RO114980B1 - Molecula anticorp capabila sa se lege la antigena cd4, secventa de nucleotide, procedeu de preparare si metoda de tratament - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o moleculă de anticorp, capabilă să se lege la antigena CD4, la secvența de nucleotide care o codifică precum și la procedeul de preparare și metoda de tratament cu această moleculă de anticorp.

în prezenta descriere, termenul de Ig” este utilizat pentru imunoglobulinele naturale.

Imunoglobulinele naturale sunt cunoscute de mai mulți ani și cuprind o moleculă generală în formă de Y având o porțiune de legătură antigenică către capătul fiecărui braț superior. Partea rămasă din structură, și în special, tulpina de la Y, mediază de exemplu Fab, (Fab’)2, Fv și Fc ca fragmente care pot fi derivate prin clivaj enzimatic.

Igs naturale cuprind catene lungi și catene scurte, capetele N-terminale ale fiecărei perechi de catene lungi și scurte fiind asociate și formând porțiunile de legătură antigenică. Capetele terminale C ale catenelor lungi sunt asociate pentru a forma porțiunea Fc.

Denumirile de reziduuri pentru catenele lungi și scurte, date în prezenta descriere de invenție și revendicări, sunt în conformitate cu schema de numerotare Kabat. Astfel, denumirile de reziduuri nu corespund totdeauna direct cu numerotarea lineară a reziduurilor de aminoacizi. Secvența actuală lineară de aminoacizi poate conține reziduuri mai puține sau reziduuri de aminoacizi adiționale față de stricta numerotare Kabat, arătând astfel că acestea au fost înserate sau distruse. Aceste inserții sau distrugeri pot fi prezente oriunde în aceste catene. Numerotarea corectă a reziduurilor poate fi determinată pentru Ig dat prin aliniere la regiunile de homologie ale secvenței Ig cu secvența de numerotare standard Kabat.

Aceasta s-a determinat dintr-un studiu al secvențelor de aminoacizi al unui mare număr de Igs ca domenii variabile care sunt localizate la capetele N-terminale ale catenelor pentru ambele catene lungi și scurte conținând trei regiuni în care secvența de aminoacid este hipervariabilă. Aceste regiuni hipervariabile sunt flancate pe fiecare parte prin regiuni care variază mai puțin substanțial în secvență. S-a ajuns la concluzia că regiunile hipervariabile sunt cuprinse în legătura antigen.

Mult mai recent, studiile structurale utilizând raze X cristalografice și modele moleculare au definit trei regiuni în domenii variabile pentru fiecare din aceste catene lungi și scurte, care par a fi incluse în legătura antigenică. Aceste trei regiuni se referă în general la regiuni de determinare a complementarității (CDRs). CDRs sunt definite la un loc prin regiunile rămase la domeniile variabile pentru a forma cel puțin partea de legătură antigenică. Aceste regiuni rămase sunt în general referitoare la regiunile cadru.

Este de apreciat că unii lucrători în domeniu, și în special Kabat, s-au referit la regiunile hipervariabile ca fiind CDRs. Pentru scopul clarității, termenul de “regiune hipervariabilă” se utilizează numai pentru a descrie regiunile de legătură antigenică determinate prin analiza structurală.

O comparație a regiunilor hipervariabile, așa cum s-a determinat prin analiza secvenței și CDRs și așa cum s-a determinat prin studii structurale, arată că există o oarecare corespondență, dar nu completă, între aceste regiuni.

în prezenta descriere de invenție termenul de “anticorp” se utilizează pentru a descrie Igs sau fragmentele acestuia, a monomerilor cu catene lungi sau scurte sau dimerii și anticorpii cu catenă simplă, cum ar fi de exemplu o simplă catenă Pvs în care catena lungă și scurtă din domeniile variabile sunt legate prin linkeri de peptide dacă

RO 114980 Bl tehnologia ADN recombinat produs sau natural sau altfel, prevede ca anticorpul să includă cel puțin o parte de legătură antigenică. Partea rămasă din anticorp nu este necesar să cuprindă numai secvențele proteine derivate de la Ig. De exemplu, o genă poate fi construită din secvența de ADN codificată parțial la catena Ig umană este fuzionată la secvența de ADN codificată la secvența de aminoacid a polipeptidei efectoare 50 sau moleculei reportoare. Astfel, “anticorpul” cuprinde anticorpii hibrizi (vezi mai jos).

Prescurtarea “Mab” este utilizată pentru a indica anticorpul monoclonal așa cum este produs prin hibridoma sau prin linia celulară derivată.

Termenul de “anticorp recombinant” este utilizat pentru a descrie un anticorp produs printr-un procedeu, incluzând utilizarea tehnologiei recombinante a ADN. 55

Termenul de anticorp chimeric” este utilizat pentru a descrie un anticorp în care domeniile variabile, ca un întreg, sunt derivate din anticorp, de la specii de mamifere și au fost fuzionate în cel puțin un domeniu constant din anticorp din diferite specii de mamifere.

Termenul de “anticorp hibrid” este utilizat pentru a descrie o proteină care eo cuprinde cel puțin o porțiune de legătură antigenică a Ig atașată la polipeptida de legătură, la cel puțin o parte din proteină. Este de apreciat că anumite persoane care lucrează în domeniu pot utiliza termenul de “chimeric” pentru a descrie astfel de construcții, dar în prezenta specificație, astfel de construcții se referă la anticorpi hibrizi, și termenul de anticorpi chimerici este utilizat în același sens cum s-a definit mai sus. 65

Termenul de “anticorp grefat pe CDR” este utilizat pentru a descrie un anticorp având cel puțin unul, doi sau trei din CDRs într-unul sau în ambele domenii variabile derivate de la un anticorp din prima specie, părțile rămase derivate de Ig ale anticorpului fiind derivate de la unul sau de la mai mulți anticorpi diferiți. Domeniile variabile pot fi realizate prin utilizarea unei tehnologii recombinante a ADN-ului sau prin sinteza de 7 o polipeptide.

Termenul de “vector de exprimare” include vectorii care sunt capabili de exprimare a secvențelor de ADN conținând în ei de exemplu secvențe codificate care sunt operabil unite la alte secvențe capabile de efectuare a exprimării acestora. Un element uzual, dar nu totdeauna necesar (de exemplu celulele de insecte) al unui vector de exprimare 75 efectivă este un marker cu secvență codificată ca de exemplu o secvență codificată, o secvență de vector care rezultă într-o proprietate fenotipică (de exemplu rezistența la neomicină, rezistența la sulfoximina metioninică sau prototrofia triptofanului) a celulelor care conțin proteina, și permit acestor celule să fie real identificate. Pe scurt, termenul de “vector de exprimare” este dat ca definiție funcțională, și orice secvență de ADN este eo capabilă de efectuare a exprimării unui cod specificat conținut de ADN, astfel ca să fie aplicat la secvențe specificate. Astfel de vectori sunt frecvent, în formă de plasmide. O astfel de “plasmidă” și “vector de exprimare” sunt adesea utilizați interschimbabili. Totuși, invenția de față intenționează să includă astfel de forme de exprimare a vectorilor care servesc ca funcții echivalente și care pot, din timp în timp, să devină cunoscute în 8 5 literatura de specialitate, incluzând retrovirusurile, în sistemele vitro și altele asemănătoare.

Așa cum s-a menționat mai înainte, secvențele de ADN vor fi exprimate în celule gazdă după ce secvențele au fost operabil unite la (de exemplu poziționate pentru a asigura funcționarea lor] secvența control de exprimare. Acești vectori de exprimare sunt 90

RO 114980 Bl tipic replicabili în organismele gazdă, fie ca epizomi sau ca parte integrală a ADN-ului gazdă cromozomială.

Termenul de “celule gazdă recombinante” se referă la celulele care au fost transformate cu vectorii construiți, utilizându-se tehnici de recombinare a ADN-ului. Datorită acestei transformări, celula gazdă este capabilă de a produce produsul dorit în cantitățile utilizate, mai degrabă decât în cantități mai mici sau mai comune; în cantități mai mici decât cele detectabile sau comune, așa cum este de așteptat să se producă prin gazda netrasformată.

în descrierea procedeului pentru izolarea anticorpilor din gazdele recombinante, termenul de “celulă” și “cultură de celulă” se utilizează interschimbabil pentru a arăta sursa de anticorpi mai ales dacă nu este clar specificat. Cu alte cuvinte, recuperarea unui anticorp din “celule poate însemna fie prin îndepărtatea celulei întregi, fie izolarea din cultura celulară care conține atât mediul cât și celulele suspendate sau adițional, așa cum este posibil în cazul liniei celulare mieloma din cultura de ascite.

Igs naturali au fost utilizați în analiza de diagnoză și, până la o extindere mult mai limitată, în terapie. Cu toate acestea, astfel de utilizări, în special, au fost împiedicate de natura policlonală a Igs naturale. O fază semnificativă către realizarea potențialului Igs ca agenți terapeutici este descoperirea tehnicilor de preparare a MAbs de specificități definite. MAbs sunt în general produse prin fuziunile celulelor splenice de rozătoare cu celule mieloma de rozătoare, și astfel sunt în esență proteine de rozătoare. Totuși, există foarte puține referiri la producerea cu succes a MAbs umani. O serie de MAbs având specificități pentru antigeni pe limfocitele T și subseturile de limfocite T, se descrie în literatura de specialitate.

Deoarece mult mai convenabil pentru MAbs este ca să fie în întregime de origine de rozătoare, acestea sunt de natură antigenică la oameni și astfel se poate obține un răspuns imun nedorit, cum ar fi de exemplu un răspuns denumit HAMA (răspuns anticorp anti-șoarece uman. De aceea utilizarea MAbs de rozătoare ca agenți terapeutici la om este inerent limitată, prin faptul că subiectul uman poate determina un răspuns imunologic la MAb și acesta va fi, fie complet îndepărtat sau cel puțin redus ca efectivitate. Astfel, în practică, MAbs la origine de rozătoare nu se recomandă în general pentru utilizare la pacienți pentru mai mult decât unul sau câteva tratamente, ca un răspuns HAMA care se poate dezvolta, redând ineficacitatea MAb cât și ducând la creșterea unor reacții secundare nedorite.

Au fost făcute propuneri pentru redarea la oameni a MAbs mai puțin antigenic. Astfel de tehnici pot fi în general denumite “tehnici de umanizare”. Aceste tehnici cuprind în general utilizarea tehnologiei recombinante a ADN-ului pentru a manipula secvențele de ADN, codificând catenele de polipeptide ale moleculei anticorp.

în anii recenți, avansurile în biologia moleculară este bazată pe producerea unei game largi de polipeptide heteroloage prin transformarea celulelor gazdă cu secvențe de ADN heteroloage care codifică pentru producerea produșilor doriți.

în literatura de specialitate se propune construirea unor vectori recombinanți de ADN cuprinzând o secvență de ADN care se codifică pentru domeniul variabil al catenei lungi sau scurte a Ig specifice pentru un ligand predeterminat. Secvența de ADN este prevăzută cu codoane de inițiere și terminație la cel puțin termenii de 5' și respectiv 3', dar se leagă de orice nucleotide codificate pentru aminoacizii superflu în domeniul variabil. Secvența ds a ADN-ului este utilizată pentru transformarea celulelor bacteriene.

RO 114980 Bl

Aplicarea nu contemplează variațiile de secvență a domeniului variabil.

Tot în literatura de specialitate se descrie clonizarea și exprimarea organismelor gazdă bacteriene a genelor pentru întreaga sau parțiala catenă umană de polipeptidă cu catenă lungă IgE, dar aceasta nu contemplează variațiile în secvența polipeptidei. 140

Se propune utilizarea tehnicilor de ADN recombinant în celule bacteriene pentru a produce Igs care sunt analoage cu cele găsite în mod normal în sistemele vertebrate și care au avantaj în tehnicile de modificări ale genei propuse în prezenta descriere de invenție pentru construirea anticorpilor chimerici sau alte forme modificate de anticorpi.

Se crede că propunerile făcute mai sus prin, aplicație de tehnică genetică, nu 145 conduc la exprimarea oricăror cantități semnificative de catene polipeptidice Ig și nici la producerea activității Ig, de asemenea nici la secreția și la asamblarea catenelor în anticorpii chimerici doriți.

Urgența recentă a acestor tehnici permite introducerea stabilă a genei Ig la ADN, în celulele de mamifere care deschide posibilitatea utilizării in vitro a mutagenezei și 150 transfectarea ADN-ului la construcția de anticorpi recombinanți care posedă proprietăți noi.

Totuși, se cunoaște că funcția moleculei de anticorp este dependentă de structura sa tridimensională care în schimb este dependentă de secvența sa primară de aminoacid. Astfel, schimbând secvența de aminoacid a anticorpului poate afecta advers 155 activitatea sa. Mai mult decât atât, o schimbare a secvenței de ADN codificând pentru anticorp poate afecta abilitatea celulei care conține secvența ADN pentru a exprima, a secreta sau a asambla anticorpi.

De aceea nu este totul clar că, va fi posibil să se producă anticorpi funcționali modificați prin tehnici recombinante ale ADN-ului. Cu toate acestea, s-a prezentat un 160 procedeu prin care anticorpii hibrizi, în care ambele părți ale proteinei sunt funcționale, pot fi secretați. Acest procedeu este descris în PCT/GB85/00392. Totuși, aplicația PCT de mai sus arată numai producerea anticorpilor hibrizi în care domeniile variabile complete sunt codificate pentru prima parte a secvenței de ADN. Aceasta nu arată anticorpi hibrizi în care secvența domeniului variabil a fost modificată. ies

EP-A-0239400 descrie un procedeu în care CDRs a MAb la șoarece a fost grefat în regiunile cadru ale domeniilor variabile ale Ig uman prin mutageneză directă parțială utilizându-se oligonucleotide lungi. Inventatorii admit posibilitatea de modificare a secvenței naturale de aminoacizi a regiunilor cadru.

