JPH03227399A - ホスファチジルコリン或いはホスファチジルエタノールアミンの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は二種以上のりン脂質を特定のリン脂質に再現性
よくしかも高純度に分離することができるリン脂質の分
離方法に関する。

〈従来の技術〉 近年、リン脂質が持っている様々な生理活性について種
々研究がなされている。例えば鶏卵黄より抽出したリン
脂質については、血清コレステロール低下作用、血圧降
下作用。

神経伝達系の活性化作用等有用な機能が注目されている
。しかし、卵黄の状態では例えばコレステロールや卵黄
たんばく質が共存しているため、十分に上記有用な機能
が発揮できないという問題がある。そこで卵黄の状態か
ら卵黄リン脂質の主成分である卵黄ホスファチジルコリ
ン（ｐｃ）、卵黄ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ
　Ｅ）等を分画して高純度で取り出す必要がある。

上記ＰＣ，ＰＥ等のリン脂質を分離・精製する方法とし
ては、数多くの報告があゆ、高純度にリン脂質を得るに
は液体クロマトグラフィーが適しているが、従来のクロ
マトグラフィーの条件は、移動相として極性の高い溶媒
（例１ｆ、メタノール、エタノール、水）と極性の低い
溶媒（例えば、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、ベンゼン
、アセトニトリル）とを組み合わせて使用するものであ
り、成分も例えばアセトニトリル／メタノール／水ある
いはジクロロメタン／メタノール／アンモニアなどの３
種類以上のもの又はこれに酸。

塩類を加えた複数成分系の混合溶媒がほとんどであった
（「続　生化学実験講座　第３巻膜脂質と血漿タンパク
質（上）」ｐ３〜５日本生化学会編東京化学同人発行参
照）。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかしながら前述した従来の技術に係るリン脂質の分離
においては、大量の移動相溶媒を使用する必要があり、
従来の複数成分系の混合溶媒の回収・再利用は、単純な
精製方法では困難なために使い捨てにされており、その
分製品のコストアップとなっていた。

また、分離・精製した製品を食品、医薬の原料として使
用するには安全性の高い溶媒を使用しなくてはならない
が、従来知られている溶媒の組み合わせにはそのような
ものはないのが現状である。

一方、移動相溶媒を例えばｎ−ヘキサン。

クロロホルム、メタノール等の単一相としてケイ酸系吸
着分配クロマトグラフィーでリン脂質の分画を行うこと
が提案されている（特開昭６２−１２０３４０号公報参
照）。

しかしながら、当該公報には、ＰＥ、ＰＣを分離できる
のは、ベンゼンにリン脂質を溶解させてから移動相溶媒
（メタノール等）を流していることが開示されているが
、この場合分離したＰＥ、ＰＣからベンゼンを完全に除
去することは難かしく、得られた製品中に該ベンゼンが
少量残存している可能性が高いため、食品・医薬向けの
原料には適さないという問題がある。さらに移動相溶媒
のメタノールにベンゼンが混入したベンゼン−アルコー
ル系の溶媒ζよ、単蒸留法で精製しても再利用すること
は難かしく、再利用するためには専用の大きな設備が必
要となる。

本発明は息上述べた事情に艦み、食品・医薬品の原料と
して十分に安全性が高く且つ特定のリン脂質のみを効率
よく分離することができるリン脂質の分離方法を提供す
ることを目的とする。

く課題を解決するための手段〉 前記目的を達成するための本発明に係るリン脂質の分離
方法は、二種以上のリン脂質を含有する油脂を液体クロ
マトグラフィーにより特定のリン脂質に分離するリン脂
質の分離方法において、液体クロマトグラフィーの移動
相溶媒がエタノールと水との混合溶媒であることを特徴
とする。

す下、本発明の構成を詳細に説明する。

ここで二種以上のリン脂質を含有する油脂（以下「リン
脂質混合物」という）とは、グリセロリン脂質（ＰＣ，
ＰＥ、ホスファチジルセリン（ｐｓ）、ホスファチジル
イノシトール（ＰＴ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）。

ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びこれらのリゾ
体）及びスフィンゴリン脂質（ＳＰＭ）のリン脂質が二
種以上成分中に含まれろ油脂をいい、例えば卵黄、大豆
、牛脳等の動植物組織や糸状菌体（例えばレスダマカビ
属等）等の微生物体より抽出したリン脂質や、全合成・
半合成により得られたリン脂質を含有するとともに他の
脂質（中性脂質、！脂質等）を含むものを挙げることが
できる。この場合リン脂質が２０重量％以上含むリン脂
質混合物であることが望ましい。市販品としては、例え
ば「卵黄レシチンＰＬ−３０（リン脂質的３０％、中性
脂質的７０％）」〔商品名；キューピー■製〕、「卵黄
レシチンＰＬ−６０（ＩＪリン質約７５％、中性脂質的
２５％）」〔商品名；キューピー■製〕、「卵黄レシチ
ンＰＬ−１００Ｈ（リン脂質的１００％）」〔商品名；
キューピー■製〕を挙げる乙とができる。

リン脂質混合物から特定のリン脂質を分離する液体クロ
マトグラフィーとは、カラムクロマトグラフィーの一種
であり、吸着剤を充填したカラムを用い、さらに移動相
に液体を用いるクロマトグラフィーをいい、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の他に中圧液体クロマト
グラフィー、低圧液体クロマトグラフィーを挙げること
ができる。

この吸着分配り四マドグラフィーに用いる充填剤として
は、四塩化珪素又はケイ酸ソーダから得られるモノケイ
酸が三次元的に重合したシリカゲルを用いるのが好まし
い。このシリカゲルは一般には全多孔シリカと称せられ
ており、直径１０人〜２０００人の大きさの微細孔を有
するものが用いられてお外、中でも３０人から５ｏｏ人
程度のものを用いるのが好ましい。具体的には、粒径３
〜５０μｍの全多孔性球状シリカゲル、粒径５〜３５０
μｍの全多孔性破砕状シリカゲルがある。

液体クロマトグラフィーの移動相溶媒は、低級アルコー
ルと水との二成分系混合溶媒が使用でき、特に医薬品２
食品用の原料にリン脂質を用いる場合には、エタノール
と水との混合溶媒が好ましく、そのエタノール／水比が
９９／１〜５０１５０より好ましくは９５１５〜８５／
１５の範囲とするのがよい。

尚、食品、医薬原料としないならば、エタノールに代え
Ｃ４以下の低級アルコール、例えば、メチルアルコール
、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールなどを使
うことができる。この際、アルコールの濃度が上記範囲
に入るならば他の成分を含んでいても何ら影響ない。

また、分画の際のテーリングを減少させる方法としては
、公知の方法であればいずれの方法を使用しても差しつ
かえない。

さらに、これらの移動相溶媒は使用後に単蒸留などを行
い、比重計などにより濃度の確認をしてアルコール、水
などを加えて適宜調整することにより、容易に何度も使
用でき、コストを削減することができる。

上記リン脂質混合物を溶解させる溶媒としては、新たな
溶媒の調整は必要なく上記液体クロマトグラフィーで使
用する移動相溶媒を用いればよい。

く試　験　例〉 以下、本発明の効果を示す試験例を説明する。

無水エタノール９２０　ｍｊと蒸留水８０ｍｊとを混合
脱気して移動相溶媒とした。

試料としては卵黄精製リン脂質として「卵黄レシチンＰ
Ｌ−１００）ＩＪ　　（商品名；キューピー■製）を用
い、該卵黄レシチンＰＬ−１００Ｈ０，２ｇを移動相溶
媒に溶解し、全量を４ｍｊとし、細孔径が０．５μｍの
フィルターで濾過し、不溶物を除去したものを試料溶液
（ＰＬ−１００Ｈ５％溶液）とした。

この得られた試料溶液を用い、下記条件において高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離を行った（
第１図（ａ）参照）。

ＨＰＬＣ条件 ・移動相溶媒：無水エタノール／水（９２：　８　ｖ／
ｖ）流速１　ｍ　Ｉ　／　ｍ　ｉ　ｎ −カ　ラ　ム：　ＹＭＣ−Ｐａｅｋ　ＳＩＬ　ＡＯＯ３
（商品名；■ワイエムシイ製）２５０Ｘ４．６−ＩＤ、
シリカゲル粒径５μ窮　細孔径１２０人 ・検　出　蕾：紫外線検出器 λ＝２０４ｎｍで測定 （ＡＵＦＳ：　　１．０１ ・試　料　量：４０μＩ　（脂質絶対量２ｇ）・チャー
トスピード：６ｃｍ／ｂ 流出液を７ラクシ震ンコレクターにて２．５分毎に分取
し、得られた各フラクシｉン毎に薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）を行い、脂質組成の分析を行った（第１図
（ｂｌ参照）。

