳領域の３′末端と結合している。

即ち、本発明は、外来蛋白質を発現させるのに有用な組
換えDNAクローニングベクターであって、（ａ）複製の機能起源（functional origin）を含有し
ているDNAセグメント、（ｂ）該ベクターを形質転換し得る宿主細胞に導入した
場合、選択に使用することができる性質を該宿主細胞に
伝達する１種またはそれ以上のDNAセグメント、および（ｃ）縦列に、（１）リポプロテインの発現コントロー
ル配列のプロモータ、（２）リポプロテインの発現コン
トロール配列の５′−非翻訳領域、および（３）固有
（endogenous）蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配
列の全てまたは１部によって介在されることなく、
（イ）外来蛋白質を暗号化している配列、または（ロ）
外来蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列と、中断
されることなく、結合しているエンテロキナーゼ開裂サ
イトを暗号化しているヌクレオチド配列、が後に続いて
いる翻訳開始コドン、を指定している配列を含むDNAセ
グメント、を含有している組換えDNAクローニングベクターに関す
る。

本発明の組換えDNAクローニングベクターは、DNAセグメ
ント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を連結（link）するこ
とにより製造される。既述した様に、本発明は、外来蛋
白質を生産するのに極めて効率の良いDNA配列および組
換えDNAクローニングベクターを提供するものである。
これらはいずれも、リポプロテイン遺伝子（lpp）機
構、好ましくはグラム陰性菌のリポプロテイン遺伝子の
少なくとも１部を使用するものである。本明細書に於い
て、「外来蛋白質」なる用語は、リポプロテイン遺伝子
機構によって正常に発現されるリポプロテイン分子以外
の蛋白質生産物またはその様な分子のあらゆる部分を指
すものとする。

lpp機構のソース（source）として役立つグラム陰性菌
の代表例は例えばEscherichia coli,Shigella dysenter
iae,Salmonella typhimu-rium,Citrobacter freundii,K
lebsiella aerogenes,Enterobacter aerogenes,Edward-
siella tarda,Erwinia amylovora,Serratia-marcescens
などである。

このlpp遺伝子は、５つの要素で表わすことができる。
この遺伝子中のこれらの要素の順序は以下の通りであ
る：（１）プロモータ領域、（２）５′−非翻訳領域、
（３）リポプロテイン暗号領域、（４）３′−非翻訳領
域、および（５）転写終了サイト。

遺伝子系でのこれらの要素の夫々の機能はよく知られて
いる。プロモータ領域は、メッセンジャーRNA（mRNA）
の生産（転写）の開始をとりなす。プロモータは外部コ
ントロールがなくてもよく（構成性）、それが存在する
とき、遺伝子機能を抑制する物質即ちリプレッサの支配
下であってもよく、また、遺伝子機能を誘発するのに必
要な物質、即ちインジューサの支配下にあってもよい。
lpp遺伝子は外部コントロールがなく、従って「構成
性」と呼ばれる。

プロモータまたはその近くに、RNAポリメラーゼが結合
しmRNAの転写を開始する点、「転写開始サイト」が存在
する。転写が開始されると、mRNAが生成する。生成した
mRNAの構造は、上記の遺伝子要素（２）〜（４）のDNA
配列によって決まる。

生成したmRNAは、蛋白質生産物に翻訳され得る配列を持
っている。この翻訳される配列は、５′−非翻訳領域の
下流であって、３′−非翻訳領域の上流に存在する。翻
訳は、mRNA5′−非翻訳領域内のリボゾーム結合サイト
と呼ばれる配列にリボゾームが結合することによって媒
介され、生産物遺伝子配列の最初のコドンとして存在
し、アミノ酸、メチオニン（Met）を暗号化しているも
のでもある翻訳開始コドン（AUG）において開始され
る。翻訳は翻訳領域の末端に存在する１もしくはそれ以
上の終止コドンで終了する。

ベクターに、発現コントロール（調節）配列、即ち構造
遺伝子に効果的に（operatively）連結したとき該遺伝
子の発現をコントロールし調整するヌクレオチド配列、
を挿入することにより、外来（exogenous）蛋白質の生
産に有用なクローニングベクターを調整することが、組
換えDNA技術によって最近可能となってきた。本発明の
要旨は、前記の要素（１）、（２）、（４）および
（５）を含む、lpp発現コントロール配列の全てまたは
一部を使用したクローニングベクターに存する。本発明
のクローニングベクターにおいては、これらの４つの要
素のうち要素（１）および（２）、即ちプロモータ領域
および５′−非翻訳領域だけが必要である。

従来、組換えDNA法によって、外来蛋白質を暗号化して
いるDNA配列を、クローニングベクターの発現コントロ
ール配列に、発現された生産物がハイブリッド（雑種）
蛋白質になるような位置に挿入することにより、外来蛋
白質を生産するのが普通であった。本明細書に於いて、
「ハイブリッド蛋白質」とは、外来蛋白質が付着してい
る、発現コントロール配列によって生産される固有の
（endogenous）蛋白質（この場合リポプロテイン）の全
てまたは一部からなる組換えDNA生産物を意味する。

適切に設計されたハイブリッド蛋白質は、固有の蛋白質
部分と外来蛋白質との結合部に開裂サイトを含有してい
る。ハイブリッド蛋白質生成物を化学的にまたは酵素的
に処理するとこの開裂サイトによって外来蛋白質生成物
が完全な形で生成する。

既述したように、lpp発現コントロール配列は外来蛋白
質の発現に有用であることが解った。しかし極く最近、
このlpp発現コントロール配列は次のような設計で組み
立てを行うとき、非常に好都合に外来蛋白質を発現する
のに使用し得ることが解った：即ち縦列に、プロモータ
およびリポプロテイン発現コントロール配列の５′−非
翻訳領域を指定している配列および翻訳開始コドンを含
み、その後に、固有の蛋白質を暗号化しているヌクレオ
チド配列の全てまたは一部分で中断されることなく、外
来蛋白質を暗号化している配列、或いは、外来蛋白質を
暗号化している配列と中断することなく結合しているエ
ンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化しているヌクレオチ
ド配列、が続いているといったDNAセグメント。これは
リポプロテインまたはその一部および外来蛋白質からな
るハイブリッド蛋白質とは対照的なものである。

本発明に係るクローニングベクターを組み立てるには2,
3の要素が必要である。必要な要素の２つは有用なクロ
ーニングベクターの全てに共通している。第１は、この
ベクターは複製の機能起源（レプリコン）を含有するDN
Aセグメントを持っていなければならないということで
ある。プラスミドおよびファージDNAは、本来、宿主細
胞中で複製を促進するレプリコンを含んでいる。

第２に、このベクターは非形質転換細胞から形質転換細
胞を選択するのに有用な性質を形質転換し得る宿主細胞
に運び込むDNAセグメントを持っていなければならな
い。選択の目的には広範囲の性質のいずれをも使用する
ことができる。最も普通に使用される性質の１つは抗生
物質耐性、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシ
リン耐性である。

上記の２つの要素は一般に容易に入手し得る、そして知
られているクローニングベクター中に存在している。好
適なクローニングベクターの例は細菌性プラスミド、例
えばpBR322,pMB89,ColE1,pCR1を包含するE.coliからの
プラスミド、RP4を含むより広い宿主範囲のプラスミ
ド、ハァージDNA、例えばラムダーなどである。全てで
はないが、上記の既知のベクターの大部分は、前記の２
つの要素を既に含んでいる。

本発明に係るベクターに特異な第３の要素はリポプロテ
イン発現コントロール（調節）配列である。プラスミド
pKEN111に存在し、E.coli CC620で培養されるE.coliリ
ポプロテイン発現コントロール配列は、Northern Regio
nal Research Center,Agricultural Research,North Ce
ntral Region,1815 North Universety Street,Peoria,I
lli-nois,61604に寄託され、そのストックカルチャーコ
レクションの一部となっており、そこから誰でも寄託番
号NRRL15011で利用することが出来る。このリポプロテ
イン発現コントロール配列は、pKEN111から、認識され
ている制限サイトおよびそれに相当する制限エンドヌク
レアーゼを使って取除くことができる。広範囲のその他
のリポプロテイン発現コントロール配列も認識されてい
る方法を使って利用することができる。このような方法
には、例えば、合成による調製、または入手し得るlpp
配列（例えばpKEN111）を使ってプローブを単離し、lpp
配列間の高度の類似性を利用して、このプローブを使っ
て選択し、ハイブリジデーション（雑種形成）によって
他のソースからのlpp配列を調整する方法が含まれる。

リポプロテイン発現コントロール配列を挿入することに
より好適なクローニングベクターを製造するには常法を
用いてもよい。クローニングベクター内には特定の制限
エンドヌクレアーゼを使って切断し得る種々のサイトが
存在する。これらのサイト（部位）はいずれもリポプロ
テイン発現コントロール配列の挿入に選択、使用するこ
とができる。例えば、よく知られた、そして文献に記載
されているプラスミドpBR322にはいくつかの好適な制限
サイトが存在し、そのいずれも挿入サイトとして使用す
ることができる。PstIサイトはβ−ラクタマーゼの遺伝
子内に存在している。全ての特異な暗号領域の外側の他
のサイトはEcoRIおよびPvuIIである。これらの、および
その他のサイトは当業者にはよく知られている。

これらの、或いはその他のサイトを利用して、リポプロ
テイン発現コントロール配列またはその必須部分を容易
に挿入することができ、本発明に係るベクターを製造す
ることができる。

本発明に係るベクターに特異な第４番目の要素は、外来
蛋白質を暗号化しているDNA配列である。本発明のベク
ターにおける外来蛋白質DNA配列に関する必須要件はそ
の位置にある。これはリポプロテイン発現コントロール
配列の５′−非翻訳領域の３′末端の下流に存在しなけ
ればならず、翻訳開始コドンおよびそれに続くエンテロ
キナーゼ開裂サイトを暗号化しているヌクレオチド配列
を介してそれと連結していなければならない。本発明の
ベクターにおいては、リポプロテインを暗号化している
DNA配列はいかなるものも、５′−非翻訳領域および外
来蛋白質を暗号化している配列の間に介在してはならな
い。

