JPH0322156B2 - - Google Patents
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- JPH0322156B2 JPH0322156B2 JP58015515A JP1551583A JPH0322156B2 JP H0322156 B2 JPH0322156 B2 JP H0322156B2 JP 58015515 A JP58015515 A JP 58015515A JP 1551583 A JP1551583 A JP 1551583A JP H0322156 B2 JPH0322156 B2 JP H0322156B2
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- poa15
- plasmid
- streptomyces
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- atcc10137
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なプラスミドに関し、さらに詳し
くは、或る種の放線菌に対してポツク（pock）
形成能を付与する特性をもつ放線菌由来の環状プ
ラスミドに関する。 染色体外遺伝子であるプラスミドは、遺伝子操
作において有用な遺伝子をクローン化するための
ベクターとして有用である。 従来、組換えDNAの研究分野では、宿主とし
ては主に大腸菌及び枯草菌が使用され、また、ベ
クターとしてはpBR322及びブドウ球菌由来の
pUB110等が用いられている。 他方、放線菌は有用な抗生物質や生理活性物質
の生産菌として重要であり、遺伝子操作による菌
株の改良によつて抗生物質や生理活性物質の生産
量の増大や新規な有用物質の創生の可能性が秘ら
れており、期待されるところが大きく、最近注目
されている。放線菌由来の遺伝子組換え操作にお
いては、その宿主もベクターも放線菌由来のもの
を利用することが望ましいと考えられ、これ迄、
放線菌由来のプラスミドとしてpUC1〜10等数多
く報告されている（例えば、特開昭55−133396
号、同55−133397号、同55−120600号公報等参
照）が、これらは特定の選択マーカーを持たず、
クローニングベクターとして不適当である。これ
に対してSCP2＊及びSLP1系プラスミドはそれぞ
れ、ストレプトミセス・セリカラー
（Streptomyce coelicolor）及びストレプトミセ
ス・リビダンス（S.lividans）にポツク形成能を
付与し、実際種々の薬剤耐性遺伝子のクローン化
に使用されている（Bibb、M.、et al.、Nature、
284、526〜531、1980.；Thompson、C.J.、et
al.、Nature、286、525〜527、1980.；
Thompson、C.J.、et al.、J.Bacteriol.、151、
669〜677、1982.）。しかし、これらの宿主はスト
レプトミセス・セリカラーまたはストレプトミセ
ス・リビダンスに限定され、他の重要な種々多様
な抗生物質生産菌中では複製維持されず、ベクタ
ーとして応用範囲が狭いという難点がある。 本発明者らは、或る種の放線菌に対してポツク
形成能を付与するという選択マーカーとしての性
質をもち、宿主内で安定で且つコピー数が適度に
多い放線菌由来のプラスミドを得るべく、ストレ
プトマイシン生産菌であるストレプトミセス・グ
リセウス（S.griseus）ATCC10137を宿主菌とし
て選び、各地の土壌から分離した放線菌のプラス
ミドの中から上記のストレプトミセス・グリセウ
スに対してポツク形成能を付与するものを形質転
換によつて検索した結果、今回、コピー数約20
個／染色体、ストレプトミセス・グリセウス内で
脱落頻度が１生活史当り約0.6％を示す如く安定
であり更に大きさが適当であり、且つ、クロニー
ングに有用と考えられる制限酵素部位として
BamH及びEcoR等を有する新規なプラスミ
ドを見い出し、本発明を完成した。 しかして、本発明によれば、ストレプトミセ
ス・グリセウスATCC10137に対してポツク形成
能を付与する性質を有し、分子量が約10.4kbであ
り、且つ下記の制限酵素に対して下記の感受性を
示す、すなわち (a) BamHによる認識部位が１ケ所であり、 (b) EcoRによる認識部位が１ケ所であり、 (c) Salによる認識部位が５ケ所であり、 (d) Bgl、Hind、Kpn、Pst及びXba
により切断されない ことを特徴とするプラスミドpOA15が提供され
る。 本発明のプラスミドpOA15は、ストレプトミ
セス・グリセウスATCC10137に対してポツク形
成能を付与する性質があり、ここで「ポツク形
成」とは、ある種のプラスミドを保持している菌
株を当該プラスミドを保持していない同じ種に属
する菌株と接触する状態で生育させた場合、該プ
ラスミド非保持菌の気菌糸または胞子の形成が阻
害される現象をいう。 本発明のプラスミドpOA15におけるポツク形
成の特徴は次のようである。プラスミドpOA15
をもたないストレプトミセス・グリセウスの胞子