Au fost de asemenea efectuate lucrări mai recente privind modificarea MAbs prin 170 grefare CDR pe antigeni sintetici de recunoaștere MAbs, ca de exemplu antigenii NP sau NIP. Totuși, exemplele în care un lizozom de recunoaștere MAb la șoarece și un antigen de recunoaștere MAb la șobolan, pe celulele T umane respectiv, sunt umanizați prin grefare pe CDR, sunt prezentate în literatura de specialitate.

Se mai știe că transferul clonei CDRs (așa cum s-a definit în prezenta descriere 175 de invenție) nu este suficient pentru a prevedea o activitate de legare antigenică satisfăcătoare în produsul grefat pe CDR. Referințele din literatura de specialitate arată că este necesar să se convertească un reziduu de serină la poziția 27 a secvenței umane la reziduul de fenilalanină corespunzător la șobolan pentru a obține un produs grefat pe CDR având o activitate de legare antigenică satisfăcătoare. Aceste reziduu la poziția 27 iso a catenei lungi este un lanț adiacent structural la CDR1. □ construcție ulterioară care conține adițional o serină umană la tirozina de șobolan care se schimbă în poziția 30 a

RO 114980 Bl catenei lungi, neavând o activitate de legare semnificativ modificată față de anticorpul grefat pe CDR cu serina la schimbarea în fenilalanină la poziția 27 numai. Aceste rezultate arată că anticorpii grefați pe CDR recunosc antigeni mult mai complecși, iar prin schimbările în reziduuri a secvenței umane din afara regiunilor CDR, în special în lanțul adiacent la CDR1, poate fi necesar să se obțină o activitate de legare antigenică efectivă.

Aceste tehnici au fost așadar recent descrise pentru modificarea unui anticorp monoclonal anti-TAC, prin grefare pe CDR. Regiunile cadru umane sunt alese pentru a maximaliza homologia cu secvența anticorp anti-TAC, în timp ce aminoacizii adiționali din afara CDRs sunt reținuți. Anticorpii anti-TAC astfel modificați au o afinitate pentru catena p55 a interleukinei-2 umane, de aproximativ o treime față de murina anti-TAC.

PCT/US89/05857 descrie așadar anticorpii grefați pe CDR, care sunt specifici pentru proteina p55 TAC a receptorului IL-2. Este stabilit că anticorpul grefat pe CDR poate cere ca trei sau mai multe reziduuri aminoacide din donorul Ig în adiție la CDRs, de obicei la cel puțin unul care este imediat adiacent la CDR în Ig donor, să fie schimbați pentru a corespunde cu cel al anticorpului donor în vederea obținerii activității de legare antigenică.

Este deci real aparent că nu este o problemă simplă de a produce un anticorp grefat pe CDR. Adesea nu este suficient, mai mult, să grefezi CDRs din donorul Ig în regiunile cadru din acceptorul Ig. De asemenea este necesar să se modifice reziduurile în regiunile cadru ale anticorpului acceptor în vederea obținerii activității de legare. Cu toate acestea, nu este posibil să se aprecieze, pe baza datelor prezentate până acum în literatura de specialitate, în care este necesar ca reziduurile cadru să fie modificate.

EP-A-O 018794 descrie un MAb murinic care recunoaște o caracteristică antigenică a celulelor T umane helper. Un exemplu special al acestui MAb este descris în descriere și este desemnat ca 0KT4. Antigenul se recunoaște în general ca fiind referitor la antigenul CD4. MAb este corespunzător comercial. De asemenea convenabil este și murina MAb cunoscută ca 0KT4A. Aceasta recunoaște un epitop diferit pe antigenul CD4 din unul recunoscut de către 0KT4.

Experimentele de transplantare la primate au fost indicate ca fiind 0KT4 și 0KT4A care se pot extinde prin supraviețuire prin grefare și pot fi utilizate ca imunomodulatori umani. Experiența de la tratamentul pacienților cu transplant renal cu murină MAb 0KT3 arată că uneori o populație de pacienți dezvoltă neutralizarea anticorpilor la OKT3. Acest răspuns de imunizare exclude administrarea repetată. Pentru a scade răspunsul imun anticipat la murină anti-CD4 MAbs, este de dorit să se producă o versiune grefată pe CDR a 0KT4A având murina CDRs și cadrul uman și alte regiuni derivate Ig.

Totuși, așa cum este descris mai sus, simpla apropiere la construcția anticorpului grefat pe CDR nu rezultă întotdeauna într-un anticorp care în mod efectiv se leagă la antigen. Reziduurile exacte care cuprind CDRs sunt dificil de definit, și acestea nu corespund în mod necesar la toate reziduurile în regiunile hipervariabile. Pot exista, de asemenea, reziduurile critice ale cadrului care sunt importante în poziționarea CDRs pentru interacțiunea cu antigenul sau care includ catene lungi și catene scurte în aceste interacțiuni. Este necesar să se modifice anumite reziduuri cadru astfel ca acestea să corespundă la reziduurile muriniceîn aceste poziții, redând anticorpul grefat pe CDR mai puțin “uman” în caracter.

RO 114980 Bl

Molecula anticorp, capabilă să se lege la antigena CD₄, în conformitate cu prezenta invenție, constă în aceea că, în domeniul variabil al numitei catene lungi compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant de la un anticorp uman (acceptor) 230 și cel puțin reziduurile 23, 24, 26 până la 35, 49 până la 65 și 95 până la 102, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un al doilea anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece (donor) așa cum se arată în fig.3, iar în domeniul variabil al numitei catene scurte compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant dintr-un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 24 până la 34, 49 235 până la 56 și 89 până la 97, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece(donor) așa cum se arată în fig. 4. în domeniul variabil al numitei catene lungi compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant de la un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 23, 24, 26 până la 35, 49 până la 65 Si 95 până la 102, conform cu sistemul de 240 numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un al doilea anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece (donor) așa cum se arată în fig.3. Reziduurile 6 și 48 din catena lungă compozită corespund suplimentar reziduurilor din anticorpul donor. Reziduurile 71, 73 și 79 din catena lungă compozită corespund suplimentar reziduurilor echivalente din anticorpul donor. Oricare din toate combinațiile reziduurilor 57, 58, 60, 88 și 91 din 245 catena lungă compozită corespund reziduurilor echivalente din anticorpul donor. Reziduul acceptor din catena lungă compozită corespunde reziduurilor echivalente din catena lungă KOL umană, așa cum se arată în fig.5. Catena scurtă complementară este o catena scurtă compozită, în care în domeniul variabil al acestei catene scurte compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant de la un prim anticorp (acceptor) și cel puțin 250 reziduurile 24 până la 34, 49 până la 56 și 89 până la 97, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece (donor) așa cum se arată în fig.4. în domeniul variabil al numitei catene scurte compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant dintr-un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 24 până la 34, 49 până la 56 și 89 până la 97, 255 conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece(donor) așa cum se arată în fig. 4. Reziduul 89 din catena scurtă compozită corespunde suplimentar reziduului echivalent din anticorpul donor. Reziduurile acceptoare din catena scurtă compozită corespund reziduurilor echivalente din catena scurtă REI umană, așa cum se separă arată în fig. 6. Molecula 260 anticorp are o afinitate pentru antigena CD4 de la 1O⁵.M’¹ până la 1O¹².M'¹. Molecula anticorp are o afinitate pentru antigena CD4 de cel puțin 1Ο^Θ.Μ'¹. Molecula anticorp are o afinitate pentru antigena CD4 similară cu cea a 0KT4A. Molecula anticorp este un Ig completă și este izotip lgG₄. Unul sau mai multe reziduuri din domeniile constante ale Ig au fost modificate în scopul alterării funcțiunilor efectoare ale domeniilor constante. 265 Molecula anticorp este obținută prin utilzarea tehnologiei ADN recambinante și se utilizează în terapie, și anume în tratamentul respingerilor de grefă sau în tratamentul tulburărilor celulelor T helper.

Secvența de nuceotide codifică o catenă de anticorp compozită, așa cum aceasta este definită mai înainte și este prezentată în fig. 1 și fig. 2. 220

Procedeul pentru prepararea moleculei anticorp capabile să se lege la antigena CD₄, în conformitate cu prezenta invenție cuprinde:

RO 114980 Bl

a) furnizarea unei prime secvențe ADN, care codifică o catenă lungă compozită, așa cum aceasta este definită mai sus sau o catenă scurtă compozită de asemeneaașa cum aceasta este definită mai sus, sub controlul elementelor corespunzătoare din partea superioară și inferioară;

b) transformarea celulei gazdă cu prima secvență ADN; și

c) cultivarea celulei gazdă transformate astfel încât să se producă o moleculă anticorp conform cu cele prezentate mai sus.

Procedeul mai cuprinde

a) furnizarea unei a doua secvențe ADN, care codifică o catenă scurtă sau lungă de anticorp complementară față de prima catenă, sub controlul elementelor corespunzătoare din partea superioară și inferioară;

b] transformarea celulei gazdă atât cu prima cât și cu cea de a doua secvență ADN. Cea de a doua secvență ADN codifică o catenă de anticorp compozită. Prima și a doua secvență ADN sunt prezente în același vector. Secvențele sunt sub controlul acelorași elemente superioare și/sau inferioare diferite. Prima și a doua secvențe ADN sunt prezente în vectori diferiți. Celula gazdă este o celulă CHO.

Metoda pentru tratamentul respingerii unei grefe sau a unei afecțiuni a celulei T helper, în conformitate cu prezenta invenție, constă în aceea că, intervenția asupra organismului viu se realizează direct cu un anticorp grefat CDR, conform celor de mai sus, împreună cu un purtător sau suport acceptabile din punct de vedere farmaceutic, administrat pe căi convenționale, într-o doză zilnică de D,OD4 până la 5 mg/kilocorp, de preferință de la 0,05 până la 2 mg/kilocorp.

Abordând problemele inerente, în producerea unui anticorp specific grefat pe CDR, într-o întruchipare preferată a prezentei invenții, s-a procedat la producerea anticorpului grefat pe CDR bazat pe regiunile cadru umane și având o porțiune de legătură antigenică care recunoaște antigenul CD₄. într-o întruchipare specială preferată, anticorpul grefat pe CDR are o afinitate pentru antigenul CD₄ similară cu cea a murinei MAb 0KT4A.

De aceea, conform prezentei descrieri de invenție, se prevede un anticorp grefat pe CDR având cel puțin o catenă în care regiunile cadru sunt predominant derivate din anticorpul prim (acceptor) și cel puțin o CDR care este derivată din al doilea anticorp (donor), anticorpul grefat pe CDR fiind capabil de legare la antigenul CD4.

De preferință catena grefată pe CDR are două și, mult mai preferabil, toate trei CDRs derivate din anticorpul donor. în mod avantajos, în catena grefată pe CDR, fiecare CDR cuprinde o compoziție CDR care conține toate reziduurile din CDR și toate reziduurile din regiunea hipervariabilă corespunzătoare a anticorpului donor.

De preferință, cel puțin un reziduu din reziduurile regiunilor cadru cu catenă grefată pe CDR a fost modificat, astfel ca să corespundă la un reziduu echivalent în anticorp.

De preferință, regiunile cadru ale catenei grefate pe CDR sunt derivate din anticorpul uman.

în mod avantajos, regiunile cadru ale catenei grefate pe CDR sunt derivate din catena lungă Ig umană. Pentru astfel de catene lungi, se preferă ca reziduul 35 în catena din aceste regiuni să fie modificat astfel ca acesta să corespundă la un reziduu echivalent din anticorpul donor.

RO 114980 Bl în mod avantajos, pentru astfel de catene lungi se preferă cel puțin o compoziție CDR care cuprinde reziduurile 26 până la 35, 50 până la 65 sau 95 până la 102 respectiv, care este grefată pe cadrul uman. Este de apreciat în acest caz că reziduul 320 35 va corespunde deja la reziduul echivalent din anticorpul donor.

De preferință, reziduurile 23, 24 și 49, în astefl de catene lungi corespund la reziduurile 6, 23, 24, 48 și 49 la anticorpul donor în pozițiile echivalente de reziduuri. Dacă se dorește, reziduurile 71, 73 și 79 pot așadar să corespundă.

într-o afinitate de optimizare, oricare sau orice combinație a reziduurilor 57, 58, 325

60, 88 și 91 pot corespunde la reziduul echivalent din anticorpul donor.

Catena lungă este de preferință derivată din catena lungă umană KOL. Totuși, aceasta poate fi de asemenea derivată din catena umană NEWM sau EU.

în mod alternativ, regiunile cadru sau catenele grefate pe CDR pot fi derivate din Kappa uman sau catena scurtă lambda. Pentru o astfel de catenă scurtă, în mod 330 avantajos cel puțin o compoziție CDR cuprinde reziduurile 24 până la 34, 50 până la 56 sau 89 până la 97 respectiv și se grefează pe cadrul uman. De preferință, reziduul 49 corespunde așadar la reziduul echivalent din anticorpul donor.

Pentru o afinitate de optimizare ulterioară, se preferă să se asigure ca reziduurile 49 și 89 să corespundă la reziduurile echivalente din anticorpul donor. Este de 335 asemenea de dorit să se selecteze reziduurile donoare echivalente care formează săruri de legături.

Catena scurtă este, de preferință, derivată din catena scurtă umană REI. Totuși, aceasta poate fi de asemenea derivată din catena scurtă EU umană.

De preferință, anticorpul grefat pe CDR, conform prezentei descrieri de invenție, 340 cuprinde o catenă scurtă și o catenă lungă, de preferință una sau ambele care au fost grefate pe CDR în conformitate cu principiile stabilite mai sus pentru catenele lungi și scurte individuale.

într-un caz preferat, este avantajos ca toate trei CDRs de pe catena lungă să fie modificate, și ca modificarea minimală să fie realizată pe catena scurtă. Este de 345 asemenea posibil să se modifice una, două sau niciuna din catenele scurte CDRs și să se rețină încă afinitatea de legare la un nivel rezonabil.