ＴＬＣ条件 ＴＬＣプレート：シリカゲル６０　　（Ｍｅｒｅｋ製）
ｓ開ｗ：　クロ四ホルム／メタノール／水（６０：　　
２５　：　４　　ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）比較例として
従来のリン脂質分離用の移動相溶［（ｎ−ヘキサン／無
水エタノール／水（３５：　　６０：　　５　ｖ／ｙ／
ｖ）を用い、上記卵黄レシチンＰＬ−１００ＨＩＯ％溶
液（試料は移動相溶媒と同じ溶媒に溶解）２０μＩ（脂
質絶対量２＋＋＋ｇ）を注入し、リン脂質のＨＰＬＣ分
離を行った（第２図（ａ）参照）。

得られた各ワラクシ１ンを用い、同様にＴＬＣを行った
（第２図（ｂｌ参照）。

本試験例で得られたＨＰＬＣチャート（第１図（ａ））
及びＴＬＣチャート（第１図（ｂ））と、比較例で得ら
れたＨＰＬＣチャート（第２図（ａ））及びＴＬＣチャ
ート（第２図（ｂ））とを比較すると、本試験例では比
較例と同等以上に高い分離性を有することが判明した。

従来のＨＰＬＣ条件では、用いる移動相溶媒が安全上問
題のあるものが多く、得られた製品中に溶媒が残留する
可能性があるため医薬品２食品用の原料に使用すること
には問題があるが、本試験例のようにエタノール／水を
移動相溶媒として用いた場合、分離能も従来と同等以上
であるとともに、溶媒としてエタノール／水を用いてい
るので、分取した製品中にわずかに溶媒が残留したとし
ても、医薬品用２食品用の原料に用いることが可能とな
る。

く実　施　例〉 以下、本発明の好適な一実施例を詳しく説明する。

（に」ユ 試験例と同様の試料溶液を用い、ＰＬ−１００Ｈとして
２００ＷＩｇ注入し、試験例と同様に操作して　ＨＰＬ
Ｃ分離を行った（第３図（ａｌ参照）。

流出液をフラクシ蘇ンコレクターにて、５分毎に分取し
た。

得られた流出液のＴＬＣ分析を行った（第３図（ｂｌ参
照）。

また、ＰＣ分画成分としてワラクシ９ン歯１２〜Ｎｏ、
１８（流出５５　ｍｌ−９０ｒｒ、ｌ　）を集め、エバ
ポレータにて溶媒除去を行い、アセトン洗浄にて脱水し
、その後乾燥させて１２６■の白色粉末状の高純度ＰＣ
を得た。

この得られた高純度ＰＣの下記条件によるＴＬＣ−ＦＩ
Ｄ法（イアトロスキャン；■ヤトロン製）による分析で
は、ＰＣ含量は９９．６％であった。

更に、ＰＥ分画成分としてフラクシ嘗ン嵐３〜＆、５（
流出１０〜２５ｍｊ）を集め、エバポレータにて溶媒除
去を行い、アセトン洗浄にて脱水し、その後乾燥させて
２２＋＋＋ｇの黄白色塊状の高純度ＰＥを得た。

この得られた高純度ＰＥのＴＬＣ−ＦＩＤ法による分析
では、ＰＥ含量は９７．２％であった。

ＴＬＣ−ＦＩＤ分析条件 ・ロッド：　クロマロッドＳ−［ ・１　次：クロロホルム／メタノール／水（７０：　　
３０：　　３　　ｖ／ｖ／ｖ）８艶・２　次：ヘキサン
／エーテル／ギ酸 （４０：　　１０：　　０．１　　ｖ／ｖ／ｖ）ＩＯＣ
ＩＩ上記結果より、移動相溶媒としてエタノール／水（
９２：　　８）二成分系混合溶媒を用いたことにより、
ＰＣとＰＥとが効率よく分離できたと共に、高純度のＰ
ＣとＰＥとが得られた。