本発明に係るベクターに特異な第５番目の要素は、外来
蛋白質を暗号化している配列と、中断することなく結合
しているエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化している
ヌクレオチド配列が後に続いている翻訳コドンである。
上記の開裂サイトのアミノ酸配列は、酵素エンテロキナ
ーゼにより認識され、そのカルボキシ末端で開裂され
る。エンテロキナーゼで開裂されるアミノ酸配列を暗号
化しているヌクレオチド配列は、その５′末端において
翻訳開始コドンと結合しており、その３′−末端におい
て外来蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列の５′
末端と結合しており、（メチオニン）−（エンテロキナ
ーゼ開裂サイト）−（外来蛋白質）という構成の得られ
た翻訳生産物をエンテロキナーゼで処理することにより
開裂することができ、完全な外来蛋白質を生産し得るよ
うに設計する。

エンテロキナーゼ（3.4.21.9）は十二指腸の刷子縁膜に
存在する多数の加水分解酵素の１つとして記載されてい
る（J.J.LiepnieksおよびA.Light,J.Bilo.Chem.254、16
77−1683（1979））。その単離および精製については多
くの文献、例えばLiepnieks、上記、S.Mroux,J.Baratti
およびP.Desnuelle,J.Biol.Chem.246、5031−5039（197
1）、およびJ.Baratti,S.Maroux,D.Louvard,およびP.De
snu-elleのBiochimica et Biophysica Acta315、147−1
61（1973）に記載されている。

エンテロキナーゼは、各種のアミノ酸、例えばグルタミ
ン酸（Glu）および／またはアスパラギン酸（Asp）に続
くリシン（Lys）残基のカルボキシル基でペプチドを開
裂するようである。例えばA.Light,H.S.Savithriおよび
J.J.LiepnieksのAnal.Biochem.106、199−206（1980）
には、エンテロキナーゼで認識されるアミノ酸配列が多
数記載されており、例えば以下のものが含まれている： Phe−Pro−Leu−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys; Val−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys; Phe−Pro−Ile−Glu−Glu−Asp−Lys; Leu−Pro−Leu−Glu−Asp−Asp−Lys; Ala−Asp−Asp−Lys; Asp−Asp−Asp−Asp−Lys。

本発明に係るクローニングベクターには上記のおよびそ
の他のいずれかを暗号化しているヌクレオチド配列が存
在していてよい。必要なことは、そのヌクレオチド配列
は、エンテロキナーゼにより認識され、長鎖のペプチド
中に存在する場合そのカルボキシ末端で開裂されるアミ
ノ酸配列を暗号化しているものであるという点だけであ
る。

この要求を満たすベクターを組み立てるにあたり、E.co
liリポプロテイン発現コントロール配列の５′−非翻訳
領域に存在する唯一（unigue）のXbaI制限サイトを好都
合に利用することができる。このXbaIサイトで切断する
ことができ、５′−非翻訳領域の一部を除去することが
できる。既知のオリゴヌクレオチド合成法を使って、開
始コドンまたはエンテロキナーゼ開裂サイトが後に続く
開始コドンを暗号化しているDNA配列と結合している
５′−非翻訳領域の除去された部分および外来蛋白質の
全てまたは一部を含有しているリンカーを製造すること
ができる。

外来蛋白質を暗号化しているDNA配列は合成により、例
えば既知のホスホトリエステル法或いはその他のよく知
られた方法を使って組み立てることができるが、このDN
A配列はまた、既知の方法で、単離されたmRNAからのコ
ピーとして得ることもできる。一度得られると、このcD
NAコピーは開始コドンが得られる点に存在する制限サイ
トで切断することができる。本発明に係るクローニング
ベクターの第１番目の態様では、XbaI開裂によって除去
されたリポプロテイン５′−非翻訳領域フラグメントと
それに続く開始コドンを含む外来蛋白質の開裂部分から
構成されるリンカーを合成的に製造することができる。
本発明に係るクローニングベクターの第２番目の態様で
は、XbaI開裂によって除去されたリポプロテイン５′−
非翻訳領域フラグメントおよびそれに続く開始コドン、
エンテロキナーゼ開裂サイト、および外来蛋白質の開裂
された部分からなるリンカーを合成的に製造することが
できる。ギャップを埋める（橋渡しする）に十分なこれ
らのリンカーは、リポプロテイン発現コントロール配列
の残りの利用し得る要素と共に、ベクターを調製するの
に使用する。

本発明に係るクローニングベクターは哺乳動物およびヒ
トのホルモン類、酵素類、および免疫源（immunogeni
c）蛋白質を含む広範囲の外来蛋白質（またはその中間
体）を生産するのに使用することができる。このような
生産物の例は、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、
プロインシュリン、インターフェロン、成長ホルモン、
足および口腔疾患のための抗原性蛋白質、ソマトスタチ
ン、β−エンドルフィンなどである。好ましいクローニ
ングベクターはヒト成長ホルモンまたは牛成長ホルモン
を生産するように設計されたベクターである。第１番目
の態様のクローニングベクターによる発現生産物は、開
始コドンが存在するため、そのアミノ末端にメチオニン
（Met）を含んでいることは容易に理解されよう。第２
番目の態様のベクターによる発現生産物は、メチオニン
（開始コドン）、エンテロキナーゼ開裂サイト、および
外来蛋白質を含んでいる。完全な外来蛋白質は、発現生
産物を、既知の方法（例えばLightらの文献、上記参
照）でエンテロキナーゼで処理することにより生成す
る。

本発明に係るクローニングベクターは広範囲の微生物、
例えばEscherichia coli,Serratia,Pseudomonas,などの
グラム陰性原核生物、Bacillus,Streptomycesなどのグ
ラム陰性原核生物、およびSaccharomycesなどの真核生
物などの宿主生物において使用することができる。宿主
生物はグラム陰性原核生物であることが好ましい。グラ
ム陰性原核生物のうち、E.coliは特に好ましく例えばE.
coli K−12株、例えばRV308は特に好ましい。

よく知られた方法を使って、このクローニングベクター
を適当な宿主生物に導入して形質転換し、その生物中で
増幅させ、標準的な発酵条件を使用して外来蛋白質生産
物を発現させることができる。得られた発酵ブロスから
常法により外来蛋白質生産物を単離することができる。

本発明に係るクローニングベクターの構造および機能を
後記実施例において例示する。この実施例は添付の図面
を参照して理解されるべきである。

第１図〜第４図は、一緒になって、本発明に係る両態様
のクローニングベクターを組み立てるのに有用な中間体
および出発物質の製造を図式化して示したものである。

第５図は第１〜４図と一緒になって、メチオニル（Meth
ionyl）ヒト成長ホルモンを生産するのに有用なクロー
ニングベクターを組み立てるための後記実施例１に記載
した方法を図式化したものである。

第６〜８図は、第１〜５図と一緒になって、メチオニル
牛成長ホルモンの生産に有用なクローニングベクターを
組み立てるための実施例２に記載した方法を図式化した
ものである。

第９図は、第１〜５図と一緒になってメチオニルヒト成
長ホルモンの生産に有用な、実施例１に記載のクローニ
ングベクターの変異体であるクローニングベクターを組
み立てるための実施例３に記載の方法を図式化したもの
である。

第10図は、第１〜４図と一緒になって、ヒト成長ホルモ
ンの生産に有用な本発明に係る第２の態様のクローニン
グベクターを組み立てるための実施例４に記載した方法
を図式化したものである。

第11図〜第13図は、第10図および第１〜４図と一緒にな
って、牛成長ホルモンの生産のための第２の態様のクロ
ーニングベクターを組み立てるための実施例５に記載の
方法を図式化したものである。

製造例本発明に係る第１および第２の態様のプラスミ
ドを組み立てるための共通の中間体および出発物質。

プラスミドベクターpKEN021（第３図の106）のXbaI
（５′TCTAGA3′）、BamHI（５′GGATCC3′）開裂によ
って得られる〜5.1kb（キロ塩基）フラグメントを出発
物質として使用した。pKEN021はpKEN111（第１図の10
1）の誘導体である（Lee,N.らJ.Bact.146、861−866（1
981）およびZwiebel,L.J.らJ.Bact.145、654−656（198
1）参照。これはE.coli CC620に入れて寄託されている
（NRRL寄託番号15011））。プラスミドpKEN111はE.coli
のリポプロテイン遺伝子を含む2.8kbフラグメントを持
っている。このフラグメントについてはNakamura,K.お
よびI nouye,M.のCell18、1109−1117（1979）に記載さ
れている。pKEN021においては、pBR322の唯一のEcoRI
（５′GAATTC3′）およびSalI（５′GTCGAC3′）制限サ
イトの間の650Obp（塩基対）配列が、E.coliのリポプロ
テイン遺伝子から得た配列で置き換えられている。この
遺伝子の全ての機能部分のヌクレオチド配列は決定され
ている。リポプロテイン遺伝子配列（Nakamura,K.およ
びI nouye,M.のCell18、1109−1117（1979））は、リポ
プロテイン遺伝子の最初のコドン（メチオニン）の上流
に462bpAluI（５′AGCT3′）フラグメントを含んでい
る。このフラグメントはプロモータ、５′−非翻訳領域
およびリボゾーム結合サイトを持っている。唯一のXbaI
（５′TCTAGA3′）制限サイトは翻訳開始メチオニンコ
ドンの16bp前のリボゾーム結合サイト内に存在する。構
造遺伝子の翻訳終止コドンの105bp上流に存在するPvuII
（５′CAGCTG3′）制限サイトを、合成DNAアダプターフ
ラグメント（５′CCGGATCCGG3′、Collaborative Resea
rchから入手）を付加することにより、BamHI（５′GGAT
CC3′）制限サイトに変換した。リポプロテインの最後
の35アミノ酸のための暗号配列、翻訳終止コドンおよび
メッセンジャーRNAの３′−非翻訳領域に相当する配列
がこのBamHIサイトに続いている。プラスミドpKEN021は
また、リポプロテイン遺伝子に関係のない、E.coli染色
体においてその下流に位置する約850bpの外来性の配列
を含んでいる。これらの配列は、この方法の結果とし
て、また、遺伝子の最初の単離に使用した制限酵素サイ
トの結果として含まれたものである。

