JPS59169493A - プラスミドｐｏａ７ - Google Patents
プラスミドｐｏａ７Info
- Publication number
- JPS59169493A JPS59169493A JP58044463A JP4446383A JPS59169493A JP S59169493 A JPS59169493 A JP S59169493A JP 58044463 A JP58044463 A JP 58044463A JP 4446383 A JP4446383 A JP 4446383A JP S59169493 A JPS59169493 A JP S59169493A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- poa7
- streptomyces
- sites
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なプラスミドに関し、さらに詳しくは、成
る種の放線菌に対してポック（ｐｏｃｋ ）形成能を付
与する特性をもつ放線菌由来の環状プラスミドに関する
。
る種の放線菌に対してポック（ｐｏｃｋ ）形成能を付
与する特性をもつ放線菌由来の環状プラスミドに関する
。
染色体遺伝子であるプラスミドは、遺伝子操作において
有用な遺伝子をクローン化するためのベクターとして有
用である。
有用な遺伝子をクローン化するためのベクターとして有
用である。
従来、組換えＤＮＡの研究分野では、宿主としては主に
大腸菌及び枯草菌が使用され、また、ベクターとしては
ｐＢＲ３２２及びブドウ球菌由来のｐＵＢｌｌｏ等が用
いられている。
大腸菌及び枯草菌が使用され、また、ベクターとしては
ｐＢＲ３２２及びブドウ球菌由来のｐＵＢｌｌｏ等が用
いられている。
他方、放線菌は有用な抗生物質や生理活性物質の生産菌
として”Ｍ’ＪＩであシ、遺伝子操作による菌株の改良
によって抗生物質や生理活性物質の生産量の増大や新規
な有用物質の創生の可能性が秘められておシ、期待され
るところが大きく、最近注目されている。放線菌由来の
遺伝子組換え操作においては、その宿主もベクターも放
線菌由来のものを利用することが望祉しいと考えられ、
これ迄、放線菌由来のプラスミドとして９０６１〜１０
等数多く報告されている（例えは、特開昭５５−１３３
３９６号、同５５−１３３３９７号、同５５−１２０６
００号公報等参照）が、これらは特定の選択マーカーを
持たず、クローニングベクターとして不適当である。
として”Ｍ’ＪＩであシ、遺伝子操作による菌株の改良
によって抗生物質や生理活性物質の生産量の増大や新規
な有用物質の創生の可能性が秘められておシ、期待され
るところが大きく、最近注目されている。放線菌由来の
遺伝子組換え操作においては、その宿主もベクターも放
線菌由来のものを利用することが望祉しいと考えられ、
これ迄、放線菌由来のプラスミドとして９０６１〜１０
等数多く報告されている（例えは、特開昭５５−１３３
３９６号、同５５−１３３３９７号、同５５−１２０６
００号公報等参照）が、これらは特定の選択マーカーを
持たず、クローニングベクターとして不適当である。
これに対して５ＣＰ２＊及び５ＬＰＩ系プラスミドはそ
れぞれ、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｃＨｌｉｃｏｌｏｒ ）及びストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ ）にポック
形成能を付与し、実際種々の薬剤耐性遺伝子のクローン
化に使用されている（ Ｂｉｂｂ、Ｍ、 、 ｅｔ ａ
ｌ、 、 Ｎａｔｕｒｅ 、 ２８４ 、５２６〜５３
１ ＋１９８０、 、’ Ｔｈｏｒｎｐｓｏｎ 、 Ｃ
，、Ｊ、 、 ｅｔ ａｌ、 、 Ｎａｔｕｒｅ 、
２８６゜５２５〜５２７ 、１９８０． ； Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ 、 Ｃ，Ｊ、 、 ｅｔ ａｌ、 。
れぞれ、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｃＨｌｉｃｏｌｏｒ ）及びストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ ）にポック
形成能を付与し、実際種々の薬剤耐性遺伝子のクローン
化に使用されている（ Ｂｉｂｂ、Ｍ、 、 ｅｔ ａ
ｌ、 、 Ｎａｔｕｒｅ 、 ２８４ 、５２６〜５３
１ ＋１９８０、 、’ Ｔｈｏｒｎｐｓｏｎ 、 Ｃ
，、Ｊ、 、 ｅｔ ａｌ、 、 Ｎａｔｕｒｅ 、
２８６゜５２５〜５２７ 、１９８０． ； Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ 、 Ｃ，Ｊ、 、 ｅｔ ａｌ、 。
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 １５１．６６８〜６
７７ 、１９８２− ）ｏしかし、これらの宿主はスト
レプトミセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リ