108個を５mlの減菌水に懸濁する。次にプラスミ
ドpOA15を有するストレプトミセス・グリセウ
スの胞子104個を５mlの減菌水に懸濁する。両者
の懸濁液各１mlを混合し、その0.05mlを栄養寒天
培地（ブイヨン寒天培地、栄研化学(株)）の入つた
シヤーレ上に広げた後、28℃で７日間培養する。
このシヤーレを真上から観察すると、プラスミド
pOA15を持たないストレプトミセス・グリセウ
スの生育菌叢の中に数個〜数十個の直径0.5mm〜
1.5mmの円形の半透明ゾーンが見られる。これが
ポツクである。この反透明のゾーンの中には僅か
に菌糸が生育している。この部分から細かい白金
線で菌糸をとり、別の栄養寒天培地に移すことに
より、プラスミドpOA15を有する菌株を取得す
ることができる。 また、本発明のプラスミドpOA15はアガロー
ス・ゲル電気泳動法により測定した分子量が約
10.4kbであり、この分子量はR.W.Davisらのホル
ムアミド法（Methods in Enzymology、
Vol.21、413〜428、1971参照）に従いスタンダー
ドとしてpBR322（4362bp）を用い電子顕微鏡
（Hitachi HS−7D使用）観察によつて測定した
場合の分子量（10.4±0.3kb）と大体一致してい
る。しかして、本明細書においていう分子量はア
ガロース・ゲル電気泳動法により測定した分子量
を意味するものである。 さらに、本発明のプラスミドpOA15の各種制
限酵素に対する感受性は上記(a)〜(d)に示すとおり
であり、より詳細に各制限酵素による分解断片の
分子量（kb）は次のとおりである。 (a) BamH：10.4 (b) EcoR；10.4 (c) Sal：3.0；2.2；2.1；1.8；0.8 また、ダブル・ダイゼツシヨン（double
digestion）によつて決定した本発明のプラスミ
ドの制限酵素地図は添付の第１図に示すとおりで
ある。図中の数字は分子量（単位：kb＝キロベ
ースペア）である。図から明らかなように、本発
明のプラスミドpOA15のBamH又はEcoRサ
イトは、外来DNAのクローニング部位に適して
いると考えられる。 以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミ
ドpOA15は、吹田市のある土壌から分離された
ストレプトミセス属に属し、本発明者等によつて
ストレプトミセス・エスピー・OA15と命名され
た菌株から分離、精製される。 本菌株の菌学的性状は下記の通りである。 (a) 形態 分枝は単純分枝であり、車軸分枝はみられな
い。胞子連鎖の胞子数は少く、その形態は不完
全ならせん状、ループ状（loops）、カギ状
（hooks）を呈する。連鎖の長いものも見られ、
それは直状である。しばしば胞子の数ケが合体
しているのが認められた。胞子の表面構造は平
滑（Smooth）である。鞭毛胞子及び胞子のう
は認められない。 (b) 次の各培地における生育状態（特にことわら
ないかぎり28℃培養） 【表】 (c) 各生理的性質 (1) 生育温度：20〜37℃に生育、45℃では生
育できない。 (2) ゼラチンの液化：陽性（20℃培養） (3) スターチの加水分解：陽性 (4) 脱脂牛乳の凝固：陰性、ペプトン化：
陰性 (5) メラニン様色素の生成：陽性（ペプト
ン・酵母エキス鉄寒天、チロシン寒天及びト
リプトン・酵母エキスブロス培地のいづれも
陽性） (d) 次の炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリー
プ寒天培地上） Ｌ＝アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−フラクトース、シユクロース、
イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフイノー
ス、及びＤ−マンニツトを利用する。 上記の菌株は茨木県竹筑波郡谷田部町東１丁目
１番３号の工業技術院微生物工業技術研修所に、
昭和58年１月27日付で、受託番号：微工研菌寄第
6889号にて寄託されている。 本菌株からの前記プラスミドの分離・精製は、
それ自体公知の方法、例えばアルカリ抽出法
（rapid alkaline extraction method；
Birndoim，H.C.、and J.Doly、Nucleic Acids
Res.、７、1513〜1523、1979・参照）により行な
うことができる。より具体的には、上記菌株を例
えば、シユクロース及びグリシンを含む栄養培地
で培養した後、リゾチーム処理を行ない且つ界面
活性剤例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を
添加して溶菌させ、その溶菌液をアルカリでPH12
に調整することによつて染色体を特異的に変性さ
せ、次いで遠心分離により該変性染色体を除去し
た後、上澄液をエタノール沈澱及び塩化セシウム
（CsCl）−エチジウムブロマイド（EtBr）密度勾
配超遠心分離に付することにより、プラスミド
pOA15が実質的に純粋な形で分離することがで
きる。 本発明により提供されるプラスミドpOA15は、
