JPH03228681A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドをコードする核酸断片およびその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ａ型でもＢ型でもない血清型肝炎の原因ウィ
ルス（非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス）のウィルス抗原をコー
ドする遺伝子断片、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチ
ド、およびこれら利用法に関する。

ウィルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎
（血清肝炎）の２種類があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、Ａ型肝炎ウィルスは、ピコルナウィルスに属する
、直径２７ｎｍのＲＮＡウィルスであり［Ｆｉｎｅｓｔ
ｏｎ、Ｓ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１８２　ｐ１
０２６　（１９７３）］、一方Ｂ型肝炎ウィルスは、ヘ
パドナウィルスに属する直１１４２ｎ■のエンベロープ
を持つＤＮＡウィルスであることが突き止められた。［
Ｄａｎｅ、０．Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｌａｎｃｅｔ、　　＋　ｐ６９５　（１９７０）］また
、現在では、これらの肝炎ウィルスの免疫血清学的診断
方法が確立されるに至っている。

これら２つの肝炎ウィルスの確定診断方法が確立される
に従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在
が明らかになってきた［　Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ。

Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｉ　ｐ２４１
　（１９７４）］。

輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）のスクリーニング方法の導入により大幅に減少したが
ゼロにはならず、しかも、発生した肝炎患者からは、Ａ
型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このこと
から、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれている
。

この肝炎は、我国では散発性肝炎の約５０％、輸血後肝
炎の９０％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の５０％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。

これとは別に、インド、ビルマ、アフガニスタン、また
は、化アフリカなどで経口感染で流行する、第二のウィ
ルス性非Ａ非Ｂ型肝炎があることが明らかになった［　
Ｋｈｕｒｏｏ、　Ｍ、　Ｓ、　　Ａ鳳、　Ｊ、　Ｍｅｄ
、　。

６８　ｐ８１８−８２４．　　（１９８０）］、　　こ
れは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼
ばれている。我国では、この肝炎の流行は見られていな
いが、渡航者の流行地からの肝炎の輸入は若干見られる
ようである［福原ら、第２５回日本肝臓学会総会講演要
旨系１５１頁（１９８９）　］。

本発明は、上記で言う前者の、主に血液を介して感染す
る血清型非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関するものであり、
本明細書中では、このウィルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スと言う。

この非Ａ非Ｂ型肝炎についてはウィルス本体の分離同定
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。

また、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。

即ち、患者の血清について、診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非Ａ非Ｂ型肝炎として
診断されていた。

この肝炎の原因ウィルスが感染性を持つことは、１９７
８年アメリカの研究グループにより、チンパンジーを用
いた感染実験で証明された［　Ｔａｂｏｒ、　Ｅ、　。

ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ、１　ｐ４６３　（１９７
８）］、　　Ｌかし世界中の多くの努力にもかかわらず
、１０年以上経た今も、原因ウィルスの実態はわかって
いない、患者感染チンパンジーの血液や肝組織を材料と
して、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向流法、ラジオイ
ムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法などのＡ型およびＢ
型肝炎の研究で用いられたほとんどすべてのアプローチ
により、ウィルスや関連抗原抗体系捜しが行われたきた
が、いまだ確実といわれるものは得られていない。

非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス究明の歴史は、期待と失望の歴
史であったともいえる。数多くのウィルスあるいは抗原
抗体系の候補が浮かび上がってきたが、それらは次々に
否定されていった［Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ、　Ｍ、　、　
Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、　３７
．　ｐ２１７．　（１９８３）　］。

最近の例では、５ｅｔｏら、のレトロウィルス説があり
　　［５ｅｔｏ、Ｂ、　　　ｅｔ　　＆＋、：　　Ｌａ
ｎｃｅｔ、　　　Ｉ　　ｐ９４１−９４３　　（１９８
４）］、彼等によると、チンパンジーに非Ａ非Ｂ型肝炎
を起こすことが証明されている血清や血液製剤に逆転写
酵素活性が検出され、ショ糖密度勾配遠心ではこの酵素
は、１．１４ｇ／■！の部分にくる、すなわちレトロウ
ィルスと似た浮上密度を持つというものであった。続い
て、Ｐｒ１ｎｃｅらは、チンパンジー肝初代培＊Ｓ＋胞
に患者血清を接種して、レトロウィルス様粒子が見られ
たと報告した［　Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ、Ｍ、　ｅｔ　ｉ
ｆ、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｉ：ｐ１０７１−１０７５　（
１９８４）］、　Ｌかしながら、逆転写酵素活性はＨｏ
ｌｌｉｎｇｅｒらの追試により否定された［Ｂｏｌｌｉ
ｎｇｅｒ　ｅｔ　ｍｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ。