第１〜第３図に関し、プラスミドpKEN021は以下の方法
でpKEN111から誘導する:pKEN111（第１図の101）50μｇ
を、20mMトリス：塩酸（pH7.4）、10mMMgCl₂および6mM
のβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液300μｌ中、
制限酵素HpaII（５′CCGG3′）25単位を用いて37℃で２
時間消化する。この混合物をフェノールおよびクロロホ
ルムの混合物（50:50）300μｌで２回抽出し、回収した
水相にエタノール2.5容を加えて沈澱させる。DNAペレッ
トを電気泳動緩衝液100μｌに溶解し、５％のポリアク
リルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比（bis rati
o）は、特に指摘しないかぎり全てのゲルにおいて29:1
である）を用いて分画する。このゲルを0.5μg/mlのエ
チジウムブロミドを含有する溶液に入れて染色し、帯を
長波長の紫外線下で観察する。950bpの帯を単離し、電
気溶出によりゲルから透析袋に回収する。フェノール／
CHCl₃抽出、およびエタノール沈澱の後、回収したDNA
（約2.5μｇ）を24μｌのTEN（10mMのNaCl、10mMのトリ
ス:HCl（pH7.4）および1mMのナトリウムエチレンジニト
リロテトラアセテート（EDTA）、pH8.0）に溶解する。

950bpのHpaIIフラグメント２μｇを、50mM NaCl、6mM
トリス:HCl（pH7.6）、6mM MgCl₂および6mM β−メル
カプトエタノールを含有する緩衝液200μｌ中、制限酵
素AluI（５′AGCT3′）を用いて２時間37℃で消化す
る。DNAを６％のポリアクリルアミドゲル上で分画し、
生成した462bpAluIフラグメントを既述した方法で回収
し精製する。この462bpAluIフラグメント（約１μｇ）
を150ピカモル（picamole）のリン酸化EcoRIリンカー
（５′GGAATTCC3′、Col-laborative Researchから入
手）および２単位のT₄DNAリガーゼを含むT₄DNAリガーゼ
緩衝液（66mMトリス:HCl（pH7.6）、10mM MgCl₂、10mM
ジチオトレイット、0.4mM ATP）10μｌに溶解する。４
℃で16時間インキュベートした後、この混合物を65℃で
10分間加熱し、EcoRI緩衝液（100mM トリス:HCl（pH7.
2）、50mM NaCl、10mM MgCl₂、6mM β−メルカプトエ
タノール）および40単位のEcoRI酵素を加えて100μｌに
希釈する。37℃で２時間放置した後、この試料をフェノ
ール／CHCl₃で抽出し、上記の方法でエタノール沈澱さ
せる。このDNAを、0.1単位のT₄DNAリガーゼおよびEcoRI
で線状化し、アリカリホスファターゼ処理により末端ホ
スフェートを除去した0.1μｇのpBR322（第１図の102）
を含有するT₄DNAリガーゼ緩衝液20μｌに溶解する。４
℃で16時間結合させた後、この物質を用いてHB101のよ
うな好適なE.coli株（hsr^-、hsm⁺）を形質転換する。こ
の細菌細胞は、標準的なCaCl₂処理により形質転換に関
してコンピテントにする。テトラサイクリン12μg/mlを
含有する寒天平板上で形質転換体を選択する。Birnboi
m,H.C.およびDoly,J.の高速アルカリ抽出法（Nucleic A
cids Research７、1513−1523（1979））で多くのテト
ラサイクリン耐性コロニーからプラスミドを単離する。
466bpXbaI、BamHIフラグメントを含有するプラスミド
（所望の配向、第１図の103）を選択し、次の工程の出
発物質として使用する。

このプラスミド２μｇ（第２図の103）（１個のHind II
I（５′AAGCTT3′）制限サイトを持っている）を、Hind
III緩衝液（60mMNaCl、10mMトリス:HCl（pH7.4）、10m
M MgCl₂および6mM β−メルカプトエタノール）50μｌ
中、Hind III酵素２単位を用いて37℃で１時間消化す
る。フェノール／CHCl₃抽出およびエタノール沈澱の
後、このDNAを300mM NaCl、30mM酢酸ナトリウム（pH4.2
5）、1mM Zn Cl₂および１本鎖DNAに特異なS1ヌクレアー
ゼ（Miles Laboratories）200単位を含有する緩衝液200
μｌに溶解する。15℃で１時間反応させた後、フェノー
ル／CHCl₃抽出およびエタノール沈澱により反応を停止
させる。１本鎖Hind III−生成末端を除去されたこのプ
ラスミドを20ピカモルのリン酸化BamHIリンカー（５′C
CGGATCCGG3′、Collabora-tive Researchから入手）お
よび２単位のT₄DNAリガーゼを含むT₄DNAリガーゼ緩衝液
10μｌに溶解する。４℃で16時間反応させた後、この反
応混合物を65℃で10分間加熱してリガーゼを不活性化す
る。この混合物を20単位のBamHI酵素を含有するBamHI緩
衝液（150mM NaCl、20mMトリス:HCl（pH8.0）、10mM Mg
Cl₂、6mM β−メルカプトエタノール）100μｌに希釈
する。37℃で２時間放置した後、この混合物を１％アガ
ロースゲル上で精製する。ゲルを染色し、大きいほうの
フラグメント（4.5kb）を凍結後溶出により回収し、フ
ェノール／CHCl₃抽出およびエタノール沈澱により精製
する。BamHI相補末端を持ったこの回収したプラスミド
を、T₄DNAリガーゼ0.1単位を含有するT₄DNAリガーゼ緩
衝液20μｌに溶解する。４℃で16時間放置した後、この
DNAを使ってE.coli HB101を形質転換する。形質転換体
を100μg/mlのアンピシリンに対する耐性（Ap^r）により
選択し、10μg/mlのテトラサイクリンに対する感受性
（Tc^s）についてスクリーニングする。Ap^rTc^sであるコ
ロニーから既述のBirn-boim法によりいくつかのプラス
ミドを調製する。これらのHind IIIサイトの非存在およ
び唯一のBamHIサイトの存在について試験する。EcoRI、
SalIで順次消化すると、466bpおよび305bpのフラグメン
トが得られる。これらの特性を持ったプラスミド（第２
図の104）を選択し、lppプロモータの上流に位置するEc
oRIサイトを除去しこれをHind III制限サイトに変換す
るように改変する。

プラスミド（第２図の104）２μｇを、EcoRI緩衝液100
μｌ中、EcoRI、0.2単位を用いて37℃で10分間消化す
る。65℃で10分間加熱して反応を停止させる。フェノー
ル／CHCl₃抽出の後、このDNAをエタノール沈澱させ、10
00単位/mlの割合いでS1ヌクレアーゼを含有しているS1
ヌクレアーゼ緩衝液200μｌに溶解する。12℃で１時間
反応させた後、フェノール／CHCl₃抽出およびエタノー
ル沈澱により反応を停止させる。DNAを、20ピカモルの
リン酸化Hind IIIリンカー（５′CCAAGCTTGG3′、Colla
borative Researchから入手）および２単位のT₄DNAリガ
ーゼを含有するT₄DNAリガーゼ緩衝液10μｌに再懸濁す
る。４℃で16時間放置した後、65℃で10分間加熱してリ
ガーゼを不活性化する。この反応混合物を10単位のHind
III酵素を含有するHind III緩衝液150μｌに希釈す
る。37℃で２時間インキュベートした後、この混合物を
１％アガロースゲル上で分画する。エチジウムブロミド
で染色した後、最大の帯（シングルカットのプラスミド
に等しい）を回収し精製する。このプラスミドを0.2単
位のT₄リガーゼを含有するT₄リガーゼ緩衝液20μｌに溶
解し、４℃で16時間インキュベートし、これを使ってE.
coli HB101を形質転換する。形質転換体をアンピシリン
耐性について選択し、Birnboim法によりスクリーニング
する。プラスミド単離物をEcoRI（１サイト）およびHin
d III（１サイト）酵素を用いて制限分析する。500bpの
EcoRI、Hind IIIフラグメントを持ったプラスミド（第
２図の105）を選択し、lpp遺伝子の３′領域の付加のた
めのクローニングベクターとして使用する。

プラスミド（第３図の105）２μｇをSalI制限緩衝液（1
50mMNaCl、6mMトリス:HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂、6mM
β−メルカプトエタノール）50μｌ中、SalI2単位を用
いて37℃で１時間消化する。この溶液をBamHI2単位を含
有するBamHI緩衝液150μｌに希釈する。37℃で１時間放
置した後、アルカリホスファターゼ2.5単位を加え65℃
で１時間インキュベートする。この物質をフェノール／
CHCl₃抽出およびエタノール沈澱させ、TENに溶解し、lp
p3′フラグメントのためのクローニングベクターとして
使用する。