後記参考例１に示すとおり、ストレプトミセス・
グリセウスATCC10137に対してポツク形成能を
付与する特性を有しており、形質転換実験におい
て形質転換体を明確に特定することが可能とな
り、その形質転換頻度も約107pocks／μｇDNA
と高く、クローニングベクターとして極めて適し
ている。 また、本発明により提供されるプラスミド
pOA15は、後記参考例２〜３において実証され
ているように、宿主菌体における安定性に優れコ
ピー数も適度に多く、ベクターとして極めて有用
であると考えられる。 次に実施例及び参考例により本発明のプラスミ
ドpOA15についてさらに詳しく説明する。 実施例 ストレプトミセス・エスピーOA15（FERMP
−6889）からのプラスミドの調整 OA15菌株の胞子を34％シユークロース及び0.2
％MgCl2・6H2Oを含むYEME培地（0.3％イース
トエクストラクト、0.5％バクトペプトン、0.3％
マルトエキストラクト、1.0％グルコース）に接
種し、28℃で72時間ロータリーシエーカーで培養
した。この前培養液15mlを、34％シユークロー
ス、0.2％MgCl2・6H2O及び0.4グリシンを含む
YEME培地300mlに植菌し、28℃で24時間培養
後、遠心分離を行ない集菌する。12％シユークロ
ースで洗浄後、菌体を32mlの液（５mg／mlリゾ
チーム、50ｍＭグルコース、10ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）、25ｍＭトリス緩衝液、PH
8.0）に懸濁し、０℃で60分で溶菌させた。その
後、64mlの液（0.2N NaOH、１％SDS）を加
え、０℃で５分間放置した後、48mlの液（3M
酢酸ナトリウム、PH4.8）を添加し、60分間放置
した。遠心分離を行なつた後、上清に2.5倍容の
冷エタノールを加え、−20℃で30分間静置する。
遠心分離後、残渣を10mlの液（0.1M酢酸ナト
リウム、0.05Mトリス緩衝液、PH8.0）にとかし、
さらに２回エタノール沈澱を行ない、最終的に
5.6mlのTES緩衝液（20ｍＭトリス緩衝液、PH
8.0、10ｍMEDTA、50ｍＭ NaCl）にとかし
た。このDNA溶液に、0.3mlの10mg／mlのEtBr、
6.0ｇのCsClを加え、RP65Tローター（日立製作
所製）を用い、38000rpm、18℃、40時間超遠心
分離を行つた。超遠心分離を行なつた後、UVラ
ンプ照射によつて観察されるプラスミドを注射器
でぬきとり、ブタノールでEtBrを除いた後、TE
緩衝液（10ｍＭトリス緩衝液、PH7.5、１ｍＭ
EDTA）に対し十分透析した。このようにして
実質的に純粋なプラスミドDNApOA15が得られ
た。 参考例 １ pOA15によるストレプトミセス・グリゼウス
ATCC10137の形質転換 プラスミドの調製と同様に、ストレプトミセ
ス・グリセウスATCC10137を、34％シユークロ
ース、0.1MgCl2・6H2O及び0.8％グリシンを含む
YEME倍地20ml中で28℃にて24時間培養した。
菌体を12％シユークロースで２回洗浄後、10mlの
１mg／mlリゾチームを含むP3液（70ｍＭ
NaCl、５ｍＭ MgCl2・6H2O、５ｍＭ
CaCl2・2H2O、0.5Mシユークロース、25ｍＭ
TES〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタン−スルホン酸〕、PH7.2）に懸濁
し、28℃で30分間ゆるやかに振とうし、プロトプ
ラストを形成させた。1000×ｇで遠心分離後、10
mlのPWP液（70ｍＭ NaCl、10ｍＭ MgCl2・
6H2O、20ｍＭ CaCl2・2H2O、0.5Mシユークロ
ース、25ｍＭ TES、PH7.2）で２回洗浄する。
ヘマチトメーターで計数すると、約109／mlのプ
ロトプラスト懸濁液が得られる。この109／mlの
プロトプラストを含む懸濁液を遠心分離し、上清
をすてた後、残つた少量のPWP液にプロトプラ
ストを懸濁し、これに20μのpOA15DNA液
（約1μｇ）を加えた。この直後に、0.5mlのポリエ
チレングリコール（PEG）液（2.5％シユークロ
ース、0.1M CaCl2・2H2O1ｍＭ K2SO4、50ｍ
Ｍトリス−マレイン酸緩撃液、PH8.0、0.2％vol／
vol微量元〔Okanishi et al.J.Gen.Microbio、
80、389−400、1974.〕）を加え室温で１分間放置
後、５mlのPWP液を添加し、DNAの取り込みを
停止させた。遠心分離後、PWP液で洗浄し、白
全耳を用いて後記の再生培地に播いた。なお、形
質転換体の比率が多い場合には適当に希釈し、過
剰量のpOA15を保持しないプロトプラストを添
加した後に再生培地上に播いた。約28℃で７日培
養すると、再生プレート上にポツクが観察され、
すべてのポツクはpOA15を保持していた。形質
転換頻度は、ストレプトミセスOA15から調製し
たpOA15を用いると9.4×10／μ NAｇであつ
たが、ストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137から新たに調製したpOA15を用いる
