JPH03219896A - ヒト　アルファ／ベータｔ細胞レセプターに対する改良抗体、その生産および利用 - Google Patents

ヒト　アルファ／ベータｔ細胞レセプターに対する改良抗体、その生産および利用

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JPH03219896A
JPH03219896A JP2149725A JP14972590A JPH03219896A JP H03219896 A JPH03219896 A JP H03219896A JP 2149725 A JP2149725 A JP 2149725A JP 14972590 A JP14972590 A JP 14972590A JP H03219896 A JPH03219896 A JP H03219896A
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クライド・ダブリュー・シャーマン
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Roland Kurrle
ローラント・クルレ
Fritz Seiler
フリッツ・ザイラー
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９８９年６月７日に発明の名称′″ヒトア
ルファ／ベータ　Ｔ細胞　レセプターに対する抗体、そ
の生産および利用″で出願され同時継続中の一部出願で
ある。
（産業上の利用分野） 本出願は、ヒト　アルファ／ベータ　Ｔ細胞レセプター
（ＴＣＲ）の定常領域中の抗原決定基に対する有用なモ
ノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、その生産および、臓器
および骨、髄移植における免疫抑制治療、自己免疫症治
療への利用、および免疫制御に関する治療のための応用
について開示する。
（従来の技術） 何十年もの間、ウマ、ウサギ、ヤギ、およびネズミに白
血球、リンパ球、またはそれらのサブポピュレション、
またはさまざまな腫瘍細胞系を免疫することにより、抗
白血球抗体は臨床および実験用として作成されてきた。
抗白血球グロブリン／抗胸腺細胞グロブリン（ＡＬＧ／
ＡＴＧ）のような調製物の特異性は、通常、注意深く抗
原源を選んだり、赤血球、Ｂ細胞、選択した細胞系等の
ような種々の細胞タイプによって所望しない抗体を吸収
して除くことによって得ていた。この方法は、結果とし
ては高品質のＡＬＧ／ＡＴＧを作成できるが、かなり膨
大な労働力の消費と品質管理、およびバッチ毎の特異性
について再現の確保が要求される。このような制限のな
かで、ＡＬＧ／ＡＴＧは白血球分化、白血病およびリン
パ腫の細胞源の研究、Ｔ細胞サブポピュレーシミンの決
定、そして抗イデイオタイプの抗血清の調製でさえも可
能にした。ＡＬＧ／ＡＴＦの治療的効用は、特に臓器移
植に際しての免疫抑制についてよく知られている。加え
てＡＬＧ／ＡＴＧは再生不能性貧血の患者の治療および
骨髄移植に用いられている骨髄細胞の″洗浄”（ｐｕｒ
ｇｉｎｇ）のために絶えることなく使用されてきた。Ａ
ＬＧ／ＡＴＧの調製は成功しているにもかかわらす、実
験室で可能な範囲の努力では、これらのボリクａ−ナル
抗白血球抗体はバッチ毎にほらつき、特異性に限界があ
ることも、甘受されている。
コーラ−およびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　
ＭｉｌｓｔｅｉｎＸＮａｔｕｔｅ　２２５（１９７４）
）によりｍＡｂｓの生産法か開発されてから、ＡＬに／
ＡＴＧに比べてかなり高い特異性をもつ抗体を作成する
ことが可能になった。
ｍＡｂｓは、たとえは細胞表面上の特別な抗原、例えば
細胞表面上の、だけでなく、そのような抗原の中の特別
な抗原決定基も認識するので、高い効率で極めて類似し
ている細胞群間でも区別し、認識された抗原を生化学的
および機能的観点から特徴ずけるために使用できる。
ｍＡｂｓは臨床的な臓器移植に際しての免疫抑制治療の
ために最も頻繁にそして成功裡に使用されてきた。しか
しながらほとんとのｍＡｂｓは広範な免疫抑制能を持ち
、そのため、おそらくその全てが移植拒絶に関与しては
いない、広い範囲の免疫細胞に好ましくない影響を及ぼ
す。
そのほかには、モノクローナル抗体０ＸＴ３は成熟ヒト
Ｔ細胞に対するものであるが、腎臓移植後に急性同種移
植片拒絶反応が進行中の患者の治療に広く用いられてき
た（Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｐ、Ｓ、、Ｃｏ１ｖｉｎ　Ｒ，Ｂ
、。
Ｃｏ５１ｍ１．Ａ、Ｂ、：　Ａｏｎｕ、Ｒｅｖ、　Ｍｅ
ｄ、　３５：５３．（１９８４）およびＣｏ５ｍ１　Ａ
、Ｅ、、　Ｂｎｒｔｏｎ　Ｒ，Ｃ，、Ｃｏ１１ｖｉｎ、
　Ｒ，Ｂ。
ｅｔ　ａｌ、：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　３２
：５３５．（１９８１乃。さらに、０ＫＴ３およびウサ
ギ補体は、同種異系の骨髄移植における急性移植片対宿
主症（ＧＶ［ＩＤ）を防ぐために、提供者からの成熟Ｔ
細胞の洗浄に使用された（ＰｒｅｎＬｉｃｅ、Ｈ，Ｇ、
、Ｂｌａｃｋｌｏｃｋ、Ｈ，Ａ、、Ｊｘｎｏｓｓｙ、Ｇ
、ｅＬａｌ、：Ｌａｎｃｅｔ　ｌニアＧＧ（１９Ｂ２）
およびＢｌａｃｋｊａｃｋ、１１．Ａ、。
Ｐｒｅｎｔｉｃｅ　　Ｈ，Ｇ、、Ｇｉｌｍｏｒｅ、Ｍ、
Ｊ、ｅｔ　　ａｌ、：Ｅｘｐ。
Ｈｅｍａｔｏｌ、ｌｌ：３７．（１９８３））、０ＫＴ
３による治療は、急性白血球のための同種異系の骨髄移
植のＧＶＨＤの予防に効果的であるようにみえたが、０
ＫＴ３を用いたインヒドロ／インヒポの組み合わせ治療
法は重度の免疫不全合併症中のＧＶＩＩＩＤを予防する
ことに失敗しｒ二　ｏ（Ｈａｙｖａｒｄ、　　　Ａ、Ｒ
，ｅｔａｌ、：　　　Ｃ１１ｏ、　　　Ｌａｂ、　　　
０ｂｓｅｒｖ。
１００：６６５　（１９８２））。
０ＫＴ３によるＴ細胞の処理は、Ｔ細胞の活性化、免疫
