JPH0322984A - ヒト血清アルブミンａの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は成熟ヒト血清アルブミンＡの酵母による製造方
法、及びそのための遺伝子系に関する．この方法によれ
ば成熟型のヒト血清アルブミンＡが細胞外に分泌される
ため、その回収・精製が簡単となり、工業的製造のため
に極めて好ましい。

〔従来の技術〕

今まで、遺伝子工学的方法によりヒト血清アルブミンを
製造するための方法として、大腸菌を用いる方法（Ｌａ
ｗｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　９　
＋　６１０３−６１１４．　１９８１：　Ｌａｔｔａ等
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　＋　１３０９１３
１４．　（１９８７）　；特開昭５８−１５０５１７〕
、枯草菌を用いる方法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ等、Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ＋　■迫＋２９１７〜２９２５．　（１
９８７）　）　、及び酵母を用いる方法（Ｅｔ（ｈｅｖ
ｅｒｒｙ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４　＋　７
２６−７３０＋（１９８６）　）が知られている．しか
しながら、これらの方法により製造される血清アルブ旦
ンは正常なヒト血清アルブミンとはアミノ酸配列を幾分
異にし、また生産された血清アルブミンは不溶化沈澱と
なったり、シグナルペプチドのプロセシング効率が低い
、細胞外への分泌が困難である、等の間朋点を有すると
報告されている． ［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明は戒熟ヒト血清アルブミンＡを可溶性の
形で、且つ天然血清アルブミンＡと同じ立体構造におい
て細胞外に分泌せしめ、これによって回収・精製を容易
にすることにより大量のヒト血清アルブミンを工業的に
製造することができる方法を提供しようとするものであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的を達成するため、本発明は（１）ヒト血清ア
ルブ主ンＡのプレプロ配列をコードしている天然型ｃＤ
Ｎ八と該ｃＤＮＡ配列の下流に存在するヒト血清アルブ
ミンＡをコードする天然型ｃＤＮＡとを有する天然型Ｄ
ＮＡｉ　　（２）ヒト血清アルブ５ンＡのプレプロ配列
をコードしている天然型ｃＤＮＡ、ヒト血清アルブミン
Ａをコードする天然型ｃＤＮＡ、及びポリ（Ａ）配列を
この順序で有する天然型ＤＮＡ；　　（３）酵母で機能
し得るプロモーターとター藁ネーターとの間に前記（２
）に記載のＤＮＡが発現可能な方向に挿入されている発
現ブラス嵩ド；　（４）前記（３）に記載の発現ベクタ
ーにより形質転換された酵母；及び（５）前記（４）に
記載の酵母を培養し、戒熟ヒト血清アルブミンＡを産生
・分泌せしめ、これを採取することを特徴とする成熟ヒ
ト血清アルブミンＡの製造方法を提供する。

（具体的な記載） １．遺伝玉糸 且一土 正常ヒト血清アルブミンは分子内に多くのジスルフィド
結合を含有しており、組換えＤＮＡ法によって天然物と
同じ立体構造を有する正常ヒト血清アルブミンを製造す
るには、これらのジスルフィド結合が生産宿主細胞中で
正しく形威されることが必須である。正常な立体構造の
形成にはプロテインジスルフィドイソメラーゼ、ベプチ
ジルブロリルｃｉｓ−　ｔｒａｎｓイソメラーゼ等の酵
素が関与していることが最近明らかになり、多数のＳ−
Ｓ結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆ど含まな
い大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞ではたとえあっ
てもこのような立体構造形戒（フォールディング）関連
酵素系の働きは強くないことが予想される．一方、ヒト
をはじめとずる真核高等生物の細胞は数多くの複雑な高
次構造を有する蛋白Ｘ（糖蛋白質や他の修飾蛋白質も含
む）を細胞外に分泌することが知られているが、下等真
核微生物である酵母菌でも、噛乳動物の細胞で蛋白質が
分泌されるのと非常によく似た経路により蛋白質が分泌
されることが知られている（Ｈｕｆｆａｋｅｒ，Ｔ．Ｃ
．ａｎｄ　Ｒｏｂｂｉｎｓ，　Ｐ．Ｗ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．
ＣｈｅＩ１．　’ｌ５ｌ．　３２０３−３２１０（１９
８２）；　Ｓｎｔｄｅｒ，　Ｍ．Ｄ．　ｉｎ　Ｇｉｎｓ
ｂｕｒｇ，　Ｖ．　＆　Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．（ｅ
ｄｓ．）　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ，　Ｖｏｌ．２．Ｗｌｌｅｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ，　　（１９８４），　ｐｐ．１６３−１９８　）
　．このため、本発明においては、酵母及びその他の真
核細胞を宿主として使用する。