と2.4×107／μｇDNAに上昇した。これはスト
レプトミセス・グリセウスATCC10137が何らか
の制限修飾系を保持しているための考えられる。 ※再生培地 シユークロース 137ｇ グルコース 10ｇ ポリペプトン（大五） 4.0ｇ イースト・エクストラクト 4.0ｇ MgCl2・6H2O 4.1ｇ KCl 0.5ｇ K2HPO4 0.2ｇ CaCl2・2H2O 7.4ｇ TES緩衝液 5.7ｇ 脱イオン水 １ PH7.2 寒 天 22ｇ 参考例 ２ pOA15のストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137での安定性 pOA15でストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137を質転換した後、出現してきたポツ
クを再生培地に移植し胞子を形成させた。ここか
ら胞子懸濁液を調製し、適当に希釈後再生培地に
播いてコロニーを形成させた。pOA15を保持し
ないストレプトミセス・グリセウスATCC10137
の胞子をプレート一面に生育するように濃く播い
た再生培地の先のコロニーをレプリカして、コロ
ニーの回りに狭い胞子形成阻害ゾーンが形成され
るかどうかで、それぞれのコロニーのポツク形成
能を判定した。この結果１生活史（one life
cycle）当りポツク形成能を示さなくなつた胞子
は0.6％（1/158）であり、これはpOA15の脱落頻
度と考えられ、pOA15はストレプトミセス・グ
リセウスATCC10137で安定であることが明らか
となつた。 参考例 ３ pOA15のストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137におけるコピー数 コピー数はキーザーらの方法（Kieser、T.et
al.、Mol.Gen.Genet.、185、223〜238、1982.）
を一部改変して決定した。すなわち、pOA15を
保持するストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137を前記実施例と同様にプロトプラス
ト化し、１倍容の１％ザルコシル及び25ｍＭ
EDTA液を加え、完全に溶菌させた後、70℃で
10分間保温し、膜結合型DNAを細胞残渣から遊
離させた。冷却後、１倍溶のフエノール：クロロ
ホルム（１：１）液を加え激しく撹拌し、遠心分
離によつて水層と有機層とに分けた。この操作に
より蛋白質が除かれる。水層をエタノール沈澱
後、適当に希釈し、このようにして調製した種々
の希釈サンプルについてアガロースゲル電気泳動
を行なつた。泳動後、ゲルをEtBr溶液（1.0μ
ｇ／ml）で染色し、短波長の紫外線を照射し
cccDNAに切れ目を入れ、さらに、EtBr溶液で
１時間染色を行なつた。このゲルをポラロイドフ
イルム665を用いて撹拌し、そのネガテイブフイ
ルムの染色体とプラスミド部位の濃さを、島津デ
ンシトメーターCS−910を用いて定量化した。ス
トレプトミセス・グリセウスATCC10137の染色
体の大きさを104kbとすると（Benigni、R.et
al.、Appl.Microbiol.、30、180−182、1977.）、
上で得られた染色体とプラスミドの比により、
pOA15のコピー数は約20コピー／染色体と算出
された。
くは、或る種の放線菌に対してポツク（pock）
形成能を付与する特性をもつ放線菌由来の環状プ
ラスミドに関する。 染色体外遺伝子であるプラスミドは、遺伝子操
作において有用な遺伝子をクローン化するための
ベクターとして有用である。 従来、組換えDNAの研究分野では、宿主とし
ては主に大腸菌及び枯草菌が使用され、また、ベ
クターとしてはpBR322及びブドウ球菌由来の
pUB110等が用いられている。 他方、放線菌は有用な抗生物質や生理活性物質
の生産菌として重要であり、遺伝子操作による菌
株の改良によつて抗生物質や生理活性物質の生産
量の増大や新規な有用物質の創生の可能性が秘ら
れており、期待されるところが大きく、最近注目
されている。放線菌由来の遺伝子組換え操作にお
いては、その宿主もベクターも放線菌由来のもの
を利用することが望ましいと考えられ、これ迄、
放線菌由来のプラスミドとしてpUC1〜10等数多
く報告されている（例えば、特開昭55−133396
号、同55−133397号、同55−120600号公報等参
照）が、これらは特定の選択マーカーを持たず、
クローニングベクターとして不適当である。これ
に対してSCP2＊及びSLP1系プラスミドはそれぞ
れ、ストレプトミセス・セリカラー
（Streptomyce coelicolor）及びストレプトミセ
ス・リビダンス（S.lividans）にポツク形成能を
付与し、実際種々の薬剤耐性遺伝子のクローン化
に使用されている（Bibb、M.、et al.、Nature、
284、526〜531、1980.；Thompson、C.J.、et
al.、Nature、286、525〜527、1980.；
Thompson、C.J.、et al.、J.Bacteriol.、151、