lpp3′領域を含むフラグメントを得るために、pKEN111
（第３図の101）10μｇをHpaI緩衝液（20mM KCl、10mM
トリス:HCl（pH7.4）、10mM MgCl₂および6mM β−メル
カプトエタノール）200μｌ中、HpaI（５′GTTAAC3′）
10単位を用いて37℃で２時間消化する。フェノール／CH
Cl₃抽出およびエタノール沈澱の後、DNAを20ピカモルの
リン酸化SalIリンカー（５′GGTCGACC3′、Collaborati
ve Researchから入手）および２単位のT₄DNAリガーゼを
含有するT₄DNAリガーゼ緩衝液10μｌに溶解する。４℃
で16時間放置した後、65℃で10分間加熱してリガーゼを
不活性化する。この物質を10単位のSalIを含有するSalI
緩衝液100μｌに希釈し、37℃で１時間インキュベート
する。このDNAを10単位のPvuII制限酵素を含有するPvuI
I緩衝液（60mM NaCl、6mMトリス:HCl（pH7.5）、6mM Mg
Cl₂、6mM β−メルカプトエタノール）300μｌに希釈
する。37℃で１時間放置した後このDNAを５％のポリア
クリルアミドゲル上で分画する。約0.5μｇの950bpフラ
グメントを回収し、精製し、TENに溶解する。2/10μｇ
のフラグメントを20ピカモルのリン酸化BamHIリンカー
（５′CCGGATCCGG3′、Collaborative Researchから入
手）および２単位のT₄DNAリガーゼを含むT₄DNAリガーゼ
緩衝液20μｌに希釈する。４℃で16時間放置した後、65
℃で10分間加熱してリガーゼを不活性化する。このDNA
を20単位のBamHIを含有するBamHI緩衝液100μｌに希釈
する。37℃で２時間保持した後、DNAを５％のポリアク
リルアミドゲル上で分画し、過剰のリンカー分子を除去
する。BamHIおよびSalI相補末端を持った950bpフラグメ
ントを回収し精製する。このフラグメントを0.2μｇの
既述したクローニングベクターおよび0.2単位のT₄DNAリ
ガーゼを含有するT₄DNAリガーゼ緩衝液20μｌに溶解す
る。４℃で16時間インキュベートした後、この物質を使
ってE.coli HB101を形質転換する。アンピシリン耐性形
質転換体からプラスミドを調製し、950bpのSalI、BamHI
フラグメントについて分析する。所望のプラスミド（5.
2kb）はpKEN021と命名した（第３図106）。

pKEN021 10μｇをXbaI/BamHI緩衝液200μｌ中（150mM N
aCl、10mMトリス:HCl（pH8）、10mM MgCl₂、6mM β−
メルカプトエタノール）、BamHI10単位を使って37℃で
１時間、次いでXbaI10単位を使って37℃で１時間消化し
た。このDNAをアルカリホスファターゼ2.5単位で65℃で
1.5時間処理し、フェノール／CHCl₃抽出し、エタノール
沈澱によって集め、0.2μg/μｌとなるようにTEN50μｌ
（10mMトリス:HCl（pH7.4）、10mM NaCl、1mM EDTA）に
溶解した。この調製物（第３図の107）をプラスミドク
ローニングベクターとして使用した。

ヒト成長ホルモン遺伝子部分のための暗号配列を含んで
いるDNAフラグメントのソースとして、Martial,J.H.ら
により記載されているプラスミドptrpED50chGH800（第
４図の108）（Science 205、602−607（1979））を使用
した。このフラグメントは、ヒトの脳下垂体からヒト成
長ホルモンを暗号化しているmRNAを単離する既知の方法
により得ることもできる。このような方法はGoodman,H.
M.らにより報告されている（Methods in Enzym-ology 6
8、75−90（1979））。プラスミドptrpED50chGH800のヒ
ト成長ホルモン遺伝子部分には、この遺伝子の翻訳終止
コドンから6bp下流に唯一のSmaI（５′CCCGGG3′）制限
サイトが含まれている。このサイトを以下の手法でBamH
Iサイトに変換した：このプラスミド６μｇをSmaI制限
緩衝液（15mMトリス：塩酸（pH8.0）、6mM MgCl₂、15mM
KClおよび6mM β−メルカプトエタノール）200μｌ
中、SmaI6単位を用いて37℃で1.5時間消化した。消化が
完了した後、フェノール／CHCl₃抽出を行ない、DNAをエ
タノール沈澱により回収した。沈澱したDNAをTEN24μｌ
に溶解した。リン酸化BamHIアダプターフラグメント（C
ollaborative Re-search）40ピカモルを、２単位のT₄DN
Aリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液16μｌ中、上記の
消化したプラスミド0.5μｇ（0.2ピカモルends）に添加
した。22℃で２時間、４℃で16時間結合させた。65℃で
10分間T₄DNAリガーゼを不活性化した。20単位のBamHI酵
素を含有するBamHI緩衝液に希釈し、最終全容量を40μ
ｌとし、次いで37℃で１時間インキュベートすることに
よりBamHI相補末端を生成させた。この酵素によりリン
カー配列およびヒト成長ホルモンのクローンしたcDNA配
列の初めの部分に存在するBamHIサイトが開裂された。
その結果、相補BamHI末端を有する691bpフラグメントが
生成し、これを６％ポリアクリルアミドゲル上で分離
し、１μg/mlのエチジウムブロンド溶液中で染色した後
長波長の紫外線により観察した。このフラグメントを含
有するゲル部分を切取り、透析袋への電気溶出次いでエ
タノール沈澱によりDNAフラグメントを回収した。沈澱
したDNAを遠心分離により回収し、TENに溶解し、フェノ
ール／CHCl₃抽出してエチジュウムブロンドを除去し次
いでエタノール沈澱させた。回収したDNAフラグメント
を、既述した条件下で緩衝液20μｌ中、0.2単位のT₄DNA
リガーゼを用いて、その唯一のBamHIサイトで予め開裂
させ次いでアルカリホスファターゼで処理したpBR322
0.2μｇ（第４図の102）と結合させた。４℃で16時間放
置した後、この物質を用いて、寄託番号NRRLNo.15014で
寄託されているE.coli株JA221（recA^-，hrs^- hsm⁺，Δ
trpE5,thr,leu,thi,lacY^-）を形質転換した。Wensink,
P.C.らの形質転換法（Cell ３、315−325（1974）を使
用し、形質転換されたコロニーを100μg/mlのアンピシ
リンを含有する寒天平板上で選択した。Birnboimによっ
て記載されている高速アルカリ変性法により、16個のア
ンピシリン耐性コロニーからプラスミドDNAを単離し、
次いで制限酵素消化およびゲル電気泳動により分析し
た。調べた16個のプラスミドのうち11個が約700bpのBam
HIフラグメントを含有していることが解った。これらの
プラスミドの１つpNM575（第４図の109）を選んで増幅
させ、以降のプラスミド組み立てのためのDNAフラグメ
ントのソースとして使用した。完全なヒト成長ホルモン
のDNA配列には、最初のヌクレオチドから47bpのところ
に１個のFnuDII（５′CGCG3′）サイトが含まれてい
る。pBR322にはこの酵素の認識サイトが23存在する。pN
M575の25μｇを、BamHI緩衝液250μｌ中、25単位BamHI
を用いて37℃で１時間消化した。BamHI相補末端を持っ
た691bpフラグメントを６％のポリアクリルアミドゲル
から単離し、前記の方法で精製した。このフラグメント
を精製した後、その1/3（プラスミド８μｇに相当）
を、FnuDII緩衝液100μｌ中（6mM NaCl、6mMトリス:HCl
（pH7.4）、6mM MgCl₂、6mM β−メルカプトエタノー
ル）、2.5単位のFnuDIIを用いて37℃で1.5時間消化し
た。６％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標
準的な回収操作を用いてこの遺伝子の最後の175アミノ
酸およびそれに続く翻訳終止コドンの暗号配列を含有し
ている538bpDNAフラグメントを単離した。

実施例１ E.coliのリポプロテインプロモータを使ったメチオニル
ヒト成長ホルモン発現のためのプラスミド A.組み立てヒト成長ホルモンを直接発現させるため、リン酸トリエ
ステル法により、lppプロモータ領域をヒト成長ホルモ
ン暗号領域と結合させて２本鎖DNAフラグメント（第５
図の110）を合成した。上の鎖（upper strand）、XbaI
開裂により生じた４ヌクレオチドの１本鎖配列を５′末
端に含んでいる66ヌクレオチドを持っている。下の鎖は
上の鎖の最後の62ヌクレオチドに相補的な62ヌクレオチ
ドを持っている。この合成DNAフラグメントの最初の部
分は、リボゾーム結合サイトのXbaI制限サイトから翻訳
開始メチオニンコドンまで（19bp）の天然のlpp遺伝子
配列に続いており、その後に既述した唯一のFnuDIIサイ
トまでのヒト成長ホルモンの最初の47ヌクレオチドのた
めの配列が続いている。

この２本鎖DNAフラグメント（第５図110）は以下の構造
を持っている：このフラグメントは、以下のセグメントを製造した既知
のリン酸トリエステル法によって調製した：１）CTAGAGGGTAT ２）TAATAATGTTCC ３）CAACCATTCCC ４）TTATCCAGGC ５）TTTTTGACAACG ６）CTATGCTCCG ７）CATTATTAATACCCT ８）GGTTGGGAA ９）GGATAAGGGAAT 10）GTCAAAAAGCCT 11）CGGAGCATAGCGTT 上で調製したセグメントを使って以下の３種の２連体を
製造した。

ａ）確立された方法（E.L.Brown,R.Belagaje,M.J.Ryan
およびH.G.Kho-rana,Methods in Enzymology 68,109−1
51（1979））に従って、５′−リン酸化セグメント７の
存在下、T₄リガーゼを使用して、セグメント１（５′−
非リン酸化）を５′−リン酸化セグメント２と結合させ
て２連体１を製造した。この２連体を15％のポリアクリ
ルアミドゲル上、プレパラティブゲル電気泳動法により
単離した。

ｂ）５′−リン酸化セグメント８および９の存在下、T₄
リガーゼを使って５′−リン酸化セグメント３を５′−
リン酸化セグメント４と結合させ２連体２を調製し、こ
れを15％のポリアクリルアミド上、プレパラティブゲル
電気泳動法により単離した。この反応は上記と同様にし
て行なった。

ｃ）５′−リン酸化セグメント10および５′−非リン酸
化セグメント11の存在下、T₄リガーゼを使って５′−リ
ン酸化セグメント５を５′−リン酸化セグメント６と結
合させ２連体３を調製した。この反応は上記と同様にし
て行なった。この２連体を15％のポリアクリルアミド
上、プレパラティブゲル電気泳動法により単離した。

２連体1,2および３をT₄リガーゼにより結合させ、２本
鎖DNAセグメント（第５図の110）を調製し、これを15％
のポリアクリルアミド上、プレパラティブゲル電気泳動
法により単離した。この生成物の５′末端を、以下の確
立された方法に従い、T₄ポリヌクレオチドキナーゼおよ
び［γ−p³⁰］ATPを使って酵素的にリン酸化した。