１上１旦父外 ヒト血清アルブミンは噛乳類の肝臓細胞ではプレプロ配
列をアミノ末端に有する前駆体蛋白質として合成され、
戒熟ヒト血清アルブミンを効率よく分泌せしめるために
、このブレプロ配列が存在している必要がある。また、
このブレプロ配列は目的蛋白質の分泌の際に切除されて
該目的蛋白質が戒熟型で分泌される必要があり、同じ真
核生物細胞である酵母菌を宿主として用いた場合も同様
の現象が起こることが期待される。このため本発明にお
いては、この様な条件を満たすプレプロ配列としてヒト
血清アルブミンの本来のプレプロ配列を使用する。そし
て、本発明においては、この様なブレプロ配列をコード
する遺伝子として、ヒト血清アルブミンをコードするｃ
ＤＮＡに本来リンクしているｃＤＮＡを使用する。この
ｃＤＮＡは次の配列を有する。

Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ
　　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＡＴＧ　　ＡＡＧ
　　ＴＧＧ　　ＧＴＡ　　ＡＣＣ　　ＴＴＴ　　ＡＴＴ
　　ＴＣＣ　　ＣＴＴ　　ＣＴＴＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈ
ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ
　ＧｌｙＴＴＴ　　ＣＴＣ　　ＴＴＴ　　ＡＧＣ　　Ｔ
ＣＧ　　ＧＣＴ　　ＴＡＴ　　ＴＣＣ　　ＡＧＧ　　Ｇ
ＧＴヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）はすでにクローン化されており、その塩基配列及び
該塩基配列から推定されるアξノ酸配列は、特願昭６３
−０３７４５３に詳細に記載されている．従って本発明
においては、このｃＤＮＡを含有するブラスミドｐｔｌ
ｃ　−　ＩＳＡ　−　ＣＩ等をヒト血清アルブミンＡを
コードする遺伝子の供給源として使用することができる
．なお、これらのプラス嵩ドの作製方法を参考例として
後記する． ボＩＡ　　　　び＾ＡＴＡＡＡシグ　ルコード配列の３
′一末端の下流に存在するボリＡ配列及びＡＡＴＡ＾＾
シグナルが真核生物のｍＲＮＡの安定性に寄与すると言
われている（Ｂｅｒｇｍａｎｎ及びＢｒａｗｅｒｍａｎ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　　［＋　　２５９−
２６４（１９７７）；Ｈｕｅｚら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．　ｔｌｓＡ．　ｌｊ４．　９０８
−９１１（１９８１））　，従って、本発明の好ましい
態様においては、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃ
ＤＮＡの下流にこれらの配列を配置する．ボリＡ配列及
びＡＡＴＡＡＡシグナルとしでは、例えばヒト血清アル
ブミンＡ　ｃＤＮＡに自然に付随しているこれらの配列
を使用することができる。これらの配列を含有するヒト
血清アルブミンＡ遺伝子はすでにクローン化されており
、特願昭６３　−　０３７４５３に記載されている。

これらの配列の供給源として例えばλｇｔｌｌ（ｔ｛Ｓ
Ａ−ＩＡ）を使用することができ、その作製方法を参考
例において後記する。

工旦玉二叉二 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる。しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構戒的プロモーターを使用するのが好ましい．誘導可
能なプロモーターを使用して誘導操作を行った場合には
ヒト血清アルブミンが細胞内に急激に蓄積し、分子間ジ
スルフィド結合が形威されて非天然型の立体構造を有す
る分子が生成する可能性があるからである．弱い誘発性
を示すか又は構或性の酵母プロモーターの内、強力な活
性を持つものとしては、例えば、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＤＯ　Ｉ　）プロモーター、グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモー
ター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロ
モーターがあり、本発明においては、＾ロＩ目プロモー
ターを例にとって具体的に説明する。