669〜677、1982.）。しかし、これらの宿主はスト
レプトミセス・セリカラーまたはストレプトミセ
ス・リビダンスに限定され、他の重要な種々多様
な抗生物質生産菌中では複製維持されず、ベクタ
ーとして応用範囲が狭いという難点がある。 本発明者らは、或る種の放線菌に対してポツク
形成能を付与するという選択マーカーとしての性
質をもち、宿主内で安定で且つコピー数が適度に
多い放線菌由来のプラスミドを得るべく、ストレ
プトマイシン生産菌であるストレプトミセス・グ
リセウス（S.griseus）ATCC10137を宿主菌とし
て選び、各地の土壌から分離した放線菌のプラス
ミドの中から上記のストレプトミセス・グリセウ
スに対してポツク形成能を付与するものを形質転
換によつて検索した結果、今回、コピー数約20
個／染色体、ストレプトミセス・グリセウス内で
脱落頻度が１生活史当り約0.6％を示す如く安定
であり更に大きさが適当であり、且つ、クロニー
ングに有用と考えられる制限酵素部位として
BamH及びEcoR等を有する新規なプラスミ
ドを見い出し、本発明を完成した。 しかして、本発明によれば、ストレプトミセ
ス・グリセウスATCC10137に対してポツク形成
能を付与する性質を有し、分子量が約10.4kbであ
り、且つ下記の制限酵素に対して下記の感受性を
示す、すなわち (a) BamHによる認識部位が１ケ所であり、 (b) EcoRによる認識部位が１ケ所であり、 (c) Salによる認識部位が５ケ所であり、 (d) Bgl、Hind、Kpn、Pst及びXba
により切断されない ことを特徴とするプラスミドpOA15が提供され
る。 本発明のプラスミドpOA15は、ストレプトミ
セス・グリセウスATCC10137に対してポツク形
成能を付与する性質があり、ここで「ポツク形
成」とは、ある種のプラスミドを保持している菌
株を当該プラスミドを保持していない同じ種に属
する菌株と接触する状態で生育させた場合、該プ
ラスミド非保持菌の気菌糸または胞子の形成が阻
害される現象をいう。 本発明のプラスミドpOA15におけるポツク形
成の特徴は次のようである。プラスミドpOA15
をもたないストレプトミセス・グリセウスの胞子
108個を５mlの減菌水に懸濁する。次にプラスミ
ドpOA15を有するストレプトミセス・グリセウ
スの胞子104個を５mlの減菌水に懸濁する。両者
の懸濁液各１mlを混合し、その0.05mlを栄養寒天
培地（ブイヨン寒天培地、栄研化学(株)）の入つた
シヤーレ上に広げた後、28℃で７日間培養する。
このシヤーレを真上から観察すると、プラスミド
pOA15を持たないストレプトミセス・グリセウ
スの生育菌叢の中に数個〜数十個の直径0.5mm〜
1.5mmの円形の半透明ゾーンが見られる。これが
ポツクである。この反透明のゾーンの中には僅か
に菌糸が生育している。この部分から細かい白金
線で菌糸をとり、別の栄養寒天培地に移すことに
より、プラスミドpOA15を有する菌株を取得す
ることができる。 また、本発明のプラスミドpOA15はアガロー
ス・ゲル電気泳動法により測定した分子量が約
10.4kbであり、この分子量はR.W.Davisらのホル
ムアミド法（Methods in Enzymology、
Vol.21、413〜428、1971参照）に従いスタンダー
ドとしてpBR322（4362bp）を用い電子顕微鏡
（Hitachi HS−7D使用）観察によつて測定した
場合の分子量（10.4±0.3kb）と大体一致してい
る。しかして、本明細書においていう分子量はア
ガロース・ゲル電気泳動法により測定した分子量
を意味するものである。 さらに、本発明のプラスミドpOA15の各種制
限酵素に対する感受性は上記(a)〜(d)に示すとおり
であり、より詳細に各制限酵素による分解断片の
分子量（kb）は次のとおりである。 (a) BamH：10.4 (b) EcoR；10.4 (c) Sal：3.0；2.2；2.1；1.8；0.8 また、ダブル・ダイゼツシヨン（double
digestion）によつて決定した本発明のプラスミ
ドの制限酵素地図は添付の第１図に示すとおりで
ある。図中の数字は分子量（単位：kb＝キロベ
ースペア）である。図から明らかなように、本発
明のプラスミドpOA15のBamH又はEcoRサ
イトは、外来DNAのクローニング部位に適して
いると考えられる。 以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミ
ドpOA15は、吹田市のある土壌から分離された
ストレプトミセス属に属し、本発明者等によつて
ストレプトミセス・エスピー・OA15と命名され
た菌株から分離、精製される。 本菌株の菌学的性状は下記の通りである。 (a) 形態 分枝は単純分枝であり、車軸分枝はみられな
い。胞子連鎖の胞子数は少く、その形態は不完
全ならせん状、ループ状（loops）、カギ状
（hooks）を呈する。連鎖の長いものも見られ、
それは直状である。しばしば胞子の数ケが合体
しているのが認められた。胞子の表面構造は平
滑（Smooth）である。鞭毛胞子及び胞子のう
は認められない。 (b) 次の各培地における生育状態（特にことわら