ビダンスに限定され、他の重要な種々多様な抗生物質生
産菌中では複製推持されず、ベクターとして応用範囲が
狭いという難点がある。
７７ 、１９８２− ）ｏしかし、これらの宿主はスト
レプトミセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リ
ビダンスに限定され、他の重要な種々多様な抗生物質生
産菌中では複製推持されず、ベクターとして応用範囲が
狭いという難点がある。
本発明者らは、成る柚の放線菌に対してポック形成能を
付与するという選択マーカーとしての性質をもち、宿主
内で安定で且つマピー数が適度に多い放腺菌由来のプラ
スミドを得るべくストレプトマイシン生産菌であるスト
レプトミセス・グリセラム（Ｓ、 ｇｒｉｓｅ、ｕｓ
） ＡＴＣＣ１０１３７を宿主菌として選び、各地の土
壌から分離した放線菌のプラスミドの中から上記のスト
レプトミセス・グリセウスに対してポック形成能を付与
するものを形質転換によって検索した結釆、今回、スト
レプトミセス・グリセウス内で脱落頻度が１生活史当シ
約０．５％以下を示す如く安定であり更に大きさが適当
であシ１．且つ、クロ−ニグに有用と考えられる制限醇
累部位としてＥｃｏＲＩ 、 Ｋｐｎ（及びＰｓｔＩ等
を有する新規なプラスミドを見い出し、本発明を完成し
た。
付与するという選択マーカーとしての性質をもち、宿主
内で安定で且つマピー数が適度に多い放腺菌由来のプラ
スミドを得るべくストレプトマイシン生産菌であるスト
レプトミセス・グリセラム（Ｓ、 ｇｒｉｓｅ、ｕｓ
） ＡＴＣＣ１０１３７を宿主菌として選び、各地の土
壌から分離した放線菌のプラスミドの中から上記のスト
レプトミセス・グリセウスに対してポック形成能を付与
するものを形質転換によって検索した結釆、今回、スト
レプトミセス・グリセウス内で脱落頻度が１生活史当シ
約０．５％以下を示す如く安定であり更に大きさが適当
であシ１．且つ、クロ−ニグに有用と考えられる制限醇
累部位としてＥｃｏＲＩ 、 Ｋｐｎ（及びＰｓｔＩ等
を有する新規なプラスミドを見い出し、本発明を完成し
た。
しかして、本発明によれば、ストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付与す
る性質を有し、分子量が約２６．４ｋｂであ久且つ下記
の制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （ａ） Ｅｃ６ＲＩによる認識部位が１ケ所であυ、
（ｂ） ＫｐｎＪによる認識部位が４ケ所であシ、（
ｃ） Ｐｓｔｌによる認識部位が２ケ所であシ、（ｄ
） ５ａｌ）による認靴部位が゛９９ケ所上であ択（
ｅ） ＢａｍＨＩ 、 Ｂ’ｇｌｎ 、 ＨｉｎｄＩ
ｌｉ及びＸｂａ（にょシ切断されない ことを特徴とするプラスミドｐＯＡ７が提供される。
ウスＡＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付与す
る性質を有し、分子量が約２６．４ｋｂであ久且つ下記
の制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （ａ） Ｅｃ６ＲＩによる認識部位が１ケ所であυ、
（ｂ） ＫｐｎＪによる認識部位が４ケ所であシ、（
ｃ） Ｐｓｔｌによる認識部位が２ケ所であシ、（ｄ
） ５ａｌ）による認靴部位が゛９９ケ所上であ択（
ｅ） ＢａｍＨＩ 、 Ｂ’ｇｌｎ 、 ＨｉｎｄＩ
ｌｉ及びＸｂａ（にょシ切断されない ことを特徴とするプラスミドｐＯＡ７が提供される。
本発明のプラスミドｐＯＡ７は、ストレプトミセス・グ
リセウスＡＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付
与する性質があシ、ここで「ポック形成」とは、プラス
ミド保持筒を当該のプラスミド非保持菌と接触する状態
で生育させた場合、非保持菌の気菌糸または胞子の形成
が阻害される現象をいう０ また、本発明のプラスミドｐＯＡ７はアガロース・グル
電気泳動法によシ測定した分子量が約２６．４ｋｂでア
シ、この分子量はＲ，Ｗ、 Ｄａｖｉ ｓらのホルムア
ミ ド法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、Ｖｏｌ、 ２１ ＋４１３〜４２８．１９７１参
照）に従いスタンダードとしてｐＢＲ３２２（４３６２
ｂｐ）を用い電子顕微鏡（ＨｉｔａｃｈｉＨ８−７Ｄ使
用）観察によって測定した場合の分子量（２６，４±ｏ
、７ｋｂ）と大体一致している。しかして、本明細書に
おいていう分子量はアガロース・ダル電気泳動法によシ
測定した分子量を意味するものである。
リセウスＡＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付
与する性質があシ、ここで「ポック形成」とは、プラス
ミド保持筒を当該のプラスミド非保持菌と接触する状態
で生育させた場合、非保持菌の気菌糸または胞子の形成
が阻害される現象をいう０ また、本発明のプラスミドｐＯＡ７はアガロース・グル
電気泳動法によシ測定した分子量が約２６．４ｋｂでア