酵母ＡＤ叫遺伝子（ＡＤＣＩ）を含む約２．１００塩基
対の領域の塩基配列が既に決定されており、ＡＯＩ｛　
Ｉをコードする約１，１００塩基対の配列の他に７５０
塩基対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３′側非翻
訳配列が判明しているＣＢｅｎｎｅｔｚｅｎ，　Ｊおよ
び｝ｆａｌｌ，　Ｂ．Ｊ，Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｓ．　２５
７．　３０１８−３０２５（１９８２））　．転写にお
いてＲＮＡボリメラーゼによる認識配列と考えられてい
るＧｏｌｄｂｅｒｇ−１｛ｏｇｎｅｓｓボックス（ＴＡ
ＴＡボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１２８塩基上
流（−１２８の位ｉｉｆ）にあり、ＡＤ｝Ｉ　Ｉプロモ
ーター活性は−４１０の位置にあるｓｐｈ　Ｉ認識部位
より上流を欠失させても失われないといわれている（Ｂ
ｅｉｅｒＯ３及びＹｏｕｎｇ，　Ｔ．，　Ｎａｔｕｒｅ
　３００，　７２４−７２８（１９８２））。

ＡＤＨ　ｌプロモーターによる転写物は通常の酵母菌で
全ポリ（Ａ）ＲＮＡの少なくとも１％に達する（Ａｍｍ
ｅｒｅｒ，　　Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｔ
．　　１０１，　　１９２−２０１（１９８３）　）。

ーえ：』』（二ｔ二 転写における読み越し（ｒｅａｄ−　ｔｈｒｏｕｇｈ　
）により遺伝子生底物の量が減少する例が報告され“ζ
いる（例えば、Ｚａｒｅｔ，　Ｋ．Ｓ．及びＳｈｅｒｍ
ｅｎ，　Ｆ．，　Ｃｅｌｌ田．　５６３−５７３，　（
１９８２）　）　．この現象を防止するためには発現さ
れるべき構造遺伝子の下流にターごネーターを設けるの
が好ましい。このような目的のためのター稟ネーターと
してはさまざまな遺伝子由来のものが使用でき、たとえ
ばＴＲＰ５（１−リブトファン合戒酵素）遺伝子やＣＹ
Ｃ１（イソーｌチトクロームＣ）遺伝子などのターミネ
ーターが利用されている。強力なプロモーターが関与す
る転写の場合、読み越しを防ぐために強力なターξネー
ターがその下流に配置されている方が発現の制御に好都
合と考えられる．このため本発明においては例えば強力
なプロモーターを有する遺伝子のターミネーターである
ＡＤＨ　ＩターミネーターＧＡＰターミネーター等を用
いるのが好ましい．ぺ迭又二盟案 以上、本発明の発現プラスミド中に含有される、発現に
直接関連する要素について説明したが、本発明の発現ブ
ラスミドは、さらに、酵母複製起点及び標識遺伝子を含
有しなければならない．酵母複製起点としては、例えば
酵母由来の２ｎブラスミドＤＮＡの複製起点等を使用す
ることができる．標識遺伝子としては、宿主に薬剤耐性
を付与する遺伝子、宿主の栄養要求性を補完する遺伝子
等、常用の標識遺伝子を用いることができる。さらに、
ブラスくドのｍ換え操作の際にブラスミドの複製を大腸
菌中で行わせる必要があるため、本発明のブラス泉ドは
大腸菌複製起点及び標識遺伝子を含有するシャトルベク
ターであることが望ましい．この様な、シャトルベクタ
ーとしての基本的要件を備えたベクターとして市販のブ
ラスミドｐＪＤＢ２０７等を用いることができる。この
ブラスミドｐＪＤＢ２０７中の酵母標識遺伝子は、ロイ
シン生合成酵素であるβ−イソブロビルリンゴ酸脱水素
酵素をコードするＬＥυ２遺伝子である。

又里１立久１上 従って本発明の好ましい発現ブラスミドにおいては、酵
母複製起点及び標識遺伝子並びに大腸菌複製起点及び標
識遺伝子を含んでなるシャトルベクターに、プロモータ
ー、プレプロ配列をコードするリーダー配列が連結され
たヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子、ボリＡ配
列及びターミネーターがこの順序で挿入されている。

２．　　＃ＩＬＩｉＪｉ 本発明のプラスξドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例３に記載す
る。

ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含んだ発現ブラス竃ドに
より形質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の培養法に
より培養できる．たとえばＹＰＤのような天然完全培地
やＳＤ培地に１％の酵母エキスを加えたような不完全合
或培地でも培養できる．培養後柵胞外に分泌されたヒト
血清アルブミンの回収は種々の方法で可能である．エタ
ノール、アセトン、硫酸アンモニウムなどによる分別沈
澱、等電点沈澱、限外ろ過などによる濃縮及び部分精製
を行った後に各種クロマトグラフィーや上記部分精製法
を組み合わせれば高度に分泌ヒト血清アルブミンが精製
されることが期待できる。

４．発皿旦簸来 ヒト血清アルブミンＡのプレプロに配列をコードする天
然型ｃＤＮＡを、ヒト血清アルブミンＡをコードする天
然型ｃＤＮＡの上流に存在せしめることにより、ヒト血
清アルブミンを戒熟型として細胞外に分泌せしめること
ができる。また、上記のｃＤＮＡカセットを適当な発現
ベクターに挿入することにより酵母以外の種々の細胞、
特に噛乳類の細胞でヒト血情アルプ稟ンＡを産生せしめ
ることができる．なお、前記ｃＤＮＡカセットは天然の
ヒト由来ｃＤＮＡを含有するクローンから得ることがで
き、化学合成ＤＮＡの使用を必要としない。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る．以下の実施例において、特にことわらない限り、酵
素反応は次の条件下で行った。

ＥｃｏＲ　Ｉ　（　ニッポンジーン；１２ユニット／　
ｐｌ　）、Ｃｌａｌ（ニューイングランドバイオラブス
；５ユニット／Ｉｌ１）、旧ｎｄｌｌｌ（ニッポンジー
ン：１２ユ−’−７ト／ハ）、Ｘｈｏｌ（宝酒造；１２
ユニット／Ｉ１１）、及びＢ’ａｍＨ　Ｉ　　（ニッポ
ンジーン；３５ユニノト／ハ）によるＤＮＡの消化：Ｄ
ＮＡ１ｇ、酵素１Ｉ１及びＩＯＸ　ＥｃｏＲ　Ｉ　ＩＩ
衝液（　Ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１｛Ｃｌ（ｐＨ７．　５　
），１００ｍＭ　ＭｇＣｈ，　５００ｍＭ　ＮａＣＩ　
，］　３　ｉｔｌに滅菌蒸留水を加えて３０ｍとする。

３７゜ＣＳ　１時間保温して切断を完了させる，　Ｂｓ
ｔＥＩＩ　（ニッポンジーン，７．５ユニット／ｊ１ｌ
）、Ｓａｌｌ（ニッポンジーン．１５ユニット／μｌ）
、及びＸｂａｌ（ニンボンジーン．１５ユニット／ｉＩ
Ｉ）の場合はＩＯＸ　［！ｃｏＲ　Ｉ　１７１衝液の代
わりに１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．　５
　）　．　　７　０ｍＭＭｇＣｌｉ．　ｌ．７５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ　．　７　０ｓＭ　　２−メルカブトエタノール
、２ｍＭ　ｔ！ＤＴＡ　，　Ｏ．　１％ウシ血清アルブ
ａンを使用し、ＢｓｔＥＩＩは６０゜Ｃで、Ｓａｌ．１
及びＸｂａＩは３７゜Ｃで１時間反応せしめる。

バクテリアアルカリ性ホスファターゼ処理：ＤＮＡＩｎ
、制限酵素ＥｃｏＲ　ｒ及び旧ｎｄｎｌ各々１μ及びＩ
ＯＸ　ＥｃｏＲ　Ｉ緩衝液２Ｉｔ！に滅菌蒸留水を加え
て２０パとし、３７゜Ｃで１時間保温した後、９０゜Ｃ
、５分間加熱して酵素を失活させる．次に滅菌蒸留水３
８〃、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２Ｉｌ１（
宝酒造０．　５　ｊ−　二ｙト／　ｐｌ　）を加えて３
７゜Ｃ、１時間保温した後、フェノール抽出を行い、得
られた水層をエタノール沈澱に用いる。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ処理：たとえばベクターＤＮＡ　
　Ｉｎ、ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメン
ト、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（６６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐ｝１７．　５　）　　，　６　６＋＊Ｍ　Ｍｇ
ｃｌｚ、１００ＩＩＩＭジチオスライトール、１　ｍＭ
　ＡＴＰ）　３　ｔｄ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ１ｄ（
宝酒造、約４００ユニット／Ｉ１１）に滅菌蒸留水を加
えて３０ｄとし１６゜Ｃで一晩保温する．合威フラグメ
ントのＴ４ボリヌクレオチドキナーゼによる５′−リン
酸化：　５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ７。６
　）　　，　１　０ｄ　ＭｇＣｌ，、５−ジチオスライ
トール、０．　２　ｍＭ　ＡＴＰを含有する溶液（２５
パ）中でＤＮＡフラグメントの各々の分！（約３　０　
ｐ＋ｗｏｌｅｓ　）を６ユニットのＴ４ボリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造）で３７℃、６０分間処理すること
により５′端をリン酸化する．リン酸化されたフラグメ
ントを含む溶液を混ぜ（計１００ｊ１ｌ）１００’Ｃの
水浴に５分間放置した後室温で放冷しアニーリングを行
う。