ないかぎり28℃培養） 【表】 (c) 各生理的性質 (1) 生育温度：20〜37℃に生育、45℃では生
育できない。 (2) ゼラチンの液化：陽性（20℃培養） (3) スターチの加水分解：陽性 (4) 脱脂牛乳の凝固：陰性、ペプトン化：
陰性 (5) メラニン様色素の生成：陽性（ペプト
ン・酵母エキス鉄寒天、チロシン寒天及びト
リプトン・酵母エキスブロス培地のいづれも
陽性） (d) 次の炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリー
プ寒天培地上） Ｌ＝アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−フラクトース、シユクロース、
イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフイノー
ス、及びＤ−マンニツトを利用する。 上記の菌株は茨木県竹筑波郡谷田部町東１丁目
１番３号の工業技術院微生物工業技術研修所に、
昭和58年１月27日付で、受託番号：微工研菌寄第
6889号にて寄託されている。 本菌株からの前記プラスミドの分離・精製は、
それ自体公知の方法、例えばアルカリ抽出法
（rapid alkaline extraction method；
Birndoim，H.C.、and J.Doly、Nucleic Acids
Res.、７、1513〜1523、1979・参照）により行な
うことができる。より具体的には、上記菌株を例
えば、シユクロース及びグリシンを含む栄養培地
で培養した後、リゾチーム処理を行ない且つ界面
活性剤例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を
添加して溶菌させ、その溶菌液をアルカリでPH12
に調整することによつて染色体を特異的に変性さ
せ、次いで遠心分離により該変性染色体を除去し
た後、上澄液をエタノール沈澱及び塩化セシウム
（CsCl）−エチジウムブロマイド（EtBr）密度勾
配超遠心分離に付することにより、プラスミド
pOA15が実質的に純粋な形で分離することがで
きる。 本発明により提供されるプラスミドpOA15は、
後記参考例１に示すとおり、ストレプトミセス・
グリセウスATCC10137に対してポツク形成能を
付与する特性を有しており、形質転換実験におい
て形質転換体を明確に特定することが可能とな
り、その形質転換頻度も約107pocks／μｇDNA
と高く、クローニングベクターとして極めて適し
ている。 また、本発明により提供されるプラスミド
pOA15は、後記参考例２〜３において実証され
ているように、宿主菌体における安定性に優れコ
ピー数も適度に多く、ベクターとして極めて有用
であると考えられる。 次に実施例及び参考例により本発明のプラスミ
ドpOA15についてさらに詳しく説明する。 実施例 ストレプトミセス・エスピーOA15（FERMP
−6889）からのプラスミドの調整 OA15菌株の胞子を34％シユークロース及び0.2
％MgCl2・6H2Oを含むYEME培地（0.3％イース
トエクストラクト、0.5％バクトペプトン、0.3％
マルトエキストラクト、1.0％グルコース）に接
種し、28℃で72時間ロータリーシエーカーで培養
した。この前培養液15mlを、34％シユークロー
ス、0.2％MgCl2・6H2O及び0.4グリシンを含む
YEME培地300mlに植菌し、28℃で24時間培養
後、遠心分離を行ない集菌する。12％シユークロ
ースで洗浄後、菌体を32mlの液（５mg／mlリゾ
チーム、50ｍＭグルコース、10ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）、25ｍＭトリス緩衝液、PH
8.0）に懸濁し、０℃で60分で溶菌させた。その
後、64mlの液（0.2N NaOH、１％SDS）を加
え、０℃で５分間放置した後、48mlの液（3M
酢酸ナトリウム、PH4.8）を添加し、60分間放置
した。遠心分離を行なつた後、上清に2.5倍容の
冷エタノールを加え、−20℃で30分間静置する。
遠心分離後、残渣を10mlの液（0.1M酢酸ナト
リウム、0.05Mトリス緩衝液、PH8.0）にとかし、
さらに２回エタノール沈澱を行ない、最終的に
5.6mlのTES緩衝液（20ｍＭトリス緩衝液、PH
8.0、10ｍMEDTA、50ｍＭ NaCl）にとかし
た。このDNA溶液に、0.3mlの10mg／mlのEtBr、
6.0ｇのCsClを加え、RP65Tローター（日立製作
所製）を用い、38000rpm、18℃、40時間超遠心
分離を行つた。超遠心分離を行なつた後、UVラ
ンプ照射によつて観察されるプラスミドを注射器
でぬきとり、ブタノールでEtBrを除いた後、TE
緩衝液（10ｍＭトリス緩衝液、PH7.5、１ｍＭ
EDTA）に対し十分透析した。このようにして
実質的に純粋なプラスミドDNApOA15が得られ
た。 参考例 １ pOA15によるストレプトミセス・グリゼウス
ATCC10137の形質転換 プラスミドの調製と同様に、ストレプトミセ
ス・グリセウスATCC10137を、34％シユークロ