Ｉ　ｐ４１　（１９８６）１．　　更に、Ｐｒ１ｎｃｅ
らの観察しなウィルス粒子はミクソウィルスの混入とし
て否定された。

非Ａ非Ｂ型肝炎の研究を困難にしている問題点は、血清
中のウィルス濃度が１０２〜１０”と低いこと、同じ接
種材料で再感染を起こしたチンパンジーがあるなど、抗
体の存在が疑がわしいこと、感染実験モデルがチンパン
ジー　マーモセットしかいないことなどである。

最近になって米国のカイロン社が、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスのｃＤＮＡを捕らえたという報告があったが［Ｃｈ
ｏｏ、Ｑ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４
．　Ｐ２Ｓ５−３６２（１９８９）、　Ｋｕｏ、Ｇ、　
ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４．　ｐ３６２
−３６４（１９８９）　］、ウィルスそのものの性状、
ウィルス構成蛋白の性状などはまだ明らかにされていな
い。

一般に、ウィルスの違いは、その免疫血清学的性状の違
い、分子遺伝学的性状の違いより診断方法がまったく異
なってくる。また、株の違いは、免疫血清学的性状が一
部異なるため同一の診断方法では株間の違いにより検出
感度の違い、ワクチンでは免疫原性、感染防御能の違い
が出てくる。

分子遺伝学的診断方法、たとえばＤＮＡプローブ診断に
おいては、プローブとウィルス核酸の間のハイブリダイ
ゼーションは核酸レベルでのホモロジーが非常に高くな
いと実用的ではないことが一般に知られている。すなわ
ち、株間での核酸レベルでの差異により、ＤＮＡのハイ
ブリダイゼーションが起こらず、ＤＮＡプローブ診断が
効果的にできないケースが考えられる。

血清型の肝炎として、よく知られ、既によく解析されて
いるＢ型肝炎においては、欧米、東南アジア等の地域ご
とにメジャーなり型肝炎ウィルスのサブタイプ、すなわ
ちその地域に特徴的な流行株（サブタイプ）が存在する
ことが知られていることから、本発明の対象となる非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルスにおいても地域に特有なウィルス種
、もしくはウィルス株等が存在することが考えられる。

したがって、特定の地域、例えば特に日本で流行してい
る非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの診断方法、予防方法を確立
するには、日本でメジャーな非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス株
を捕らえる必要がある。

ｌ咀ａ旦碧 このような状況のもとに、本発明者らは、非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、肝炎患者血清よ
り非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗原ペプチド配列をコード
している遺伝子をクローニングすることに成功した。

すなわち、本発明者らは、献血者のＧＰＴ高値血漿を用
いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新しい分子遺
伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニング法により
、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに特有なペプチドをコードし
ている遺伝子をクロニングしな、さらに、この遺伝子断
片を遺伝子組換え技術を用いて発現させ得られた発現産
物が、非Ａ　ＩＦ、　Ｂ肝炎患者血清と蛋白レベルにお
いても特異的に反応することを確認し、本発明を完成す
るに至った。

明の　成および 本発明の目的とするような核酸断片をクローニングする
に際しては、研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎に感染した
日本人の肝臓、並びに非Ａ非Ｂ型肝炎を感染させたチン
パンジーの肝臓を用い、ｍＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合
成して、その中から、染色体ＤＮＡとのサブトラクショ
ンによりウィルス特異的ｃＤＮＡを選択してくることが
考えられる。しかしながら、これに必要な良い実験材料
を十分な量確保することはきわめて困難である。

もう一つの研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎感染者あるい
は感染チンパンジーのめ血漿が考えられる。ヒトでは非
Ａ非Ｂ型肝炎のキャリアーの存在が確認されており、輸
血において供血者のＧＰＴ値が高い程輸血後非Ａ非Ｂ型
肝炎の発生頻度が高いことからＧＰＴ高値の血漿はキャ
リアーの頻度が高いと推定されている。そこで我々は比
較的多量に入手可能である、日本の献血者のＧＰＴ高値
血漿をプールし、研究材料とした。このほか、日本人の
非Ａ１１−Ｂ型肝炎患者の血清を接種し非Ａ非Ｂ型肝炎
を発症させたチンパンジーの血漿も用いることができる
が、現在ではチンパンジーの入手性から多少問題が残る
。

血漿中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス濃度は先に述べたよう
に１０２〜１０”程度しかないと推定されていることか
ら、ウィルス核酸の抽出およびｃＤＮＡの合成には１０
００倍程度９イルスを濃縮する必要がある。しかしなが
ら、ヒト血漿は７％前後の蛋白溶液であり、ただ単に濃
縮することは不可能であり、除蛋白をしながらウィルス
を濃縮する必要がある。我々が用いたポリエチレングリ
コール（ＰＩ！Ｇ）などの沈澱剤による沈澱形成は、比
較的簡便に行うことができ、大量の血漿の処理にも適し
ており、ウィルスの失活も少ないマイルドな方法である
。