大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１反応ＩＮＡ１ｘ，ＤＮＡポ
リメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏ−フラグメント、宝酒造
３．５ユニット／ｔｄ）ｌｕｔ、１　ｍＭ　ｄＸＴＰ（
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ＴＴＰの混合物）
ｌｍ及びｉｏｘ緩衝液（　７　０’ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ｃＩ（ｐＨ７．　５），　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　　
２００＋ｗＭＮａＣＩ，　　７　０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ）
　３　ｒｄに滅菌蒸留水を加えて全量を３０Ｉｉ１とし
、３７”Ｃで３０分間保温する。

プローブの標識： １ｎの合戒ＤＮＡ，５　０　μＣｉのγ−”Ｐ−ＡＴＰ
水溶液　（３０００Ｃｉ／　　ｓａｇｏｌ　）　　、　
　（　　５　　０　ｄ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７
．５）　　，　１　０ｌＩＭ　ＭｇＣｌｚ．　５＋＋Ｍ
　ＤＴＴ，　１　０ユニットＴ４ボリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造）を含む１０ｍの溶液を３７゜Ｃで１時間
反応後、未反応のヌクレオチドをＮｉｃｋ−ｃｏｌｕｍ
ｎ（ファルマシア）を用い、メーカーのプロトコールに
のっとり除き、コ２Ｐで標識されたＤＮＡを得る（　ｌ
　Ｘ　１０＠ｃｐｍ／　１ｎ　ＤＮＡ／　４００　ｍ　
）。

ハイブリダイゼーション： ＤＮＡを固定した膜をハイブリダイゼーション液（　６
　ＸＳＳＣ（　ｌ　ＸＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ１，
　０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ｝１７．０）、
５Ｘデンハート液（０．１％ウシ血清アルブミン、０．
　１％フイコール、０．　１％ポリビニルピロリドン）
、０．５％ＳＤＳ、１００Ｒ変性サケ精子ＤＮＡＩＩＯ
■中で、４２゛Ｃ、３時間保温する．液を捨て、ブロー
ブをＩＸＩＯ’ｃｐｓ／ｌｄ加えたハイプリダイゼーシ
ョン液１０ｔｆを加え、ｓｏ’ｃ、３分保温する。次に
、４２゜Ｃで一夜保温する．液を捨て、膜を２ｘｓｓｃ
により室温で５分洗い、さらに２ＸＳＳＣにより６０゜
Ｃで３０分洗う． なお、酵素反応によりプラスミドを作製する場合には、
その酵素反応混合物を用いて大腸菌１１　８　１０１を
常法に従って形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存して
適切な常法により形質転換体を選択し、目的とするブラ
スミドを含有するクローンを例えばξニブレパレーショ
ン法により形質転換体から抽出したＤＮＡを種々の制限
酵素で切断して電気泳動法により分析する方法（たとえ
ばＭａｎｊａｔｉｓ，Ｔ，　Ｐｒｉｒｓｃｈ＋　Ｅ．　
Ｆ＋　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）により選択した。そして選
択されたクローンを培養し、菌体から常法に従ってブラ
スミドＤＮＡを抽出することにより、所望の紐換えプラ
スミドを増幅・回収した。この方法は組換え操作の各段
階により必要に応じて行った。