ース、0.1MgCl2・6H2O及び0.8％グリシンを含む
YEME倍地20ml中で28℃にて24時間培養した。
菌体を12％シユークロースで２回洗浄後、10mlの
１mg／mlリゾチームを含むP3液（70ｍＭ
NaCl、５ｍＭ MgCl2・6H2O、５ｍＭ
CaCl2・2H2O、0.5Mシユークロース、25ｍＭ
TES〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタン−スルホン酸〕、PH7.2）に懸濁
し、28℃で30分間ゆるやかに振とうし、プロトプ
ラストを形成させた。1000×ｇで遠心分離後、10
mlのPWP液（70ｍＭ NaCl、10ｍＭ MgCl2・
6H2O、20ｍＭ CaCl2・2H2O、0.5Mシユークロ
ース、25ｍＭ TES、PH7.2）で２回洗浄する。
ヘマチトメーターで計数すると、約109／mlのプ
ロトプラスト懸濁液が得られる。この109／mlの
プロトプラストを含む懸濁液を遠心分離し、上清
をすてた後、残つた少量のPWP液にプロトプラ
ストを懸濁し、これに20μのpOA15DNA液
（約1μｇ）を加えた。この直後に、0.5mlのポリエ
チレングリコール（PEG）液（2.5％シユークロ
ース、0.1M CaCl2・2H2O1ｍＭ K2SO4、50ｍ
Ｍトリス−マレイン酸緩撃液、PH8.0、0.2％vol／
vol微量元〔Okanishi et al.J.Gen.Microbio、
80、389−400、1974.〕）を加え室温で１分間放置
後、５mlのPWP液を添加し、DNAの取り込みを
停止させた。遠心分離後、PWP液で洗浄し、白
全耳を用いて後記の再生培地に播いた。なお、形
質転換体の比率が多い場合には適当に希釈し、過
剰量のpOA15を保持しないプロトプラストを添
加した後に再生培地上に播いた。約28℃で７日培
養すると、再生プレート上にポツクが観察され、
すべてのポツクはpOA15を保持していた。形質
転換頻度は、ストレプトミセスOA15から調製し
たpOA15を用いると9.4×10／μ NAｇであつ
たが、ストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137から新たに調製したpOA15を用いる
と2.4×107／μｇDNAに上昇した。これはスト
レプトミセス・グリセウスATCC10137が何らか
の制限修飾系を保持しているための考えられる。 ※再生培地 シユークロース 137ｇ グルコース 10ｇ ポリペプトン（大五） 4.0ｇ イースト・エクストラクト 4.0ｇ MgCl2・6H2O 4.1ｇ KCl 0.5ｇ K2HPO4 0.2ｇ CaCl2・2H2O 7.4ｇ TES緩衝液 5.7ｇ 脱イオン水 １ PH7.2 寒 天 22ｇ 参考例 ２ pOA15のストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137での安定性 pOA15でストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137を質転換した後、出現してきたポツ
クを再生培地に移植し胞子を形成させた。ここか
ら胞子懸濁液を調製し、適当に希釈後再生培地に
播いてコロニーを形成させた。pOA15を保持し
ないストレプトミセス・グリセウスATCC10137
の胞子をプレート一面に生育するように濃く播い
た再生培地の先のコロニーをレプリカして、コロ
ニーの回りに狭い胞子形成阻害ゾーンが形成され
るかどうかで、それぞれのコロニーのポツク形成
能を判定した。この結果１生活史（one life
cycle）当りポツク形成能を示さなくなつた胞子
は0.6％（1/158）であり、これはpOA15の脱落頻
度と考えられ、pOA15はストレプトミセス・グ
リセウスATCC10137で安定であることが明らか
となつた。 参考例 ３ pOA15のストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137におけるコピー数 コピー数はキーザーらの方法（Kieser、T.et
al.、Mol.Gen.Genet.、185、223〜238、1982.）
を一部改変して決定した。すなわち、pOA15を
保持するストレプトミセス・グリセウス
ATCC10137を前記実施例と同様にプロトプラス
ト化し、１倍容の１％ザルコシル及び25ｍＭ
EDTA液を加え、完全に溶菌させた後、70℃で
10分間保温し、膜結合型DNAを細胞残渣から遊
離させた。冷却後、１倍溶のフエノール：クロロ
ホルム（１：１）液を加え激しく撹拌し、遠心分
離によつて水層と有機層とに分けた。この操作に
より蛋白質が除かれる。水層をエタノール沈澱
後、適当に希釈し、このようにして調製した種々
の希釈サンプルについてアガロースゲル電気泳動
を行なつた。泳動後、ゲルをEtBr溶液（1.0μ
ｇ／ml）で染色し、短波長の紫外線を照射し
cccDNAに切れ目を入れ、さらに、EtBr溶液で
１時間染色を行なつた。このゲルをポラロイドフ
イルム665を用いて撹拌し、そのネガテイブフイ
ルムの染色体とプラスミド部位の濃さを、島津デ
ンシトメーターCS−910を用いて定量化した。ス