中間物質およびＴ３−調節物質の生産をふくむ免疫抑制
には調和しないいくつかの反応を引き出す。ＣＤ３−　
ｍＡｂｓ（たとえば０ＫＴ３）により認識されるこのＴ
３−抗原複合体は、Ｔ細胞活性化中にきわめて重要な役
割を果たすと考えられる。機能的研究から、このＴ３−
抗原複合体は、それぞれのＴ細胞レセプターと機能的お
よび物理的に関連した分子として、特別な免疫機能に関
与していることが示されている。生理学的条件下で、０
ＫＴ３はＴ細胞へ結合するだけで、Ｔ細胞の活性化を起
こす。Ｔ細胞が補助的な細胞の存在下で活性化されると
き、０ＫＴ３はすべての提供者からのＴ細胞への強い分
裂促進因子であり、ところがＴｇＧｌアイソタイプの抗
−Ｔ３ｍＡｂｓは、補助的な細胞の機能の中にある多型
性にて引き起こされる無応答が報告されている。加えて
０ＫＴ３によるヒト末梢血リンパ球への刺激が、免疫媒
介物質であるインターフェロン（アル７７−ＩＦＮ）、
およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を誘導するこ
とが報告されている（Ｐａｎｇ、Ｒ，Ｈ，、Ｙｉｐ、Ｙ
。
Ｋ、、　Ｖｉｌｃｅｋ、Ｊ、：Ｃｅ１１１ｍｍｕｎｏ１
．６４：３０４．（＋９１１１）および　　Ｗｅｌｔｅ
、に、、ＰｌａＬｘｅｒ　　Ｅ、ＷａｎＨ，Ｃ，Ｙ、、
ｅｔ　　ａｔ、：　　Ｊ。
Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．１３１：２３５６（１９８３乃、０
ＫＴ３がＴ細胞膜に結合した後の最も初期の出来事のひ
とつは、Ｔ３複合体の調節である。Ｔ３の調節は適当な
条件下でインビトロおよびインビボにて起こり、このメ
カニスムは、と゛りわけインビボでの０ＫＴ３の治療中
にＴ細胞の″エスケープ”（ｅｓｃａｐｅ）にたいする
役割を果たしているようである。また抗原の調節はＴ細
胞の活性化に重要な役割を果たしているようである。
（発明が解決しようとする課題） 上述した０ＫＴ３の好ましくない効果に鑑み、成熟リン
パ球に対して特異性を持ち、臨床に応用できる最適な新
しいｏＡｂｓの作成が必要であった。さらに他の観点お
よび目的は、細胞破壊を仲介する効率をあげるためにそ
のようなモノクローナル抗体を細胞毒性のある試薬（ラ
ジオアイソトープ、毒素、酵素など）に結合させること
である。もうひとつの目的は、それらの効率を高めおよ
び／または患者内での免疫原性を低めるために、ネズミ
およびヒトの性質を持つキメラ抗体を生産するための遺
伝子操作を行い、ＩＩ１ＡｂＳに修飾を施すことである
。
キメラ抗体は、患者にたいする免疫原性という点におい
て不ズミｍＡｂｓにさらに利点をもたらす。
キメラ抗体においては、親の不ズミｍＡｂｓの有する親
和性および特異は維持され、患者のマウス定常領域への
応答は除かれる。さらに改善された様態では、可変領域
をヒト由来のものにする。この適合性決定領域および抗
原結合のために選択されたアミノ酸骨格のみがネズミ由
来に維持されている。
残りの骨格領域はヒトの配列に転換される。本発明の結
果得られるｍＡｂｓは患者に対し、極めて低い免疫原性
しか持たない、本質的（こはヒト抗体である。
（課題を解決するための手段） 本発明のさまざまな目標、本発明の観点および原理にし
たがって、Ｅ−ロゼツト法により分離したヒト末梢血Ｔ
−リンパ球（Ｅ”−細胞と呼ばれる）をマウスに免疫し
て得られるハイブリドーマ細胞系ＢＭＡ　０３＋を作成
し、それが分泌する有用なｍＡｂを調製した。このＢＭ
Ａ　０３１（今後、同様にＢＭＡ　０３１と呼ぶ）によ
って分泌されるｍＡｂは、１ｇＧ２ｂアイソタイプの不
ズミモノクローナルで、ＴＣＰ／ＣＤ３レセプター複合
体のアルファーおよびベーター鎖に特異性を持つ。
０ＫＴ３又はＢＭＡ　０３０と比較して（双方ともＣＤ
３−抗体のクラスターを形成している）、ＢＭＡ　Ｑ３
１はＴ細胞に結合した後、媒介物の放出を非常に弱く誘
導するのみである。これは臨床分野（例えば、腎臓移植
の手術をしだ後またはしている時に免疫的危険性か増加
した患者）において大変効果的である。ｌｉＭＡ　０３
１は、１回あたりＳＯＢ投与しても、主要な副作用が観
察されないので、手術の際有利に投与され、（好ましく
はＳｏｍｇの静脈注射を初回の投与として）、また引き
続き移植４８時間後に第２回目に投与される。移植機能
はほとんどどのような場合でも完璧である。
それゆえに、ＢＭＡ　０３１はアルファーベータ　ＴＣ
Ｒ上の価値ある抗原決定基を、０ＫＴ３または成熟ヒト
Ｔ細胞に対する他のｍＡｂによって認識されるＣＤ３上
の抗原決定基と区別して決定する。このｍＡｂｓの性質
を完全に解明し、また組み変えＤＮＡの技術により高可
変領域の外側の可変領域骨格の交換および本来の不ズミ
定常領域のヒト定常領域への交換を可能にするため、Ｂ
ＭＡ　０３１の重鎖および軽鎖をコドするＤＮＡをクロ
ーン化し配列決定した。
故に本発明の趣旨は、アルファ／ベータ　ＴＣＲ上の抗
原決定基の認識及び決定と、この抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を含む。
本発明の抗体の好ましい実施態様としては、ＢＭＡ０３
１および高可変領域に同じアミノ酸配列を含むｍＡｂｓ
、または機能的にそれらと同等であるものである。この
同等のものとは、たとえばマウス定常領域がヒトＣ−領
域に置き換えられたキメラ体を含む。
さらに本発明の観点は、これら抗体を、臓器移植のため
の手術前、中および後に、あるいは骨髄移植や癌の処置
（白血病細胞の直接処置およびＴ細胞群の活性化による
すべてのタイプの癌の間接的処置）のために臨床的に応
用することおよび免疫抑制における治療的応用に関する
ものである。
本発明の抗体はまた免疫能力のあるＴ細胞の検出にも有
効である。
さらに本発明の観点は、これから述べる好ましい実施態
様の詳細な説明を検討することで明らかになるであろう
。
［最も好ましい態様の説明］ ここで用いる″抗原決定基″とは、モノクローナル抗体
ＢＭＡ　０３１により認識される構造を呼び、船釣には
抗原決定基はある抗原の他の部分とは独立していると考