リゲーション緩衝液14μｌ中、T₄DNAリガーゼ２単位を
使用して、0.1ピカモル（0.4μｇ）のプラスミドベクタ
ー（第５図の107）、3.2ピカモルの合成DNAフラグメン
ト（第５図の110）および0.24ピカモル（0.08μｇ）の5
38bpフラグメント（第５図の109、製造法参照）を酵素
的に結合させて発現プラスミドを組み立てた。４℃で16
時間インキュベートした後、この混合物を使って既述し
たようにE.coli JA211を形質転換した。形質転換された
コロニーを、10μg/mlのアンピシリンを含有する寒天平
板上で選択した。既述したBirn-boimスクリーニング法
により10コロニーからプラスミドを調製した。制限酵素
XbaIおよびBamHIによる消化およびそれに続くアクリル
アミドゲル電気泳動法により、１つのプラスミドが期待
した604bpフラグメントを含有していることが解った。
このプラスミドを増幅させ、XbaIサイトからFnuDIIサイ
トまでのDNA配列をMaxam,A.M.およびGilbert.W.の方法
（Oroc.Natl.Acad.Sci USA 74,560−564（1977））に従
って測定し、正しいことを確めた。このプラスミドを以
降pNM645（第５図の111）と呼ぶ。

B.ヒト成長ホルモンの発現 E.coli JA211中のプラスミドpNM645によるヒト成長ホル
モンの初期の発現は、Broome,S.およびGilbert,W.のPro
c.Natl.Acad Sci USA 75、2746−2749（1978）、Hitzem
an,R.A.らのICN−UCLA Symposia on Molecular and Cel
lular.Biology 14、57−68（1979）およびErlich,H.A.
らのCell 13、681−689（1978）に記載されている固相
放射免疫分析法の変法によって検出した。

Leammli,U.K.らの方法（Nature 227、680−685（197
0））により全細菌細胞蛋白質をSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル分析することにより、主要な蛋白質帯は約20000
ダルトンであることが解った。この帯は全蛋白質の少く
とも10％に相当すると考えられ、pKEN021を含有するE.c
oli JA221の標本には存在しない。Twomey,S.L.,Beatti
e,J.M.およびWu,G.T.らの標準的な放射免疫分析法（Cli
n Chem 20、389−391（1974））により発現を定量的に
測定した結果、細胞当り少くとも２百万分子存在するこ
とが解った。8M尿素および１％トリトンX100で抽出する
ことによりメチオニルヒト成長ホルモンを500gmのE.col
i細胞から部分的に精製した。遠心分離により残骸を除
去し、可溶性の成長ホルモンを含有している上澄液をWh
atman DE52カラムで分画した。放射免疫分析（RIA）に
よって測定したピークフラクションを集め、等電点沈澱
にかけた。この物質をWhatman SE53カラムでさらに精製
した。ピークフラクションをRIAによって測定し、この
物質を等電点沈澱または限外濾過によって濃縮した。

回収したメチオニルヒト成長ホルモンの生物活性を、Gr
eenspan,F.S.らの方法（Endo-crinology 45、455−463
（1948））により、脳下垂体切除した雌ラットにおける
基部上生軟骨幅を測定することにより測定した。その活
性は死体から得たヒト成長ホルモンのそれと同じである
ことが解った。

実施例２ E.coliのリポプロテインプロモータを使用し
たメチオニル牛成長ホルモン発現のためのプラスミドメチオニル牛成長ホルモンを発現させるプラスミドを組
み立てるための出発物質として、メチオニルヒト成長ホ
ルモンのための発現プラスミドであるプラスミドpNM645
（第６図の111）を使用した。

Miller,W.L.らにより記載されているプラスミドpBP348
（第６図の112）（J.Biol.Chem.255、7521−7524（198
0））を、牛成長ホルモン遺伝子部分の暗号配列を含ん
でいる２つのDNAフラグメントのソースとして使用し
た。このプラスミドはpBR322のPstI（５′CTGCAG3′）
制限サイトにクローンした牛成長ホルモンを暗号化して
いる831bp配列を含んでいる。Millerらにより記載され
た方法の別法として、牛成長ホルモンのための配列は、
Goodman,H.M.ら（Methodsin Enzymology 68,75−90（19
79））により記載されている常法により、牛の脳下垂体
から単離したメッセンジャーRNAから得ることができ
る。

ヒト成長ホルモンの暗号配列と牛成長ホルモンのそれと
は非常に類似しており著しい相同性を示す。制限酵素Pv
uII（５′CAGCTG3′）による消化によって生成するフラ
グメントは、牛成長ホルモンの発現プラスミドを組み立
てるのに特に有用である。生成したフラグメントのサイ
ズはヒト成長ホルモンにおいては497bpであり、牛成長
ホルモンでは494bpである。両配列において相当する制
限サイトは同じ暗号枠内にある。

１分子当り3PvuIIサイトを含有するpNM645（第６図の11
1）10μｇを、200μｌのPvuII制限緩衝液（60mM NaCl、
6mMトリス:HCl（pH7.5）、6mM MgCl₂、6mM β−メルカ
プトエタノール）中、PvuII1単位を用いて37℃で10分間
消化した。65℃で10分間加熱して反応を停止させ、DNA
をアルカリホスファターゼで処理した。この限られた消
化方法により、存在するPvuIIサイトの1/2〜2/3が開裂
される。フラグメントを１％アガロースゲル上で分離
し、497bp PvuIIフラグメントを欠く線状プラスミドに
相当するサイズのDNAフラグメント（第６図113）（シン
グルカットのプラスミドより僅かに速く移動する）を切
り取り、精製し、中間体プラスミドpNM685（第６図の11
4）を組み立てるためのベクターとして使用した。

494bp PvuIIフラグメントをpBP348から調製した。この
プラスミド10μｇを200μｌのPvuII緩衝液中、PvuII10
単位を用いて37℃で１時間消化した。フラグメントを６
％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、既述した方法
で494bpフラグメント（第６図の112から）を観察し、精
製した。

２単位のT₄DNAリガーゼを含有しているT₄DNAリガーゼ緩
衝液20μｌ中、0.2μｇのベクターを0.05μｇの494bpフ
ラグメントと連結することにより、中間体プラスミドpN
M685（第６図の114）を組み立てた。形質転換およびア
ンピシリン耐性による形質転換体の選択の後、既述した
Birnboim法により調製したプラスミドを494bp PvuIIフ
ラグメントの存在について分析した。酵素XbaIおよびSm
aIで連続的に消化することによりフラグメントの正しい
方向性を確認した。牛成長ホルモン配列からの494bp P
vuIIフラグメントは唯一の非対称SmaI制限サイトをもっ
ている。親のプラスミドpNM645はSmaIサイトを含んでい
ない。494bpPvuIIフラグメントおよび416bp XbaI、SmaI
フラグメントを持ったプラスミドを所望の中間体として
選択し、その後の組立てに使用した。

プラスミドpNM685（第７図の114）を、２つの方法で牛
成長ホルモン発現プラスミドに変換した：（１）ヒト成
長ホルモンの最初の22アミノ酸の暗号配列を除去し、牛
成長ホルモンの最初の23アミノ酸の暗号配列で置換え
た、および（２）暗号配列の第２のPvuIIサイトから終
止コドンの短い配列（これはヒト成長ホルモン配列であ
る）を、牛成長ホルモンの190番目のアミノ酸すなわち
アラニンのためのコドンを復活するため合成フラグメン
トで置換えた。

10μｇのpNM685をPvuII緩衝液200μｌ中、１単位のPvuI
Iを用いて37℃で５分間消化した。65℃で10分間加熱し
て反応を停止させた。フラグメントの混合物を１％のア
ガロースゲル上に広げ、１分子当りただ１つのPvuIIカ
ットを有する線状プラスミドを回収し精製した。この回
収した物質（約３μｇ）を５単位のXbaIで完全に消化
し、アルカリホスファターゼで処理した。フラグメント
１％のアガロースゲル上に広げ、最大のフラグメント
（ヒトおよび牛成長ホルモンにおいてXbaIおよび最初の
PvuIIサイト間の85bpフラグメントを欠失している）を
回収し、クローニングベクターとして使用した（第７図
の115）。

最初のPvuIIサイトまでの牛成長ホルモンの最初の23ア
ミノ酸（69bp）のためのDNA配列には、酵素HpaII（５′
CCGG3′）のための２つの制限サイトが含まれている。
最初のサイトは、暗号配列の最初のヌクレオチドから23
bpにある。牛成長ホルモンの最初の23bpのための配列が
後に続く、lppリボゾーム結合サイトのXbaIサイトからA
TG開始コドンまでの19bp配列に相当する42bpフラグメン
ト（第７図の116）をリン酸トリエステル法により合成
した。このフラグメントは以下の構造を有する：この42bpフラグメントを製造するに当り、以下の６つの
セグメントを調製した：１）CTGAGGGTAT ２）TAATAATGGCTTTTC ３）CGGCTATGTCTCTGTC ４）CATTATTAATACCCT ５）TAGCCGGAAAAGC ６）CGGACAGAGACA 上記のセグメントを使用して、５′−リン酸化セグメン
ト２、５′−リン酸化セグメント３、５′−リン酸化セ
グメント５および５′−非リン酸化セグメント６を、T₄
リガーゼを使って連結し２連体を調製した。この２連体
を15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製し
た。この２連体に、T₄リガーゼの存在下、５′−非リン
酸化セグメント１および５′−リン酸化セグメント４を
加えた。得られた42bpDNA2連体（第７図の116）を15％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により単離した。既
知の方法に従い、この２連体の５′末端を、T₄ポリヌク
レオチドキナーゼおよび［γ−P³²］ATPを使って酵素的
にリン酸化した。