Este de apreciat că în unele cazuri, reziduurile donoare și acceptoare atât pentru catenele lungi cât și pentru catenele scurte, pot fi identice la o poziție specială și astfel nu este necesară nici o schimbare a reziduului cadru acceptor. 35c

De asemenea, este de apreciat că, în vederea reținerii cât mai mult posibil a naturii umane a anticorpului grefat pe CDR, vor fi efectuate pe cât posibil câteva schimbări de reziduu. Este de asemenea de menționat că în multe cazuri, nu va fi necesar să se schimbe mai mult decât CDRs și un număr de reziduuri cadru. Numai în cazuri excepționale, va fi necesar să se schimbe un număr mai mare de reziduuri cadru. 355

De preferință, anticorpul grefat pe CDR este un Ig complet, ca de exemplu izotopii IgG sau lgG4.

Dacă se dorește, unul sau mai multe reziduuri în domeniile constante ale Ig pot fi schimbate în vederea modificărilor funcțiilor efectoare ale domeniilor constante.

De preferință, anticorpul grefat pe CDR are o afinitate pentru antigenul CD4 între 360 aproximativ 1O⁵.M’¹ până la aproximativ 1Ο¹².Ι\/Γ¹, mult mai preferat la cel puțin 10P.Γχ/Γ¹ și cel mai preferat este ca afinitatea să fie similară cu cea a MAb 0KT4 sau 0KT4A.

RO 114980 Bl în mod avantajos, fiecare din CDR este derivat dintr-un anticorp de mamifere și de preferință este derivat de la MAb murinic.

în mod avantajos, anticorpul grefat pe CDR din prezenta descriere de invenție este produs prin utilizarea tehnologiei ADN recombinant.

Conform cu aspectul al doilea al prezentei descrieri de invenție, se face referire la o metodă de producere a anticorpului grefat pe CDR conform cu primul aspect al prezentei descrieri de invenție, metodă care cuprinde: prevederea unei prime secvențe a ADN, care codifică o primă catenă anticorp în care regiunile cadru sunt predominant derivate dela primul anticorp (acceptor) și cel puțin o CDR este derivată de la al doilea anticorp (acceptor) sub controlul curenților convenabili și elementelor care circulă în partea superioară și în partea inferioară; se transformă o celulă gazdă cu secvența primă a ADN-ului și se aduce în cultură celulele gazdă transformate astfel ca un anticorp grefat pe CDR, conform primului aspect al prezentei descrieri de invenție, să se producă.

De preferință, metoda cuprinde în continuare: prevederrea unei secvențe secundare a ADN-ului, codificând a doua catenă complementară a anticorpului, sub controlul elementelor corespunzătoare în sensul superior și inferior de acțiune; transformarea celulei gazdă atât cu prima cât și cu a doua secvență a ADN-ului.

în mod avantajos, secvența a doua conține ADN codificând al doilea anticorp la catena în care regiunile cadru sunt predominant derivate dintr-un prim anticorp (acceptor) și cel puțin un CDR este derivat din cel de-al doilea anticorp (donor).

Prima și a doua secvență de ADN poate fi prezentă pe același vector. în acest caz, secvențele pot fi sub controlul acelorași sau diferitelor elemente în sens superior și/sau inferior.

în mod alternativ, prima secvență și cea de a doua secvență a ADN-ului poate fi prezentă pe vectori diferiți.

Conform celui de al treilea aspect al prezentei descrieri de invenție, se face referire la o secvență de nucleotidă care codifică o catenă de anticorp în care regiunile cadru sunt predominant derivate din primul anticorp (acceptor) și cel puțin un CDR care este derivat din cel de-al doilea anticorp (donor), catena de anticorp fiind capabilă de formarea unui anticorp grefat pe CDR conform primului aspect al prezentei descrieri de invenție.

Este de menționat că anticorpii grefați pe CDR conform prezentei descrieri de invenție vor deveni de un uz special în terapie, în special în tratarea rejecțiilor de grefe sau în tratamentul tulburărilor celulare de helper T.

Anticorpii grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenție, pot produce printr-o varietate de tehnici, cu exprimare în celule transfectate, cum ar fi, de exemplu, drojdia, insectele, CHO sau celulele mieloma care sunt preferate. Mult mai preferat este ca celula gazdă să fie o celulă gazdă CHO.

Pentru desemnarea anticorpului grefat pe CDR, este mai întâi necesar să se precizeze că secvența din domeniul variabil al anticorpului are proprietățile de legare dorite. Surse de celule convenabile pentru astfel de secvențe ale ADN-ului includ sursele provenite de la vertebrate, altele decât mamifere și de la, ca de exemplu păsări, șoareci, șobolani și iepuri, de preferat fiind șoarecii. Secvențele din domeniul variabil (V_H și V_L] pot fi determinați din catenele lungi și scurte ale cDNA, sintetizate din ARN-ul respectiv prin tehnici generale cunoscute în literatura de specialitate. Regiunile hipervariabile pot fi apoi determinate utilizându-se metoda Kabat. CDRs pot fi determinate prin analiza structurală,

RO 114980 Bl utilizându-se cristalografia cu raze X sau tehinicle de modelare moleculare. O compoziție CDR poate fi apoi definită ca conținând toate reziduurile într-un CDR și toate reziduurile 410 în regiunea hipervariabilă corespunzătoare. Aceste compoziții de CDRs, împreună cu anumite rezidii selectate din regiunea cadru, sunt de preferință transfectate ca “părți de legături antigenice” în timp ce restul de anticorp, cum ar fi catenele lungi și scurte din domeniile variabile constante și regiunile cadru rămase, pot fi bazate pe anticorpi umani ai diferitelor clase. Domeniile constante pot fi selectate pentru a avea funcțiile efectoare 415 dorite, corespunzătoare pentru utilizarea intenționată a anticorpului astfel obținut. De exemplu, izotopii IgG umani, lgG1 și lgG3 sunt efectivi pentru fixarea complementară și liza celulelor mediate. Pentru alte scopuri, alți izomeri cum ar fi lgG2 și lgG4 sau alte clase, cum ar fi IgM și IgE, pot fi mult mai convenabile.

Pentru terapia umană, este de dorit în special să se utilizeze izotopi umani, pentru 420 a minimiza răspunsurile antiglobulinei în timpul terapiei. Secvențele de ADN din domeniul constant uman, de preferință în conjuncție cu bazele lor în cadru variabil, pot fi preparate în conformitate cu procedeele bine cunoscute. Un exemplu din acestea este CAMPATH 1H.

în conformitate cu întruchipările preferate ale prezentei descrieri de invenție, 425 anumiți anticorpi grefați pe CDR sunt prevăzuți să conțină modificări selectate la regiunea cadru asemănătoare cu cea umană (cu alte cuvinte, domeniile variabile din afara CDRs), rezultând într-un anticorp grefat pe CDR cu afinitate de legare satisfăcătoare. O astfel de afinitate de legătură este de preferință de la aproximativ 1O⁵.M¹ la aproximativ 1O¹².M'¹ și este mult mai preferat la cel puțin aproximativ Itf.M¹. Mult mai preferabilă 430 este afinitatea de legătură aproximativ egală cu cea a 0KT4A MAb murinic.

în construcțiile de anticorpi grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenție, segmentele genei V_H și/sau V_L pot fi modificate prin mutageneză. Așa cum este menționat în literatura de specialitate, este de înțeles că diferite alte nucleotide codificând reziduurile de aminoacizi sau secvențele care sunt conținute în porțiunea Fc 435 sau alte zone ale anticorpului, pot fi modificate într-o manieră asemănătoare.

Tehnicile exemplare includ în plus, distrugerea sau substituirea neconservativă a numărului limitat de deferite nucleotide sau substituirea conservativă a multelor nucleotide, cu condiția ca să se mențină citirea cadru.

Substituțiile, distrugerile, inserțiile sau orice subcombinație pot fi utilizate pentru 440 a se ajunge la construcția finală. Deoarece există 64 secvențe codonul posibile, dar numai douăzeci de aminoacizi cunoscuți, codul genetic este degenerat în sensul că diferitele codoane pot produce aceeași aminoacizi. Cu toate acestea, codunul este precis pentru fiecare aminoacid. Astfel există cel puțin un codon pentru fiecare aminoacid, de exemplu fiecare codon produce un aminoacid simplu și nu altul. Este clar că în timpul 445 translației, cadrul de citire propriu trebuie să fie menținut în vederea obținerii secvenței de aminoacid în polipeptida produsă ca fiind ultima.

Tehnicile de adiție, distrugerile sau substituirile la porțiunile de aminoacizi predeterminate având secvențe cunoscute, sunt bine cunoascute în literatura de specialitate. Tehnicile exemplare includ mutageneza parțială directă cu oligonucleotide 450 mediate și reacția de polimerizare în lanț.

Mutageneza directă parțială cu oligonucleotide cuprinde în esență hibridizarea oligonucleotidei codificate pentru mutația dorită cu un simplu filament de ADN care conține regiunea care trebuie să fie mutată și utilizând un filament simplu ca model,

RO 114980 Bl pentru extinderea oligonucleotidelor pentru a produce un filament conținând mutația. Această tehnică, în diferite forme, este descrisă în referințele din literatura de specialitate.

Reacția polimerazei în lanț (PCR) este în esență o amplificare a ADN-ului in vitro, utilizându-se secvența specifică oligonucleotidelor. Oligonucleotidele pot fi incorporate ca secvențe modificate, dacă se dorește. Tehnica reacției în lanț a polimerazei (PCR) este descrisă în literatura de specialitate. Exemple de mutageneză care utilizează tehnica reacției în lanț a polimerazei (PCR) sunt descrise în literatura de specialitate.

Secvențele nucleotidei, conform prezentei descrieri de invenție, capabile de o exprimare ultimă a anticorpilor grefați pe CDR doriți, pot fi formați într-o varietate a diferitelor polinucleotide (ADN genomic, cADN, ARN sau oligonucleotide sintetice). în prezent, este de preferat ca secvența de polinucleotidă să cuprindă o fuziune a cADN și a ADN-ului genomic. Secvența de polinucleotidă poate codifica diferite componente Ig (de exemplu domeniile V, J, D și C). Acestea pot fi construite printr-o varietate de diferite tehnici. Unind secvențele de cADN și genomice corespunzătoare, cea mai comună metodă de producere este prezentă, dar secvențele de cADN pot fi de asemenea utilizate (cunoscut din literatura de specialitate).

Anumiți vectori de exprimare convenabili și celulele gazdă sunt descriși, de asemenea, în literatura de specialitate.

Vectorii și metodele descrise în prezenta invenție sunt convenabile pentru utilizare în celulele gazdă într-o gamă largă de organisme procariotice și eucariotice.

în general, desigur, procarioticele sunt preferate pentru clonizarea secvențelor de ADN pentru construirea vectorilor utilizați în prezenta descriere de invenție. De exemplu, Eschierichia coli DH5a este utilizată în special. Acest exemplu desigur este prezentat cu intenția de a fi ilustrativ, mai degrabă decât limitativ.

Procarioticele pot fi de asemenea utilizate pentru exprimare. Speciile de E.co//mai sus menționate, bacilii de tipul Bacillus subtilis și alte enterobacteriacee, ca de exemplu Salmonella typhimurium sau Serratia marcesans și diferitele specii de Pseudomonas pot fi utilizate.

în general vectorii plasmidelor conținând repliconul și secvențele de control, care sunt derivate din specii compatibile cu celula gazdă, sunt utilizate în legătură cu aceste gazde. Vectorul de obicei poartă o porțiune de replicație ca și secvențe de marcare care sunt capabile de o selecție fenotipică prevăzută pentru celulele transformate. De exemplu, E.coli este tipic transformată utilizându-se unul din mulții derivați de pBR322, un plasmid derivat de la speciile de E.coli. pBR322 conține genele pentru rezistența la ampicilină și la tetraciclină și astfel sunt prevăzute mijloace de analiză pentru identificarea celulelor transformate. Plasmidul pBR322, descendenții acestuia sau alte plasmide microbiene pot conține așadar sau pot fi modificate pentru a conține promotori care pot fi utilizați de către organismele microbiene pentru exprimarea proteinelor recombinante. Acei promotori comuni utilizați în construcția recombinantă de ADN, includ sistemele promotoare de lactoză până la/și sistemele promotoare de triptofan (Trp).

în timp ce acestea sunt utilizate mult mai comun, alți promotori microbieni au fost descoperiți și utilizați, detaliile privind secvențele lor de nucleotide fiind publicate, făcând capabil pe lucrătorul din acest domeniu de a-i lega funcțional la vectorii plasmidelor.

în plus față de microbii procariotici, eucarioticii, cum ar fi de exemplu culturile de drojdie, pot fi de asemenea utilizați. Saccharomyces cerevisiae sau drojdia de bere

RO 114980 Bl comună este mult mai uzual întrebuințată printre microorganismele eucariotice, de altfel un număr de alte specii sunt convenabile. Pentru exprimare în Saccharomyces, plasmidele YR_p7 de exemplu, se utilizează de obicei. Acest palsmid conține deja gena trpl care prevede o selecție a markerului pentru o specie de drojdie mutantă lipsind abilitatea de dezvoltare în triptofan, de exemplu ATCC 44076 sau PEP4-1. Prezența leziunii de trpl 505 ca o caracteristică a celulelor genomice de drojdie ca gazdă prevede o zonă efectivă de detectare a transformării prin dezvoltarea în absența triptofanului.

Secvențele promoționale convenabile în vectorii de drojdie includ promotorii pentru 3-fosfoglicerat chinaza sau alte enzime glicolitice, cum ar fi exemplu enolaza, gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenaza, hexochinaza, piruvat decarboxilaza, fosfofructo- 510 kinaza, glucozo-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat chinaza, triofosfat izomeraza, fosfoglucoza și glucochinaza. în construcția plasmidelor de exprimare convenabile, secvențele terminației asociate cu aceste gene sunt așadar legate la vectorul de exprimare 3' al secvenței dorite a fi exprimată pentru a prevedea poliadenilarea mARN și terminația. Alți promotori care au un avantaj adițional de 515 transcripție controlată prin condițiile de dezvoltare, sunt regiunile promotoare pentru alcool dehidrogenaza 2,izocitocromul C, acid fosfataza, enzimele degradative asociate cu metabolismul de azot și gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenaza menționate mai sus, o enzimă responsabilă de utilizarea maltozei și galactozei. Orice vector plasmid conținând un promotor compatibil de drojdie, origina în replicație și secvențele terminației sunt 520 convenabile.