！！−モＬｍ　　フ゜−スξド八Ｔ−ｎＨｓＡのプレプ
ロヒト血清アルブミンＡｃＤＮＡの５′一非翻訳領域と
コーディング領域の前半部分を含むブ’ｙ　スミ｝’ｐ
Ｕｃ−ＨＳＡ−ＥＸ　（参考例１及び２）からプレプロ
ヒ１・血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡ部分をＥｃｏＲ　Ｉ
とＸｂａ　Ｉによる二重消化によって切り出し、ヒト血
清アルブミンＡｃＤＮＡのコーディング領域の後半部分
と３′一非翻訳領域を含むプラスミドｐｌｌＣ−ＨＳＡ
−ビ　（参考例４）から切り出したＸｂａ　Ｉ　−Ｈｉ
ｎｄｌＩＩフラグメントおよびｐＡＴ１５３ベクター（
Ａｍｅｒｓｈａｍ社製：　Ｔｗｉｇｇ，＾．Ｊ．及びＳ
ｈｅｒａｔｔ，　Ｄ．．　Ｎａｔｕｒｅ　２８３＋２１
６−２１８．　１９８０）から切り出したＥｃｏＲ　Ｉ
　−Ｈｉｎｄｌｎフラグメントとを連結し、プラスミド
ｐＡＴ−ＨＳＡ−ＥＨを得た。プレプロヒト血清アルブ
ミンＡをコードするｃＤＮＡ配列を酵母菌由来の強力な
プロモーター配列と隣接させるためにｃＤＮＡ配列の５
′末端に付けられているＥｃｏＲ　ｌサイトとプレプロ
ヒト血清アルブミンＡのシグナルペプチドをコードする
配列中三番目のアくノ酸Ｔｒｐから５番目のアくノ酸Ｔ
ｈｒのコドンにわたって存在するＢｓｔＥｌｌサイトを
利用した。プレプロヒト血清アルブミン八の５′一非翻
訳領域とシグナルペプチドのア逅ノ末端から３個のアミ
ノ酸をコードする配列とを含むＥｃｏＲ　ＩＢｓｔＥＩ
ＩフラグメントをｐＡｒ−ｏｓａ−Ｅ＋＋から切除した
。

残った大きなＤＮＡフラグメントを５′末端にＥｃｏＲ
　Ｉ粘着末端配列を、３′末端にＢｓｔＥＩＩ粘着末端
配列を有し、プレプロヒト血清アルブミン八のシグナル
ペブチドの三番目のアミノ酸までをコードすることので
きる合成ＤＮＡフラグメント：ＥｃｏＲ　Ｉ　　　　　
Ｂｓ　ｔＥ　Ｕと連結した。すなわち、この合成フラグ
メントをＴ４ボリヌクレオチドキナーゼで処理すること
により５′一末端をリン酸化し、Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼ
によりこの連結を行い、天然型のプレプロヒト血清アル
ブミンＡｃＤＮＡを含むブラスミドｐＡＴ−ｎ｝ＩｓＡ
を作製した． 夫益班Ｌ　　ブースξドＪＤＢ−ＡＤＨ−ｎＨＳＡ−Ａ
のρＡＴ−ｎｌ−ＩＳＡをプレプロヒト血清アルブミン
Ａ　ｃＤＮＡ配列の５′端にあるＥｃｏＲ　Ｉサイトで
切断し、ここに両末端がＥｃｏＲ　Ｉ粘着末端配列で内
部にＸｈｏ　Ｉサイトを含む合或リンカー ＥｃｏＲＩＸｈｏｌＥｃｏＲ［ ５’　−ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡ−　　５　　’ を挿入しプラスミドｐＡＴ−Ｘ−ｎｔｌｓ＾を作製した
。このｐＡＴ−Ｘ−ｎＨＳＡ中のブし・プロヒト血清ア
ルブミンＡ．ｃＤＮＡ配列の３′末端に隣接するｐＡＴ
１５３ブラスミド由来の旧ｎｄ　Ｉ［［　−　ＢａｍＨ
　Ｉフラグメントを切り出し、ｐＵｃＩＳＡ一ビより切
り出したプレプロヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡの３
′側配列でボリＡシグナル及びボＪＡ配列を含む領域と
ｐＵｃ１８ベクター由来の領域とを含む旧ｎｄ　■−Ｂ
ａ＋ｍＨ　Ｉフラグメントと置換しプラスミドｐＡＴ−
ｎＨＳＡ−Ａを作製した。ボリＡシグナル及びボリＡ配
列を有する完全な構造のプレプロヒト血清アルブミンＡ
ｃＤＮＡを酵母菌由来のプロモーターの支配下に発現さ
せるために作製したプラスξドｐＡＴ−ｎＨＳＡ−Ａか
らヒト血清アルブミンＡｃＤＮＡ部分を含むχｈｏ　Ｉ
　−Ｂａｗｌ　１フラグメントを切り出し、酵母菌で発
現される遺伝子において優先的に多用されるコドンから
なるリーダー配列を有するプレプロヒト血清アルブミン
Ａの発現に用いたプラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＩＳＡ
−Ａ　（参考例９）から切り出したＸｈｏ　Ｉ　−Ｒａ
ｍ｝ｌ　Ｉの大きい方のフラグメントと連結した。この
操作によりｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＩＳＡ−Ａ中のリーダー
配列が人工的な構造を有するプレプロヒト血清アルブミ
ンＡｃＤＮＡに由来する配列が完全に天然型のプレプロ
ヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡ配列と置き代わった発
現プラスミドｐＪＤＢ　−　ＡＤＩＩ　−　ｎｆｉｓＡ
−＾が構築された． このブラスミドを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ
　ｉａｃｏｌｉ　｝１８１０１／ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｎ
ＨＳＡ−Ａは、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研系寄第２４５４号（ＦＥＲＭＢＰ−２４５４）として
、１９８９年６月８日にブダペスト条約に基き国際寄託
された。