上記のHpaIIサイトからPvuIIサイトに至る46bpのDNAフ
ラグメントをもとのpBP348プラスミドから得た。100μ
ｇのプラスミドを、400μｌのPvuII緩衝液中、50単位の
PvuIIを用いて37℃で２時間消化した。フェノール抽出
およびエタノール沈澱の後、DNAを50単位のPstIを含む4
00μｌのPstI（５′CTGCAG3′）緩衝液（50mM NaCl、6m
Mトリス:HCl（pH7.4）、6mM MgCl₂、6mM β−メルカプ
トエタノール）に37℃で２時間溶解した。このDNAフラ
グメントを６％のポリアクリルアミドゲル（長さ30cm）
上に広げ、所望の46bp配列を含む135bpフラグメントを
回収し、常法により精製した。回収したDNAの1/3（プラ
スミド33μｇに相当）をHpaII制限酵素による限定され
た消化にかけた。このDNAを100μｌのHpaII緩衝液（20m
Mトリス:HCl（pH7.4）、7mM MgCl₂、6mM β−メルカプ
トエタノール）中、１単位のHpaIIを用いて37℃で40分
間消化した。65℃で10分間加熱して反応を停止させた。
このDNAフラグメントを５％のアクリルアミドゲル（ア
クリルアミド：ビス比19:1）上で展開させた。SauIIIA
制限酵素で消化した１μｇのpBR322を別の井戸（well）
で展開した。このフラグメント混合物は、サイズマーカ
ーとして使用される46bpフラグメントを含んでいる。13
5bpフラグメントのHpaII部分的消化によって生成する46
bpフラグメントを標準的な方法で精製した（第７図の11
2から）。

XbaIおよびPvuII末端を有するプラスミドベクター（第
７図の115）2/10μｇを1.6ピカモルの合成42bpフラグメ
ント（第７図の116）および0.5〜１ピカモルの46bpフラ
グメント（第７図の112から）と、T₄DNAリガーゼ２単位
とともにリゲーション緩衝液10μｌ中で混合し、４℃で
16時間連結させた。この混合物を用いてE.coli JA221を
形質転換し、アンピシリン耐性で選択したコロニーから
プラスミドを調製した。494bp PvuIIフラグメントおよ
び88bp XbaI、PvuIIフラグメントの存在についてプラス
ミドをスクリーニングした。分析した36のうち18がこれ
らのフラグメントを持っていた。２つのプラスミドにつ
き、XbaIサイトからPvuIIサイトまでを配列化し、牛成
長ホルモンのものかどうか放射免疫分析により試験し
た。放射免疫分析で陽性の反応を示した１つは正しい配
列を持っていた。このプラスミドはpNM797（第７図の11
7）と命名した。標準的な放射免疫分析法により牛成長
ホルモンの発現を定量的に測定し、１細胞当り少くとも
10⁵分子が存在することが解った。

プラスミドpNM797（第８図の117）は、完全に牛成長ホ
ルモンに変換するには、１個のアミノ酸コドンを変換し
なければならない。これは、pNM797の28bp PvuII〜BamH
Iフラグメントを除去し、以下の配列を有する、第８図
の118に示した合成２本鎖フラグメント（上の鎖13bp、
下の鎖17bp）で置換えることにより達成することができ
る：５′CTGTGCCTTCCTAG 3′ ３′ GACACGGAAGATCCTA− G 5′ 10μｇのpNM797をPvuII緩衝液200μｌ中、PvuII1単位を
用いて37℃で５分間消化する。65℃で10分間加熱して酵
素を不活性化させる。この試料に、BamHI緩衝液を加え
て300μｌに希釈し、10単位のBamHIを用いて37℃で１時
間完全に消化する。次いでアルカリホスファターゼ５単
位を添加し、65℃で１時間インキュベートする。DNAフ
ラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、シング
ルカットプラスミドのサイズのDNAフラグメント（第８
図の119）を精製する。この2/10μｇを、リガーゼ緩衝
液20μｌ中、T₄リガーゼ２単位を用いて５ピカモルの合
成フラグメントと一夜４℃で連結させる。形質転換およ
び既述したBirnboimプラスミド単離法により、適切なサ
イズのPvuIIフラグメント（494bp）およびXbaI、BamHI
フラグメント（604bp）を含有しているいくつかのプラ
スミドを選択する。これらのうち少くとも２つの配列
を、BamHIサイトから唯一のSmaIサイトまで測定し、所
望の配列を持った１つを選択する（第８図の120）。

実施例３実施例１のプラスミドの変異体 BamHIおよびSalI制限サイトの間のlpp3′配列を、pBR32
2から誘導したDNAフラグメント（第９図の102）で置換
えることによりpNM645のテトラサイクリン耐性変異体
（第９図の111）を組み立てた。pBR322のテトラサイク
リン耐性はそのプロモータがHind III（５′AAGCTT
3′）によって開裂される遺伝子の生産物により付与さ
れる。この遺伝子の暗号領域はその近くで始まり、プラ
スミドのBamHIおよびSalI制限サイトまで伸びている。
テトラサイクリンプロモータはHind IIIによる配列の消
化およびそれに続く１本鎖末端を除去するS1ヌクレアー
ゼ処理により破壊される。５μｇのpBR322をHind III緩
衝液200μｌ中（60mM NaCl、20mMトリス:HCl（pH7.
4）、10mM MgCl₂、6mM β−メルカプトエタノール）、
10単位のHindIIIを用いて37℃で１時間消化し、DNAをフ
エノール／CHCl₃抽出し、エタノール沈澱させ、S1緩衝
液300μｌ（300mM NaCl、25mM酢酸ナトリウム（pH4.2
5）、1mMZnCl₂）に再懸濁する。S1ヌクレアーゼを1000
単位/mlの割合いで加え、15℃で１時間インキュベート
した。フェノール／CHCl₃抽出およびエタノール沈澱の
後、DNAを200μｌのSalI制限緩衝液（150mM NaCl、6mM
トリス:HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂、6mM β−メルカプ
トエタノール）に再懸濁し、５単位のSalIを用いて37℃
で１時間消化した。６％のポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動し、生成した600bpフラグメントを単離した。
既述した方法でこのフラグメントを回収し精製した。５
μｇのpNM645を５単位のBamHIを用いて37℃で１時間消
化した。フェノール／CHCl₃抽出およびエタノール沈澱
の後DNAをTENに溶解した。２μｇのBamHI相補末端を持
ったpNM645を20μｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液（70mM
トリス:HCl（pH7.6）、10mM MgCl₂、10mM β−メルカ
プトエタノール、各0.5mMのdATP、dCTP、dGTP、TTP）
中、E.coli DNAポリメラーゼＩの大型フラグメント１単
位を用いて15℃で１時間、鈍感末端DNAに変換するため
に埋める（filling in）。この酵素を65℃で10分間変性
させ、DNAをSalI緩衝液および３単位のSalI制限酵素を
加えて37℃で１時間開裂させた。このDNAを１％のアガ
ロースゲル上で分離し、凍結後大きいプラスミドフラグ
メントをゲルから溶離した。エチジウムブロミドおよび
アガロースフラグメントをフェノール／CHCl₃抽出およ
びエタノール沈澱により除去した。プラスミドをTEN20
μｌに溶解した。既述した条件下で、2/10μｇのプラス
ミドベクター（0.05ピカモル）を0.2μｇの617bpフラグ
メント（0.5ピカモル）と連結した。形質転換したE.col
i JA221コロニーを、100μg/mlのアンピシリンおよび15
μg/mlのテトラサイクリンを含有する寒天平板上で選択
した。プラスミド（pNM736と命名された。第９図の12
1）を単離し、制限酵素分析により所望の配列を含んで
いることが解った。メチオニルヒト成長ホルモンの発現
はpNM645の場合と同じほど高率であることが解った。

実施例４ Met−Phe−Pro−Leu−Asp−Asp−Asp−Asp−
Lys−ヒト成長ホルモン発現のためのプラスミドおよび
エンテロキナーゼ（3.4.21.9）による選択的開裂にそれ
を基質として使用する成熟ヒト成長ホルモンの生産リン酸トリエステル法により、lppプロモータ領域を、
開始コドンおよびエンテロキナーゼに認識され、開裂さ
れる配列を指定している短いペプチドのための暗号領域
に続くヒト成長ホルモン暗号領域と連結することにより
２本鎖DNAフラグメント（第10図の122）を合成した。上
の鎖は90ヌクレオチドからなり、これは５′末端にXbaI
開裂により生じた４ヌクレオチド１本鎖配列を含んでい
る。下の鎖は86ヌクレオチドからなり、これは上の鎖の
最後の86ヌクレオチドと相補的である。この合成DNAフ
ラグメントの最初の部分は、リボゾーム結合サイトのXb
aI制限サイトから翻訳開始メチオニンコドンまで（19b
p）のlpp遺伝子の天然の配列に続いており、エンテロキ
ナーゼ開裂サイトのための配列および既述した唯一のFn
uDIIサイトまでのヒト成長ホルモンの最初の47ヌクレオ
チドがその後に続いている。この２本鎖DNAフラグメン
ト（第10図の122）は以下の構造を有する：このフラグメントは既知のリン酸トリエステル法により
調製し、この際以下のセグメントを製造した：１）CTAGAGGGTAT ２）TAATAATGTTCC ３）CATTGGATGAT ４）GATGATAAGTTCC ５）CAACCATTCCC ６）TTATCCAGGC ７）TTTTTGACAACG ８）CTATGCTCCG ９）CATTATTAATACCCT 10）ATGGGAA 11）CTTATCATCATCCA 12）GGTTGGGAA 13）GGATAAGGGAAT 14）GTCAAAAAGCCT 15）CGGAGCATAGCGTT 上記のセグメントを使用して、以下に示すようにT₄リガ
ーゼ触媒連結反応を段階的に行なった：ａ）５′−非リン酸化セグメント１を、５′−リン酸化
セグメント９の存在下、T₄リガーゼを使って５′−リン
酸化セグメント２に結合させ、DNA2連体１を製造した
（E.L.Brown,R.Belagaje,M.J.RyanおよびH.G.Kho-rana,
Methods in enzymology 68、109−151（1979））。この
２連体を15％ポリアクリルアミド上、プレパラティブゲ
ル電気泳動法により単離した。

ｂ）５′−リン酸化セグメント３を、５′−リン酸化セ
グメント11の存在下、T₄リガーゼを使って５′−リン酸
化セグメント４と結合させ、DNA2連体２を調製し、これ
を15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製し
た。