シ、この分子量はＲ，Ｗ、 Ｄａｖｉ ｓらのホルムア
ミ ド法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、Ｖｏｌ、 ２１ ＋４１３〜４２８．１９７１参
照）に従いスタンダードとしてｐＢＲ３２２（４３６２
ｂｐ）を用い電子顕微鏡（ＨｉｔａｃｈｉＨ８−７Ｄ使
用）観察によって測定した場合の分子量（２６，４±ｏ
、７ｋｂ）と大体一致している。しかして、本明細書に
おいていう分子量はアガロース・ダル電気泳動法によシ
測定した分子量を意味するものである。
さらに、本発明のプラスミドｐＯＡ７の各種制限酵素に
対する感受性は上記（ａ）〜（、）に示すとおシであシ
、よシ詳細に各制限酵素による分解断片の分子量（ｋｂ
）は次のとお９である。
対する感受性は上記（ａ）〜（、）に示すとおシであシ
、よシ詳細に各制限酵素による分解断片の分子量（ｋｂ
）は次のとお９である。
（ａ） ＥｃｏＲＩ ： ２６．４
（ｂ） Ｋｐｎｌ ： １５．０ ； ８．１ ；
３．３（ｃ） Ｐｓｔｌ ’ ： １８．３ ；
８．１（ｄ） ５ａｌｌ ：４．４’：３．８；３
．８；３．２；３．１；１．９；１．８；１．５；１．
３：０８以下不詳 マタ、ダブル・グイゼッション（ｄｏｕｂｌｅｄ ｉ
ｇｅ ｓ ｔ ｔｏｎ）によって決定した不発明のプラ
スミドの制限酵素地図は添付の図に示すとおシである。
３．３（ｃ） Ｐｓｔｌ ’ ： １８．３ ；
８．１（ｄ） ５ａｌｌ ：４．４’：３．８；３
．８；３．２；３．１；１．９；１．８；１．５；１．
３：０８以下不詳 マタ、ダブル・グイゼッション（ｄｏｕｂｌｅｄ ｉ
ｇｅ ｓ ｔ ｔｏｎ）によって決定した不発明のプラ
スミドの制限酵素地図は添付の図に示すとおシである。
図中の数字は分子量（単位：ｋｂ＝キロペースベア）で
ある。図から明らかなように、ＥｃｏＲＩ ＊ Ｋｐｎ
Ｉ ＋ＰｇｔＪサイトは、外来ＤＮＡのクローニング部
位に適していると考えられる。以上に述べた如き特性を
もつ本発明のプラスミドｐＯＡ７は、次田市のある土壌
から分離されたストレプトミセス属に属し、本発明者等
によってストレプトミセス・エスピー・０Ａ−７と命名
された菌株から分離、精製される０ 本菌株の菌学的性状は下記の通シである。
ある。図から明らかなように、ＥｃｏＲＩ ＊ Ｋｐｎ
Ｉ ＋ＰｇｔＪサイトは、外来ＤＮＡのクローニング部
位に適していると考えられる。以上に述べた如き特性を
もつ本発明のプラスミドｐＯＡ７は、次田市のある土壌
から分離されたストレプトミセス属に属し、本発明者等
によってストレプトミセス・エスピー・０Ａ−７と命名
された菌株から分離、精製される０ 本菌株の菌学的性状は下記の通シである。
（１）形態
分枝は単純分枝でチシ、車軸支枝はみられない。
胞子連鎖の胞子数は１０〜５０、或はそれ以上で、その
形態は皿線状である。胞子表面構造は平滑である。鞭毛
胞子及び胞子のりは認められない。
形態は皿線状である。胞子表面構造は平滑である。鞭毛
胞子及び胞子のりは認められない。
（１１）次の各培地における生育状態（特にことわらな
いかぎり ２．８℃培養）。
いかぎり ２．８℃培養）。
（ｉｉ） 各生理的性質
（１）生育温度：１０〜３７℃、４０℃で生育しない。
（２）ゼラチンの液化：陽性（２０℃培養）（３）
スターチの加水１分解：陽性（４）脱脂牛乳の凝固と液
化；凝固陰性、液化陽性 （５）メラニン様色累の生成：陽性（ペフ） ７酢母エ
キス・鉄寒天、トリプトン・酵母エキス・ブロス及びチ
ロシン寒天培地に於て陽性）（■）次の炭素源の同化性
（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上） グリコース、フラクトースを利用する。アラビノース、
ラムノース、マンニットを利用しない。
スターチの加水１分解：陽性（４）脱脂牛乳の凝固と液
化；凝固陰性、液化陽性 （５）メラニン様色累の生成：陽性（ペフ） ７酢母エ
キス・鉄寒天、トリプトン・酵母エキス・ブロス及びチ
ロシン寒天培地に於て陽性）（■）次の炭素源の同化性
（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上） グリコース、フラクトースを利用する。アラビノース、
ラムノース、マンニットを利用しない。
キシロース、シュクロース、ラフィノースハ利用しない
か、或は微弱な利用である。イノシトールの利用は変動
する。
か、或は微弱な利用である。イノシトールの利用は変動
する。
以上がストレプトミセス・エスピー・ＯＡ７菌株の性質
である。
である。
上記の菌株は茨木県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号の
工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和５８年３月１
１日付で受託番号；微工研菌寄第ど２２２号で寄託され
ている。
工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和５８年３月１
１日付で受託番号；微工研菌寄第ど２２２号で寄託され