în adiție la microorganisme, culturi celulare derivate din organisme multicelulare pot fi utilizate ca gazdă. în principiu, orice cultură celulară este utilizabilă, când este provenită din vertebrate sau din organisme de nevertebrate. Mai mult decât atât, interesul a fost mărit la cultura de celule provenită de la vertebrate, la fel ca și 525 propagarea celulelor de vertebrate în culturi (cultură de țesuturi), ceea ce a devenit un procedeu de rutină în anii recenți. Ca exemple se dau linii celulare gazdă, care sunt utilizate, cum ar fi VERO, HeLa, ovarul de hamster chinezesc (CHO), W138, BHK, COS7, MDCK și liniile celulare mieloma. Vectorii de exprimare pentru astfel de celule pot include (dacă este necesar) o origină corespunzătoare a replicației, ca și un promotor 530 localizat în fața genei care trebuie exprimate, împreună cu orice porțiuni de legătură ribozomică necesară, porțiuni de legătură cu ARN, porțiuni de poliadenilare și secvențe transcrispționale terminatoare.

Pentru utilizarea celulelor de mamifere, funcțiile de control pe vectorii de exprimare sunt adesea prevăzuți prin materiale virale. De exemplu, promotorii utilizați de 535 obicei sunt derivați de la Cytomegalovirusul uman (HCMV), virusul Polyoma, Adenovicusul 2 și mult mai frecvent virusul Simian 40 (SV40). Promotorii dintâi și cei întârziați ai virusului SV40 sunt utilizați în special, deoarece ambii sunt obținuți ușor din virus, ca un fragment care conține așadar originea virală SV40 a replicației. Mai departe, este de asemenea posibil și adesea de dorit să se utilizeze secvențele de control și promotoare 540 asociate normal cu secvența genei dorite,prevăzându-se un astfel de control pentru secvențe compatibile cu sistemul celular gazdă.

origine a replicației se poate prevedea fie prin construirea vectorului pentru a include o origină exogenă, ca de exemplu cea care poate fi derivată din SV40 sau alți viruși (de exemplu virusul Polyoma, Adenovirusul, VSV sau BPV) ca sursă, sau se pot 545 prevedea prin mecanismul de replicație cromozomială a celulei gazde. Dacă vectorul este

RO 114980 Bl integrat în cromozomul din celula gazdă, acesta din urmă este de obicei suficient.

Vectorii conținând segmentele de ADN de interes (de exemplu secvențele codificate cu catene lungi și scurte și secvențele de exprimare de control), pot să fie transferate în celulele gazdă prin metode bine cunoscute, care variază dependent de tipul gazdei celulare. De exemplu, transfectarea clorurii de calciu este de obicei utilizată pentru celulele procariotice, de aici și tratamentul cu fosfat de calciu, lipofecția și electroporarea fiind utilizate pentru gazdele celulare diferite.

□dată exprimați, anticorpii grefați pe CDR conform prezentei descrieri de invenție, pot fi purificați conform procedeelor standard din literatura de specialitate, incluzând precipitarea cu sulfat de amoniu, coloane de afinitate, cromatografie pe coloană și gelelectroforeza. Afinitățile de legătură ale acestor construcții astfel exprimate pot fi precizate prin tehnici cunoscute în literatura de specialitate, așa cum s-a exemplificat complet în secțiunea din exemplul prezentei specificații.

Anticorpii grefați pe CDR pur substanțiali, și cel puțin 90 până la 95% omogenitate sunt preferați, omogenitatea de 98 până la 99% sau mai mare fiind cea mai preferată pentru utilizări farmaceutice. Odată purificați, parțial sau cu o omogenitate dorită, anticorpii grefați pe CDR pot fi apoi utilizați pentru diagnosticare sau cu scop terapeutic (incluzând anticorpii extracorporali), sau prin procedee de analiză de dezvoltare și de performare, prin colorații imunofluorescente și alte procedee.

Anticorpii grefați pe CDR conform prezentei descrieri de invenție, vor găsi utilizare în mod tipic în tratamentul tulburărilor medii T-celulare. De exemplu, maladiile tipice stabilite pentru tratament includ grefarea și rejecția de transplant la pacianții având un organ bolnav, cum ar fi inima, plămânul, rinichiul sau ficatul, ca transplant. Alte boli includ bolile autonome, cum ar fi de exemplu diabetul de tip I, scleroza multiplă, artrita reumatoidă, lupusul sistemic eritematos și miastenia gravis.

Celulele T sunt expansiuni clonale dintr-o singură celulă care exprimă numai un receptor antigen celular T capabil să recunoască o legătură peptidică la o moleculă HLA specifică pe celule care prezintă antigenul, specializate, cum ar fi de exemplu, macrofagele și alte țesuturi. Activarea acestor celule T poate fi blocată prin recunoașterea anticorpilor din complexul receptor celular T sau complexul peptidic HLA.OKT3 recunoaște molecula CD3 care este cuprinsă în diferite subunități fizic complexate cu receptorul celular T. Diferite alte molecule pe celula T, incluzând moleculele CD4 și CDs sunt așadar incluse în activarea celulei T prin legarea la molecula HLA, la porțiunile care sunt distincte din porțiunea de legătură receptoare celulară-T.

CD4 este găsită pe subpopulația celulelor T cu receptorii celulelor T care recunosc moleculele din clasa II HLA. De aceea, o apropiere de imunosupresie include utilizarea anticorpilor monoclonali, ca de exemplu 0KT4 sau 0KT4A care sunt imunodepresivi deoarece aceștia inhibă intercțiunea moleculei CD4 cu molecula II din clasa HLA. Anticorpul legat Ia CD4 poate rezulta la imunosupresia printr-un număr de mecanisme incluzând inhibiția semnalului de activare normală, împiedicarea căii semnalului de reglare inferioare sau modularea acestui receptor din suprafața celulară. Aceasta ar putea fi de asemenea introdus cu o subpopulație de celule T capabile de supresarea altor subpopulații aloreactive sau autoreactive. Anticorpii anti-CD4 pot să acționeze prin inducerea complementului sau a lizei celulare T dependent de anticorp sau prin îndepărtarea celulelor T din circuitul sanguin sau a părților de inflamație. De aceea caracteristicile de legare Fc receptoare pentru fiecare anticorp pot fi importante în

RO 114980 Bl funcția lor. Strategiile alternative includ utilizarea anticorpilor anti-CD4 care au fost radiomarcați sau cuplați la toxine.

Aceste proprietăți imunosupresive ale anticorpilor anti-CD4 prevăd utilizarea 595 terapeutică în supresiunea limfocitelor activate T care mediează maladiile asociate cu transplantarea și autoimunitatea. Molecula de CD4 este așadar receptoare pentru subunitatea gp12O a virusului HIV. Deoarece 0KT4A inhibă legarea gp12O la CD4, acest anticorp sau fragmentele acestuia pot bloca infecția virală.

Molecula de CD4 este inclusă normal în prevederea unui semnal costimulator la 600 celulele T ca rezultat al legării la molecula din clasa II HLA. De aceea, este posibil ca anticorpii anti-CD4 să poată prevedea o funcțiune costimulatoare în combinația cu alți reactivi de inducere a semnalului. Această strategie terapeutică poate fi utilizată în tratamentul pacienților imunocompromiși.

Anticorpii grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenței, pot fi utilizați 605 în combinație cu alți anticorpi, în special MAbs reactivi cu alți markeri asupra celulelor umane responsabile de aceste maladii. De exemplu, anumiți markeri T-celulari convenabili pot să fie incluși, grupați, în așa numiții “clusteri de diferențiere.

în general, prezenții anticorpi grefați pe CDR, vor fi utilizați în forma purificată în combinație cu substanțele suport cu farmacologie corespunzătoare. în mod tipic, aceste eic substanțe suport includ soluțiile apoase sau alcoolice sau soluțiile apoase, emulsiile sau suspensiile incluzând medii saline și medii tampon. Vehicole parenterale includ soluția de clorură de sodiu, dextroxa Ringer, dextroza și clorură de sodiu și soluția Ringer lactat. Astfel de adjuvanți convenabili, acceptați din punct de vedere fiziologic, dacă este necesar pentru menținerea complexului în suspensie, pot fi aleși dintre agenții de îngroșare, cum ei 5 ar fi de exemplu carboximetilceluloza, polivinilpirolidona, gelatina și alginații.

Vehicolele intravenoase includ fluide și agenți de alimentare sau agenți electrolitici, cum ar fi de exemplu acei bazați pe dextroze Ringer. Conservanții și alți agenți antimicrobieni, agenții antioxidanți, agenții de chelare și gazele inerte pot fi de asemenea prezenți în aceste preparate. 62:

Anticorpii grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenței, pot fi utilizați ca compoziții de administrare separate sau în conjuncție cu alți agenți. Aceste preparate pot include diferite medicamente imunoterapeutice, cum ar fi de exemplu ciclosporina, metotrexatul, adriamicina sau cisplatina și imunotoxinele. Compozițiile farmaceutice pot include “cocktailuri” din diferiți agenți citotoxici sau alți agenți în conjuncție cu anticorpii 625 grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenței, sau chiar combinații de anticorpi grefați pe CDR având diferite specificații.

Calea de adiministrare a compozițiilor farmaceutice, conform prezentei invenții, poate fi una din cele comune cunoscute din literatura de specialitate. Pentru terapie, fără o limitare imunoterapică, anticorpii grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de 630 invenței, pot fi administrați la orice pacient în conformitate cu tehnicile standard. Administrarea poate fi realizată prin orice mod convenabil, incluzând calea parenterală, intravenoasă, intramusculară, intraperitoneală sau de asemenea o administrare corespunzătoare prin infuzare directă cu un cateter. Dozajul și frecvența de adminsitrare vor depinde de vârstă, sex și condiția pacientului; o adminsitrare concurentă cu alte 635 medicamente, indicații de dozare și alți parametrii pot fi luați în considerație de către clinician.

RO 114980 Bl

Anticorpii grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenței, pot fi liofilizați pentru conservare și reconstituiți într-un vehicol corespunzător, înainte de utilizare. Această tehnică s-a dovedit a fi efectivă cu imunoglobuline convenționale, utilizându-se tehnici de liofilizare și de reconstituire cunoscute în literatura de specialitate. Se poate aprecia, că așa cum este menționat în literatura de specialitate, liofilizarea și reconstituirea pot conduce la diferite grade a activității anticorpilor (de exemplu cu imunoglobuline convenționale, anticorpi IgM tind la o pierdere de activitate mai mare decât anticorpii IgG] și că utilizarea acestor nivele trebuie să fie ajustată pentru compensare.

Compozițiile care conțin prezenții anticorpi grefați pe CDR sau cocktailurile acestora, pot fi administrate pentru tratamente profilactice și/sau terapeutice. în anumite aplicații terapeutice, o cantitate adecvată pentru a însoți cel puțin parțial inhibarea sau distrugerea populației celulelor selectate, este definită ca “doză terapeutică efectivă”. Cantitățile care trebuie să obțină acest dozaj, vor depinde de severitatea bolilor și de starea generală a pacientului cu sistem propriu imunitar, dar în general sunt cuprinse de la 0,005 până la 5,0 mg de anticorp grefat pe CDR /kg corp, iar doze de la 0,05 până la 2 mg/kg/doză care sunt mult mai obișnuite. Pentru aplicații profilactice, compozițiile care conțin anticorpul grefat pe CDR sau cocktailurile acestuia se pot administra în dozaje similare sau ușor mai scăzute.

□ compoziție care conține anticorpul grefat pe CDR, conform prezentei descrieri de invenție, se poate utiliza în scop profilactic sau terapeutic pentru a ajuta la modificarea, inactivarea, distrugerea sau îndepărtarea populației constituită din celulele T selectate, la mamifere.

Conform unei alte întruchipări, construcțiile descrise în prezenta invenție, pot fi utilizate extracorporal sau prin selectivitate in vitro pentru a distruge, a slăbi sau a avea alt efect de îndepărtare a populației celulare menționate, dintr-o colecție celulară heterogenă. Sângele de la mamifere poate fi combinat extracorporal cu anticorpi grefați pe CDR din care celulele nedorite sunt distruse sau sunt îndepărtate din sânge pentru a fi readuse la mamifere, conform tehnicilor standard cunoscute.

în plus față de aceste utilizări terapeutice, anticorpi grefați pe CDR vor găsi utilizare în analizele de diagnostic. Anticorpii grefați pe CDR pot fi marcați, în conformitate cu tehnicile cunoscute în literatura de specialitate. Anticorpii grefați pe CDR sunt de asemenea covenabili pentru alte scopuri in vivo. De exemplu, anticorpii grefați pe CDR, pot fi utilizați pentru tratamentul selectiv celular al celulelor sanguine periferice acolo unde se dorește numai eliminarea limfocitelor T menționate sau în mod similar în culturile de celule pentru a elimina limfocitele T nedorite.