このほかには、超遠心によるベレッテイング、硫安など
の塩類の添加による塩析、限外濾過、ゲルクロマトグラ
フィーなどが用いられうる。

このように１０００倍程度倍程縮した血漿をグアニジウ
ムチオシアネートで処理し、フェノール／クロロホルム
で抽出をおこない、エタノール沈澱により濃縮血漿中の
全核酸を精製する０次にＤＮＡ分解酵素で混入している
ヒト由来のＤＮＡを分解し、フェノール／クロロホルム
抽出とエタノール沈澱によりＲＮＡを精製する。

精製したＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、λｇｔｌ　１ベ
クターに挿入しｃＤＮＡライブラリーを作成する。

λファージを大腸菌に感染させ、細菌培養プレートにま
き、４２℃で数時間培養する。その後ニトロセルロース
フィルター（ＮＣフィルター）をかぶせ数時間培養し、
ＮＣフィルターをはがしレプリカをとる。

このレプリカをブロキッング液で処理し、ＰＢＳなどで
洗浄した後イムノスクリーニングを行う。

すなわち、レプリカを非Ａ非Ｂ型肝炎回復期あるいは急
性期のヒトまたはチンパンジー血清と反応させ、ＰＢＳ
などで洗浄後、酵素標識抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭと反
応させ、洗浄後、基質溶液と反応させて発色させる０発
色したプラークに対応するファージを選び二次スクリー
ニングを行い、再現性のあるクローンを得た。

このクローンについて非Ａ非Ｂ型肝炎特異性を調べた。

非Ａ非Ｂ型肝炎回復期、キャリアー期、および正常期の
チンパンジーのＩｇＧを用いてプラークイムノアッセイ
を行った結果非Ａ非Ｂ型肝炎キャリアー期に特異性の高
いクローンを得ることができた。このクローンをサブク
ローニングし、アクリルアミドゲル電気泳動で約９０ｂ
ｐの挿入断片（ｊｎｈｌ−１）を確認した。

チンパンジーの正常及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の肝臓、
並びに正常人の白血球より染色体ＤＮＡを精製し、アガ
ロース電気泳動を行った後、＄２ｐ標識したｊｎｈｌ−
１クローンを用いてサザンハイプリダイゼーションを行
った。ｊｎｈｌ−１はいずれのＤＮＡとも反応せず、し
たがってｊｎｈｌ−１は染色体由来ＤＮＡでないと判明
した。

また、日本人のＧＯＴ、ＧＰＴ高値血漿のプール（非Ａ
非Ｂ型肝炎感染性がチンパンジー感染実験で確認されて
いる）、アメリカＮＩＨ由来Ｆ株の非Ａｌ）：Ｂ型肝炎
を継代したチンパンジー血漿および日本の正常人血漿か
らＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ｊｎｈｌ−１ク
ローンの塩基配列の一部をプライマーとしてＰＣＲ反応
［５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．　ｐ４８７−　（１９８８）
］を行った。同様に正常ヒト肝臓よりＤＮＡを抽出し同
じプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。その結果、
日本人のＧＯＴ、ＧＰＴ高値血漿のプールのみからｊｎ
ｈ’！−１塩基配列が検出された。このことは、我々が
捕らえたＪｎｈｌ−１の塩基配列を含む非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスは、米国ＮＩＨ由来Ｆ株の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスと核酸配列上かなり相違があることを示唆している
。

本発明のＪｎｈｌ−１クローンのＤＮＡ配列は、ジデオ
キシ法により決定された。その結果ｊｎｈｌ−１クロー
ンは非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子由来の計８０ｂｐの
ｃＤＮＡ断片であり、その塩基配列は第３５！Ｉの中に
示される通りであった。この塩基配列とこれから推定さ
れるアミノ酸配列をデータベース（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｃ
Ｄソフトウェア開発　１９８９　）で検索したところ、
現在まで知られているウィルス、細菌、その他ホモロジ
ーを示すものはなかった。

このアミノ酸配列から、ＨＯＰＰ　＆　ＷＯＯＤらの手
法に基づき、ｊｎｈｌ−１がコードするペプチドの親水
性・疎水性のパターンを解析した。その結果、第５図に
示すような結果が得られ、このペプチド領域は、全体的
に親水性の強いペプチドであることが確認された。

このように、本発明で得られたｃＤＮＡ断片が、非Ａ　
１１−　Ｂ型肝炎ウィルス抗原のうち親水性の強いペプ
チド領域をコードするものであったことは、免疫学的見
地からも非常に意義深いものと思われた。また、このよ
うな親水性のペプチドは取扱が容易になることから、実
用性の面がらも非常に有用である。

非Ａ非Ｂ型肝炎との関連性をさらに確認するために、多
数の肝炎患者、正常人の血清を用いてｊｎｈｌ−１に対
するプラークイムノアッセイ及びドツトイムノアッセイ
を行った。その結果、正常人、Ｂ型肝炎、その他の肝炎
の群に比べ非Ａ非Ｂ型肝炎患者で高率に抗体陽性者が検
出され、イムノアッセイにより蛋白レベルでも非Ａ　ｌ
＃Ｂ型肝炎に対する特異性が証明された。