トレプトミセス・グリセウスATCC10137の染色
体の大きさを104kbとすると（Benigni、R.et
al.、Appl.Microbiol.、30、180−182、1977.）、
上で得られた染色体とプラスミドの比により、
pOA15のコピー数は約20コピー／染色体と算出
された。
第１図は本発明のプラスミドpOA15の制限酵
素地図である。
素地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス・グリセウスATCC10137
に対してポツク形成能を付与する性質を有し、分
子量が約10.4kbであり、下記の制限酵素に対して
下記の感受性を示す、すなわち (a) BamHによる認識部位が１ケ所であり、 (b) EcoRによる認識部位が１ケ所であり、 (c) Salによる認識部位が５ケ所であり、そし
て (d) Bgl、Hind、Kpn、Pst及びXba
により切断されず、 且つ下記図に示す制限酵素地図によつて特徴づ
けられるプラスミドpOA15。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58015515A JPS59143589A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | プラスミドｐＯＡ１５ |
| US06/575,848 US4615980A (en) | 1983-02-03 | 1984-02-01 | Plasmid pOA15 |
| EP84101119A EP0115864A1 (en) | 1983-02-03 | 1984-02-03 | Plasmid pOA15 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58015515A JPS59143589A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | プラスミドｐＯＡ１５ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59143589A JPS59143589A (ja) | 1984-08-17 |
| JPH0322156B2 true JPH0322156B2 (ja) | 1991-03-26 |
Family
ID=11890950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58015515A Granted JPS59143589A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | プラスミドｐＯＡ１５ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4615980A (ja) |
| EP (1) | EP0115864A1 (ja) |
| JP (1) | JPS59143589A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP4258874B2 (ja) * | 1999-02-10 | 2009-04-30 | チッソ株式会社 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0006692A1 (en) * | 1978-06-01 | 1980-01-09 | National Research Development Corporation | Streptomyces plasmids and microorganisms containing them, their use as vectors for nucleic acid and a process for the incorporation of nucleic acids into cellular systems |
| JPS57206699A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid patm 3 and its preparation |
-
1983
- 1983-02-03 JP JP58015515A patent/JPS59143589A/ja active Granted
-
1984
- 1984-02-01 US US06/575,848 patent/US4615980A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-02-03 EP EP84101119A patent/EP0115864A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59143589A (ja) | 1984-08-17 |
| EP0115864A1 (en) | 1984-08-15 |
| US4615980A (en) | 1986-10-07 |
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