Prezenta descriere de invenție este descrisă prin exemplu de realizare cu referire la fig. 1 ...19 în care:

- fig. 1, reprezintă secvența de nucleotidă a domeniului variabil cu catenă lungă 0KT4A;

- fig. 2, reprezintă secvența de nucleotidă a domeniului variabil cu catenă scurtă 0KT4A;

- fig. 3, reprezintă secvența de aminoacid din domeniul variabil cu catenă lungă □KT4A în care CDRs sunt subliniate;

- fig. 4, reprezintă secvența de aminoacid din domeniul variabil cu catenă scurtă 0KT4A în care CDRs sunt subliniate;

RO 114980 Bl

685

- fig. 5, reprezintă o aliniere la KOL cu 0KT4A secvența de aminoacid cu catenă lungă grefată pe CDR în care CDRs se subliniază, secvențele umane fiind în partea superioară și secvențele murinice fiind în partea inferioară;

-fig. 6, reprezintă alinierea REI cu 0KT4A secvența de aminoacid cu catenă lungă grefată pe CDR, care sunt subliniate, secvențele umane sunt în partea superioară și secvențele murinice fiind în partea inferioară;

- fig. 7, reprezintă o secvență de ADN și translația de aminoacid cu catenă lungă grefată pe CDR;

- fig. 8, reprezintă o secvență de ADN și translația de aminoacid cu catenă scurtă grefată pe CDR;

- fig. 9, reprezintă construcția vectorului de exprimare cu catenă lungă 0KT4A grefată pe CDR;

- fig. 10, reprezintă analizele de blocare și legare a construcțiilor cu catene scurte 0KT4A grefată pe CDR în combinație cu catene lungi chimerice 0KT4A;

- fig. 11, reprezintă analizele de legătură și blocare ale construcțiilor cu catene lungi 0KT4A, HCDR1, HCDR2 și HCDR3, în combinație cu 0KT4A cu catenă scurtă;

-fig. 12, reprezintă alinierea REI la catenele lungi 0KT4A grefate pe CDR, LCDR1 și LCDR2 și secvențele cu aminoacizi cu catene scurte 0KT4A murinice în care CDRs se subliniază, secvențele umane fiind în partea superioară și secvențele murinice fiind în partea inferioară;

-fig. 13, reprezintă alinierea KOL la catenele lungi grefate pe CDR, HCDR1 prin HCDR1O și secvențele cu aminoacizi cu catene lungi 0KT4A murinice în care CDRs sunt subliniate, secvențele umane fiind în partea superioară și secvențele murinice fiind în partea inferioară;

- fig. 14, reprezintă legarea și analiza de blocare a construcțiilor cu catene lungi grefate pe CDR, HCDR1, HCDR2 și HCDR3, în combinație cu catenele scurte LCDR2 grefate pe CDR;

- fig. 15, reprezintă analizele de legare și blocare a construcțiilor HCDR4 cu catene lungi grefate pe CDR prin HCDRIOîn combinație cu LCDR2 cu catenă scurtă;

- fig. 16, reprezintă analizele de blocare a construcțiilor cu catene lungi HCDR5, HCDR6 și HCDRIOîn combinație cu construcțiile cu catenă scurtă LCDR2, LCDR3, LCDR2Q, LCDR3Q și LCDR4Q în forma chimerică 0KT4A;

- fig. 17, reprezintă analizele cu afinitate relativă ale 0KT4A construcții HCDR5 și HCDR1D cu catene lungi, în combinație cu construcția LCDR2 cu catenă lungă și formele chimerice și murinice ale 0KT3 ca control negativ;

- fig. 18, reprezintă rezultatele studiilor de inhibare a MLR prin diferiți anticorpi utilizându-se T6 ca control negativ;

- fig. 19 reprezintă rezultatele studiilor de inhibare a proliferării prin diferiți anticorpi.

Umanizarea 0KT4A: 0KT4A este un anticorp murinic monoclonal care recunoaște antigenul CD4 localizat în primul rând pe limfocitele helper T. Anticorpii grefați pe CDR au fost construiți astfel ca CDRs din domeniile variabile având atât catene lungi cât și catene scurte, să fie derivate de la secvența murinică 0KT4A. Cadrele din domeniul variabil și domeniile constante sunt derivate din secvențele anticorp umane.

Cele trei CDRs care se află pe catenele lungi și scurte sunt compuse din acele reziduuri, care după studierea structurală, au demonstrat a fi incluse în legătura

690

695

700

05

710

715

720

725

730

RO 114980 Bl antigenică. Teoretic, dacă anticorpul 0KT4 murinic cu CDRs se grefează pe cadrul uman pentru a forma domeniul variabil grefat pe CDR și acest domeniu variabil este atașat la domeniile constante umane, rezultă că anticorpul grefat pe CDR ar fi, în esență, un anticorp uman cu specificitate pe 0KT4A murinic pentru a lega antigenul uman CD4. Dată fiind natura umană superioară a acestui anticorp, este de așteptat să fie mult mai puțin imunogenic decât 0KT4 murinic când se administrează la pacienți.

Urmând testele de legare antigenică a anticorpului 0KT4 grefat pe CDR în care numai CDRs sunt grefate pe cadrul uman, s-a demonstrat că nu se produc anticorpi grefați pe CDR având o afinitate rezonabilă pentru antigenul CDR4. S-a hotărât astfel ca reziduurile adiționale adiacente la unele CDRs și reziduurile cadru critice sunt necesare să fie transformate de la reziduurile 0KT4A umane la cele murinice corespunzătoare în vederea generării anticorpului funcțional.

Izolarea OKT4A cu catene lungi și scurte prin analiza de secvență a cADN și ADN În domeniul variabil:

Pentru a desemna anticorpul 0KT4A grefat pe CDR, este mai întâi necesar să se determine secvența domeniului variabil al catenelor lungi și scurte murinice 0KT4A. Secvența este determinată de la catena lungă sau scurtă cADN care a fost sintetizată din mARN respectiv.

mARN este preparat din celule hibridoma producătore de DKT4A prin extracție cu tiocianat de guanidină urmată de purificare pe gradient de clorură de cesiu. cADN este sintetizat și colecțiile sunt preparate și ecranate în laborator. cADN este sintetizat din mARN, la care se adaugă linkerii EcoRI și acesta este apoi legat la partea EcoRI a vectorului clonizat Igtlo. Fagul recombinant este grupat în particule infecțioase care sunt utilizate pentru infectarea E. coli C60O.

Această colecție este ecranată pentru secvențele 0KT4A cu catene lungi utilizându-se probele de oligonucleotide Cg și FR3. Primerul de secvențare Cg are secvența: 5' GGCCAGTGGATAGAC5 3' și se leagă la domeniul constant IgC murinic. Proba FR3 are următoarea secvență: 5' GGCCGTGTCCTCAGACCT 3' și se leagă la regiunea a treia cadru a domeniului variabil murinic cu catene lungi. Cinci clone pozitive sunt evaluate prin transferul sudic și prin hibrizare la probele Cg și FR3 și un cADN la șoarece lgG2a CH3. O singură clonă cu o inserție bp EcoRI care hibridizează la toate trei probele, este selectată.

Colecția este ecranată pentru secvența catenei scurte DKT4A utilizându-se o probă de oligonucleotidă Ck (primerul de secvențare MRNA] cu următoarea secvență: 5' GGCTCCAGGTTGCTGATGCTGAAGG 3' și care se leagă la domeniul constant kappa la șoarece. Șase clone pozitive sunt apoi evaluate prin transfer sudic și prin hibridizarea la probele de oligonucleotide T4AK, a cărui secvență este următoarea: 5' GGCTCCAGGTTGCTGATGCTGAAGG 3' și care se leagă la regiunea cadru 3 kappa la șoarece și Ck. O singură clonă care conține o inserție 900 bp EcoRI și este hibridizată la ambele probe, este aleasă.

Catena lungă de cADN 1600 bp este subclonizată în porțiuni EcoRI ale vectorului plasmid pBluescript (Sisteme de Clonizare Strategene) și vectorul de secvențare M13mp8. Catena cADN scurtă 900 bp a fost subclonată în porțiunile EcoRI a vectorului plasmid pUC8 și vectorul de secvențare M13mp19.

Metoda catenei terminale dideoxi-nucleotidei, pentru analiza secvenței ADN, se utilizează pentru a determina secvența ambelor modele cu filament simplu răsucit

RO 114980 Bl

780 (M13)și dublu răsucit (plasmid). Secvența regiunilor 5' netranslate, secvențele semnal, domeniile variabile și o porțiune din domeniile constante sunt determinate pentru ambele tipuri de catene cADN lungi și scurte. Secvența ADN pentru catene lungi și scurte este ilustrată în figurile 1 și 2. Translația secvenței din domeniul variabil cu catenă lungă este prezentată în fig. 3.0 translație din domeniul variabil cu catenă scurtă este prezentat în fig. numărul 4.

Este de notat că secvența nucleotidei dată pentru catena scurtă, are un reziduu A la poziția 163, către începutul secvenței de codificare CDR1 (vezi fig. 2). Translația acestei secvențe dă un reziduu de glutamină la poziția 27 în catena scurtă (vezi fig. 4).

Când secvențarea catenei scurte 0KT4 este efectuată original, reziduul de nucleotidă 163 este un reziduu care trebuie să fie C, dând un reziduu de prolină la poziția 27 în catena scurtă. Primii anticorpi grefați pe CDR, produși, în prezența invenție sunt construiți astfel ca reziduul 27 cu catenă scurtă să fie reziduul de prolină. Aceasta se poate vedea din fig. 6, 8 și 12.

Desemnarea anticorpului 0KT4A grefat pe CDR.

Desemnarea anticorpului 0KT4A grefat pe CDR este necesar să fie determinată ca reziduuri 0KT4A murinice care cuprind CDRs cu catene lungi și catene scurte. Examinarea anticorpului ca structură cristalină prin raze X arată suprafața de legătură antigenică care trebuie localizată pe o serie de trei lanțuri extinzându-se din cadrul bcarrel al domeniului variabil. Aceste lanțuri pot fi astfel utilizate pentru a defini CDRs.

Deoarece structura de cristal a 0KT4A murinic nu este convenabilă, structura unui anticorp murinic similar al strcturii de cristal cunoscute este utilizată pentru a defini reziduurile acestor lanțuri menționate mai sus.

Trei regiuni ale amidei cu hipervariabilitate cu secvențe cadru mai puțin variabile sunt găsite pe ambele catene scurte și lungi. In majoritatea cazurilor aceste regiuni hipervariabile corespund la CDRs, dar se pot extinde de la acestea. S-a hotărât ca o combinație a reziduurilor 0KT4A murinic în CDRs și cel în regiunile hipervariabile ar cuprinde compoziția CDRs care trebuie grefată pe cadrul anticorpului uman. Secvențele de aminoacid ale catenelor lungi și scurte 0KT4A murinice sunt prezentate în figurile 3 și 4, cu compozițiile CDRs selectate, subliniate.

Anticorpul uman cu secvență cadru pentru catena lungă este anticorpul uman KDL. KOL este ales deoarece structura cristalografică cu raze X a fost determinată la grad ridicat de rezoluție. Aceasta ar permite o acuratețe moleculară de modelare a anticorpului. Pentru același motiv, secvența cadru a dimerului uman cu catenă scurtă, REI se utilizează pentru catenele cadru, lungi. Secvențele de aminoacid ale KOL și REI sunt arătate în figurile 5 și 6, în comparație cu cele ale domeniilor variabile cu catene scurte (LCDR1) și lungi (HCDR1) pentru 0KT4A grefate pe CDR.

Catenele lungi grefate pe CDR sunt desemnate a avea o porțiune constantă lgG4 umană. Subclasa lgG4 este selectată pe baza experienței cu anticorpul monoclonal murinic anti-CD3 OKT3 care este utilizat pentru tratarea rejecției renale grefate. OKT3 are un izotop lgG2 murinic și nu se fixează complet la oameni. Izotopul lgG4 uman așadar nu se fixează complet. Catena scurtă 0KT4A grefată pe CDR este construită cu domeniul constant kappa uman.

Construcția genelor OKT4A grefate pe CDR.

Domeniile variabile grefate pe CDR cu catene lungi și scurte sunt construite prin legarea oligomerilor ADN sintetice filamente dublu răsucite, similar cu metoda utilizată

785

790

795

800

805

810

815

820

RO 114980 Bl în literatura de specialitate. Capătul 5' al domeniilor variabile conțin secvențele catenelor scurte și lungi ale anticorpilor monoclonali murinici B72.3. Secvența semnal direcționează secreția anticorpului din celulele mamiferelor. O secvență Kozak precede imediat codonul de start AUG pentru a crește translația. Domeniile variabile sunt apoi legate la ADN codificând pentru domeniile constante umane și pentru a crea genele cu catene lungi și scurte grefate pe CDR.

Construcția catenei lungi 0KT4A grefate pe CDR.

Un număr de opt perechi de oligomeri complementari, aproximativ 30 bp în lungime, sunt desemnați a avea capete suprapuse și domenii variabile de la porțiunea Xhol localizată în cadrul 2 la partea Hind III la începutul primului domeniu constant. Acești oligomeri în opt perechi sunt sintetizați, legați la un loc, într-o manieră fazică și apoi sunt legați la capătul Hindlll5' al domeniului constant ADN uman lgG4. lgG4 ADN se prevede ca ADN genomic. Aceasta este o inserție 2153bp într-un vector ADN fag M13 cu 5' EcoRI și o porțiune de restricție 3' BamHI. CH1, CH2 și CH3 în domenii sunt înconjurate prin patru introni. Gena este modificată prin Celltech, pentru a avea o schimbare C până la A la penultima bază a exonului CH1 și pentru a crea o nouă porțiune Hind III în scopurile de construcție a genei grefate pe CDR.

Capătul 5' al domeniului variabil este construit prin legarea a două perechi complementare de oligomeri sintetici, fiecare fiind de aproximativ 90pb în lungime. Acest fragment care are un capăt 5' EcoRI și un capăt 3' Xhol 2364bp este legat la capătul Xhol al fragmentuli descris mai sus pentru a produce gena cu catenă lungă complet grefată pe CDR. Această genă este 2364bp în lungime și are capetele 5' EcoRI și 3' BamHI. Secvența ADN cu translația de aminoacizi ai genei este arătată în fig.7. Regiunile de interes definite prin numărul de nucleotide sunt următoarele: 1-14, porțiunea EcoRI și secvența Kozak; 15-71, secvența de semnal; 72-146, cadrul 1; 147-176, CDR1; 177-218, cadrul 2; 219-254, CDR2; 255-362, cadrul 3; 363-392, CDR3; 393-431, cadrul 4; 432-727, domeniul CH1; 738-1117, intron; 118-1153, domeniul hinge; 1154-1271, intron; 1272-1599 domeniul CH2; 1600-1698, intron; 1699-2016, domeniul CH3 și 2017-2366, regiunea netranslată 3'.

Construcția genei cu catenă scurtă grefată pe CDR

Douăsprezece perechi complementare de oligomere sintetice cu capete suprapuse au fost legate simultan pentru a grupa domeniul variabil cu catene lungi grefate pe CDR. Acest fragment are capetele 5' EcoRI și 3' Nari. Acesta a fost legat la capătul 5' Nari al domeniului ADN constant kappa uman. cDNA constant kappa uman a fost modificat prin Celltech pentru a include o porțiune de restricție Nari în codonul trei și patru. Gena cu catenă lungă grefată pe CDR rezultată este 754 bp în lungime și are capetele EcoRI. Secvențele de ADN cu translație de aminoacid este arătată în fig 8. Regiunile de interes definite prin numărul de nucleotide sunt următoarele: 1-8, porțiunea EcoRI și secvența Kozak; 9-68, secvența semnal; 69-143, cadrul 1; 144-164, CDR1; 165-215, cadrul 2; 216-236, CDR2; 237-338 cadrul 3; 339-356, CDR3; 357-404, cadrul 4; 405-710, domeniul constant kappa și 711-754, netranslat.

Exprimarea anticorpului 0KT4A grefat pe CDR

Construcția vectorului de exprimare cu catenă lungă

Un vector de exprimare cu catenă lungă grefat pe CDR este construit prin inserția genei cu catenă lungă în plasmidul de exprimare pEe6HCMVBg12 și adiția fragmentului GS care este compus al originii SV40 și glutamin sintetazei minigene. Aceste faze sunt

RO 114980 Bl diagramate în fig.9. pEe6HCMVBg12 și fragmentul GS sunt prevăzute de Celltech.

pEe6HCMV este digerat la porțiunile de EcoRI și Bcll.pFe6HCMVBg12 ADN au 870 fost demetilați prin trecerea prin DAM E.coli ca specie GM242, care este lipsită de deoxiadenozin metilază. Beli va restricta numai ADN care nu conține N⁶-metilat deoxiadenozina la o parte de recunoaștere a enzimei. Proieminența care rezultă din restricția Beli este compatibilă cu BamHI proieminență. Gena cu catenă lungă grefată pe CDR EcoRI/BamHI (HCDR1) a fost apoi legată la capetele EcoRI/Bcll ale 87 5 pEe6HCMVBg12 pentru a produce pEe6HCDR1.

Un fragment 5500 bp BamHI conținând glutamin sintetaza minigenă și originea SV40 a replicației și promotorii apăruți mai devreme și cei apăruți mai târziu, sunt înserați pe porțiunea BamHI a pEe6HCDR1 pentru a produce pEe6HCDR1. Orientarea corectă a fragmentului GS este verificată prin restricție. pEe6HCDR1gs este preparat aso pentru celulele de mamifere cu transfectarea acestora prin metoda lizei alcaline și purificarea gradientului de clorură de cesiu.

pEe6HCDR1gs este capabil de exprimarea catenei lungi 0KT4A grefată pe CDR în COS și celulele CHO. Promotorul HCMV se întinde 5' la gene cu catenă lungă și se direcționează în transcripția acesteia. Secvența semnal poliadenilarea SV40, leagă 3' la 885 gena care acționează ca terminator transcripțional. Pentru exprimarea transientă în celulele COS, originea SV40 a replicației este prezentă în fragmentul GS 5500 bp. Minigenă GS este prezentată ca un marker selectabil pentru utilizarea următoarelor transfecții celulare CHO. Exprimarea glutamin-sintetazei minigene este condusă de promotorul târziu SV40. Fragmentul GS este orientat astfel ca promotorul târziu SV40 8 90 să conducă transcripția în aceeași direcție ca promotorul HCMV.

Diferite evenimente post-transcripționale produc catena lungă grefată pe CDR. In nucleu, trei secvențe de intervenție ale porțiunii constante lgG4 sunt separate și exonii sunt legați la un loc pentru a crea un mARN matur. Urmând translației, secvența semnal de 19 aminoacizi este îndepărtată în reticulum endoplasmic brut (ER). Un simplu 8 95 carbohidrat este adăugat la domeniul CH2 la fiecare catenă în ER și la aparatul Golgi. Fiecare catenă conține așadar patru legături disulfidice intracatenice. Când o peptidă cu catenă scurtă este prevăzută printr-un vector de exprimare cu catene scurte contrasfectate, un anticorp matur este grupat la un loc prin legături reciproce, prin legături disulfidice a două catene lungi și două catene scurte. 90c

Construcția vectorului de exprimare cu catenă scurtă grefată pe CDR

Vectorul de exprimare cu catene scurte 0KT4A grefate pe CDR este construit prin înserarea genei cu catenă scurtă grefată pe CDR în vectorul de exprimare pEe6HCVBg12 și apoi se adaugă originea SV4D și glutamim sintetaza minigenică care conține fragmentul GS. Vectorul de exprimare cu catenă scurtă este construit printr-un 905 procedeu esențial asemănător care a fost utilizat pentru vectorul de exprimare cu catenă lungă, așa cum s-a ilustrat în fig. 9. Gena cu catenă scurtă este legată în porțiunea EcoRI a pEe6HCMVB12 pentru a produce pEe6LCDRI. Orientarea corectă a genei cu catenă scurtă este verificată prin analiza de restricție. Fragmentul 55DO bp GS este înserat în porțiunea BamHI pentru a produce pEe6LCDR1gs. Orientarea corectă a fragmentului GS 910 este verificată prin analiza de restricție. pEe6LCDR1gs este preparat pentru transfecția de celule de mamifere, prin metoda de liză alcalină și purificarea cu gradient fiind clorură de cesiu.

RO 114980 Bl

Ca și cu gena cu catenă lungă grefată pe CDR, transcripția genei cu catenă scurtă grefată pe CDR în pEe6LCDRgs este condusă prin promotorul HCMV și terminația transcripțională este semnalată prin secvența semnal SV40 de poliadenilare. Origina SV40 a replicației conținută în fragmentul GS permite pentru replicația autonomă a acestei construcții în celulele COS. Glutamin sintetaza minigenă în fragmentul GS prevede un mecanism pentru selecția și amplificarea în celule CHO.

Procedeul post transcripțional al mARN cu catenă scurtă grefată pe CDR nu este necesar înainte de translație deoarece niciun intron nu este prezentat în genă. Urmând translației, secvența lider este îndepărtată din ER brut. Sunt formate două legături disulfidice intracatenice. Gruparea anticorpilor maturi este discutată în secțiunea dinainte.

Exprimarea transientă a celulelor COS-1 0KT4A grefate pe CDR

Exprimarea transientului genelor grefate pe CDR în celule COS-1, prevăd un sistem convenabil și rapid de testare a exprimării și funcției anticorpului 0KT4A grefat pe CDR. Celulele COS-1 exprimă consecutiv antigenul T mare SV40 care suportă replicația transientă a epizomilor purtați de replicația de origină SV40. Vectorii de exprimare ai genei grefate pe CDR pEe6HCDR1gs și pEe6LCDR1gs conțin origina SV40 a replicației ca o porțiune a fragmentului GS. După transfectare în celule COS-1, vectorii de exprimare sunt replicați în nucleu la un număr mare de exemplare rezultând în nivelele de exprimare relativ superioare.

Celulele COS-1 sunt obținute din Colecția de Cultură de Tip American (CRL 1650) și aduse într-un mediu de cultură Eagle Dulbecco Modificat (DMEM) cu ser de vițel fetal 10% concentrație. Vectorii de exprimare a genei grefate pe CDR sunt transfectați în celule COS utilizându-se metoda dextran-DEAE urmată de șoc DMSO. Pe curt, 0,2 ml din 1 mg/ml de DEAE-dextran în amestec tampon se adaugă la 15 mg vector ADN în 0,8 ml DMEM/Tris. Aceasta se adaugă la 1...1,5 x 10⁶ celule în 60 ml de cultură de țesuturi și se incubează timp de aproximativ 6 h. Complexul DEAE-dextran/DNA este îndepărtat și se adaugă DMSO 10% concentrație în tampon la acest disc timp de două minute. Acesta se îndepărtează, celulele se spală odată cu DMEM și apoi se incubează cu DMEM conținând ser de vițel fetal 10% concentrație, timp de 3...4 zile. In acest timp supernatantul din recipient este recoltat și examinat pentru nivelele de anticorp și pentru abilitatea de legare a limfocitelor CD4 pozitive. Nivelul de anticorpi este determinat prin ELISA. Recipientele sunt acoperite cu un anticorp specific de capră Fc antiuman. Diferitele diluții din supernatantul celular COS conținând anticorpul secretat sunt adăugate, incubate timp de o oră la temperatura camerei într-o cameră umedă și apoi sunt spălate. Se adaugă apoi un anticorp cu catenă kappa antiuman de capră legat la peroxidaza din hrean, care este apoi incubată timp de o oră la temperatura camerei și apoi se spală. Substratul pentru peroxidază din hrean este adăugat pentru detecție. Nivelele 0KT4A grefate pe CDR urmează contransfecției pEe6HCDR1gs și pEe6LCDR1gs în ordinul de la ng/ml 200 la 1200 ng/ml de supernatant celular COS.

Studii de legătură antigenică

0KT4A grefat pe CDR produs de celulele COS se testează pentru abilitatea acestuia de a se lega la limfocitele din sângele uman periferic (PBLs) sau linia celulară HPBALL CD4-pozitivă (leucemia limfocitică acută din sângele periferic uman). Așadar acesta este testat pentru abilitatea de blocare a legăturii 0KT4A murinice la aceste celule. Legarea este măsurată prin procedeul următor: PBLs se izolează din celulele

RO 114980 Bl

965

HPBAIL care sunt recoltate din cultura celulară. Celulele sunt incubate la temperatura de 4°C timp de o oră, cu diferite diluții ale anticorpului testat, controlul pozitiv al anticorpului sau controlul negativ la anticorp. Celulele sunt spălate odată și apoi sunt incubate la temperatura de 4°C timp de o oră cu un IgG antiuman de capră marcat FITC (Fc absorbit la șoarece). Celulele sunt spălate de două ori și analizate prin citofluorografie. 0CT4A chimeric (descris mai jos) este utilizat ca control pozitiv. 0CT4A murinic FITC marcat este utilizat ca control pozitiv pentru legarea directă. Celulele incubate cu supernatantul celular COS mock-transfectat, urmat de IgG antiuman de capră FITC marcat, prevede un control negativ.

Testarea abilității 0KT4A grefat pe CDR pentru blocarea legăturii murinice 0KT4A se realizează prin incubarea celulelor de PBLs sau HPBALL, la o temperatură de 4°C timp de o oră, cu diferite diluții ale anticorpului de testat sau ale anticorpului de control. □ cantitate de saturare fixată de FITC-0KT4A este adăugată. Probele sunt incubate timp de o oră la temperatura de 4°C, apoi sunt spălate de două ori și analizate prin citofluorografie. Controalele pozitive sunt FITC marcate 0KT4A pentru a determina maximum de legătură și 0KT4A murinic nemarcat, ca referință standard pentru blocare. Controalele negative sunt celule necolorate cu sau fără supernatant celular mocktransfectat.

Abilitatea catenei scurte 0KT4A grefate pe CDR de legătură a celulelor CD4 pozitive și de blocare a legăturii 0KT4A murinic este inițial testată în combinație cu □KT4A chimeric cu catenă lungă. Catena lungă 0KT4A chimerică este compusă dintr-un domeniu variabil 0KT4A murinic și o porțiune constantă lgG4 umană. Gena cu catenă lungă chimerică este exprimată în același vector de exprimare utilizat pentru genele grefate pe CDR. Vectorul de expirmare cu catenă scurtă grefată pe CDR și vectorul de exprimare cu catenă lungă chimerică, sunt contrasfectați pe celulele COS. Anticorpul 0KT4 chimeric complet (catenă scurtă chimerică și catenă lungă chimerică) a fost găsit a fi complet capabil de legare la celulele CD4 pozitive și de blocare a legăturii 0KT4 murinic la aceste celule.

Așa cum este ilustrat în fig. 10, catena scurtă 0KT4A grefată pe CDR, LCDR1, în combinație cu catena lungă 0KT4A chimerică, este incapabilă de legătură la celulele CD4 pozitive sau de blocare a legăturii 0KT4A murinic la aceste celule.

Figura 11 arată studiile de legare și studiile de blocare efectuate cu catene lungi □KT4A grefate pe CDR, HCDR1, combinate cu cateă scurtă 0KT4A chimerică. Catena scurtă 0KT4A chimerică este compusă dintr-un domeniu variabil 0KT4A murinic și un domeniu constant kappa uman. Este așadar exprimat în același vector de exprimare cum este utilizat pentru anticorpii grefați pe CDR. Celulele COS sunt co-transfectate cu vectorul de expirmare cu catenă lungă grefată pe CDR și vectorul de exprimare cu catenă scurtă chimerică.

HCDR1 cu catenă lungă 0KT4A grefată pe CDR, în combinație cu catena scurtă 0KT4A chimerică, este așadar incapabil de legare la celulele pozitive CD4 sau de blocare a legăturii 0KT4A murinic la aceste celule.

Modificarea anticorpului grefat pe CDR

Datele de legare și de blocare demonstrează clar că anticorpul grefat pe CDR desemnat inițial nu este capabil de recunoaștere a antigenului CD4. 0 altă modificare a anticorpului este necesară. Este necesar ca CDRs 0KT4A murinic să fie în continuare expandat sau este necesar ca reziduurile cadru critice incluse în poziționarea CDRs, ca

970

975

980

985

990

995

1000

1005

RO 114980 Bl și intercațiunile dintre domeniile de grupare cu catenă lungă și scurtă să fie schimbate de la uman la cele de șoarece.

Modelele moleculare sunt utilizate pentru a identifica reziduurile care par mult mai critice pentru intercațiunea antigenică plină de succes. Modelarea a fost efectuată la Celltech.

Modificarea catenei scurte grefate pe CDR

Structura de cristal a 0KT4A n-a fost determinată ca model molecular chiar pentru 0KT4A care nu s-a utilizat în această analiză. Pentru analizarea reziduurilor cu catene scurte grefate pe CDR, un model molecular al catenei scurte REI umane este superimpozat cu un fragment de MOPC 6D3 Fab la șoarece. Catena scurtă MOPC 603 este similară în secvența de aminoacizi la 0KT4A. Așadar, au fost efectuate studii în cazul în care catene scurte REI umane și catene lungi KOL umane au fost scurtate. Deciziile au fost efectuate pentru extinderea CDR1 prin reziduuri de convertire 33 și 34 din Leu uman și Asp uman la Ile și Ala de la 0KT4A murinic. Reziduul uman REI Glu38 este găsit a fi inclus în gruparea de catene lungi și catene scurte. Prin schimbarea acestui reziduu în 0KT4A murinic, His 38 poate fi beneficial. Reziduul 49 la capătul terminal aminic intră direct în impact cu CDR2 și astfel în contact cu CDR3 a catenei lungi. Reziduul 89 aproape de capătul terminal aminic al CDR3, interacționează cu Phe98 al catenei scurte și astfel intră în contact cu CDR3 al catenei lungi. REI Tyr49 și Gln89 sunt schimbate în DTK4A murinic His49 și Leu89.

Noua genă cu catenă scurtă 0KT4A grefată pe CDR care este generată prin schimbările de mai sus, este desemnată ca LCDR2. O comparare a secvenței domeniilor variabile ale REI, LCDR2 umane și asumate cu catena scurtă 0KT4A murinică este arătată în fig. 12. Schimbările sunt efectuate prin codoane modificate prin mutageneză parțială directă. Vectorul phagemid bluescript din Sistemele Stratagene de Clonizare, sunt utilizate pentru generarea modelului simplu răsucit pentru mutageneză. Vectorul de exprimare pEe6LCDR2gs este construit în aceeași manieră ca și pentru LCDR1. Celulele COS sunt co-transfectate cu pEe6LCDR2gs și cu vectorul de exprimare cu catenă lungă chimerică.

Rezultatele studiilor de legare și blocare sunt arătate în fig. 10. Versiunea LCDR2 a catenei scurte 0KT4A grefate pe CDR, în combinație cu catena lungă 0KT4A chimerică, este capabilă de legare a celulelor CD4 pozitive și de blocare a legăturii murinice 0KT4A. Aceste date arată că LCDR2 este o catenă scurtă 0KT4A grefată pe CDR funcțională.

Modificarea catenei lungi grefate pe CDR

Catena lungă de model molecular a anticorpului KOL uman este utilizată pentru studii de modelare. Toate schimbările de reziduuri au fost efectuate prin mutageneză parțială directă pe codonii care vor fi schimbați. S-a hotărât să se efectueze Glu57 și His58 din KOL la Thr57 și Tyr58 a 0KT4A murinic. Astfel are loc o revizuire a catenei lungi grefate pe CDR, care a fost desemnată ca HCDR2. In plus, față de schimbările la reziduurile 57 și 58, reziduul 24 se întinde aproape de CDR1 și poate fi cuprins în CDR1 poziționat. Așadar, reziduurile 88 și 91 sunt conținute în gruparea de domenii variabile cu catene lungi și se interfațează între catenele lungi și cele scurte. Aceste trei reziduuri adiționale se schimbă de la KOL la 0TK4A murinic fiind încorporate într-o versiune HCDR3 cu catenă lungă. O comparație a secvenței de aminoacid în domeniul variabil pentru KOL, HCDR1, HCDR2, HCDR3, 0KT4A murinic cu catenă lungă și versiunile care

RO 114980 Bl

1055 vor fi descrise mai departe, este ilustrată în fig. 13.

Vectorii de exprimare pEe6HCDR2gs și pEe6HCDR3gs sunt co-transfectați pe celulele COS fie cu vectorul de exprimare cu catenă lungă 0KT4A chimeric fie cu pEe6LCDR2gs. Datele privind legarea și blocarea, sunt prezentate în fig. 11 și 14. Nici HCDR2, nici HCDR3 nu sunt capabili să interacționeze efectiv cu antigenul când acesta este combinat cu o catenă scurtă 0KT4A grefată pe CDR sau cu o catenă lungă chimerică.

Alte modificări la catena lungă grefată pe CDR sunt explorate. Este de asemenea efectuată o decizie de schimbare a KOL Tyr35 în 0KT4A murinic Ser35. Modelul molecular demonstrează că reziduul 42 este inclus în poziționarea CDR2. Reziduul 44 este inclus în contactele catenelor scurte. Este de asemenea beneficial să se schimbe KOL Gly42 și Gly44 în 0KT4A murinic Glu42 și Arg44. KOL Ala6O este echimbat în OKT4A ProSO murinic. Aceste schimbări sunt introduse în diferite combinații, în timp ce sunt reținute schimbările efectuate pe reziduurile 24, 57, 58, 88 și 91 în versiunile prealabile. Aceste ultime versiuni sunt denumite ca HCDR4, HCDR5, HCDR6, HCDR7 și HCDR8. Schimbările de reziduuri din fiecare, sunt descrise în fig. 13. Același vector de exprimare este utilizat și cu alte construcții. Celulele COS sunt co-transfectate cu vectorii de exprimare cu o nouă catenă lungă și pEe6LCDR2gs.

Rezultatele studiilor de legare și blocare în combinație cu LCDR2 (vezi fig. 15) arată interacțiunile pozitive cu antigenul CD4în toate aceste versiuni cu excepția HCDR8. Aparent, conversiunea Tyr35 în Ser35 murinic este o schimbare critică. Schimbarea în reziduu murinic la poziția 60 para că intensifică interacțiunea antigenică (se compară HCDR6 cu HCDR4) în timp ce schimbarea la poziția 44 pare a fi inhibitor slab (HCDR5 față de HCDR4 și HCDR7 față de HCDR6).

Pentru a determina dacă schimbările reziduurilor 35 și 60 ar fi suficiente pentru legarea antigenului, HCDR9 (reziduurile murinice la pozițiile 24, 35, 57, 58, 88, 91) și HCDR1O (reziduurile murinice la pozițiile 24, 35, 57, 88, 91) a fost efectuată mutageneza parțailă directă.

Același sistem vector de exprimare este utilizat pentru aceste versiuni având catene lungi grefate pe CDR. Aceștia sunt co-transfectați în celule COS cu pEe6LCDR2gs.

Rezultatele experimentelor de legare și blocare sunt ilustrate în fig. 15 la un loc cu versiunile precedente cu catenă lungă grefată pe CDR. In mod clar, schimbările efectuate la reziduurile 42 și 44 în versiunile precedente nu sunt necesare, contrar criteriilor stabilite în PCT/US89/05857. Schimbarea la reziduul60, prezent în HCDR10, dar nu și în HCDR9, este folositoare.

Un rezumat al catenelor lungi 0KT4A grefate pe CDR și al activității lor în analizele de legare și blocare, sunt prezentate în tabelul 1. Cel mai activ anticorp 0KT4A grefat pe CDR care conține cele mai puține reziduuri murinice reprezintă o combinație de HCDR1D și LCDR2.

1060

1065

107 0

1075

1080

1085

1090

RO 114980 Bl

Tabelul 1

Catenele lungi 0KT4A grefate pe CDR și activitățile acestora

Grefat pe CDR H6	Reziduu nou schimbare +	Total reziduuri murinice++	Activi-tate de legare	Activitate de blocare
HCDR1	niciunul	niciunul	-	-
HCDR2	57,58	57,58	-	-
HCDR3	24,88,91	24,57,58,88,91	-	-
HCDR4	35,42	24,35,42,57,58,88,91	++	++
HCDR5	35,42,44	24,35,42,44,57,58,88,91	++	++
HCDR6	35,42,60	24,35,42,57,58,60,88,91	++	+++
HCDR7	35,42,44,60	24,35,42,44,57,58,60,88,91	++	++
HCDR8	42,44,60	24,42,44,57,58,60,88,91	+	-
HCDR9	35	24,35,57,58,88,91	++	++
HCDR1D	35,60	24,35,57,58,60,88,91	++	+++

+ Reziduurile sunt denumite conform numărului de poziție Kabat ++ Reziduurile murinice se referă numai la acele regiuni cadru, nu la CDRs

Construcții alternative cu catene scurte

Așa cum s-a precizat mai sus, construcțiile cu catenă scurtă prezente produse pe considerentul că la poziția 27 în catenă scurtă 0KT4A, există un reziduu de prolină. Odată ce acesta este aprecizat că poziția 27 ar reprezenta un reziduu de glutamină, trei noi construcții cu catenă scurtă sunt astfel produse și exprimate. LCDR2Q, LCDR3Q și LCDR4Q sunt marcate, fiind identice cu LCDR2, LCDR3 și respectiv LCDR4 exceptând faptul că la poziția 27 există o glutamină (Q) în loc de reziduul prolinic (P). S-a demonstrat că aceste catene scurte, păstrează completa activitate. Altele care ara tă acest fapt, sunt prezentate în fig. 16.

Este de asemenea de notat că pralina este semnificativ diferită de alți aminoacizi prin aceea că are o structură plană. De aceea s-a găsit în mod comun că la părțile secvențelor de peptide se produce o schimbare în orientarea catenei. De aceea este asemănător că structura catenei scurte CDR1 având pralină la reziduul 27, va fi semnificativ diferită de cea a catenei scurte CDR1 având glutamină la reziduul 27. In ciuda acestui fapt, s-a demonstrat că două catene scurte sunt echivalente dintr-un punct de vedere funcțional. Aceasta suportă punctul de vedere de exprimare că nu este necesar să se schimbe toate cele șase CDRs din anticorp în vederea producerii unui anticorp grefat pe CDR, funcțional.

Modificările alternative ale catenelor lungi și scurte grefate pe CDR

RO 114980 Bl

1135

Schimbările de reziduuri efectuate în versiunile ultime ale catenelor lungi și scurte grefate pe CDR au la bază modelul molecular al RE1, KOL și anticorpul referitor la șoarece, MOPC 603, mai de grabă decât anticorpii însăși, grefați pe CDR. Linele din aceste modificări nu pot fi necesare pentru legare, în special la afinități de legătură mai slabe. Astfel au fost construite diferite gene cu catene lungi și scurte în care unele din reziduurile cadru în prealabil modificate în reziduuri la șoarece, au fost schimbate înapoi la cele umane. In general, acele reziduuri care nu sunt implicate direct în lungimea CDRs sau CDRs poziționate, pot fi schimbate înapoi în reziduuri umane în diferite combinații. Tabelul 2 următor prezintă liste din aceste gene cu catene lungi și scurte cu numerele de reziduuri care revin de la murinic la uman. Mutageneza parțială directă este utilizată pentru construirea acestor gene. Acestea vor fi exprimate în celule COS, și abilitatea lor de a recunoaște CD4 va fi testată prin analize de legătură și blocare. Cel mai dezirabil anticorp grefat pe CDR este unul cu cele mai puține reziduuri murinice care este capabil de recunoaștere a CD4 cu o afinitate similară cu cea a 0KT4A murinic.

Tabelul 2 Modificările catenelor lungi și scurte grefate pe CDR

1140

1145

1150

Construcția	Schimbarea reziduului+	Reziduuri murinice totale++
Catenă scurtă LCDR3	38	33, 34, 49, 89
LCDR4	49	33, 34, 38, 89
LCDR5	89	33, 34, 38, 49
LCDR6	38, 49, 89	33, 34
Catenă lungă HCDR11	89, 91	24, 35, 47, 58, 60
HCDR12	24, 88, 91	35, 57, 58, 60

+ reprezintă reziduuri denumite de numărul de poziție Kabat. Reziduurile notate vor fi

1155

1160

1165 schimbate din secvența murinică în secvența umană ++ reziduurile murinice se referă la reziduurile în cadru, nu la CDRs.

Determinarea activității de legare relativă:

Afinitățile de legare relativă sau anticorpii monoclonali anti-CDR4 grefați pe CDR sunt determinați prin legătura de competiție, utilizându-se linia celulară T umană HPB-ALL ca sursă de antigen CD4 și 0KT4A murinic conjugat cu fluoresceină (F1-0KT4A) cu afinitate de legare cunoscută ca anticorp tracer F1-0KT4A. Afinitatea de legătură a anticorpului tracer F1-0KT4A este determinată prin analiza directă în care cantitatea crescută de F1-0KT4A este incubată cu HPB-ALL (5 x 10⁵) în PBS cu ser de vițel fetal 5% concentrație, timp de 60 min la temperatura de 40°C. Celulele sunt spălate și intensitatea fluorescenței este determinată cu ajutorul unui citometru calibrat ca debit FACScan, cu cantități microbiene stabilite. Intensitatea fluorescenței per moleculă de anticorp (raportul F/P] a fost determinată prin utilizarea microstraturilor care au un număr predeterminat la porțiunile de legătură ale anticorpului IgG la șoarece. F/P egalează intensitatea fluorescenței acestor straturi saturate cu F1-0KT4A divizate

1170

117 5

RO 114980 Bl printr-un număr de porțiuni de legătură per strat. Cantitatea de legături și F1-0KT4A liberi este calculată din intensitatea medie de fluorescentă per celulă și raportul legat liber este calculat față de numărul de moli ai legăturii anticorpului. O adaptare lineară este utilizată pentru a determina afinitatea de legătură (valoarea absolută a pantei).

Patru legături competitive, cantități crescute de anticorp competitor sunt adăugate la doza de sub-saturare a F1-0KT4A și se incubează cu 5 x 1O⁵ HPB-ALLîn 2OQ pl de PBS cu ser de vițel fetal 5% concentrație, timp de 60 min la temperatura de 4°C. Intensitățile de fluorescență ale celulelor sunt măsurate cu ajutorul citometrului debit calibrat FACScan, cu standarde microstraturi cantitative. Concentrațiile de legături și F1-0KT4A libere sunt calculate. Afinitățile anticorpilor competitivi sunt calculate din ecuația [X]-[F1-0KT4A]=(1/Kx]-(1/Ka), unde Ka este afinitatea 0KT4A murinic, Kx este afinitatea competitorului x, [] este concentrația anticorpului competitor la care raportul de legătură legat/liber este R/2 și R este legătura legat/liber, maximă.

Rezultatele de afinitate

Constantele de afinitate relativă ale anticorpilor umanizați (vezi fig. 17, tabelul 3) sunt determinate și LCDR2 combinat cu HCDR1O reține 68% din activitatea parentă. LCDR2/HCDR5 (vezi tabelul 1) reține numai 13% din afinitatea anticorpilor murinici. Aceste rezultate sunt în conformitate cu cele obținute prin analizele de blocare (vezi fig. 16a și 16b). Compararea HCDR5 cu HCDR7 (vezi fig. 15) sugerează că reziduul 60, nefiind critic pentru activitate, este folositor când se transformă în cel al secvenței donoare. în aceeași figură, efectul de distrugere al reziduului donor la poziția 44, poate fi așadar observat (HCDR4 față de HCDR5).

Tabelul 3

Constantele afinității relative ale anticorpilor grefați pe CDR

Construcții de anticorpi	Log. conc. competitor (dMI la inhibare 50%	Afinitate constantă (Kx)
□KT4A murinic	2,4	3 x 1O9
CKT4A chimeric	2,9	1,1 x 1D9
LCDR2/HCDR1O	2,6	2,1 x 1D9
LCDR2/HCDR5	3,4	□,4 x 1O9
0KT3 chimeric	nici o inhibiție
0KT3 murinic	nici o inhibiție

Studii funcționale.

Se crede că, antigenul CD4, care esre recunoscut de 0KT4A, ca și echivalenții săi chimerici și grefați pe CDR, sunt incluși în interacțiunile care se intensifică în ceea ce privește funcțiile biologice ale limfocitelor T care poartă antigenul CD4. în special, se crede că antigenul CD4 este conținut în amestecul de reacție limfocitar (MLR) și în celulele mononucleare din sângele periferic în proliferare. în vederea demonstrării că anticorpii grefați pe CDR, conform prezentei descrieri de invenție, probabil au o oarecare activitate biologică ca 0KT4A murinică sunt efectuate următoarele studii funcționale.

RO 114980 Bl

Inhibarea MLR.

PBMC uman este izolat prin centrifugare cu gradient de densitate cu Ficoll și se resuspendă în DMEM complet, conținând 1% ser de vițel fetal (FCS). Se adaugă apoi 2 x 1O⁵ PBMC și 1 x 10⁵ PBMC alogenic iradiat (2 Mrad), la fiecare din discurile cu țesuturi de cultură bune (96), urmând diluții seriale din anticorpul purificat anti-CD4. 1225 Celulele sunt aduse în cultură timp de 6 zile, pulsate cu 3 H-timidină timp de 24 h și recoltate. încorporarea a 3H-timidinei este măsurată prin scintilație lichidă.

Ca un control negativ, celulele responder iradiate sunt utilizate în locul PRMC alogenice iradiate, nefiind adăugat nici un anticorp. Ca un control pozitiv, experimentul este efectuat cu adiție de anticorp. în experiment, anticorpii utilizați sunt 0KT4A murinic, 1230 □KT4A chimeric și fragmentul F(ab’)2 din 0KT4A murinic.

Rezultatele experimentului sunt arătate în fig. 18. Atât 0KT4A chimerice cât și 0KT4A murinice arată o inhibiție similară a MLR.

Inhibarea proliferării.

0KT3 (20 ng/ml), un MAb murinic care recunoaște CD3 antigenul pe limfocitele 1235 T, este imobilizat pe polistiren, plăci de cultură tisulară bune (96) timp de 4 h la temperatura de 2O°C. Discurile sunt apoi spălate de trei ori cu fosfat salin tamponat (PBS) și apoi se adaugă 1 x 10⁵ PMBC la fiecare recipient. După aceea, sunt adăugate diluțiile seriale cu anticorpi anti-CD4. Celulele se aduc în cultură timp de 72 h, pulsate cu 3H-timidina timp de 24 h și se recoltează. 3H-timidina încorporată este măsurată prin 1240 scintilație lichidă.

Ca control negativ, proliferarea este măsurată în absența anticorpilor 0KT3 și anti-0KT4. Ca control pozitiv, proliferarea este măsurată în prezența numai a 0KT3. în acest experiment, anticorpii utilizați sunt 0KT4A murinic, CKT4A chimeric și fragmentul F(ab')2 din 0KT4A murinic. 1245

Rezultatele experimentului sunt prezentate în fig. 19 care arată că 0KT4A chimeric are substanțial aceeași abilitate de inhibare a proliferării ca și 0KT4A murinic.

Studiile funcționale de mai sus arată că 0KT4A chimerice au proprietăți bilogice echivalente cu 0KT4A murinic. Deoarece anticorpii anti-0KT4 grefați pe CDR au substanțial aceeași afinitate pentru antigenul CD4 ca și anticorpul 0KT4A chimeric, și 1250 deoarece anticorpul 0KT4A chimeric are aceleași domenii constante ca și anticorpii 0KT4 grefați pe CDR, este de așteptat ca anticorpii 0KT4 grefați pe CDR să aibă aceleași funcții biologice ca 0KT4A murinic și astfel va fi de folos în terapie.

Sumar.

Un număr de anticorpi 0KT4 diferit grupați pe CDR au fost generați. în esență, 1255 ADN codifică CDRs pentru 0KT4A murinic cu catene lungi și catene scurte care se grefează pe cadrul catenei umane lungi KOL și genele anticorpului REI cu catenă scurtă. Aceste domenii variabile sunt legate la ADN codificând porțiunea constantă cu catene lungi lgG4 și catene scurte kappa umane. Genele rezultate grefate pe CDR sunt exprimate prin celulele 1260

COS-1. Anticorpul secretat în mediul de cultură tisular este colectat, cuantificat prin ELISA și testat pentru abilitatea sa de legare la celulele pozitive CD4 și de blocare a legăturii cu 0KT4A murinic.

Anticorpul grefat pe CDR desemnat inițial este incapabil să interacționeze cu CD4.

Un număr de modificări sunt făcute la catena scurtă, când reziduurile cadru umane 12 65 critice în secvențela REI, identificate prin modelul molecular, sunt schimbate în reziduurile

RO 114980 Bl murinice 0KT4A. Această versiune nouă a catenei scurte, LCDR2, este capabilă de a recunoaște antigenul CD4. în mod similar, un număr de reziduuri cadru umane cu catenă lungă sunt schimbate în murinice prin diferite combinații pentru a genera HCDR2 până la HCDR1O. Diferite catene lungi, în combinație cu LCDR2, au bună competiție față de anticorpul 0KT4A murinic pentru CD4. 0KT4A grefat pe CDR prezent în selecție este în combinația LCDR2Q și HCDR1O. Alte versiuni ale catenelor lungi și scurte sunt curent generate când reziduurile cadru care sunt recent modificate în reziduuri murinice sunt schimbate înapoi în reziduuri umane. Acești anticorpi grefați pe CDR mult mai umanizați vor fi testați pentru abilitatea lor de recunoaștere a CD4.

Claims (28)

1. Revendicări

   1. Moleculă anticorp, capabilă să se lege la antigena CD4, care conține o catenă lungă compozită și o catenă scurtă complementară sau conține o catenă scurtă compozită și o catenă lungă complementară, caracterizată prin aceea că, în domeniul variabil al numitei catene lungi compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant de la un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 23, 24, 26 până la 35, 49 până la 65 și 95 până la 1D2, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un al doilea anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece (donor) așa cum se arată în fig. 3, iar în domeniul variabil al numitei catene scurte compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant dintr-un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 24 până la 34, 49 până la 56 și 89 până la 97, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece(donor) așa cum se arată în fig. 4.
2. 2. Moleculă anticorp, capabilă să se lege la antigena CD4, care conține o catenă lungă compozită și o catenă scurtă complementară, caracterizată prin aceea că, în domeniul variabil al numitei catene lungi compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant de la un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 23, 24, 26 până la 35, 49 până la 65 Si 95 până la 102, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un al doilea anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece (donor) așa cum se arată în fig.3.
3. 3. Moleculă anticorp conform revendicărilor 1 și 2, caracterizată prin aceea că reziduurile 6 și 48 din catena lungă compozită corespund suplimentar reziduurilor din anticorpul donor.
4. 4. Moleculă anticorp conform revendicării 1 sau 3, caracterizată prin aceea că reziduurile 71, 73 și 79 din catena lungă compozită corespund suplimentar reziduurilor echivalente din anticorpul donor.
5. 5. Moleculă anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 4, caracterizată prin aceea că oricare din toate combinațiile reziduurilor 57, 58, 60, 88 și 91 din catena lungă compozită corespund reziduurilor echivalente din anticorpul donor.
6. 6. Moleculă anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la I până la 5, caracterizată prin aceea că reziduul acceptor din catena lungă compozită corespunde reziduurilor echivalente din catena lungă KOL umană, așa cum se arată în fig. 5.

   RO 114980 Bl

   1315
7. 7. Moleculă anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 6, caracterizată prin aceea că, catena scurtă complementară este o catena scurtă compozită, în care în domeniul variabil al acestei catene scurte compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant de la un prim anticorp (acceptor) și cel puțin reziduurile 24 până la 34, 49 până la 56 și 89 până la 97, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece (donor) așa cum se arată în fig. 4.
8. 8. Moleculă anticorp, capabilă să se lege la antigena CD4, care conține o catenă scurtă compozită și o catenă lungă complementară, caracterizată prin aceea că, în domeniul variabil al numitei catene scurte compozite, regiunile cadru sunt derivate predominant dintr-un anticorp uman (acceptor) și cel puțin reziduurile 24 până la 34, 49 până la 56 și 89 până la 97, conform cu sistemul de numerotare Kabat, corespund reziduurilor echivalente dintr-un anticorp 0KT4A monoclonal de șoarece(donor) așa cum se arată în fig. 4.
9. 9. Moleculă anticorp conform revendicării 7 sau 8, caracterizată prin aceea că reziduul 89 din catena scurtă compozită corespunde suplimentar reziduului echivalent din anticorpul donor.
10. 10. Moleculă anticorp conform cu oricare dintre revendicările de la 7 până la 9, caracterizată prin aceea că reziduurile acceptoare din catena scurtă compozită corespund reziduurilor echivalente din catena scurtă REI umană, așa cum se arată în fig. 6.
11. 11. Moleculă anticorp, onform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 10, caracterizată prin aceea că are o afinitate pentru antigena CD4 de la 1O⁵.M'¹ până la 1O¹².M’¹.
12. 12. Moleculă anticorp, nform revendicării 11, caracterizată prin aceea că are o afinitate pentru antigena CD4 de cel puțin 1O⁸.M‘¹.
13. 13. Moleculă anticorp,conform revendicărilor 11 sau 12, caracterizată prin aceea că are o afinitate pentru antigena CD4 similară cu cea a 0KT4A.
14. 14. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 la 13, caracterizată prin aceea că este o Ig completă.
15. 15. Moleculă anticorp, conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că este izotip lgG₄.
16. 16. Moleculă anticorp, conform revendicării 14 sau 15, caracterizată prin aceea că unul sau mai multe reziduuri din domeniile constante ale Ig au fost modificate în scopul alterării funcțiunilor efectoare ale domeniilor constante.
17. 17. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 16, caracterizată prin aceea că este obținută prin utilzarea tehnologiei ADN recambinante.
18. 18. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 la 17, caracterizată prin aceea că se utlizează în terapie, și anume în tratamentul respingerilor de grefă sau în tratameentul tulburărilor celulelor T helper.
19. 19. Secvență de nucleotide, caracterizată prin aceea că, codifică o catenă de anticorp compozită, așa cum aceasta este definită în oricare dintre revendicările de la 1 până la 10 și este prezentată în fig. 1 și fig. 2.
20. 20. Metodă pentru tratamentul respingerii unei grefe sau a unei afecțiuni a celulei T helper, caracterizată prin aceea că intervenția asupra organismului viu se realizează

    1320

    1325

    1330

    1335

    1340

    1345

    1350

    1355

    RO 114980 Bl direct cu un anticorp grefat CDR conform revendicării 1, împreună cu un purtător sau suport acceptabile din punct de vedere farmaceutic, administrat pe căi convenționale, într-o doză zilnică de 0,004 până la 5 mg/kilocorp, de preferință de la 0,05 până la 2 mg/kilocorp.
21. 21. Procedeu pentru prepararea unei molecule anticorp capabile să se lege la antigena CD4, caracterizat prin aceea că cuprinde:

    ajfurnizarea unei prime secvențe ADN, care codifică o catenă lungă compozită așa cum aceasta este definită în oricare dintre revendicările de la 1 până la 5 sau o catenă scurtă compozită așa cum aceasta este definită în oricare dintre revendicările de la 7 până la 10, sub controlul elementelor corespunzătoare din partea superioară și inferioară;

    b] transformarea celulei gazdă cu prima secvență ADN; și

    c) cultivarea celulei gazdă transformate astfel încât să se producă o moleculă anticorp conform cu oricare dintre revendicările de 1a 1 până 1a 17.
22. 22. Procedeu conform revendicării 21, caracterizat prin aceea că mai cuprinde:

    a) furnizarea unei a doua secvențe ADN, care codifică o catenă scurtă sau lungă de anticorp complementară fără de prima catenă, sub controlul elementelor corespunzătoare din partea superioară și inferioară; și

    b) transformarea celulei gazdă atât cu prima cât și cu cea de a doua secvență ADN.
23. 23. Procedeu conform revendicării 22, caracterizat prin aceea că cea de a doua secvență ADN codifică o catenă de anticorp compozită.
24. 24. Procedeu conform revendicării 22 sau 23, caracterizat prin aceea că prima și a doua secvență ADN sunt prezente în același vector.
25. 25. Procedeu conform revendicării 24, caracterizat prin aceea că secvențele sunt sub controlul acelorași elemente superioare și/sau inferioare.
26. 26. Procedeu conform revendicării 24, caracterizată prin aceea că secvențele sunt sub controlul unor elemente superioare și/sau inferioare diferite.
27. 27. Procedeu conform revendicării 22 sau 23, caracterizat prin aceea că prima și a doua secvențe ADN sunt prezente în vectori diferiți.
28. 28. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările de la 21 până la 27, caracterizat prin aceea că celula gazdă este o celulă CHO.