非Ａ非Ｂ型肝炎には複数の因子が関与しているとも考え
られているので次にｊｎｈｌ−１の塩基配列の一部を参
考にプライマーを合成してＧＯＴ−ＧＰＴ高値ヒトプー
ル血漿についてＰＣＲ反応を行いサブタイプのクローニ
ングを実施した。ＰＣＲ反応反応度物をλｇｔｌｌベク
ターに挿入し、１ｎｖｉｔｒｏパツケージングを行い感
染性ファージ液を調製後、抗体によるスクリーニング、
あるいはｊｎｈｌｌ内のオリゴプローブを用いたハイブ
リダイゼーションを行った。その結果、抗体と反応する
ファージを２クローン（ｊｎｈｌ−１３、ｊｎｈｌ−１
６＞、オリゴプローブと反応するファージを４クローン
（ｊｎｈｌ−２、ｊｎｈｌ−４、ｊｎｈｌう、ｊｎｈｌ
−６）を得た。これら６クローンについても同様にジデ
オキシ法により塩基配列を決定しく第３図参照）、推定
されるアミノ酸配列を比較した（第４図参照）。

本発明の遺伝子配列は、これを適当な発現系を用いて発
現させ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗体検査に使用する
ことができるし、また、発現した蛋白を動物に免疫して
抗体を作らせ、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎感染患者の
肝組織中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを検出することも可
能である。

さらに、本発明で得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは、
感染予防のためのワクチンの作製に掻めで有用である。

また、遺伝子配列そのものは、非Ａ非Ｂ型肝炎のＤＮＡ
プローブ診断キットの開発に極めて有用である。

このような、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプ
チドをコードする核酸断片、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
原ペプチドおよびこれらを利用した非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスの各種検出方法は、特に日本における非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスの検出において極めて有用であると考えられ
る。

以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明する。

日本赤十字社より供与された、ＨＢｓ抗原陰性で６ＰＴ
値１００以上のヒトプール血漿（８，５１１１＞を以下
の方法で１０００倍に濃縮した。まず、ヒトプール血漿
を粗遠心し、不溶物を除去した。これに１７１０量の５
Ｍ塩化ナトリウム液、次いでｌ／１０量の４０％（Ｗ／
Ｗ　）ポリエチレングリコール液（ＰＥＧ６０００、和
光純系社製、平均分子量７５００　）を４℃にて攪拌し
ながら添加した。−時間静置したのち、７０００回転、
２０分間遠心分離して上清を除き、沈渣に元の血漿の約
ｌ／２０量のＴＨＥ液（１０ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣｌ
、　ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１４０ｍＭＮａｃ
１）を加え、再溶解した。この溶液を、癒着の２０％、
１５％、１０％および５％ＴＮＥ液を段階的に重層した
遠心管の頂部に重層し、４℃、８００００Ｘ　Ｇで、１
２時間超遠心分離した０分離後、上清を除去し、沈渣を
８ｍｌのＰＢＳに溶解してＧｆｆｒ、　　ＧＰＴ高値ヒ
トブール血漿の１０００倍濃縮物とした。

まず、前記の１０００倍濃縮血漿８■ｌに５倍量のグア
ニジウムチオシアネート溶液（４Ｍグアニジウムチオシ
アネート、５０ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，６，
１０ｍＭ　ＥＩＩＴＡ、０．１Ｍ２−メルカプトエタノ
ール、２％ザルコシル）を加え、攪拌した後フェノール
／クロロホルム抽出し、グリコーゲンをキャリアーとし
てエタノール沈澱により濃縮血漿中の全核酸を精製した
０次に、この全核酸中に存在するヒト由来のＤＮＡを分
解するために、２璽閤バナジｌレリボヌクレオチツドコ
ンプレツクス存在下、ＲＮａｓｅフリーＤＮジーｅ　１
．１５ＫＵ／ｍｌ（ベーリンガー／マンハイム社製）、
５０履Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，４，１腸ＭＥＤ
ＴＡ、１０１Ｍ　ＭｇＣ１ｚの混液４００Ａ中にて、３
７℃、３０分間処理した。その後、２５０朧ＭＥＤＴＡ
液１６ｕｇ、１０％ＳＤＳ液８ＩＡを加え反応を停止し
、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
りＲＮＡを精製した。さらに、このＲＮＡ中に存在する
多量のグリコーゲン及び微量に存在すると思われる不純
物を除くために、ＱＩＡＧＩＥＮ　ｐａｃｋ−１００（
ＤＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製操作を行った。