ている。
本菌株からの前記プラスミドの分離・精製は、それ自体
公知の方法、例えばアルカリ抽出法（ｒＢｐｉｄ ａｌ
ｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
；Ｂｉｒｎｂｏｌｍ。
公知の方法、例えばアルカリ抽出法（ｒＢｐｉｄ ａｌ
ｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
；Ｂｉｒｎｂｏｌｍ。
Ｈ，Ｃ，１ａｎｄ Ｊ、Ｄｏｌｙ 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋ ７ 。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋ ７ 。
１５１３〜１５２３．１９７９゜参照）にょ９行なうこ
とができる。よシ具体的には、上記菌株を例えば、シュ
クロース及びグリシンを含む栄養培地で培養した後、リ
ゾチーム処理を行ない且つ界面活性剤例えばドデシル硫
酸ナトリウム（Ｓ’ＤＳ ）を添加して溶菌させ、その
溶菌液をアルカリでｐｎ １２に調整することによって
染色体を特異的に変性させ、次いで遠心分離によシ該変
性染色体を除去した後、上澄液をエタノール沈殿及び塩
化セシウム（ＣｓＣ１）−エチジウムブロマイド（Ｅｔ
Ｂｒ ）密度勾配超遠心分離に付すことによシ、グラス
ミドｐＯＡ７が実質的に純粋な形で分離することができ
る。
とができる。よシ具体的には、上記菌株を例えば、シュ
クロース及びグリシンを含む栄養培地で培養した後、リ
ゾチーム処理を行ない且つ界面活性剤例えばドデシル硫
酸ナトリウム（Ｓ’ＤＳ ）を添加して溶菌させ、その
溶菌液をアルカリでｐｎ １２に調整することによって
染色体を特異的に変性させ、次いで遠心分離によシ該変
性染色体を除去した後、上澄液をエタノール沈殿及び塩
化セシウム（ＣｓＣ１）−エチジウムブロマイド（Ｅｔ
Ｂｒ ）密度勾配超遠心分離に付すことによシ、グラス
ミドｐＯＡ７が実質的に純粋な形で分離することができ
る。
本発明によシ提供されるプラスミドｐＯＡ７は、後記参
考例１に示すとおシ、ストレプトミセス・グリセウスＡ
ＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付与する特性
を有しておシ、形質転換実験において形質転換体を明確
に特定することが可能となυ、その形質転換頻度も約１
０ ｐｏｃｋｓ／Ｉｉ、！ｉ’ ＤＮＡと高くクローニ
ングベクターとして極めて適している。
考例１に示すとおシ、ストレプトミセス・グリセウスＡ
ＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付与する特性
を有しておシ、形質転換実験において形質転換体を明確
に特定することが可能となυ、その形質転換頻度も約１
０ ｐｏｃｋｓ／Ｉｉ、！ｉ’ ＤＮＡと高くクローニ
ングベクターとして極めて適している。
また、本発明によシ提田されるプラスミドｐＯＡ７は、
後記参考例２〜３において実証されているように、宿主
菌体における安定性に優れコピー数も適度に多く、ベク
ターとして極めて有用であると考えられる。
後記参考例２〜３において実証されているように、宿主
菌体における安定性に優れコピー数も適度に多く、ベク
ターとして極めて有用であると考えられる。
次に実施例及び参考例によシ本発明のプラスミドｐＯＡ
７についてさらに詳しく説明する。
７についてさらに詳しく説明する。
０Ａ−７菌株の胞子を３４チシユークロース。
０．２チＭｇＣＡ２・６Ｈ２０を含むＹＥＭＥ培地（０
，３チイーストエクストラクト、０．５％バクトペプト
ン。
，３チイーストエクストラクト、０．５％バクトペプト
ン。
０．３チマルトエキストラクト、１．０％グリコース）
に接種し、２８℃で７２時間ロータリーシェーカーで培
養した。この前培養液１５ｍ１！を３００ｍ１の３４％
シュークＯ−ス、 ０．２％ＭｇＣ，ａ２・６Ｈ２０、
０，４チグリシンを含むＹＥ■培地に植菌し、２８℃で
２４時間培養後、遠心分離を行ない集菌する。１２チシ
ユークロースで洗浄後、菌体を３２１ｎｌの液Ｉ（５４
個リゾチーム、５０ｍＭグリコース、ｌｏｍＭエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） 、 ２５ｍＭ ）リス緩
衝液、ｐｆ−１８，０）に懸濁し、ｏ ℃、 ６ ｏ分
−ｃ溶ｍさせた。その後、６４ｒｎｌの液ＩＩ （０，
，２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ）を加え０℃、５分間
放置した後４８ｍＡ！の液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナトリウム
、ｐｉ−１４，８）を添加し６０分間放置した。遠心分
離を行なった後、上清に２．５倍容の冷エタノールを加
え、−２０１２に３０分間静置する。遠心分離後、残査
を１０ｍＪの液■（０，１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５
Ｍ）リス緩衝液、ｐＨ３，０）にとがし、さらに２回エ
タノール沈澱を行ない、最終的に５．６ ｍｌのＴＥＳ
緩衝液（２０嘘トリス緩衝液、 ｐＨ８，０、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ 、＋ ５０’ｍＭＮａＣｔ）にとかした。
に接種し、２８℃で７２時間ロータリーシェーカーで培
養した。この前培養液１５ｍ１！を３００ｍ１の３４％
シュークＯ−ス、 ０．２％ＭｇＣ，ａ２・６Ｈ２０、
０，４チグリシンを含むＹＥ■培地に植菌し、２８℃で
２４時間培養後、遠心分離を行ない集菌する。１２チシ
ユークロースで洗浄後、菌体を３２１ｎｌの液Ｉ（５４
個リゾチーム、５０ｍＭグリコース、ｌｏｍＭエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） 、 ２５ｍＭ ）リス緩
衝液、ｐｆ−１８，０）に懸濁し、ｏ ℃、 ６ ｏ分
−ｃ溶ｍさせた。その後、６４ｒｎｌの液ＩＩ （０，
，２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ）を加え０℃、５分間
放置した後４８ｍＡ！の液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナトリウム
、ｐｉ−１４，８）を添加し６０分間放置した。遠心分
離を行なった後、上清に２．５倍容の冷エタノールを加
え、−２０１２に３０分間静置する。遠心分離後、残査
を１０ｍＪの液■（０，１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５
Ｍ）リス緩衝液、ｐＨ３，０）にとがし、さらに２回エ
タノール沈澱を行ない、最終的に５．６ ｍｌのＴＥＳ
緩衝液（２０嘘トリス緩衝液、 ｐＨ８，０、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ 、＋ ５０’ｍＭＮａＣｔ）にとかした。
このＤＮＡ溶液に、０．３ ｍの１０ｍ９／１ｎｌのＥ
ｔＢｒ 、 ６．０ ｇのＣ８Ｃ４を加えＲＰ６５Ｔロ
ーター（日立製作所）を用い、３８．Ｏ’ＯＯｒｐｍ
＝１８℃、４０時間超遠心分離を行った。超遠心分離を
行なった後、Ｕｖクランプ射によって観察されるプラス
ミドを注射器でぬきとシ、ブタノールでＥｔＢｒを除い
た後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス緩衝液。
ｔＢｒ 、 ６．０ ｇのＣ８Ｃ４を加えＲＰ６５Ｔロ
ーター（日立製作所）を用い、３８．Ｏ’ＯＯｒｐｍ
＝１８℃、４０時間超遠心分離を行った。超遠心分離を
行なった後、Ｕｖクランプ射によって観察されるプラス
ミドを注射器でぬきとシ、ブタノールでＥｔＢｒを除い
た後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス緩衝液。
ｐＨ７，５、、１ｍＭ ＥＤＴＡ ）に対し十分透析し
た。このようにして実質的に純粋なプラスミドＤＮＡ
ｐＯＡ ７が得られた。
た。このようにして実質的に純粋なプラスミドＤＮＡ
ｐＯＡ ７が得られた。
参考例１
プラスミドの調製と同様に、ストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣ１０１３７を２０１Ｌｌの３４％シューク
ロース、０、Ｉ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０，８チグリ
シンを含むＴＥＭＥ培地で２８℃２４時間培養した。菌
体を１２％シュークロースで２回洗浄後、１０１ｎｌの
１ｍｐ／ｍＩ！リゾチームを含むＰ３液（７０ｍＲ４Ｎ
ａＣ４゜５ｍＭＭｇＣ４２・６Ｈ２０，５ｒｒＩＭＣａ
Ｃｔ２・２Ｈ２０，０，５Ｍシュークロー７’−、２５
ｍＭＴＥｓ （Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−２−アミノエタン−スルホン酸） 、 ｐｉ−１７，
２）に懸濁し、２８℃３０分ゆるやかに振とうし、プロ
トプラストを形成させた。
ウスＡＴＣＣ１０１３７を２０１Ｌｌの３４％シューク
ロース、０、Ｉ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０，８チグリ
シンを含むＴＥＭＥ培地で２８℃２４時間培養した。菌
体を１２％シュークロースで２回洗浄後、１０１ｎｌの
１ｍｐ／ｍＩ！リゾチームを含むＰ３液（７０ｍＲ４Ｎ
ａＣ４゜５ｍＭＭｇＣ４２・６Ｈ２０，５ｒｒＩＭＣａ
Ｃｔ２・２Ｈ２０，０，５Ｍシュークロー７’−、２５
ｍＭＴＥｓ （Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−２−アミノエタン−スルホン酸） 、 ｐｉ−１７，
２）に懸濁し、２８℃３０分ゆるやかに振とうし、プロ
トプラストを形成させた。
１０００ｘＪで遠心後、１０ｍ１のｐｗｐ液（７０ｍＭ
Ｎａｃｔ。
Ｎａｃｔ。
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、２０ｍＭ ＣａＣＡ
２・２Ｈ２０、０，５Ｍシュークｏ −、Ｘ 、 ２５
ｍＭ ＴＥＳ 、 ｐＨ７，２）で２回洗浄する。ヘマ
チトメーターで計数すると、約１０／ｍｌのプロトプラ
スト懸濁液が得られる。１０のプロトプラストを含む懸
濁液を遠心し、上清をすてた後、残った少量のＰＷＰ液
にプロトプラストを懸濁し、それに２０μｔのｐＯＡ
７ ＤＮＡ液（約１μ１１）を加えた。この直後に、Ｏ
，５＝のポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）液（２，
５チシュークロース、０．１ＭＣａＣＡ２・２Ｈ２０、
１ｍＭ Ｋ２ＳＯ３，５０ｍＭ ）リスーマレイン師緩
衝液、 ｐＨ８，０、０，２％ ｖｏｌ／ｖｏｌ微量元
素溶液［０ｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｇｅ
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、 ＋ ８０ ＋３８９−４
００．１９７４．１ ）を加え室温で１分間放置後５
ｒｕｌのＰＷＰ液を添加しＤＮＡの取シ込みを停止させ
た。遠心後、ｐｗｐｇで洗浄し、白金耳を用いて、再生
培地にまいた。形質転換体の比率が多い場合は、適当希
釈し、過剰量のｐＯＡ７を保持しないプロトプラストを
添加後再生培地にまいた。約２８℃、７日培養すると、
再生プレート上にポックが観察され、すべてのポックは
、ｐＯＡ７を保持していた。形質転換頻度はストレプト
ミセスＯＡ７から調製したｐＯＡ７を用いると４．２Ｘ
１０／μｇＤＮＡであったがストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣ１０１３７から新たに調製したｐＯＡ７を
用いると８．５Ｘ１ｏ ／μｇＤＮＡと上昇した。これ
は、ストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７
が何らかの制限修飾系を保持しているためと考えられる
。
２・２Ｈ２０、０，５Ｍシュークｏ −、Ｘ 、 ２５
ｍＭ ＴＥＳ 、 ｐＨ７，２）で２回洗浄する。ヘマ
チトメーターで計数すると、約１０／ｍｌのプロトプラ
スト懸濁液が得られる。１０のプロトプラストを含む懸
濁液を遠心し、上清をすてた後、残った少量のＰＷＰ液
にプロトプラストを懸濁し、それに２０μｔのｐＯＡ
７ ＤＮＡ液（約１μ１１）を加えた。この直後に、Ｏ
，５＝のポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）液（２，
５チシュークロース、０．１ＭＣａＣＡ２・２Ｈ２０、
１ｍＭ Ｋ２ＳＯ３，５０ｍＭ ）リスーマレイン師緩
衝液、 ｐＨ８，０、０，２％ ｖｏｌ／ｖｏｌ微量元
素溶液［０ｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｇｅ
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、 ＋ ８０ ＋３８９−４
００．１９７４．１ ）を加え室温で１分間放置後５
ｒｕｌのＰＷＰ液を添加しＤＮＡの取シ込みを停止させ
た。遠心後、ｐｗｐｇで洗浄し、白金耳を用いて、再生
培地にまいた。形質転換体の比率が多い場合は、適当希
釈し、過剰量のｐＯＡ７を保持しないプロトプラストを
添加後再生培地にまいた。約２８℃、７日培養すると、
再生プレート上にポックが観察され、すべてのポックは
、ｐＯＡ７を保持していた。形質転換頻度はストレプト
ミセスＯＡ７から調製したｐＯＡ７を用いると４．２Ｘ
１０／μｇＤＮＡであったがストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣ１０１３７から新たに調製したｐＯＡ７を
用いると８．５Ｘ１ｏ ／μｇＤＮＡと上昇した。これ
は、ストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７
が何らかの制限修飾系を保持しているためと考えられる
。
＊再生培地
シュークロース １３７ＩＩグルコース
１０ｙ ポリペプトン（大玉） ４．Ｏ，！ｉ’イース
ト・エクストラクト ４．０ｇＭｇＣ４２・６Ｈ２０
４、ＩＩ ＫＣ４” ０．５ＦＫ２ＨＰ
０４０゜２ｇ ＣａＣＡ２・２Ｈ２０７，４＆ ＴＥＳ緩衝液 ５・７ｇ脱イオン水
１ｔ ｐＨ７，２ 寒天 ２２．９参考例２ ｐＯＡ７でストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７を形質転換した後、出現してきたポックを再生培
地に移植し胞子を形成させた。ここから胞子懸濁液を調
製し、適当希釈後再生培地にまいてコロニーを形成させ
た。ｐＯＡ７を保持しないストレプトミセス・グリセウ
スＡＴＣＣ１０１３７の胞子をプレート−面に生育する
ように磯くまいた再生培地に、先のコロニーをＬ／プリ
カしてコロニーの回りに狭い胞子形成阻害ゾーンが形成
されるかどうかで、それぞれのコロニーのポック形成能
を判足した。この結果１生活史（ｏｎｅ １ｉｆｅ ｃ
ｙｃｌｅ ）当υポック形成能を示さなくなった胞子は
０．５％以下（０／２００）であシ、これはｐＯＡ７の
脱落頻度と考えられ、ｐＯＡ７はストレプトミセス・ブ
リセラｙ、 ＡＴＣＣ１０１３７で安定であることが明
らかとなった。
１０ｙ ポリペプトン（大玉） ４．Ｏ，！ｉ’イース
ト・エクストラクト ４．０ｇＭｇＣ４２・６Ｈ２０
４、ＩＩ ＫＣ４” ０．５ＦＫ２ＨＰ
０４０゜２ｇ ＣａＣＡ２・２Ｈ２０７，４＆ ＴＥＳ緩衝液 ５・７ｇ脱イオン水
１ｔ ｐＨ７，２ 寒天 ２２．９参考例２ ｐＯＡ７でストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７を形質転換した後、出現してきたポックを再生培
地に移植し胞子を形成させた。ここから胞子懸濁液を調
製し、適当希釈後再生培地にまいてコロニーを形成させ
た。ｐＯＡ７を保持しないストレプトミセス・グリセウ
スＡＴＣＣ１０１３７の胞子をプレート−面に生育する
ように磯くまいた再生培地に、先のコロニーをＬ／プリ
カしてコロニーの回りに狭い胞子形成阻害ゾーンが形成
されるかどうかで、それぞれのコロニーのポック形成能
を判足した。この結果１生活史（ｏｎｅ １ｉｆｅ ｃ
ｙｃｌｅ ）当υポック形成能を示さなくなった胞子は
０．５％以下（０／２００）であシ、これはｐＯＡ７の
脱落頻度と考えられ、ｐＯＡ７はストレプトミセス・ブ
リセラｙ、 ＡＴＣＣ１０１３７で安定であることが明
らかとなった。
参考例３
コピー数はキーザーらの方法（Ｋｉｅａｅｒ ｈ Ｔ、
ｅｔａｌ、 ｈ Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
＃ １８５ ＊ ２２：３〜２３８ ＋ ）・９８２
、）を一部改変して決定した。すなわち、ｐＯＡ７を
鵠するストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３
７を実施例と同様にプロトプラスト化し１倍答の１チザ
ルコシル、 ２５ ｍＭ ＥＤＴＡ液を加え完全に溶菌
させた後、７０℃、１０分間保温し、膜結合型ＤＮＡを
細胞残渣から遊離させた。冷却後、１倍溶のフェノール
：クロロホルム（１’： １ ）液を加え激しく攪拌し
、遠心によって水層と有機層とに分けた。この操作によ
シ蛋白質が除かれる。水層をエタノール沈澱後、適当希
釈しオΔ々の希釈サンプルをアガロースゲル電気泳動を
行なった。泳動後、グルをＥｔＢｒ溶液（１，Ｏｔｔ９
／ＴＬＩ ） テ染色し、短波長の紫外線を照射しｃ
ｃ ｃ ＤＮＡに切れ目を入れ、さらに、ＥｔＢｒ溶液
で１時間染色を行なった。このダルをポラロイドフィル
ム６６５を用いて撮影し、そのネガティブフィルムの染
色体とプラスミド部位の濃さを、高滓デンシトメーター
Ｃ８−９１０を用いて定量化した。ストレプトミセス・
グリセウスＡＴＣＣ１０１３７の染色体の大きさを１０
’ｋｂとすると（Ｂｅｎ１ｇｎ１＋Ｒ，ｅｔ ａｌ、、
Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋ ３０ ＋１８
０−１８２．１９７７、 ）、上で得られた染色体とプ
ラスミドの比よシ、ｐＯＡ７のコピー数は約３０コヒー
／染色体と算出された。
ｅｔａｌ、 ｈ Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
＃ １８５ ＊ ２２：３〜２３８ ＋ ）・９８２
、）を一部改変して決定した。すなわち、ｐＯＡ７を
鵠するストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３
７を実施例と同様にプロトプラスト化し１倍答の１チザ
ルコシル、 ２５ ｍＭ ＥＤＴＡ液を加え完全に溶菌
させた後、７０℃、１０分間保温し、膜結合型ＤＮＡを
細胞残渣から遊離させた。冷却後、１倍溶のフェノール
：クロロホルム（１’： １ ）液を加え激しく攪拌し
、遠心によって水層と有機層とに分けた。この操作によ
シ蛋白質が除かれる。水層をエタノール沈澱後、適当希
釈しオΔ々の希釈サンプルをアガロースゲル電気泳動を
行なった。泳動後、グルをＥｔＢｒ溶液（１，Ｏｔｔ９
／ＴＬＩ ） テ染色し、短波長の紫外線を照射しｃ
ｃ ｃ ＤＮＡに切れ目を入れ、さらに、ＥｔＢｒ溶液
で１時間染色を行なった。このダルをポラロイドフィル
ム６６５を用いて撮影し、そのネガティブフィルムの染
色体とプラスミド部位の濃さを、高滓デンシトメーター
Ｃ８−９１０を用いて定量化した。ストレプトミセス・
グリセウスＡＴＣＣ１０１３７の染色体の大きさを１０
’ｋｂとすると（Ｂｅｎ１ｇｎ１＋Ｒ，ｅｔ ａｌ、、
Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋ ３０ ＋１８
０−１８２．１９７７、 ）、上で得られた染色体とプ
ラスミドの比よシ、ｐＯＡ７のコピー数は約３０コヒー
／染色体と算出された。
添付の第１区：ｄ１本発明のプラスミドｐＯＡ ７の制