ＸｌＪｕｌ３．　　　ブース”　−　ＪＯＢ−ＡＤｔｌ
−ｎｔｌｓＡ−Ａに発現ブラスミドによる酵母菌の形質
転換は基本的には橋本英明、木村光〔発酵と工業１．　
６３０−６３７（１９８５）　）のＫＵＲ法に従い、少
し改良した方法によって行った。まずＹＰＤ培地（２％
ポリベプトン（Ｄｉｒｃｏ）　、１％酵母エキス（Ｄｉ
ｒｃｏ）　、２％グルコース）５成にＡ｝１２２株（Ｍ
ＡＴａ，　１ｅｕ２−３，　ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ
４−５１９，　Ｃａｎｌ）のＹＰＤ培地による一晩培養
液０．　１　ｄを加え３０゛Ｃで約４時間（濁度が００
　６００で０．５に達するまで）振盪培養を行った。４
゜Ｃで２．　００Ｏｒｐｍ、５分間の遠心を行い集菌し
、菌体を５．０−の０．　Ｉ　ＭＬｉＳＣＮに懸濁し、
そのうち１．　５　ｄを分取し、２，　０００ｒｐｍ、
５分間または１０，０００ｒｐｍ　％　１分間の遠心で
集菌した。得られた菌体を２　ＭＬｉＳＣＮ１０パ、５
０％ＰＥＧ４０００　４　６μｌに再懇濁し、そこに１
０ｌのＤＮＡ溶液（５〜１０ｇのＤＮＡを含む）を加え
、３０″Ｃで一晩保温した。その懸濁液にｌｄの滅菌蒸
留水を加えゆるくボルテックスミキサーにて振盪した．
次に２，ＯＯＯｒｐｍ，　５分間または１０，０００ｒ
ｐｍ、１分間の遠心を行い、得られた菌体を１００ｍの
滅菌蒸留水に再懸濁し、選択用の寒天培地（ＳＤ培地：
２０ｎ／ｄアデニン硫酸塩、２０ｎ／ｍｌアルギニン塩
酸塩、２０ｎ／−メチオニン、２０ｇ／ｍヒスチジン塩
酸塩、２０ｔｎｒ／ｍｌトリプトファン、２０ｎ／ｍｌ
ｌウラシル、３０ｎ／一イソロイシン、３０ｎ／ｄリジ
ン塩酸塩、３０ｎ／ｍｌチロシン、５０ｎ／ｍｌフエニ
ルアラニン、１５０ｎ／ｍｅバリン、０．１５％アミノ
酸不含イースト・ニトロゲン・ベース（Ｄｉｆｃｏ）　
、０．　５％硫酸アンモニウム、２％デキストロースに
１。５％の寒天を加えたもの〕にまいた．生じたコロニ
ー（Ｌｅｕ”　）をＳＤ培地５−に懸濁し、２日間３０
゜Ｃで振盪培養した，　２．　００Ｏｒｐｍ　５分間、
４゜Ｃでの遠心により集菌し、菌体を０．５一の１Ｍソ
ルビトールに再懸濁し、遠心後、菌体を０．　５　ｄの
ＩＭソルビトール、ｏ．　ｉ％２−メルカブトエタノー
ル、４００ｎ／一のザイモリエースＣＺｙｍｏｌｙａｓ
ｅ−１００Ｔ生化学工業）に再懸濁した．３０゜Ｃで３
０分間保温後、生戒したスフェロブラストを遠心（２．
ＯＱＯｒｐｍ，　５分間）して集め、１００Ｊｌｌの溶
液１（５０ｓＭグルコース、１０ｄＥＤＴＡ、２　５　
ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ（ｐｆ１８．　０　））に再懸
濁し、次に２００４の溶液ｕ　（０．２ＮＮａＯＨ，　
１％ＳＤＳ）を加え、よく混合した後、氷上に５分間放
置した。１５０ｍの５Ｍ酢酸カリウムを加え、よく混合
し氷上にＩＯ分間放置した後、１５，０００ｒｐｍ　、
５分間、４℃での遠心を行い、得た上清を新しいチュー
ブに移した．等量のフェノール／クロロホルム（１：１
混合液）を加え激しく攪拌し、遠心（１２．　００Ｏｒ
ｐｍ、５分間）して得た水層を新しいチューブに移し、
７５０μｌのエタノールとボルテックスミキサーを用い
てよく混合した。混合液を１５．００Ｏｒｐｍ　、５分
間遠心し、得られた沈澱に０．５−の７０％エタノール
を加えボルテックスミキサーを用いて振盪した後、１５
．００Ｏｒｐｍ　、５分間の遠心で沈澱を回収した。