ｃＤＮＡ−−＋　− 前記までの方法で精製したＲＮＡすべてを、ｃＤＮＡ合
成システムプラス（アマジャム社製）を用いてｃＤＮＡ
合成を行った０次に、合成したｃＤＮＡをｃＤＮ＾クロ
ニングλｇｔｌｌ　（アマジャム社製）によりλｇｔｌ
ｌベクターにクローニングした。ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッ
ケージングの結果、１．８Ｘ　１０’プラークフオーミ
ングユニツト（ＰＦＵ）のライブラリーを得た。

（４）非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）回復期及びキャリ
アｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いる一次
抗体はＦＩＡＮＢＨ回復期及びキャリアー期のチンパン
ジー血漿であることがら、高い非特異反応が予想された
。そこで、この非特異反応を抑えるためにスクリーニン
グ用チンパンジー血漿の吸収操作に用いる大腸菌Ｙ１０
９０のライゼートを調製した。即ち、単一コロニーから
アンピシリン５０μ９／厘ｌを含むＬＢ培地［１％Ｂａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｔｏｎｅ　（ジフコ社製）、０．５％Ｂ
ａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　（ジフコ社製
）、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７，５］中で３７℃、−夜培養
した大腸菌Ｙ１０９０培養液２０ｍ１を２ｇのＬＢ培地
に加え、さらに３７℃で一夜培養した。この培養液を遠
心管に移し、９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離
し、上清を除去して沈渣を得た。この沈渣１ｇ当り４１
のＲＩＰＡ液（１％デオキシコール酸ナトリウム、１％
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０，３１！ＮａＣ１，Ｏ，
Ｌ％ＳＤＳ、　０．ＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＩ　　ｐ
Ｈ７，５，１ｍ１ｌ　　ＰＭＳＦ＞を加えて可溶化し、
これをさらに９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離
してその上清を大腸菌ライ、ゼートとした。

Ｂ　　　ス　−−二゛　　　プ１　　　ル　−Ｇｆｆｒ
、ＧＰＴ高値ヒトプール血漿濃縮物中のＲＮＡより構築
したｃＤＮＡラスブラリーから、−枚のＬＢプレート［
１，５％Ａｇａｒ　（日永製薬社製）、１％Ｂａｃｔｏ
−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、　　０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａ
ｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣ１ｐＦＩ７．５．５
０周／ｍｌアンピシリンの入った細菌培養用プレート（
ヌンク社製；２３Ｃ■×２３Ｃ腸）］当り１００ＯＯＰ
ＦＵのファージをとり、大腸菌Ｙ１０９０に３７℃で１
５分間感染させて、Ｔｏｐ　Ａｇａｒ　４０ｍ１　（０
，７％Ａｇａｒ、　　１％Ｂａｃｔ。

ｔｒｙｐｔｏｎｅ＝　　０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓ
ｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、　　１％Ｎ＆Ｃ１１ｐＦ１７．５
．５０μ９／謙１アンピシリン）と共にまき、４２℃で
４〜５時間培養した。その後、１０■ＭＩＰＴＧ（シグ
マ社製）を染みこませたニトロセルロースフィルター（
ＮＣフィルター：　　Ｓ＆Ｓ社製、Ｃｏｄｅ　Ｂ＾８５
．２３ｃｍ×２３ｃ■）をかぶせ、さらに３７℃で培養
を続けた。

３時間後ＮＣフィルターをプレートからはがし、ＰＢＳ
で洗い、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％スキムミルク、０．
０５％Ｎａｐｓを含むＰＢＳ溶液）に浸し、４℃で一夜
振とうした。

Ｃス　１−ニン ブロッキング液中で一夜漬したレプリカフィルターをＰ
ＢＳで洗浄後、ＰＢＳで１０倍に希釈したＮＡＮＢＦ１
回復期及びキャリアー期のチンパンジープール血漿（ス
クリーニング用血漿）　　［ＮＡＮＢＨ回復期及びキャ
リアー期のチンパンジープール血漿をＰＢＳで５倍希釈
し、１／２０量の大腸菌ライゼートを加えて４℃で一夜
非特異反応の吸収操作を行い、さらにＰＢＳで２倍希釈
した。］に浸し、室温で振とうしながら反応させた。２
時間後、ＰＢＳ−Ｔ　（０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳ溶液）で、−回につき１５分間、計３回レプリ
カフィルターを洗浄の後、各々１０００倍希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ抗体（）Ｉ
ＢＬ社製、Ｆａｂ）の入ったインキュベーションバッフ
ァー（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液）に浸し
、３７℃で振とうしながら反応させた。１時閉後、ＰＢ
ＳＴで一回につき１５分間、計４回、その後ＰＢＳで５
分間洗浄後、発色液［０，０２％ＤＡＢ　（シグマ社製
）、０．１％ＮＩＣ１＆・６Ｈ２０，０，００５％［２
０２］に浸し発色させた。