ｃ）５′−リン酸化セグメント５を、５′−リン酸化セ
グメント12および13の存在下、T₄リガーゼを使って５′
−リン酸化セグメント６と結合させDNA2連体３を調製
し、これを15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り精製した。

ｄ）５′−リン酸化セグメント７を、５′−リン酸化セ
グメント14および５′−非リン酸化セグメント15の存在
下、T₄リガーゼを使って５′−リン酸化セグメント８と
結合させ、DNA2連体４を調製し、これを15％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により精製した。

ｅ）DNA2連体２、３および４をT₄リガーゼにより結合さ
せてDNA2連体５を調製し、これを15％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により精製した。

ｆ）次いでこのDNA2連体１に、５′−リン酸化セグメン
ト10およびDNA2連体５をT₄リガーゼの存在下で加え、得
られたDNA2連体（第10図の110）を10％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により精製した。次いでこのDNA2
連体を、既知の方法により、T₄ポリヌクレオチドキナー
ゼおよび［γ−p³²］ATPを使って酵素的にリン酸化し
た。

0.1ピカモル（0.4μｇ）のプラスミドベクター（第５図
の107）、0.025ピカモルの合成DNAフラグメント（第５
図の110）および0.3ピカモル（0.08μｇ）の538bpフラ
グメント（第10図の109、製造法参照）を、リゲーショ
ン緩衝液24μｌ中、T₄DNAリガーゼ1.5単位を用いて酵素
的に結合させることにより発現プラスミドを組み立て
た。４℃で16時間インキュベートした後、既述したよう
にこの混合物を使ってE.coli JA221を形質転換した。形
質転換されたコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを
含有する寒天平板上で選択した。既述したBirnboimスク
リーニング法により19のコロニーからプラスミドを調製
した。制限酵素XbaIおよびBamHIによる消化、次いでア
クリルアミドゲル電気泳動法により、12個のプラスミド
が所望の628bpフラグメントを含んでいることが解っ
た。

陽性プラスミドの８個を、XbaI次いでPvuIIで順次消化
したところ、これらのうち７個が109bpフラグメントを
生成した。１つのプラスミドの配列を、Maxam,A.M.およ
びGilbertの方法（W.,Proc.Natl.Sci.USA 74、560−564
（1977））により測定したところ正しいことが解った。
このプラスミドはpNM702（第10図の123）と命名され
た。ヒト成長ホルモンの発現は、Twomey,S.L.らの標準
的放射免疫分析法（Clin.Chem.20、389−391（1974））
により検出した。定量的に発現を測定した結果細胞当り
少くとも２百万分子であることが解った。

500gmのE.coli細胞から、8M尿素および１％のトリトンX
100で抽出することによりMet−phe−pro−leu(asp)₄lys
−ヒト成長ホルモンを部分的に精製した。遠心分離によ
り残骸を除去し、可溶性のヒト成長ホルモン生成物を含
有している上澄液をワットマンDE52カラムで分画した。
放射免疫分析（RIA）により検出したピークフラクショ
ンを集め、等電点沈澱にかけた。この物質をさらにワッ
トマンSE53カラムで精製した。ピークフラクションをRI
Aで検出し、その物質を等電点沈澱または限外濾過によ
り濃縮した。

部分的に精製したこの物質をエンテロキナーゼ開裂にか
けた。粗製の豚の腸エンテロキナーゼ（Miles Laborato
ries）をAndersonらの方法（Biochemistry 16、3354−3
360（1977））でさらに精製した。エンテロキナーゼを
基質とともにインキュベートし、時々試料を採取して等
電点焦点ゲル（isoelectric focus-ing gel）で調べ
た。出発物質の等電点は4.3であり、これを時間ととも
にヒト成長ホルモンの等電点（4.91）を有するバンド
（帯）にシフトするのが見られる。

実施例５ E.coliのリポプロテインプロモータを使った
Met−phe−pro−Leu−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−牛成
長ホルモン発現のためのプラスミド Met−phe−pro−Leu−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−牛成
長ホルモン発現プラスミド組み立てのための出発物質と
して、ヒト成長ホルモン発現プラスミドであるプラスミ
ドpNM702（第11図の123）を使用した。

Miller,W.L.ら（J.Biol.Chem.255、7521−7524（198
0））により記載されているプラスミドpBP348（第11図
の124）を、牛成長ホルモン遺伝子部分の暗号配列を含
んでいる２つのDNAフラグメントのソースとして使用し
た。このプラスミドは、pBR322のPstI（５′CTGCAG
3′）制限サイトにクローンされた牛成長ホルモンを暗
号化している831bp配列を含んでいる。Millerらの方法
の別法として、牛成長ホルモンの配列は、現在通常の方
法となっているGoodman,H.M.らの方法（Methods in Enz
ymology 68、75−90（1979）により牛の脳下垂体から単
離したメッセンジャーRNAからも得ることができる。

既述したように、ヒト成長ホルモンおよび牛成長ホルモ
ンの暗号配列は非常に類似しており、著しい相同性を示
す。制限酵素PvuII（５′CAGCTG3′）による消化により
生成したフラグメントは、牛成長ホルモンのための発現
プラスミドを組み立てるのにも有用であった。

１分子当り３個のPvuIIサイトを含んでいるpNM702（第1
1図の123）10μｇを、200μｌのPvuII制限緩衝液（60mM
NaCl、6mMトリス:HCl（pH7.5）、6mM MgCl₂、6mM β
−メルカプトエタノール）中、１単位のPvuIIを用いて3
7℃で10分間消化する。65℃で10分間加熱して反応を停
止し、DNAをアルカリホスファターゼで処理する。この
限られた消化法により、存在するPvuIIサイトの1/2〜2/
3が開裂される。フラグメントを１％のアガロースゲル
上で分離し、497bpPvuIIフラグメントを欠失している線
状プラスミドに相当するサイズのDNAフラグメント（第1
1図の125）（シングルカットプラスミドより僅かに早く
移動する）を切り取って精製し、中間的プラスミドの組
み立てにベクターとして使用した（第11図の126）。

pBP348から494bpPvuIIフラグメントを調製した。このプ
ラスミド10μｇを、200μｌのPvuII緩衝液、10単位のPv
uIIを用いて37℃で１時間消化した。フラグメントを６
％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、494bpフラグ
メント（第11図の124から）を既述した方法で確認し、
精製した。

T₄DNAリガーゼ２単位を含有する20μｌのT₄DNAリガーゼ
緩衝液中、0.2μｇのベクターを0.05μｇの494bpフラグ
メントと４℃で16時間連結することにより中間的プラス
ミド（第11図の126）を組み立てる。形質転換次いでア
ンピシリン耐性に対する形質転換体の選択の後、既述の
Birnboim法により調製したプラスミドを、494bpPvuIIフ
ラグメントの存在について分析する。フラグメントが適
正な配向性を有するかどうかは酵素XbaIおよびSmaIで連
続的に消化することにより調べる。牛成長ホルモン配列
からの494bpPvuIIフラグメントは唯一の非対称SmaI制限
サイトを持っている。親プラスミドpNM702はSmaIサイト
を持っていない。494bpPvuIIフラグメントおよび440bpX
baI、SmaIフラグメントを有するプラスミドを所望の中
間体として選択しその後の組み立てに使用する。

中間体プラスミド（第12図の126）を以下の２つの方法
で所望の融合牛成長ホルモン発現プラスミドに変換す
る：（１）エンテロキナーゼ基質−ヒト成長ホルモンの
最初の30アミノ酸の暗号配列を除去し、エンテロキナー
ゼ基質−牛成長ホルモンの最初の31アミノ酸の暗号配列
で置換え、（２）この暗号配列内の第２のPvuIIサイト
から終止コドンまでの短い配列（これはヒト成長ホルモ
ン配列である）を合成フラグメントで置換え、牛成長ホ
ルモンの190番目のアミノ酸であるアラニンのためのコ
ドンを復活させる。

この中間体プラスミド（第12図の126）10μｇを、PvuII
緩衝液200μｌ中、１単位のPvuIIを用いて37℃で５分間
消化する。65℃で10分間加熱して反応を停止させる。フ
ラグメントの混合物を１％のアガロースゲル上に広げ、
１分子当りただ１個のPvuIIカットを持った線状プラス
ミドを回収して精製する。この回収した物質（約３μ
ｇ）を５単位のXbaIで完全に消化し、アルカリホスファ
ターゼで処理する。このフラグメントを１％のアガロー
スゲル上に広げ、最も大きなフラグメント（ヒトおよび
牛成長ホルモンにおけるXbaIおよび最初のPvuIIサイト
の間の109bpフラグメントを欠失している）を回収し、
クローニングベクターとして使用する（第12図の12
7）。

最初のPvuIIサイトまでの牛成長ホルモンの最初の23ア
ミノ酸のためのDNA配列（69bp）は、酵素HpaII（５′CC
GG3′）のための２個の制限サイトを含んでいる。最初
のサイトは、暗号配列の最初のヌクレオチドから23bpの
ところにある。63bpフラグメント（第12図の128）はリ
ン酸トリエステル法により合成した。このフラグメント
は、Phe−Pro−Leu−Asp−Asp−Asp−Asp−Lysのための
暗号配列（24bp）および牛成長ホルモンのPheから最初
のHpaIIサイトまでの暗号配列の20ヌクレオチドが後に
ついた、lppリボゾーム結合サイトのXbaIサイトからATG
開始コドンまでの19bp配列に相当する。

このフラグメントは以下の構造を有する：この63bpフラグメントを製造するのに以下の９個のセグ
メントを製造した：１）CTAGAGGGTAT ２）TAATAATGTTCC ３）CATTGGATGAT ４）GATGATAAGTTCC ５）CAGCCATGTCCTTGTC ６）ATGGGAACATTATTAATA−CCCT ７）TTATCATCATCATCCA ８）ATGGCTGGGAAC ９）CGGACAAGGAC 上記のセグメントを使用し、以下に述べる方法でT₄リガ
ーゼ触媒結合反応を段階的に行なった：ａ）５′−非リン酸化セグメント１を５′−リン酸化セ
グメント６の存在下、T₄リガーゼを使って５′−リン酸
化セグメント２と結合させ、DNA2連体１を調製し、これ
を15％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製
した。