えられている。抗原決定基がどのように構造的に形成さ
れるかは、いまだ明らかではないが、恐らく、（１）抗
原分子のアミノ酸配列の部分；（Ｕ）同分子内にある非
連続的なアミノ酸により形成される三次構造；（ｉｉ）
抗原複合体内のさまざまな分子により形成される三次構
造；または（Ｖ）これらの組み合わせ、により形成され
ると予想される。ここで用いる″モノクローナル抗体（
＋ｎＡｂｓ）’“とは、実質的に均一な抗体群を持つ抗
体組成物を意味する。これは抗体の起源または作成方法
にて限定することを意図してはおらず、最も好ましい実
施態様には、遺伝子組み変え法による製造が含まれる。
ここで例示されるＢＭＡ　０３１抗体に関し、″′機能
的に同等″とは、つぎの性質を持つモノクローナル抗体
を意味する：（ａ）ＢＭＡ　０３１の結合をブロックし
、およびそのような結合が、結合したＢ！Ｉ１Ａ　０３
１によりブロックされる；（ｂ）アルファ／ベータ　Ｔ
ＣＲを発現しているか、ＴＣＲ−ガンマおよび／または
デルタ鎖は発現していないヒトＴ細胞に選択的に結合す
る；（ｃ）既知のアイソタイプのひとつを有する；（ｄ
）免疫沈降、ウェスタンブロッティング、または他の生
化学的分析で決定したときＢＭＡ　０３１　と同じ抗原
に結合する；（ｅ）アルファ／ベータ　ＴＣＲまたはそ
のセグメントの遺伝子によりトランス７ェクトされた細
胞で同じであると決定された抗原に結合する。
実施例１．免疫および細胞融合 ３匹のＢａ１ｂ／ｃマウス（メス二週齢：６−８週）を
各回１．５ＸｌＯ’個のＥ＋−細胞を２度腹腔に投与し
て免疫した。末梢血ヒトＴリンパ球はＥ−ロゼブト−法
（ヒツジ赤血球とのロゼツトを形成する細胞とする）に
て分離し、そして健常人から免疫の目的で提供された血
液を、その後１年以上、■■Ｖ−陰性であることをルー
チンに試験した健常人由来の末梢血から分離した。
最終免疫の３日後に、３匹のマウスすべてから肺臓を取
り出し、単一細胞懸濁液を調製し、リンパ球を、標準的
な融合方法によりマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３（ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ　１５８０）と融合
した。このミエローマ細胞Ｐ３１６３−Ａｇ８．６５３
ハ、も、！ｌ：　（１）　ミニ。
マ細胞Ｐ−３−１６３−ＡｇＢ（ＡＴＣＣ＃　Ｔ１Ｂ　
９）由来の免疫グロブリン非生産変異体である。
融合した細胞（ＩＸ　１０６細胞／ウニル）はハイブリ
ドーマ細胞を選別するために、■ＡＴ−培地（ダルベツ
コの改良イーグル培地＋ｌＯ％ＦＣ５＋０．１ｍＭハイ
ポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭ　
チミジン）存在下で培養した。
実施例　２．ハイブリドーマクローンＢＭＡ　ｆ１３１
の単離と特性決定 生育中のハイブリドーマ細胞（融合番号ＢＷ２４２）の
上清を、ルーチンに収穫し、ネズミＩ！Ｇの量を測定す
るためのＥＬＩＳＡテスト−システムにて免疫グロブリ
ンの存在を試験した。同時に、上溝はヒトリンパ球細胞
表面抗原にたいする特異性全もつ抗体についても試験し
た。
この選別工程の中で、単一の細胞かもとのウェル（Ｗｅ
ｌｌ）から選択され（ｂｖ２４２／Ｉ）７）、別個に培
養した。引き続きこの細胞は、顕微鏡での制御のもと顕
微操作を行い繰り返しクローニングを行った（ＢＷ　２
４２／４１２）。３回のクローニングサイクル中、生育
するクローンの１００％が、同一の結合特異性および生
化学的基準という点で同一作用を持つモノクロナル抗体
を生産した。ひとつのクローンを選別しＢＭＡ　０３１
と名づけだ。
このハ。イブリドーマ　クローンＢＭＡ　０３＋の特異
性および機能の特徴を明らかにするため、あらゆる分析
を行った。
保存用シード（ｍａｓｔｅｒ　５ｃｃｄ）バンクおよび
作業用（ｗｏｒｋｉｎｓ）細胞バンクはハイブリドーマ
クローン　ＢＭＡ　０３１から開始して樹立した。この
ふたつの細胞バンクは、病原（マイコプラズマ、バクテ
リアおよびウィルスによる感染）の混入が無いことを確
認するために十分な検査を行った。加えて、保存用シト
バンクから始まり、５０回の継代培養後の実験でさえも
、単一細胞クローニングによる分析およびバルクカルチ
ャー内の抗体生産率を計算した時、検出できる抗体の特
異性の変化は測定されず、抗体非生産変異体は検出され
ないことが示された。
実施例３　、　ＢＭＡ　０３＋の特異性リンパ球細胞表
面抗原にたいするモノクローナル抗体は、通常結合活性
測定により特徴づけられる。ＢＭＡ　０３１の特異性を
分析するために、細胞蛍光活性測定システムを主に採用
した。特に結合活性測定は以下のように行われた。
３．１　　ＢＭＡ　０３１の末梢血白血球への結合分析
参照ｍＡｂｓとのｍＡｂ反応性の比較 性質の特定された末梢血白血球の各種サブポピユレーシ
ョンを、参照ＩＩ１Ａｂｓおよび／またはＢＭＡ　０３
１　でラベルした。もし両方のｍＡｂｓが同一の特異性
をもつならば、同一の細胞群を染める筈である。この実
験では、参照ｍＡｂｓとして使用されたものは、あらか
しめヒト白血球弁イし抗原に関するワークショップ、、
Ｉ［、ＩＩＩ　、（Ｐａｔｉｓ、１９８２；Ｈｏ５ｔｏ
ｎ、１９８４；　０ｘｆｏｒｄ、１９ｇ６；　［１ｅｒ
ｎａｒｄ、　Ａ、Ｅ、：　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐ
ｉｎｇ、　ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ（１９８４）
；Ｒｃｉｎｈｅｒｘ、Ｅ、Ｌ、Ｅ、：Ｌｅｕｋｏｃｙｔ
ｅ　ｔｙｐｉｎｇ　Ｉｌ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｔ４ｅｒｌ
ａｇ（１９８６）；ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ａ、Ｊ、Ｅ。