限酵象１１ト１図である。 特許出願人 三楽オーシャン株式会社 手 続 補 正 書（自発） 昭和５ｒ年タ月７２日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、 事件の表示 昭和夕ど年特許願第≠≠グ６３号 λ 発明の名称 プラスミドｐＯＡ ７ ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 電 話 （０３’９乙乙−タｇ６り 弘 補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ！ 補正の内容 （１） 明細書第３頁第１６行から第１７行に「宿主
内で安定で且つマビー数が適度に多い放線菌由来の・・
・・」とあるを「宿主内で安定な放線菌由来の・・・・
」に訂正する。 （２）同第グ頁第ｊ行から第６行に「安定であり更に大
きさが適当であり、且つ、」とあるを「安定であシ、且
つ、」と訂正する。 （３）同第グ頁第７４行に「≠ケ所」とあるを「３ケ所
」と訂正する。 （４）同第５頁第１乙行に［（，２＆≠±０７ｋｂ）」
とあるを［ｉ’（、＋、、ｔ９±０７ｋｂ）」と訂正す
る。 （５）同第１１頁第ｒ行に「参考例２〜３」とあるを「
参考例λ」と訂正する。 （６）同第１１頁第７行から第ｉｏ行に「安定性に優れ
コピー数も適度に多く、ベクターとして・・・・」とあ
るを「安定性に優れ、ベクターとして・・・・」と訂正
する。 （力 同第１７頁第グ行から第１ｒ頁第１／行の「参考
例３」を全文削除する。 以上
限酵象１１ト１図である。 特許出願人 三楽オーシャン株式会社 手 続 補 正 書（自発） 昭和５ｒ年タ月７２日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、 事件の表示 昭和夕ど年特許願第≠≠グ６３号 λ 発明の名称 プラスミドｐＯＡ ７ ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 電 話 （０３’９乙乙−タｇ６り 弘 補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ！ 補正の内容 （１） 明細書第３頁第１６行から第１７行に「宿主
内で安定で且つマビー数が適度に多い放線菌由来の・・
・・」とあるを「宿主内で安定な放線菌由来の・・・・
」に訂正する。 （２）同第グ頁第ｊ行から第６行に「安定であり更に大
きさが適当であり、且つ、」とあるを「安定であシ、且
つ、」と訂正する。 （３）同第グ頁第７４行に「≠ケ所」とあるを「３ケ所
」と訂正する。 （４）同第５頁第１乙行に［（，２＆≠±０７ｋｂ）」
とあるを［ｉ’（、＋、、ｔ９±０７ｋｂ）」と訂正す
る。 （５）同第１１頁第ｒ行に「参考例２〜３」とあるを「
参考例λ」と訂正する。 （６）同第１１頁第７行から第ｉｏ行に「安定性に優れ
コピー数も適度に多く、ベクターとして・・・・」とあ
るを「安定性に優れ、ベクターとして・・・・」と訂正
する。 （力 同第１７頁第グ行から第１ｒ頁第１／行の「参考
例３」を全文削除する。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ストレプトミセス・グリセラムＡＴＣＣ１０１３７に対
してポック形成能を付与する性質を有し、分子量が約２
６．４ｋｂであジ、且つ下記の制限酵素に対して下記の
感受性を示す、すなわち （ａ） ＥｃｏＲ４による認識部位が１ケ所であ）、
（ｂ） Ｋｐｎ Ｉによる認識部位が３ケ所であり、
（ｃ） Ｐｓｔｌによる認識部位が２ケ所であシ、（
ｄ） Ｓａｌ ｌによる認識部位が９ケ所以上であシ
、（ｅ） ＢａｍＨｌ 、 Ｂｇｌｌｌ 、 Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ及びＸｂａ）によシ切断されない ことを特徴とするプラスミドｐＯＡ７゜
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58044463A JPS59169493A (ja) | 1983-03-18 | 1983-03-18 | プラスミドｐｏａ７ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58044463A JPS59169493A (ja) | 1983-03-18 | 1983-03-18 | プラスミドｐｏａ７ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59169493A true JPS59169493A (ja) | 1984-09-25 |
Family
ID=12692185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58044463A Pending JPS59169493A (ja) | 1983-03-18 | 1983-03-18 | プラスミドｐｏａ７ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59169493A (ja) |
-
1983
- 1983-03-18 JP JP58044463A patent/JPS59169493A/ja active Pending
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