哀ｍ 無水エタノール８．５ｊと蒸留水１．５１とを混合し、
移動相溶媒とした、このときの溶媒のエタノール濃度を
酒精計で計測したところ８６．５％であった。

次にＰＬ−１００Ｈ２０ｇを移動相溶媒に溶解し、実施
例１と同様の操作により、下記条件にてＨＰＬＣ分離を
行った。

ＨＰＬＣ条件 ・移動相：無水エタノール／水（８５：　　１５　ｖ／
ｖ）流速　２０　ｍ　／　／　ｍ　ｉ　ｎ ・カラＡ：　ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　　ＳＩＬ　　５Ｈ−０
４６−５０（商品名；■ワイエムシイ製） １０００Ｘ２０ｍｌＤ　シ’−１ヵゲル粒径５０μｓ細
孔径１２０人 ・検出器＝Ｕ■　λ＝２０４ｎｍ ｐｃＢ分として、１０．５ｇの高純度ＰＣが得られ、Ｔ
ＬＣ−ＦＩＤ法による分析ではＰＣ含量は９９．３％で
あった。

またＰＥ画分として、１．７ｇの高純度ＰＣが得られ、
ＴＬＣ−ＦＴＤ法による分析ではＰＥ含量は９６．５％
であった。

本実施例でＨＰＬＣに使用した移動相溶媒を蒸留回収し
たところ、８．４１のエタノール／水混合溶媒が得られ
た。この回収溶媒の濃度は酒精計で計測したところ、８
５．３％であった。

本実施例においては混合溶媒のエタノール／水比を８５
／１５としてリン脂質のＨＰＬＣを分離し、高純度のＰ
ＣとＰＥとが得られた。

また移動相溶媒も回収出来、実施例３て使用することと
した。

害−施一伝−ｊ 実施例２において回収した回収溶媒８．４１に、無水エ
タノール１．５９ｒと蒸留水０．１５１とを加えて混合
し、移動相溶媒とした。、この得られた移動相溶媒の濃
度は、酒精計で計測したところ、８６．５％であった。

実施例２と同様に操作し、ＰＬ−１００Ｈ２０ｇをＨＰ
ＬＣにて分離した。

その結果２６画分として、１０．２ｇの高純度ｐｃ　（
ｐｃ含量９９．４％）と、ＰＥ画分として１．８ｇの高
純度ＰＥ　（ＰＥ含量９６．５％）とが得られた。

本実施例では回収溶媒を用いてＨＰＬＣ分析を行ったが
、実施例２と同様に、高純度ＰＣと高純度ＰＥとが得ら
れた。

〈発明の効果〉 以上、試験例、実施例とともに詳しく述べたように本発
明は、分離・精製するリン脂質混合物を分離するに際し
、移動相溶媒として、エタノール・水という人体に対し
安全性の高い溶媒だけを使用するため、す下の効果を奏
する。

■　従来のように有害成分の残留が全（なく、食品・匡
薬に使用しても十分に安全性が高い。

■　単蒸留により移動相溶媒を簡単に回収して再利用で
きる。

■　エタノール・水という極性の高い溶媒同士の組み合
わせにもかかわらずリン脂質（例えばＰＣ，ＰＥ等）を
高純度に分離することができる。

■　低コストで高純度のリン脂質を工業的に製造するこ
とが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａｌは本発明の試験例に係るＨＰＬＣのクロマ
トグラム、第１図（ｂｌはその分画物のＴＬＣのクロマ
トグラム、第２図（ａｌは従来例にががるＨＰＬＣのり
四マドグラム、第２図（ｂ）はその分画物のＴＬＣのク
ロマトグラム、第３図（ａｔは本発明の実施例１に係る
ＨＰＬＣのクロマトグラム、第３図（ｂｌはその分画物
のして得られたＴＬＣのクロマトグラムである。 （ａ） 第 試験例 図 Ｕの比較例 （ｂ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）二種以上のリン脂質を含有する油脂を液体クロマト
   グラフィーにより特定のリン脂質に分離するリン脂質の
   分離方法において、液体クロマトグラフィーの移動相溶
   媒がエタノールと水との混合溶媒であることを特徴とす
   るリン脂質の分離方法。 ２）請求項１記載のリン脂質の分離方法において、 上記移動相溶媒のエタノール／水比が９９／１〜５０／
   ５０の範囲であることを特徴とするリン脂質の分離方法
   。