ＮＣフィルター上で発色したプラークに対応するファー
ジを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次ス
クリーニングで選択した各ファージ２００ＰＦＯを別々
に挿入断片のないファージ２００ＰＦＵと共に大腸菌Ｙ
１０９０に感染させ５９０園−シャーレ（ベクトンディ
ッキンソン社製）のＬＢプレートにまき直し、レプリカ
フィルターを作製した。これらを上述の方法で抗体スク
リーニングし、頁ＡＮＢｌ’１回復期及びキャリアー期
のチンパンジー血漿と再現性よく反応するファージを１
クローン（Ｊｎｈｌ）得た。

（４）で得たクローンについて、（４）、Ｃの２次スク
リーニングと同様にレプリカフィルターを作製し、ＮＡ
ＮＢＨ回復期、キャリアー期及び正常のチンパンジー血
清又は、硫安沈澱後ＤＥＡＥ−セルロファイン力ラム（
生化学工業社製）で精製したＩｇＧ分画を用いてプラー
クアッセイを行った。その方法は抗体スクリーニングの
場合と同様であるが、−次抗体反応にチンパンジーのＩ
ｇＧ分酉を用いる場合には５０Ｉｔｇ／ｍｌの濃度にＰ
ＢＳで希釈し、１７２０量の大腸菌ライゼートを加え、
４℃で一夜非特異反応の吸収処理をして使用した。

プラークアッセイの結果、ＪｎｈｌはＮＡＮＢＨキャリ
アー期のチンパンジー血清あるいはＩｇＧ分画と高率に
反応し、正常チンパンジーの血清あるいはＩｇＧ分画と
は全く反応しなかった。

この結果から、ｊｏｈｌは特にＮＡＮＢＨキャリアー期
のチンパンジー血清に特異性の高いクローンであるとい
える９ このｊｎｈｌのファージＤＮＡを精製［実験医学臨時増
刊号、遺伝子工学総集編＋２（１１）、Ｐ３１−３２（
１９８７）参照コし、制限酵素ＥｅｏＲＩ　（東洋紡社
製）切断後ｐｒＪｃ１１８ベクターのＥｃｏ１１部位に
挿入し、サブクローニングを行った［Ｄｏｕｇｌａｓ　
Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

ＩＨ，Ｐ２Ｓ５−５８０（１９８３）参照］、このサブ
クローニングしたプラスミドｐＪｎｈｌ−１をＥｃｏＲ
１切断後、電気泳動で５％アクリルアミドゲルに展開し
たところ、約９０ｂｐの挿入断片（ｊｎｈｌ−１）が確
認できた（第１図）。

’ｎｈ−いた　　ン　ロ 下記のとうり、ｊｎｈｌ−１を用いたサザンプロット分
析を行った。チンパンジーの正常及び米国ＮＩＢ由来Ｆ
株感染ＮＡＮＢＨ急性期（ＮＡ？ＩＢＨウィルス接種後
８週目）の肝臓、さらに正常人の白血球より染色体ＤＮ
Ａを精製し、各々２０ｔｔｇをＥｃｏＲＩで切断後、電
気泳動で２％アガロースゲルに展開し、ＮＣフィルター
に転写した。このフィルターをマルチプライム法で［３
２ｐ］標識したｊｎｈｌ−１プローブを用いサザンハイ
プリダイゼーションを行った（第２図）、この図かられ
かるように、ｊｎｈｌ−１プローブは、−週間オートラ
ジオグラフィーすると、サブクローニング前のＪｎｈｌ
クローンとは反応するが、正常及びＮＡＮＢＨ急性期の
チンパンジーの染色体ＤＮＡあるいは正常なヒトの染色
体ＤＮＡとは反応しなかった。このことから、ｊｎｈｌ
−１はヒトの染色体ＤＮＡ由来のクローンではなく、ウ
ィルス等の外来性の核酸由来のものであると考えちれる
。

ｊｎｈｌ−１の遺伝子断片を組み込んだプラスミドＤＮ
Ａを鋳型とし、　［ａ　−８２Ｐ］　ｄＣＴＰ　（８０
０Ｃ１／　ｍ　ｍｏｌ　）を反応に用いた。　　Ｘｌｅ
ｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔによるポリメラーゼ反応は宝
酒造の７ＤＥＡＺ＾シーゲンシングキツトによって行っ
た。８％のポリアクリルアミド−８Ｍウレアゲルを用い
て、４時間１８００ｖで電気泳動し１６時閏感光した。

Ｂ　　　　　ｆ− 上記の結果得られた塩基配列とそれから予測されるアミ
ノ酸配列の解読の結果をそれぞれ第３図および第４図に
示した。

ｊｎｈｌ−１の予測されるアミノ酸配列の親木性／疎水
性プロフィールを第５図に示す。

得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベ−ス（前
述）で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはなかった。