このＤＮＡの沈澱を真空中で減圧乾燥し、次に３０ｊＬ
１のＴＥ緩衝液に溶解した。ブラス旦ドｐＪＤＢＡＤＨ
−ｎ｝ｔｓＡ−Ａを含むＡＨ２２の形質転換株から得ら
れたＤＮＡ標品を各種酵素（たとえば旧ｎｄＩ［［　＊
　　Ｘｈｏ１　，　ＥｃｏＲＩ　，　ＢａｍＨＩ　，　
　Ｓａｔ　１など）単独または、組合せにより制限酵素
分解し、得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳
動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析すること
によりプラス逅ドの構造を確認した。

ＳＤ（−Ｌｅｕ）培地上に生した単一のコロニーを５．
０一の新鮮なＳＤ（−Ｌｅｕ）培地に懸濁し、３０゜Ｃ
で２日間振盪培養し、００，。。が約２、Ｏになった時
点で培養液の０．　１　ｍを５．　０　ｍｌのＹＰＤ培
地に加えた。これを２４時間３０℃で、００６。。が約
３．０になるまで培養した．培養液を５．００Ｏｒｐｍ
、１０分間、４゜Ｃで遠心し、上清画分を回収した。上
清画分に等量の９９％エタノールを加え、混合した後３
０分間４゜Ｃに放置した。次に１２．００Ｏｒｐｍ　，
　　１　０分間、４℃で遠心し、沈澱物を得た。この沈
澱物を１００ｍの１×ローディング（Ｌｏａｄｉｎｇ）
緩衝液（５％２メルカブトエタノール、０．００２５％
プロモフユノールブルー、２％ＳＤＳ．　０．０２５Ｍ
　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ，　８％グリセロール）に溶解し
、そのうち１０ｔｒｌを電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル：４〜２０％濃度勾配ゲル８４（幅）
Ｘ９０（高さ）×１．０（厚み）（単位はＩＩ１Ｉ１）
〕に重層して分析した。

泳動は泳動緩衝液（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８．　４　）、０．１９２Ｍグリシン、０．　１％
ＳＯＳ　）を用い、６０ｍ＾の定電流下６０分間行った
．同時に泳動したマーカーは卵白リゾチーム（分子１１
４．４００）、トリブシンインヒビター（分子量２１．
５００）　、炭酸脱水酵素（分子１３１．０００）　、
オバルブミン（分子量４５，０００）　、子牛血清７１
Ｌ，ブ果ン（分子［６６，２００）、ホスホリラーゼＢ
（分子量９２，５００）　（全テＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
であった。泳動終了後、常法に従いクマシー・ブリリア
ント・ブルーにより染色し、または以下に示すようにウ
エスタンブロッティング後免疫検出を行った。泳動後、
分離された蛋白質をