JPH03220101A - 試料冷却方法とその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生体細胞の試料保存技術、特に、試料冷却方
法とその装置（ｓｙｓｔｅｍ）に関する。

［従来の技術］ 生体細胞の保存は非常に重要な科学分野である特に、組
繊細胞、精子、受精卵子の長期保存は、極めて重要であ
る。細胞を極低温まで冷却し、その温度で保存する方法
がよく使用される。

冷却は、結晶の大きさを押さえるように注意深（行われ
る必要がある。これは結晶が大きくなって細胞が損傷を
受けやすくなるのを防ぐためである冷却過程において、
約−４０ないし−５０”Ｃあたりまでが、結晶成長の限
界温度である。　この温度範囲での正確な冷却制御は、
試料の成育にとって重要である。　最大臨界温度は、約
ｏ℃から一８°Ｃまでである。この温度範囲で、試料は
冷却中融合熱を発散する。つまり、この温度で、プログ
ラムされた冷却勾配を保つため除去されるべき熱量が著
しく増加する。結果として、この温度範囲で所望の冷却
率を維持するためには、正確に制御された割合で、熱を
除去することが要求される。　−度、試料が、約−４０
℃ないし一５０’Ｃ以下まで冷却されれば、結晶形成は
もはや問題ではなく、冷却率の正確な制御もそれほど必
要でない。

異なった細胞の配列に対しては、冷却のパラメータも異
なってくる。　したがって、異なった細胞配列に関する
冷却プログラム〔温度、速度、時間）もまた、異なった
ものとなる。

現在、細胞の冷却を達成するために、二つの方法が使わ
れている。　液体ガス（液体窒素が代表的）による冷却
と、機械的な冷却方法である。

液体窒素が使われる場合には、非常に大きな温度勾配を
得ることができる。例えば、初期冷却率が、８０℃／分
　が可能である。　試料は通常、液体窒素の入った容器
に浸漬する。　この方法は、非常に大きな冷却率が得ら
れる反面、冷却率の制御ができない。　また、液体窒素
には取り扱い上の問題もある。

液体ガス（液体窒素）の蒸気を利用することでより制御
性の良い冷却を行うことができる。

この場合、冷却すべき試料は、液体窒素を含んだ容器の
中に置かれるが、液体との物理的な接触はない。液体窒
素から出る冷却蒸気は、冷却にとって有効ではあるが、
この方法は、ガスの熱容量が低いため問題となる。　従
って、試料全体にわたって、均一な冷却率と温度を維持
することは難しい。

機械的冷却方式では、試料容器の周囲の壁に、冷却コイ
ルを設けた冷却装置を使う。　試料容器内の熱伝導物質
（例えば、エタノール）が、試料から冷却コイルへの熱
伝導を司っている。　この方法は、液体窒素を必要とせ
ず、少なくとも一８０℃までの冷却が可能である。　し
かし、実現可能な熱勾配は、　せいぜい２〜ｂ る。　多くの生体試料において、−４０’Ｃ以上の臨界
温度で、結晶が損傷を及ぼす大きさまで成長するのを防
ぐためには、この熱勾配では不十分である。

［発明の目的］ 本発明の目的は、高い温度勾配を実現可能とす試料冷却
方法とその装置を提供することにある。

また、本発明の目的は、液体窒素の取り扱いを必要とし
ない試料冷却装置を提供することにある上述したとおり
、細胞保存装置は、冷却液槽内に貯蔵した予め冷却した
冷却液を使用し、制御された割合で、試料容器に送り込
むものである。

また、この発明は、冷却速度を制御でき、試料内の結晶
成長を制御できる。

本発明の実施例において、試料冷却装置は、冷却液、試
料槽、冷却液槽、試料容器及び冷却液槽内の冷却液、冷
却液を試料槽と冷却液槽の間で循環させる機構、冷却液
槽の冷却液を冷却する機構試料槽の試料を予め設定した
割合で冷却するために、循環機構そのものを制御する機
構から構成される。

また、この発明によれば、試料冷却方法は、冷却すべき
試料を試料槽に配設し、冷却液槽内の冷却液を冷却し、
冷却液を予め設定した割合で、冷却液槽と試料槽を通し
て循環させ、予め設定した冷却速度を得るために十分な
熱容量を供給できるように、冷却液槽の大きさを調整す
る（ｓｉｚｉｎｇ）構成になっている。

［実施例］ 第１図は、本発明の一実施例である細胞保存装置１０の
ブロック図である。　冷却する試料を有る試料容器１２
が、予め冷却された冷却液（クーラント）を貯えた冷却
液槽１４と連絡して配設されている。　冷却液は冷却液
槽１４と接続した冷却装置１６によって、予め冷却され
ている。　冷却液槽１４は密封され、冷却液で満たされ
ている冷却液は、試料槽１２の上部から冷却液槽１４へ
、ポンプ１８によって輸送される。　冷却液槽１４は、
遮蔽されているので、冷却液槽１４の上部への冷却液の
流入は、その下部から試料槽１２へ予め冷却された冷却
液の流れを生じさせる。

そして、この冷却液は試料槽１２内の冷却液と熱交換す
る。　試料槽１４内の冷却液の初期温度と熱容量及びポ
ンプ１８による冷却液の循環速度が、試料槽１２内の試
料の冷却速度を決定する。

つまり、もし、ポンプ１８が停止した場合は、試料槽１
２内の試料の冷却は、試料槽１２の内部に存在する熱伝
導媒体の熱容量と温度によって制限される。　ポンプ１
８が高速度で稼働している場合は、冷却液槽１４の全熱
容量が試料の冷却のために有効である。　ポンプ１８が
中間速度で動いている場合は、中程度の冷却速度が得ら
れる。

ポンプＩ８のボンピング速度は、コントローラ２０によ
って制御される。

ここで、ポンプ１８が、試料槽１２の上部に近い位置か
ら冷却液を引き出し、引き出された冷却液は、試料槽１
２の下部に戻される。　これは、多くの好ましい効果を
もたらす。　第一に、ポンプ１８によって生じたいかな
る摩擦熱も、試料槽１２よりも冷却液槽１４に移転され
るからであるまた、冷却液を試料槽１２の上部から引き
出し、新たに冷却された冷却液を試料槽１２の下部に流
入させることで、試料室１２の中に、後述するような、
冷却液の層状の温度分布を形成する。

第２図には、試料槽１２の中に冷却液２４を有する細胞
保存装置１０が図示されている。　冷却液槽１４は、冷
却装置１６によってすでに冷却されている冷却液２４で
満たされている。

本発明では、冷却液として適当なものであればいかなる
ものでも使い得る。　冷却液は、この装置内での最低温
度においても液状を保ち、装置内に配設した試料に対し
ては、無害でなければならない。　適当な冷却液として
は、エタノールやシリコン油がある。　冷却すべき試料
を含んだ試料容器２６は、試料１ｉ１２の中に配設され
ている。　試料容器２６は、冷却を行う冷却液２８によ
り包囲されている。　冷却速度は、コントローラ２０に
よって制御され、ポンプ１８の速度を変えることでｆｌ
ｉｌｌ　（卸される。

従来どおり、試料容器２６の中には、試料の他に、低温
保存流体が含まれている。　この低温保存液の使用法は
、従来どおりなので、これ以上の説明は省略する。

試料容器２６内の試料と冷却液２４の間で、高効率の熱
交換を確保するために、予め冷却した冷却液２４は、試
料槽１２の下部に設けた注入管３４を通して、試料槽１
２に送られる。　試料容器２６との接触によって加熱し
た冷却液は、試料槽１２の上部に設けた排出管３６を通
して排出される。冷却液２４の全容量の均一な温度分布
を得るために、試料槽１２内に磁気撹拌子’３０を設け
ている。　磁気撹拌子３０は、強磁性の物体で、そのま
ま試料槽１２内に設けるか、あるいは、ベアＪングに保
持して回転できるようにしてもよい。

永久磁石３１は、試料槽１２の外部で、撹拌モータ３２
によって回転する。　試料槽１２の外部にある永久磁石
３１と、試料槽１２の内部に置かれた強磁性の撹拌子３
０との磁気結合によって、攪拌子３０が回転し、冷却液
の極めて均一な温度分布が得られる。

コントローラ２０は、予め冷却した冷却液２４を試料槽
１２に供給する際の速度を制御している従って、試料槽
１２内の冷却速度を太き（したい場合には、ポンプ１８
の稼働速度を太き（すれば良い。　この方法によって、
好みの冷却速度を得ることができる。　更に、冷却速度
を試料ごとに変えることも、特定の試料を冷却するため
異なった冷却速度に変えることもできる。

ここで留意すべきことは、磁気撹拌子３０が、冷却液２
４の温度分布を、試料槽１２内全体に亙り均一に保つこ
とである。　冷却過程のある時点では、最大の冷却効率
を得るために、磁気撹拌子３０を止めることが望ましい
。　これは、そうすることで、試料槽１２内に温度成層
（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａ−ｔｉｏｎ）が形成されるから
である。　つまり、低温の冷却液２４が試料槽１２の底
部付近゛に流れ込みその上に暖まった冷却液をのせてし
まうため、冷却液が冷却液槽１４を離れた時の温度で冷
却液２４に漬けられる。

コントローラ２０は、開回路で駆動で−きる。

つまり、試料容器２６の周囲で得た温度をフィードバッ
クすることな（駆動できる。　開回路の一実施例として
は、コントローラ２０が、前もって設定された時間割に
従ってポンプ１８のポンピング速度を制御するマイクロ
プロセッサを含んだものがある。　この時、時間割は、
試料容器２６内の試料の種類あるいは大きさによって、
作業者によって設定される。　あるいは、閉回路制御も
可能である。　例えば、従来の温度感知器（プローブ）
３８を使ったものがそれである。

この他のフィードバック方法としては、温度感知器３８
の代わりに、あるいは、それに加えて、温度感知器（図
示せず）を含んだダミー試料容器４６を供給する方法が
ある。　ダミー試料容器４６の中の温度感知器からの信
号は１．コントローラ２０へ送られる。　ダミー試料容
器４６には、試料容器２６と同様の温度と熱容量を持っ
た材料を入れておくことが望ましい。　つまり、ダミー
試料容器４６内の温度が、試料容器２６内の温度に十分
に追従するようにする。

また、試料容器２６内に、温度感知器（図示せず）を挿
入して、温度を直接測定することも可能である。

試料槽１２には、熱損失を防ぐために、外側に断熱部材
４０を設けることが望ましい。　同様に冷却液槽１４に
も断熱部材４２を外部に設けることが望ましい。　この
場合、冷却コイル４４は冷却液槽１４の外側、断熱部材
４２の下に設ける。　あるいは、他の方法として、冷却
コイル４４を冷却液槽１４の中に浸すか、槽の内壁に張
りつけることもできる。

冷却液槽１４の大きさ、試料槽１２の大きさ、冷却装置
１６の冷却能力、試料容器２６から取り去られる熱量と
その速さ、そして細胞保存装置の処理量は相互関係のパ
ラメータである。　冷却液ｔ１１４の中の冷却液２４は
、所望の冷却速度を得るために、−通りの冷却工程が終
了するまで十分低い温度に保っておく必要がある。　従
って、冷却液槽１４中の冷却液２４の初期基量及び初期
温度は、冷却液槽１４内の冷却液２４が、試料容器２６
内の試料の温度を所望の冷却速度で、所望の値まで下げ
るのに必要なすべての熱を吸収できる十分の容量を得ら
れるように設定しなければならない。

１時間当たりに処理できる試料数は、冷却装置１６の冷
却能力に左右される。　標準状態において、冷却装置１
６は、連続稼働される。　試料の冷却中に、冷却液槽１
４内の冷却液２４の温度が上昇するが、これは冷却装置
１６が、所望の冷却速度で試料を冷却するのに十分な容
量を持っていないためである。１個以上の試料を冷却し
た後で冷却液槽１４内の冷却液２４の温度は上昇してそ
れ以上の試料を効率的に冷却できなくなっている。　そ
こで、冷却工程は冷却液ｔ１１４内の冷却液の温度を、
別の試料を冷却できる温度に下げる必要がある。

冷却液槽１４の大きさ、試料槽１２の大きさ、ポンプ１
８の送給制御、冷却装置１６の冷却能力試料の処理量（
スルーブツト）は、相互に依存するパラメータである。

　これらの相互依存するパラメータが明らかになり、細
胞保存装置１０がそれに応じて設計されれば、液体窒素
の欠点に影響されず、所望の速度で試料を制御、冷却す
ることができる。

当業者に自明のとおり、永久磁石３１の使用は、試料槽
１２内の磁気撹拌子３０を回転させるための回転磁場形
成のための一例に過ぎない。　磁気撹拌子３０を磁気的
に駆動する他の方法も、この発明の範囲に包含される。

　例えば、複数のコイル（図示せず）を永久磁石３１と
駆動モータ３２の代わりに使うこともできる。　この場
合、コントローラ２０は、磁気コイルを駆動させるため
信号を発信して、磁場を作動させ、その影響下で磁気撹
拌子を駆動させる。　なお、磁場は回転磁場であること
が望ましい。　これは何らかの目的により往復ａｉ場を
除去してはならないからである冷却過程における正確な
制御は、一定の段階での加熱工程を加えることによって
実現される。

更に、ひとつの試料の冷却が完了して次の試料の準備を
する際に、試料槽１２内の冷却液２４の温度を上げてお
くことが望ましい。　この目的、あるいは、他の目的の
ため電気加熱器４８を試料槽１２の内側に設けることも
可能である。

電気加熱器４８は、手動制御でも良いが、コントローラ
２０による自動制御が望ましい。

電気加熱器４８はまた、試料の加熱制御に用いることも
できる。

以上、本発明の実施例を図面に従い説明したがその具体
的構成はこの発明の範囲内で種々変更可能である。

［発明の効果］ この発明によれば、試料冷却装置は、冷却液と、試料槽
と、冷却液槽と、試料容器及び冷却液槽内の冷却液と、
冷却液を試料槽と冷却液槽の間で循環させる循環機構と
、冷却液槽の試料を予め設定した割合で冷却するために
、循環機構そのものを制御する制御機構から構成されて
いるので、常に正確で均一な冷却率を得ることができ、
冷却の制御性に優れている６したがって、細胞等の試料
の結晶増大を防止することができ、試料を長期に冷却保
存できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のブロック図、第２図は、本発明に係
る試料冷却装置の一実施例の概略構成図である。 １０゜ １４゜ １８゜ ２４゜ ３０゜ 、細胞保存装置、 冷却液槽、　　１６゜ ポンプ、　２０゜ 冷却液、　　２６゜ 、ｌ１ｆｉ気撹拌子、　　３１ １２、、、試料槽、 冷却装置、 コントローラ１ 、試料容器１ １６．永久磁石、 ３２゜ ４８゜ 撹拌モータ、 電気加熱器 ３８゜ 温度感知器

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）試料槽と、 冷却液槽と、 前記試料槽及び前記冷却液槽内の冷却液と前記試料槽と
   前記冷却液槽の間で冷却液を循環させる循環機構と、 前記冷却液槽内の前記冷却液を冷却するための機構と、 前記試料槽内の前記試料を予め設定された冷却速度で冷
   却するため、前記循環機構を制御するための機構から構
   成される試料冷却装置。 （２）前記試料槽内の前記冷却液を撹拌して、前記試料
   槽内全体に実質的に均一な温度分布を得るための撹拌機
   構を具備した特許請求の範囲第１項記載の試料冷却装置
   。 （３）前記撹拌機構は、 前記試料槽内の磁気撹拌子と、 前記試料槽内に可動磁場を発生させるための機構からな
   り、 前記磁気撹拌子と前記可動磁場を磁気的に結合して、前
   記磁気撹拌子が前記冷却液を撹拌して、前記試料槽内を
   可動するようにした特許請求の範囲第２項記載の試料冷
   却装置。 （４）前記循環機構は、 ポンプを具え、 前記冷却液槽は密封されており、 前記ポンプは、前記冷却液を前記試料槽から前記冷却液
   槽に送るよう接続されており、更に前記冷却液槽内で生
   じた圧力で前記冷却液を前記冷却液槽に送給し、その冷
   却液を冷却液槽から試料槽に強制的に送給する機構から
   なる特許請求の範囲第１項記載の試料冷却装置。 （５）少なくとも前記循環機構を、所定の冷却速度を得
   られる循環速度で循環できるように制御可能なコントロ
   ーラを具えた特許請求の範囲第１項記載の試料冷却装置
   。 （６）前記循環速度がゼロである特許請求の範囲第５項
   記載の試料冷却装置。 （７）前記制御装置は、 ポンプを具え、 前記ポンプは、前記冷却液を前記冷却液槽と前記試料槽
   の間で循環させるよう接続されており、また、 コントローラと、 前記試料槽内の温度の感知機構を具え、 前記コントローラは、前記温度に反応して 、前記ポンプのポンピング速度を制御するようにした特
   許請求の範囲第１項記載の試料冷却装置。 （８）前記試料槽内に加熱器を具えた特許請求の範囲第
   １項記載の試料冷却装置。 （９）試料槽と、 冷却液槽と、 前記試料槽と前記冷却液槽内の冷却液と、 冷却装置と、 前記冷却装置が、前記冷却液槽内の前記冷却液を予め冷
   却できる機構と、 冷却液ポンプを具え、 前記冷却液ポンプが、前記冷却液槽と前記試料槽の間で
   冷却液を循環できるようにするとともに、 前記冷却液ポンプを制御して、前記試料槽内の温度を制
   御するための機構を具えた試料冷却装置。 （１０）前記冷却液ポンプは、前記冷却液を前記試料槽
   から前記冷却液槽に送るようにした特許請求の範囲第９
   項記載の試料冷却装置。 （１１）前記冷却液ポンプは、前記冷却液を前記冷却液
   槽の上部から送り出すようにした特許請求の範囲第１０
   項記載の試料冷却装置。 （１２）前記冷却液槽は密封され、冷却液の送り出しは
   、前記冷却液槽から前記試料槽への冷却液の強制送給で
   きる圧力を生成させる特許請求の範囲第９項記載の試料
   冷却装置。（１３）前記冷却液は、前記試料槽の底部に
   流れ込むようにした特許請求の範囲第９項記載の試料冷
   却装置。 （１４）前記試料を試料槽内に配設し、 冷却液を冷却液槽内で予め冷却し、 前記冷却液槽と前記試料槽を介し冷却液を所定の冷却速
   度で前記試料を冷却できるポンプ速度で循環させ、 前記冷却速度を得るに十分な熱容量を供給して、前記冷
   却液槽の容量を制御するようにした試料冷却方法。 （１５）前記循環工程は、前記冷却液を前記試料槽の下
   部に流し込むようにした特許請求の範囲第１４項記載の
   試料冷却方法。 （１６）実質的に均一な温度分布を得るため、前記試料
   槽内で冷却液を撹拌する工程を具えた特許請求の範囲第
   １４項記載の試料冷却方法。 （１７）前記撹拌工程は、前記試料槽内の磁気撹拌子を
   磁気的に可動する特許請求の範囲第１６項記載の試料冷
   却方法。 （１８）前記磁気可動工程は、前記試料槽外部の磁石を
   回転させる特許請求の範囲第１７項記載の試料冷却方法
   。 （１９）前記試料槽内の前記冷却液を加熱する特許請求
   の範囲第１４項記載の試料冷却方法。 （２０）前記加熱工程は、前記試料槽内の前記冷却液の
   温度を別の試料の冷却を開始するに適した温度に上昇さ
   せるようにした特許請求の範囲第１９項記載の試料冷却
   方法。