：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｔｙｐｉｎｇ　Ｉｌ、　０ｘｆｏ
ｒｄ　（Ｉｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（＋９８７
））にて特徴が明らかになっているものである。
異なる白血球サブポピユレーション上の抗原の発見 末梢血白血球は、全血を１ステツプで分析するために改
良したオルト　サイトフルオログラフ　５０■／２１５
０コンピユーターシスシムにて分析した。細胞は１１Ｍ
Ａ　ｆ１３１−ＦＩＴＣおよび／または参照ｍＡｂｓで
直接“ラベルするか、または第２ステツプにて、インチ
オシアネイトー蛍光標識ウサギ抗マウス　ＩｇＧ（Ｉｇ
−Ｆ（ａｂ″）！−ＦＩＴＣ）を用いて染色した。細胞
蛍光測定法によりＢＭＡ　０３＋は、アルファ／ベータ
　Ｔ細胞レセプターを発現しているＴ細胞種の細胞上に
のみ結合が検出されることが発見された。ＢＭＡ　０３
１はガンマ／デルタＴ細胞レセプターを発現している細
胞とは反応しない。それ故にＢＭＡ　０３１は、アルフ
ァ／ベーターＴＣＲ＋とガンマ／デルタ−ＴＣＲ＋細胞
を区別するのに効果的に利用できる。明らかなＴＣＲ鎖
の存在または不存在が、Ｔ細胞の個体発生の間における
Ｔ細胞分化の状態を反映する。末梢血のなかでは、ＣＤ
３−複合体の分、子は主としてヒトアルファ／ペターＴ
ＣＲと共に発現される（７）。健常人からの血液中では
、ＢＭＡ　０３１により染色されるＴ−リンパ球の頻度
は通常、　ＣＤ３　ｎ＋Ａｂｓで測定されるよりも！−
５％低いにｔＪない（ＣＤ３＋細胞の通常の頻度につい
ては１３を参照）。クローン化されたＴ細胞にて示され
るヨウニ、このＣＤ３“ＢＭＡＯ３＋＝細胞群は、アル
ファ／ベータＴＣＲの代わりにガンマ／デルタＴＣＲを
発現する。しかしながら病理学上の見地からは、ＣＤ３
’ＢＭＡＯ３＋−Ｔ細胞の頻度は２個々の患者において
ＣＤ３＋細胞の２０％にまで増加することがある。競合
的な免疫蛍光活性測定−Ｃ’ハ、ＣＤ３”ＢＭＡＯ３１
＋細胞上テ（７）ＢＭＡ　０３１−ＦＩＴＣの結合は０
ＫＴ３にてブロックされ、またその逆も起こる。しかし
ながら、このようなデータをより詳細に検討することに
より（蛍光−ヒストグラムの比較）および抗−イディオ
タイプ抗血清にてブロッキングを研究することにより、
Ｂ１１１Ａ　０３＋はすべての既知のＣＤ３−ｍＡｂｓ
とは異なるエピトープを認識することが明らかに示され
た。
実施例４　、　ＢＭＡ　０３１の機能の特性決定ＢＭＡ
　０３１はＩｇＧ２ｂアイソタイプの不ズミモノクロナ
ル抗体である。このユニークな特異性とＢＭＡ　０３１
のアイソタイプ性から、この抗体は特別な生物学的機能
のパターンを引き起こす。Ｔ細胞に結合してから、ＢＭ
Ａ　０３１は、３日間のチミジン取り込み活性測定で、
ＩｇＧ２ａのアイソタイプであるＣＤ３−ｍＡｂｓ（た
とえばＤＭＡ　０３Ｇ、０ＫＴ３）と比較してＴ細胞の
増殖を誘導しないし、静止中の１９２３球へのＣａ２＋
の流入も誘導しない。ＢＭＡ　０３０または０ＫＴ３の
ようなＣＤ３−ＩＩ１Ａｂｓとは対照的にＢＭＡ　０３
１のＴ細胞への結合は抗原調節を非常に弱くしか誘導せ
ず、サイト力インの放出／生産を極めて低い程度にしか
誘発しない。
実施例５　、　ＢＭＡ　０３＋からＤＮＡおよびＲＮＡ
の調製染色体ＤＮＡを調製するために、約Ｉ　Ｘ　１０
’の細胞をＴ−フラスコ中で生育した。ＳＤＳ中にて溶
解して、プロテナーゼにおよびｇＮａｓｅ　Ａにて消化
し、高塩濃度中でゆるやかにフェノール／クロロホルム
で連続的に抽出を行ってＤＮＡを調製した。低密度アガ
ロスゲルではこの染色体ＤＮＡの平均の長さは５０キロ
ベ一ス以上であり；ラムダファージベクター内での完全
な染色体クローンライブラリーには、長いことが重要で
ある。収率は約１０１１１１　ＤＮＡであった。
約１０９の細胞を、ＲＮＡを単離するためにもまた生育
した。細胞は溶解させ、グアニジンチオシアネト（ｇｕ
ａｎｉｄｉｎｉｕａ＋　ｔｂｉｏｃｙａｎａＬｅ）にて
抽出した。ＲＮＡの収率は約１０ｍｇで、コンタミがな
く、分解されていないことがアガロースゲルにてあきら
かであった。
すべてのＩＮＡをオリゴｄＴセルロースに結合してポリ
Ａ″’ＲＮＡを調製した。収率は約５％で、すなわち５
００μｇのポリＡ”ｍＲＮＡが得られた。。
実施例６．ｍＲＮＡのプライマー伸長反応によるＢＭ八
へ３１重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）のシーフェンシング 特異的なｍＲＮＡが非常に豊富であるので、総ポリＡ”
ｍＲＮＡのプライマー伸長により、免疫グロブリンのシ
ーフェンス決定をすることができる。またこのシーフェ
ンス決定は、伸長開始に使う″ユニバーサルブライマー
を合成できる一般的な定常領域を利用しても行うことが
できる。最終的なプライマーは、シーフェンスに関する
情報を集めて作られる。″ユニバーサル”ＨおよびＬ鎖
プライマー：（軽鎖”ユニバーサルプライマー″： ”ＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ”　、重鎖”ユ
ニバーサルプライマー”：　”　ＧＧＧＧＧＣＣＡＧＴ
ＧＧＡＴＡＧＡＣ”　）はポリヌクレオキナーゼで末端
放射ラベルを行い、それぞれ約７μｇのＢＭＡ　０３１
　ポリＡ”　ｍＲＮＡのアリコートとハイブダイズした
。ハイブリダイズして得たものを、デオキシヌクレオシ
ド３リン酸混合物の存在下で、鳥類のリバース　トラン
スクリプターゼを使用して伸長させた。反応生成物は濃
度勾配アクリルアミドゲルにて分離し、オートラジオグ
ラフィーを行った。初めの伸長反応からおよそ２００塩
基（ＮＴ）のシーフェンスが解読された。ＨおよびＬ鎖
用にさらにふたつのプライマーを合成し、それぞれ長さ
は１７−１８（ＮＴ）であり、すなわち、 ＃目９（軽鎖）　”ＡＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣ
Ａ”＃１８０　（軽鎖）Ｓ″ＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＡ
ＣＡＴＧ”＃Ｉ７９　（重鎖）　”ＣＴＣＣＡＴＧＴＡ
ＧＧＣＴＧＴＡＣＴ”＃１７８　（重鎖）　”ＣＣＡＧ
ＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡ”である。
上記複製の伸長プライマーは、■およびＬ鎖可変（Ｄ領
域を特定する完全に重複する、シーフェンス（それぞれ
の遺伝子について、全長的４４０　ＮＴ）を生成しｔこ
　。
得られたシーフェンスは、表１Ａ（重鎖）、表１Ｂ（軽
鎖）に示した。シグナルシーフェンスは、成熟タンバク
質の開始点、不変システィン、相補性決定領域（ＣＤＲ
）、結合領域（Ｊ）、およびシーフェンスに使用したプ
ライマーの位置も示した。これらのシーフェンスは、単
離されたラムダクローンのＤＮＡシークエンス決定によ
り確認した（以下の実施例７を参照）。
実施例７．染色体クローンライブラリーの構築およびス
クリーニング このライブラリー構築の一般的方法は第１図および表２
の八およびＢの部分に表した。全ゲノムＤＮＡを制限酵
素Ｓａｕ　３Ａにより部分消化した。消化した１１ＮＡ
のＩＧ−２ｔｌＫｂの大きさのものを、調製用電気泳動
およびガラスを埋め込んだ濾紙に吸着させて単離した。
結果として得られた物はラムダベクタＥＭＢＬ−３（Ａ
ＴＣＣ＃３７２６６）のファージ腕”（ａｒｍｓ）に結
合した。結合物を７ア一ジ粒子に封入した（クローニン
グ効率ＩＸＩＩＩ’　ｐｆｕ／μｇ染色体ＤＮＡ）。組
み変えクローンは１０Ｓ／プレートの密度で蒔いた。そ
れぞれのプレートについて濾紙転写法を行い、転写した
ニトロセルロースディスクをハイブリダイゼーションの
工程に供した。これらのディスクは、■またはＬｌのＶ
エクソンとＣエクソンの間のイントロン由来の３２ｐ−
ラベルフラグメントプローブと２連でハイブリダイズさ
せた（これらのプローブは”ユニバーサル１ｇプローブ
である）ａ陽性であると推定されるクローンは、再スク
リーニングを４回行いプラーク精製して確認した。再ス
クリーニングは実施例６で示した高可変領域に対応する
合成オリゴマー（＋７−３３　ＮＴ）を放射ラベルして
使用した。スクリーニングにプローブとして使用した７
ラグメントおよびグローブの相対位置を第２図に示した
。
このライブラリーの徹底的なスクリーニングの後、ＢＭ
Ａ　０３１ＨおよびＬ鎖エクソンを含む多数の陽性ラム
ダクローンが単離された。表２、Ｃの部分に示すように
、初めに１４の■鎖りローンが同定され、４個が真に陽
性であり；２７個のＬ鎖りローンのうち７個が真に陽性
であった。■およびＬ鎖の染色体シーフェンスは、サン
ガーおよびマキサム　ギルバートシーフェンシング法に
よって決定され、それぞれ表３Ａおよび３Ｂに示す。
実施例８．キメラＢＭＡ　（１３１発現用のベクターの
構築キメラＢＭＡ　０３１の■鎖は、ヒト　ガンマ　１
定常領域をふくむベクターまたはヒトガンマ４定常領域
を含む第２ベクターにより合成した。Ｌ鎖用のベクタは
、ヒトカッパ一定常エクソンを含むものを用いた。
各々のベクターは、それぞれのＢＭＡ　Ｙ遺伝子用の上
流クローニング部位、薬剤選択マーカーおよびバクテリ
ア内で複製するために必要なシグナルを含んでいた。こ
れらの制限ベクターのマツプは、第３図に示す。ＢＭＡ
　０３１　ＨおよびＬ鎖のＶエクソンは、上述したベク
ターにサブクローニングした。
実施例９１発現のための、キメラＢＭＡ　０３１遺伝子
のミエローマ細胞へのトランスフェクション 上述のように構築したキメラ体は、エレクトロポレーン
ヨンにより、非−免疫グロブリン−生産不ズミハイプリ
ドーマ５Ｐ２１０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ　１５８＋）にコ
ートランスフエクションされた。４８時間の発現期間の
後に得られた細胞またはトランスフエフトーマは、マイ
コフェノール酸（１μｇ／ｍｌ）およびジエネチシン（
１ｕ／ｍ１ＸＧｉｂｃｏ）の双方を含む培地中に存在さ
せた。
このトランスフェクションされた細胞は約２週間で明ら
かな生育を示した。２度の選別によりトランスフェクシ
ョンの効率は約ｌＸｌ０−’であった。抗体を分泌する
薬剤耐性クローンの割合は、抗体の分泌が約１μｇ／ｌ
ｌ１ｌから約１７μｇ／ｍｌとばらつくなかでも、５０
％よりは高かった。
実施例１Ｇ、トランスフェクション体のサブクローニン
グ ＢＭＡ　０３１−ＧｌおよびＢＭＡ　０３１−Ｇ４細胞
ラインは、初めのトランスフェクションの後に生じたお
それのある遺伝的なヘテロジエニティを除くため、サブ
クローニングした。各々のキメラトランスフェクション
体の中の最も良いサブクローンを、単離し、抗体の生産
を分析した。これらの最終的な細胞系は、ＢＭＡ　０３
＋−Ｇｌ−１およびＢＭＡ　０３１−Ｇ４−１であり、
ＩｇＧ１抗体を７ｐｇ／細胞７２４時間、ｒｒＧ４抗体
ヲ５ｐｇ／細胞／２４時間の割合で生産した。飽和状態
に達した培養物は、ＩｘＧｌが３ＳＪＩｇ／ｍｌ　、　
１ｇＧ４がＩＳＪ１ｇ／ａ＋１を蓄積した。
実施例−１１，キメラＢＭＡ　０３１の特性決定ＢＭＡ
　０３１−Ｇｌ−１およびＢＩＪＡ　０３１−Ｇ４−１
によりそれぞれ生産される抗体、（ＭＡ　０３１−Ｇｌ
およびＢＭＡ　０３＋−０４と今後呼が）は、それらが
ほんとうにＢＭＡ　０３１マウス−ヒトキメラ抗体であ
るかどうかを試験し確認した。ＥＬＩＳＡ法による一連
の分析により、この抗体はヒトカッパーおよびヒト　ガ
ンマ定常領域を含んでいた。さらには、この抗体はネズ
ミ　カッパーおよびガンマ定常領域に対する抗体とは反
応しなかった。アイソタイプを決定する試薬を用い、こ
のキメラ抗体は１ｘＧ１および１ｇＧ４アイソタイプで
あることも確認された。
精製したキメラ抗体は、固定化細胞ＥＬＩＳＡ活性測定
において機能的に活性であることも示された。
双方のキメラ抗体は、起源である不ズミＢＭＡ　０３＋
と同し様式でＰＢＬ−ＡＬＬ細胞に結合した。直接ラベ
ルしたキメラ　抗体ＢＭＡ　０３１−Ｇｌ−ＦＩＴＣお
よびＥＩｉｌＡ　０３１０４−ＦＩＴＣを、ネズミＢＭ
Ａ　０３１−ＦＩＴＣと特異性を比較するために、細胞
蛍光活性測定システムに供した。
これらの抗体の末梢血白血球との典型的な反応性パター
ンを表４に示す。競合的免疫蛍光活性測定により、ヒト
　リンパ球をキメラ　ＢＭＡ　０３１−ＧｌまたはＢＭ
Ａ　０３１−Ｇ４とブレインキュベーションすると、マ
ウスＢＭＡ　０３＋−ＦＩＴＣの結合がブロックされま
た逆も起こる（第４Ａ−４Ｃ図参照）。これらすべての
結果は、キメラＢＭＡＯ３１−ＧｌおよびＢＭＡ　０３
１−Ｇ４が、特異性という点においてネズミ　ＢＭＡ　
０３１と同一であることを示している。
しかしながら、キメラＢＭＡ　０３１−抗体の機能的特
質は、ネズミＢＭＡ　０３１またはＢＭＡ　０３０のよ
うなＣＤ３−ｉＡｂｓとは明らかに異なる。はとんどの
ＣＤ−ｍＡｂｓ（例えばＨＭＡ　０３０）は、少ない投
与量でさえもＴ細胞の増殖を触発するが、高濃度で使用
した時には、分裂促進因子として影響を及ぼさないこと
がよく知られている。この効果は”高濃度阻害″として
知られている。
ネズミＢＭＡ　０３１と比較して、双方のキメラＩＩＭ
Ａ　０３１−ＩＩ１Ａｂ　ｓは、３日または６日のチミ
ジン取り込み活性測定において、高濃度に投与しても高
濃度阻害が起こらずに、極めて高い効率で１９２８球の
増殖を触発する。ふたつの代表的な実験を第５Ａおよび
５Ｂ図に示す。この実験では、ＤＭＡ　０３０または他
のＣＤ３−ｍＡｂｓによる刺激のための応答性の高さお
よび至適な濃度は、個々の免疫状態により血液提供者毎
に異なる。
上述した（実施例４）ように、ＣＤ３−ｍＡｂｓと比較
して、不ズミＢＭＡ　０３１のヒト　Ｔ−りンバ球への
結合は、わずかに低濃度の免疫メデイエータ−の放出し
かもたらさない。再度この点でキメラＢＭＡ　０３＋抗
体はネズミＢＭＡ　０３１およびＢＭＡ　０３０（ＣＤ
３）とは異なる。表５のそれぞれの実験では、免疫メデ
イエータ−の放出はＣ０ＬＯ２０５−細胞上のｔｌＬＡ
−Ｄｔ発現の誘導により示されている。
文献から、Ｃ０ＬＯ２０５細胞はガンマ−インターフェ
ロンのような組み変え免疫メデイエータ−１腫瘍壊死因
子、またはそのような因子を含む活性化Ｔ細胞の上溝と
インキュベートした後の応答として、増強した■ＬＡ−
ＤＲ抗原の発現を示すと言われている。
ガンマ−インターフェロンのような組み変え因子により
得られた対照値と活性化Ｔ細胞の上溝により誘導された
ＨＬＡ−ＤＲの発現の増強度を比較して、カルチャー上
溝中の免疫メゾエータ−の量を測定することができる。
その結果を表５に示すが、これよリキメラＢＭＡ　０３
＋抗体が結合した後に放出される免疫メデイエータ−の
カイネチックスおよび量は、ネズミＢＭＡ　ｆ１３１抗
体またはＣＤ３−ｍＡｂｓにより触発された効果とは異
なることが示唆される。
キメラＢＭＡ　０３＋抗体は、Ｔ細胞増殖活性測定にて
ヒトＦｅレセプターと効果的に相互作用するので、それ
らは、ＡＤＣＣ力値も高いという可能性が強い。
これらｍＡｂｓのＡＤＣＣ能力を評価するために、ＡＤ
ＣＣ能力において８つのウサギ抗−ヒトＴ細胞クロプリ
ンから最も良いとして選択されたウサギ抗−〇■−１抗
血清と比較した。各々の試験のデータを第６ｌ−６Ｃ図
に示す。「エフェクター：標的となる細胞」の割合が低
くても（第６Ａ図）または抗体の濃度が極めて低くても
（第６Ｂ図）、キメラＢＭＡ　０３＋抗体はＩＩＩＰＢ
−ＡＬＬ細胞を殺す高い能力を有する。これと比較して
、ネズミＢＭＡ　０３１は＾ＤＣＣ活性が低い。従って
、もし細胞溶解が重要な基準であれば、ＢＭＡ　０３＋
は細胞毒性部分に結合させて有利に使用できる。
実施例１２．”改良”ＢＭＡ　１１３１抗体の生産改良
ＢＭＡ　０３＋アミノ酸配列の決定過去においては、″
ヒト化する″とはヒトＣ領域と共に発現されたネズミｖ
領域のキメラ構造と関連して用いられていた。混乱を避
ける為に、ここで使用する″改良”という言葉は、ヒト
Ｃ領域と共に発現された″ヒト化された″Ｖ領領域意味
するための用語として用いる。ネズミＢＩＪＡ　０３＋
抗体を改良して使用する最適なヒトの配列を決定するた
めに、このネズミ　ＨＭＡ　ＯＨアミノ酸配列が、最も
相同性のあるヒト抗体のＮＢＲＦデータを調査するのに
用いられた。抗体の重鎖と軽鎖は分子モデルに示唆され
るように、強い相互作用を示すので、同じヒト抗体の重
鎖および軽鎖を使用することに決めた。ヒ）ＥＵ抗体が
中でも最適な選択枝であると判明した。
ＢＭＡ　０３１とＥＵ　ＦＲｓ　（＃ｌ−３）の相同性
は重鎖で６６％、軽鎖で６３％であった。このＢＭＡ　
０３１抗体は、ＪＨ３およびＪＫ５を用いている。これ
らは、ヒトＪＨ４およびＪＫ４に最も相同性がある。第
１世代改良ＢＭＡ　０３１抗体は、ＢＭＡ　０３１　Ｃ
ＤＲ５，ＥＵ　ＦＲｓおよびホモロガスなヒトＪ領域を
含んでいた。この抗体はＢＭＡ　０３１−ＥＵＣＩＶＩ
（表６Ａおよび６Ｂ）と呼ばれる。
この基本改良物のための更なる改良は、ＣＤＲ５の直前
および直後の配列に有利に作成される。ここでＣＤＲ５
は、配列相同性データに基づいて選択された（カバト等
Ｈａｂｉｔ　ｅｔ　ａｌ、　１９１７）、抗体の分子モ
デルによれば、実際のＣＤＲルーゾは、′カバト″ＣＤ
Ｒ５とは４種類までの相違アミノ酸を含むことができる
と示されている。ゆえに、ＣＤＲ５の４種類のアミノ酸
中の少なくとも主なアミノ酸の差（大きさおよび電荷）
をネズミに維持することは、利点である。
コノ抗体１１ＢＭＡ　０３１−ＥＵＣＩＶ２ト呼ばれテ
ィる（表６Ａおよび６Ｂ）。加えて、ＣＤＲ５の４つの
アミノ酸中のすべての差を、ネズミに維持することもで
きた。この抗体をＢＭＡ　０３１−ＥｔｌＣＩＶ３と呼
ぶ。さらなる改良も可能であることはすぐに認識できる
が、複雑なコンピューターモデル操作無くしては重要性
の優先度の決定が難しい。しかし、すでに他の抗体で解
明されている構造の配列の相同性に基づいて、簡単なコ
ンピュータモデルを作成した。このモデルは、ＣＤＲ５
に対するアミノ酸骨格の近似性を判断するのに使用した
。この分析の結果を表７Ａおよび７Ｂに示す。
この結果は以下に述べる改良の方針に用いた。例えば、
いくつかのアミノ酸は、ＢＭＡ　０３１特異的またはＥ
ＴＩ特異的である（すなわち、それらのサブグループ内
の共通配列とは異なる）。おそらくこれらのアミノ酸は
、それぞれの活性を強めるために体細胞突然変異をとお
して起ったのであるから、ＢＭＡ　０３１特異的アミノ
酸を維持しまたＥＵ特異的アミノ酸をヒト共通配列に変
えるのが理論的であるようにみえる。しかしこのことは
同時に反対の可能性ももっている。ひとつの鋼内のアミ
ノ酸を変えることは、その鋼内の他のアミノ酸、および
他の鋼内アミノ酸との相互作用に変化を引き起こす。ゆ
えに変換の数を制限するために細心の注意を払わなけれ
ばならない。表８にこのような可能な変換の概要を示す
。
表８をみれば分かるように、ＥＵはヒトＶＨ−１サブグ
ループの共通配列と６箇所で異なる。その３箇所はＣＤ
Ｒ５の４つのアミノ酸の中に存在し、（＃７０．９５．
９８）、ＢＭＡ−ＥＵＣＩＶ３に位置している。ひとつ
の位置（＃９３）でヒト共通配列はＢＭＡ　０３１と同
じである。この事実はＥＵからＢＭＡ　０３１へ戻す変
換が合理的であるとも思われ、この変換はＢＭＡ−ＥＵ
ＣＩＶ３に組み入だ。残る２つの位置（＃Ｈ，７４）は
ヒト共通配列中に存在しない。しかしながらコンピュー
タモデルではこれらはＣＤＲ５４ｍ近イノテＢＭＡ　０
３１７　ミ／　［１配列ヲＢＭＡ−ＥＵＣｒＶ４内に使
うことにした。次に表８において軽鎖には５つのＥＵ特
異的アミノ酸がある。ひとつはＣＤｌ５の４ツノアミノ
酸中にあり（１４ｇ）、ＢＭＡ−ＥＵＣＩＶ３中（７）
ＢＭＡ０３１として維持されている。ふたつの位置で（
＃６３゜８１）ヒト共通配列は、ＢＭＡ　０３１と同じ
であり、ゆえにＢＭＡ　０３１として維持することがで
きた。このような変換はＢＭＡ−Ｆ、ＵＣＩＶ４内で行
った。他のふたつの位置については（＃ｌＯ，７０）議
論の余地がある。コンビュータルモデルでは＃７６の位
置はおそらく重要であると同定されたので、この変換は
ＢＭＡ−ＥＵＣＩＶ４内にて行った。＃ｌＯの位置のア
ミノ酸は、ＥＵに保持された。さらに表８において重鎖
内には８つのＢＭＡ　０３１特異的アミノ酸がある。ふ
たつの位置（＃７，８２）においてＢＭＡ　０３１シー
クエンスはＥＵと同じである。＃７２は上述のように位
置している。Ｈｉｓ＊ａはＢＭＡ　０３１にユニークで
あり、ＣＤＲ５にたいへん近い；この変換をＨＭＡ−Ｅ
［ＩＣＩＶ３に組み入れることに決めた。残る４つの位
置（＃ｌ、９，２０．４０）のうち、Ｒ４０のみがＣＤ
Ｒ５に近いので、この変換をＩＩＭＡ−ＥｔｌＣＩＶ４
内で行った。他はＥＵに維持された。軽鎖内には、ＢＭ
Ａ　０３１に特異的なアミノ酸は無い。その配列は、サ
ブグループ■共通配列と同じである。
最終的なりＭＡ−ＥＵＣＩＶ４の配列は、初期的コンピ
ュタ−モデルに基づいて決定した。重鎖には、さらにふ
たつの位置、Ｒ７７，８７、がＣＤＲ５に近いと判明し
、これらはＢＭＡ　０３１のアミノ酸に変換された。軽
鎖では、ふたつの位置（＃２１，６０）がＣＤＲ５から
除かれていることが明らかになり、この変異体中にＥＵ
アミノ酸を使用することに決めた。さらに５つの位置（
＃ｌ、３，４゜４２．７１．１０１１）が相互作用する
のにＣＤＲ５に十分近いと判断し、それらはＢＭＡ　０
３＋のアミノ酸に変換された。
改良ＢＭＡ　０３＋抗体の合成および発現改良抗体をコ
ードする軽および重鎖の可変領域エクソンを合成し、あ
らかじめ単離されたＢＭＡ　０３１の染色体フラグメン
ト中に置き換えた。これらの７ラグメントを、ヒトカッ
パーおよびガンマ１定常領域エクソンを含む哺乳動物発
現ベクターに挿入した。この改良遺伝子は、エレクトロ
ポレーションにより５ｐ２１０ハイブリドーマ細胞にト
ランスフェクトされ、トランスフェクトされた改良ＢＭ
Ａ　０３１　を分泌している細胞を選別した。分泌レベ
ルは、最高７ｐｇ／細胞７２４時間であった。
、ｎノＢＭＡ　−ＥＵＣＩＶＩおよびＢＭＡ４ＵＣＩＶ
２抗体は、Ｔ細胞に結合しなかった。これとは対照的に
、ＢＭＡ−ＥＵＣＩｖ３は、Ｔ細胞に特異的に結合し、
ネズミＢＭＡ　０３＋抗体およびすでに構築したキメラ
ＢＭＡ　０３１−Ｇｌ抗体とはこれらの細胞に対する結
合に関して競合した（第７図）。
抗原結合に重要なアミノ酸骨格 改良ＢＭＡ　０３＋抗体のＴ細胞結合データは、抗原結
合部分におけるアミノ酸骨格の重要性を示している。Ｂ
ＭＡ　０３１（７）　ＣＤＲ５を含むだけでは（ＢＭＡ
−ＥＵＣＩＶＩ）抗原に対する親和性の維持が十分では
無かった。
結合親和性を回復するために重鎖Ｖ領域の１２種アミノ
酸の置換体、（ｓＨ，Ｈ，３０，口、４１，６７．６８
．）［１，９３゜９４．９５．９８）が作成された。中
でも６つ（ＩＮ、４８．７０，９３゜９４．９５）が、
あまり良く結合しなイＢＭＡ−ＥＵＣＩＬ２からよく結
合するＢＭＡ−ＥＵＣＩＶ３への変換をもたらすので重
要である。同じように軽、ｇｌｖ領域については、５種
のアミノ酸の置換体（＃２１．４６，４７．４８．６０
）を作成した。中でも３−’）（＃２１．４７．４８）
がＢＭＡ−ＥＵＣＩＶ２からＢＭＡＥＵＣＩＶ３への変
換で用いられ、これらはより重要である。
表１Ａ Ｂｌ［Ａ　０３１　ｍＲＮＡ重鎖可変領域配列、、、Ｇ
ＴＣＴＡＴＣＣＡＣｒＧＧＣＣＣＣ，、。
領域 表１Ｂ Ｂｌ［Ａ　０３１鱈Ｎ＾軽鎖可変領域 シグナル 領域 Ｂｉ［Ａ　０３１遺伝子ライブラリ のスクリ ニング イントロンプロ ■領域プロ マスク Ｎ、　Ｄ。
Ｎ、　Ｄ。
Ｎ、　Ｄ。
Ｎ、　Ｄ。
表２ ＾、　ＢＭＡ口３１染色体ライブラリ の構築 封入効率 （ファージ／μｇ　ＤＮＡ） 　ＤＮＡ ３、６Ｘ１０” 腕のみ結合 ４．０Ｘ１０’ 腕＋コントロール挿入を結合 ６．８ＸｌＯ’ 腕＋Ｂｌ１Ａ　０３１　ＯＮＡを結合 １、５Ｘ１０’ Ｂ、統計上完全なライブラリ のための計算 １ｎ（１−Ｐ） Ｎ＝・・・・・・・−・・・・・・・・−・１ｎ（１−
Ｆ） Ｎ：クローン数 Ｐ＝望まれる可能性 Ｆ：単一クローン内に おける遺伝子の割合 哺乳動物遺伝子（３Ｘ１０”ｂｐ）の１５１ｂフラグメ
ントのライブラリー内に表される特定のＤＮＡ配列をも
つ可能性を９９％達成するには、ライブラリーは９．２