ｂ）５′−リン酸化セグメント３、４および５を５′−
リン酸化セグメント７および８、ならびに５′−非リン
酸化セグメント９の存在下、T₄リガーゼを使って結合さ
せ、DNA2連体２を調製し、これを15％のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により精製した。

ｃ）次いで２連体１および２をT₄リガーゼで結合させて
DNA2連体（第12図の128）を調製し、これを15％のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。次いで
このDNA2連体を確立された方法に従い、T₄ポリヌクレオ
チドキナーゼおよび［γ−p₃₂］ATPを使って酵素的にリ
ン酸化した。

上記のHpaIIサイトからPvuIIサイトまでの46bpのDNAフ
ラグメントを、もとのpBP348プラスミドから得た。プラ
スミド100μｇを400μｌのPvuII緩衝液中、50単位のPvu
IIを用いて37℃で２時間消化した。フェノール抽出およ
びエタノール沈澱の後、このDNAを400μｌのPstI（５′
CTGCAG3′）緩衝液（50mM NaCl、6mMトリス:HCl（pH7.
4）、6mM MgCl₂、6mM β−メルカプトエタノール）
に、50単位のPstIとともに37℃で２時間溶解した。この
DNAフラグメントを６％のポリアクリルアミドゲル（長
さ30cm）に広げ、所望の46bp配列を含む135bpフラグメ
ントを回収し標準的な方法で精製した。回収したDNAの1
/3（プラスミド33μｇに相当）をHpaII制限酵素を用い
て部分的に消化した。このDNAを、HpaII緩衝液（20mMト
リス:HCl（pH7.4）、7mM MgCl₂、6mM β−メルカプト
エタノール）100μｌ中、１単位のHpaIIを用いて37℃で
40分間消化した。65℃で10分間加熱して反応を停止させ
た。このDNAフラグメントを５％のアクリルアミドゲル
（アクリルアミド：ビス比19:1）上で展開した。SauIII
A制限酵素で消化したpBR322の１μｇを別の井戸（wel
l）で展開した。このフラグメントの混合物はサイズマ
ーカーとして使用される46bpフラグメントを含んでい
る。135bpフラグメントの部分的HpaII消化により生成し
た46bpフラグメント（第12図の124から）を標準的な手
法で精製した。

XbaIおよびPvuII末端を有するプラスミドベクター（第1
2図の127）2/10μｇを、合成63bpフラグメント（第12図
の128）3.2ピカモルおよび46bpフラグメント（第12図の
124から）0.5〜１ピカモルと、リゲーション緩衝液10μ
ｌ中、T₄DNAリガーゼ２単位とともに混合し、４℃で16
時間連結させた。この混合物を用いてE.coli JA221を形
質転換し、アンピシリン耐性により選択されたコロニー
からプラスミドを調製した。このプラスミドを494bpPvu
IIフラグメントおよび109bpXbaI、PvuIIフラグメントの
存在についてスクリーニングした。分析した12個のうち
１個がこれらのフラグメントを持っていた。このフラグ
メントをXbaIサイトからPvuIIサイトまで配列化し、牛
成長ホルモンについて放射免疫分析で試験した。これ
は、放射免疫分析において陽性であることが解り、正し
い配列を持っていた。このプラスミドはpNM789（第12図
の129）と命名された。牛成長ホルモンについて標準的
な放射免疫分析法により定量的に発現を測定したとこ
ろ、細胞当り少くとも10⁵分子が存在することが解っ
た。

プラスミドpNM789（第13図の129）は、牛成長ホルモン
に完全に変換するには１つのアミノ酸コドンを変換する
必要がある。これはpNM789の28bpのPvuIIからBamHIフラ
グメントを除去し、以下の配列であって第13図の130に
示す合成２本鎖フラグメント（上の鎖13bp、下の鎖17b
p）で置換えることにより達成される： pNM789（10μｇ）をPvuII緩衝液200μｌ中、１単位のPv
uIIを用いて37℃で５分間消化する。65℃で10分間加熱
してこの酵素を非活性化する。このサンプルをBamHI緩
衝液を加えて300μｌに希釈し、10単位のBamHIを用いて
37℃で１時間完全に消化する。次いでアルカリホスファ
ターゼ５単位を添加し、65℃で１時間インキュベートす
る。DNAフラグメントを１％のアガロースゲル上で分離
し、シングルカットのプラスミドサイズのDNAフラグメ
ント（第13図の131）を精製する。この2/10μｇを、リ
ガーゼ緩衝液20μｌ中、T₄リガーゼ２単位を用いて合成
フラグメント５ピカモルと４℃で一夜連結させる。形質
転換および既述したBirnboimプラスミド単離法に従い、
適当なサイズのPvuIIフラグメント（494bp）およびXba
I、BamHIフラグメント（628bp）を含むいくつかのプラ
スミドを選択する。これらのうち少くとも２つの配列を
BamHIサイトから唯一のSmaIサイトまで測定し、所望の
配列（第13図の132）を持った１つを選択した。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は本発明のクローニングベクターの組み
立てに使用する出発物質および中間体の製造の模式図、
第５図は、第１〜４図と一緒になって、メチオニルヒト
成長ホルモン製造用クローニングベクターの組み立てを
示す模式図、第６〜第８図は、第１〜５図と一緒になっ
て、メチオニル牛成長ホルモン製造用クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図、第９図は第１〜５図と一
緒になって、メチオニルヒト成長ホルモンの製造に有用
なクローニングベクターの変異体の組み立てを示す模式
図、第10図は、第１〜４図と一緒になって、ヒト成長ホ
ルモンの製造に有用な第２の態様のクローニングベクタ
ーの組み立てを示す模式図、第11図〜第13図は、第10図
および第１〜４図と一緒になって、牛成長ホルモンの製
造に有用な第２の態様のクローニングベクターの組み立
てを示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラマモ−ルシ−・ベレガ−エアメリカ合衆国インデイアナ46260インデイアナポリス・モホ−ク・レイン7821番 (72)発明者ハンセン・マクスウエル・シウングアメリカ合衆国インデイアナ46260インデイアナポリス・ウエスト・エイテイ−エイトウス・ストリ−ト108番 (56)参考文献特開昭56−21596（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−36499（ＪＰ，Ａ) 欧州特許47600（ＥＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ，1979〔18〕Ｐ．1109−1117

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトまたは牛成長ホルモンを発現させるの
に有用な組換えDNAクローニングベクターであって、（ａ）大腸菌内で機能する複製起点を含有しているDNA
セグメント、（ｂ）該ベクターを大腸菌宿主細胞に導入した場合、選
択に使用することができる性質を該宿主細胞に伝達する
１種またはそれ以上のDNAマーカーセグメント、および（ｃ）直列に、（１）大腸菌リポプロテインの発現コン
トロール配列のプロモータ、（２）該リポプロテインの
発現コントロール配列の５′＿非翻訳領域、および
（３）ヒトまたは牛成長ホルモンの蛋白質をコードする
DNA以外のDNA配列によって介在されることなく、ヒトま
たは牛成長ホルモンを暗号化しているヌクレオチド配列
と中断されることなく結合しているエンテロキナーゼ開
裂サイトを暗号化しているヌクレオチド配列、が後に続
いている翻訳開始コドン、を指定している配列を含むDN
Aセグメント、を含有する組換えDNAクローニングベクター。
【請求項２】ヒトまたは牛成長ホルモンを暗号化してい
る配列の下流に存在する、大腸菌リポプロテイン発現コ
ントロール配列の３′−非翻訳領域の全部または一部を
含有している第１項に記載のベクター。
【請求項３】ヒトまたは牛成長ホルモンを暗号化してい
る配列の下流に存在する、大腸菌リポプロテイン発現コ
ントロール配列の転写終了領域の全部または一部を含有
している第１項または第２項に記載のベクター。
【請求項４】３′−非翻訳領域の下流に存在する、大腸
菌リポプロテイン発現コントロール配列の転写終了領域
の全部または一部を含有している第３項に記載のベクタ
ー。
【請求項５】翻訳開始コドンの後にヒト成長ホルモンを
暗号化している配列が続いている第１項〜第４項のいず
れかに記載のベクター。
【請求項６】翻訳開始コドンの後に牛成長ホルモンを暗
号化している配列が続いている第１項〜第４項のいずれ
かに記載のベクター。
【請求項７】プラスミドpNM645である第５項に記載のベ
クター。
【請求項８】プラスミドpNM797である第６項に記載のベ
クター。
【請求項９】翻訳開始コドンの後に、ヒト成長ホルモン
を暗号化しているヌクレオチド配列と、中断されること
なく、結合しているエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号
化しているヌクレオチド配列が続いている第１項〜第４
項のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】翻訳開始コドンの後に、牛成長ホルモン
を暗号化しているヌクレオチド配列と、中断されること
なく、結合しているエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号
化しているヌクレオチド配列が続いている第１項〜第４
項のいずれかに記載のベクター。
【請求項１１】エンテロキナーゼ開裂サイトがAsp−Asp
−Asp−Asp−Lysを含有するアミノ酸配列を暗号化して
いる第９項または第10項に記載のベクター。
【請求項１２】エンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化し
ているDNA配列が以下の式で表わされる第11項に記載の
ベクター： GATGATGATGATAAG CTACTACTACTATTC。
【請求項１３】エンテロキナーゼ開裂サイトがPhe−Pro
−Leu−Asp−Asp−Asp−Asp−Lysを暗号化している第９
項または第10項に記載のベクター。
【請求項１４】エンテロキナーゼ開裂サイトをコードし
ているDNA配列が以下の式で表わされる第13項に記載の
ベクター： TTCCCATTGGATGATGATGATAAG AAGGGTAACCTACTACTACTATTC。
【請求項１５】プラスミドpNM702である第13項または第
14項に記載のベクター。
【請求項１６】プラスミドpNM789である第13項または第
14項に記載のベクター。