ｊｎｈｌ−１クローンを取るための材料となったＧｆｆ
ｒ。

ＧＰＴ高値ヒトブール血漿、米国ＮＩＦＩ由来のＮＡＮ
ＢＨのＦ株を接種し慢性化したチンパンジーの血漿（感
染性は確認ずみ）、正常ヒト血漿およびヒト肝臓由来の
染色体１１ＮＡについて、ＰＣＲ反応を用いてＪｎｈｌ
−１塩基配列の検出を行った。まず、各血漿については
、各々１謹ｌを　（１）項と同様に、５Ｍ塩化ナトリウ
ム液と４０％（ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール液を用
いて沈澱させ、この沈渣に５００−のグアニジウムチオ
シアネート溶液を加え、フェノール／クロロホルム抽出
とエタノール沈澱により全核酸を精製した。これを、　
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３、６１Ｍ　
ＭｇＣｈ、　４０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ　ＩＩＴｒ、ｌｄ
　ｄＮＴＰｓ、１．３Ｘｔｌ／ｍｌ　ＲＮａｓｉｎ、３
０ｍｇ／■１ランダムプライマー、４ＫＵ／ｍｌ逆転写
酵素（ＢＲＬ社製）の混液２ＯＩＡ中で、３７℃、１時
間３０分間反応させた。この反応液ｌ−をとり１０ｍＭ
　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、
１．５ｍ１４　ＭｇＣｈ、　０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラ
チン、　１１００ｎ　ｄＮＴＰｓ、２５０ｎＭプライマ
ー（第６図にその位置を示す）２０σ／＋＊Ｉ　Ｔａｑ
　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの混液５〇−中で、９４℃；３
０秒、５５℃；３θ秒、７２℃；　１分を１サイクルと
して４０サイクル反応させた（パーキン・エルマー・シ
ータス社製のサーマルサイクラ−を使用）。

またヒト肝臓由来の染色体ＤＮＡについては、１０Ｍｇ
を上記組成の反応液中で、上記と同一条件下でＰＣＲ反
応を行った。　　ＰＣＢ反応後、各サンプル共５−を取
り、電気泳動により２％アガロースゲルに展開し、ＮＣ
フィルターに転写した。このフィルターを［’ａｌｌｐ
”Ｊ標識したｊｎｈｌ−１内のオリゴプローブ（第６図
にその位置を示す）を用いてハイブリダイゼーションを
行った。その結果ｊｎｈｌ−１塩基配列は、材料となっ
たＧｆｆｒ、　　ＧＰＴ高値ヒトプール血漿からは検出
されたが、正常ヒト血漿、米国ＮＩＨ由来Ｆ株のチンパ
ンジー血漿及び染色体ＤｔｌＡ中には検出されなかった
（第８図）ｊｎｈｌ−１のｃＤＮＡ断片を発現プラスミ
ドｐＵＥＸ２に読み枠が一致するように挿入し、大腸菌
ＪＭ１０９形質転換後ドツトイムノアッセイを行った。

この発現プラスミドは３０℃から４２℃への温度シフト
により発現に誘導がかかるので以下の方法で行った。

形質転換した大腸菌をアンピシリン（Ａｐ）含有（５０
Ｍｇ／ｄ）ＬＢで３０℃−夜培養し、翌日クレット値が
８０となるようにＬＢで希釈後、３０℃１．５時間さら
に４２℃へ移して２時間培養し発現を誘導した。

その後集菌し菌体を１ｗｄＰＢＳ−Ｔに溶解し、１ｇの
ガラスピーズを加えポルテックスミキサーで破砕し、そ
のペレットを１−の５０■Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｌ、　　ｐ
Ｈ８，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡに懸濁してドツトアッセ
イに用いた。この懸濁液をニトロセルロースフィルター
に５Δスポツトした。乾燥後ブロッキング反応から発色
反応までは（４）Ｃと同様に行った。その結果を表１に
示す。

（以下余白） 表 血 清 陽性／検体 陽性率（Ｘ） 正常人　　　　　　　　０／２０　　　０．０非Ａ非Ｂ
型肝炎患者　１７／３０　　５６．７Ｂ型肝炎患者　　
　　　１／９　　　１１．０その他の肝炎患者　　　０
／１０　　　０．０以上のように、非Ａ非Ｂ型肝炎の患
者群においては陽性率が５６．７％と非常に高率である
のに対し、正常人、Ｂ型肝炎患者およびその他の肝炎で
は陽性率０．０％、１１．０％、０．０％と極めて低く
、本発明のｊｎｈｌ−１クローンが非Ａ非Ｂ型肝炎特異
的である事が示された。

非Ａ１１−Ｂ型肝炎には複数の因子が関与しているとも
考えられているのでｊｎｈｌ−１の塩基配列の一部を参
考にプライマー（第７図参照）を合成し、これを用いて
ｊｎｈｌ（のクローンを取る材料となったＧＯＴ−ＧＰ
Ｔ高値ヒトプール血漿（日本人由来）についてＰＣＲ反
応を行いクローニングを実施した。ＰＣＲ反応条件は（
８）に記載しである方法に準じて行った。ＰＣＲ反応反
応度物をｃＤＮＡクローニングλｇｔｌｌ（アマ−ジャ
ム社製）によりλｇｔｌｌベクターにクローニングし、
ｉｎ　ｖｉｔｒ。