Ｘ１０ｓのクローンを含まなければならない。
０ ロ ロ ロ ロ ロ ≧ ト じ ト１く ト く ＾＾ＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＣＴＡ
ＡＴＧＴＧＡ ＴＧＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＣＴｒＴＡＴＴＴ
ＴＡＣＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ
ＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＴＭＴＣＣＣＴＴＡＡＴＣＴ
ＴＴＣＣＣＧＴＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＡＴＡＧＧＴＣＡ
ＣＭＴＡＴＭＴＴＴｒＣＧＡＡＴＴ 表５ キメラＩＩＭ＾０３１抗体によるＴ　１１１１胞の活性
化Ｔ−インターフェロン放出のＨ４ ′１′−細胞 活性化剤 ｅｄｌｕｍ ｌａ 〈１ｂ Ｔ−細胞上清 ２ 〈１ く１ 〉１００ ａＴ−細胞上清はＴ−細胞活性化俊１白目にて収穫ｂτ
−インターフ、Ｌロン（ｎｇ／耐）はＣｏ１ｏ　２０５
−細胞上の［Ｌ＾−叶により測定 表４ 直接ラベルした抗体を用いて、キメラ−ＢＩｉＡ　０３
１抗体を免疫蛍光活性測定した反応パターン培地　　　
　２±２゜ ＢＭＡ　　０３１　　　　６９土８ ＢＩ１Ａ　０３１−Ｇｌ　６９±９ ８Ｂ［Ａ　０３１−Ｇ４６９±８ ５±１ ６±３ｂ ６±２ｂ ５±３ｂ ３±２ ２±３ｂ ２±３ｂ ２±３ｈ ａ：血液提供者３人についての平均値 ｂＦｃレセプターによる非特異的結合はブロックされた
。
表６Ａ 改良　ＢＩｉＡ　０３１　Ｖ［Ｉ領域のアミノ酸配列−
ＣＤＲ−３−／ 表６Ｂ ＣＩＶ−４ ＧＴＫＶＥＩＫ 表７Ｂ コンビニ タ モデルによる１扁＾ＥＬＩＣＩＶＬＩおよびｎＩ１Ａ〜
０３１の比較 の相違 アミノ酸 アミノ酸 の近似 ｌｙ ｎ１＾−０３１の比較 表８ Ｂ［＾０３１およびＥＵおよびそれらの共通配列間のア
ミノ酸の相違 重鎖、ＥＵ特異的・ 軽鎖、Ｅｌｆ特異的： 重鎖、■＾特異的： 軽鎖、ＢＩ［Ａ特異的：存在せず ＋、可変
【図面の簡単な説明】
第１図はＢＭＡ　０３１遺伝子ライブラリーの構築手順
を模式的に示す工程図であり； 第２図はライブラリーのスクリーニングに使用したプロ
ーブを表す模式図であり； 第３図はヒト定常領域発現ベクターを直線状で示す模式
図であり； 第４Ａ図、第４Ｂ図および第４Ｃ図は各々ＢＭＡ０３１
　ＦＩＴＣ，ＢＭＡ　０３１−ＧＩ　ＦＩＴＣおよびＢ
ＭＡ　０３１−Ｇ４　ＦＩＴＣを用いた場合の競合的免
疫蛍光活性測定の結果を表すグラフであり： 第５Ａ図および、第５Ｂ図は各々ＢＭＡ　０３１キメラ
抗体を用いた３日Ｔ細胞−増殖活性測定の結果および６
日Ｔ−細胞活性測定の結果を表すグラフであり： 第６Ａ図、第６Ｂ図および第６Ｃ図は各々ＢＭＡ０３１
抗体、ＢＭＡ　０３１−Ｇｌキメラ抗体をおよびＢＭＡ
　０３１−Ｇ４キメラ抗体を用いたＡＤＣＣ活性測定の
結果を表すグラフであり；そして； 第７図はＩＭＡ　−ＥＵＣＩＶ３抗体を用いた競合的免
疫蛍光活性の結果を表すグラフである。 （外４名）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、モノクローナル抗体ＢＭＡ０３１により認識される
    、ヒトアルファ／ベータＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）上
    の抗原決定基。 ２、請求項１に記載の抗原決定基と免疫的に反応できる
    、少なくとも一つの可変領域を有する抗体。 ３、ＢＭＡ０３１の免疫的反応性を有し、実質的に表１
    Ａに示される可変領域よりなる重鎖アミノ酸配列、およ
    び実質的に表１Ｂに示される可変領域よりなる軽鎖アミ
    ノ酸配列からなる抗体。 ４、該アミノ酸配列が全定常領域より少ないものよりな
    る請求項３に記載の抗体。 ５、該抗体はヒト抗体由来の定常領域よりなる請求項３
    に記載の抗体。 ６、請求項２に記載の抗体または該抗体の部分をコード
    する塩基配列の少なくとも部分よりなるＤＮＡ構造物。 ７、請求項２に記載の抗体を治療に効果的な量で投与す
    ることよりなる、哺乳動物の免疫システム調節のための
    方法。 ８、請求項３に記載の抗体を治療に効果的な量で投与す
    ることよりなる、哺乳動物の免疫システム調節のための
    方法。 ９、請求項５に記載の抗体を治療に効果的な量で投与す
    ることよりなる、哺乳動物の免疫システム調節のための
    方法。 １０、請求項２に記載の抗体を薬学的に受容できるキャ
    リヤーとともに含んでなる薬学的組成物。 １１、請求項３に記載の抗体を薬学的に受容できるキャ
    リヤーとともに含んでなる薬学的組成物。 １２、請求項２に記載の抗体を生産するハイブリドーマ
    細胞系。 １３、請求項３に記載の抗体を生産するハイブリドーマ
    細胞系。 １４、請求項４に記載の抗体を生産するハイブリドーマ
    細胞系。 １５、請求項２に記載の抗体と細胞毒性部分との結合物
    よりなるイムノトキシン。 １６、生化学または分子生物学的手法を用いて、アイソ
    トープまたはタンパク質を結合させた請求項２に記載の
    抗体。 １７、タンパク質が酵素である請求項１６に記載の抗体
    。 １８、さらにヒト可変領域配列と相同性をもつ可変領域
    の配列の少なくとも一部を有する請求項４に記載の抗体
    。 １９、ＢＭＡ０３１−ＥＵＣＩＶ１、ＢＭＡ０３１−Ｅ
    ＵＣＩＶ２、ＢＭＡ０３１−ＥＵＣＩＶ３およびＢＭＡ
    ０３１−ＥＵＣＩＶ４の群から選択される請求項１８に
    記載の抗体。 ２０、請求項１９に記載の抗体を生産するトランスフェ
    クションされた細胞系。
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