パッケージングを行い感染性ファージ液を調製した０次
に、（４）Ｂの方法に従ってスクリーニング用のレプリ
カフィルターを作製し、抗体によるスクリーニングある
いはｊｎｈｌ−１内の混合オリゴプローブ（第７図にそ
の位置を示す）を用いてのハイブリダイゼーションによ
るスクリーニングを行った。

抗体スクリーニング用血漿としてはキャリア期のチンパ
ンジープール血漿を用いて（４）Ｃの二次スクリーニン
グの場合と同様に行った。スクリーニングの結果オリゴ
プローブと反応するクローンを４クローン（ｊｎｈｌ−
２，Ｊｎｈｌ−４，ｊｎｈｌ−５，ｊｎｈｌ−６）、キ
ャリアー期のチンパンジー血漿と反応するファージを２
クローン（ｊｎｈｌ−８、ｊｎｈｌ−１６）おのおの得
た。これらの６クローンの塩基配列ならびにアミノ酸配
列を第３図ならびに第４図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明においてクローニングしたｐｊｎｈｌ
−１のＦ、ｃｏＲ１挿入断片の５％アクリルアミドゲル
電気泳動展開後の模式図である。 第２図は、本発明においてクローニングしたｊｎｈｌ−
１とヒト及びチンパンジーの染色体ＤＮＡとのサザンハ
イブリダイゼーションの模式図である。 第３図は、本発明でクローニングした非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルス抗原をコードする核酸断片の塩基配列を示す。 第４図は、本発明でクローニングした非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルス核酸断片がコードするアミノ酸配列を示す。 第５図は、アミノ酸配列を基に解析した、Ｊｎｈｌ−１
がコードするペプチドの親水性・疎水性プロフィールを
示す。 第６図は、実施例（８）におけるＰＣＢ反応に使用した
ハｈｌ−１塩基配列中のプライマー及びオリゴプローブ
の位置を示したものである。 第７図は、実施例（１０）におけるＰＣＲ反応に使用し
たｊｎｈｌ−１の塩基配列を参考とした混合プライマー
及び混合オリゴプローブの位置と塩基配列を示したもの
である。 第８図は、本発明でクローニングしたｊｎｈｌ−１の塩
基配列中のプライマーを用い、１’ＣＲ反応を利用して
、ヒトの染色体ＤＮＡ及び血清中の核酸から増幅した遺
伝子のハイブリダイゼーションの模式図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドをコードす
   る核酸断片。
2. （２）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスペプチドが、下記の
   （Ａ）から（Ｃ）のアミノ酸配列からなる群から選ばれ
   るアミノ酸配列もしくはその一部を含むペプチドである
   前記第（１）項記載の核酸配列。 （Ａ）【核酸配列があります】 （Ｂ）【核酸配列があります】 （Ｃ）【核酸配列があります】
3. （３）下記の（Ａ）〜（Ｇ）の核酸配列からなる群から
   選ばれる核酸配列もしくはその一部を含む前記第（２）
   項記載の核酸配列。 （Ａ）【核酸配列があります】 （Ｂ）【核酸配列があります】 （Ｃ）【核酸配列があります】 （Ｄ）【核酸配列があります】 （Ｅ）【核酸配列があります】 （Ｆ）【核酸配列があります】 （Ｇ）【核酸配列があります】
4. （４）下記の（Ａ）から（Ｃ）のアミノ酸配列からなる
   群から選ばれるアミノ酸配列もしくはその一部を含む非
   Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 （Ａ）【アミノ酸配列があります】 （Ｂ）【アミノ酸配列があります】 （Ｃ）【アミノ酸配列があります】
5. （５）該ペプチドが、化学的に合成されたペプチドであ
   る前記第（４）項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペ
   プチド。
6. （６）該ペプチドが、前記第（１）項の核酸断片を適当
   な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞内で発現さ
   せることにより得られるペプチドである前記第（４）項
   記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。
7. （７）下記の（Ａ）から（Ｇ）のいずれかの塩基配列に
   含まれる少なくとも１０塩基以上の核酸断片からなるこ
   とを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子検出用核
   酸プローブ。 （Ａ）【塩基配列があります】 （Ｂ）【塩基配列があります】 （Ｃ）【塩基配列があります】 （Ｄ）【塩基配列があります】 （Ｅ）【塩基配列があります】 （Ｆ）【塩基配列があります】 （Ｇ）【塩基配列があります】
8. （８）上記第（７）項の核酸プローブを用いて、対象と
   なるサンプルのＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる
   ことを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出方法。
9. （９）上記第（４）項記載のペプチドを抗原として調製
   される抗非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体。
10. （１０）上記第（９）項記載の抗体を用いることを特徴
    とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの免疫学的検出方法。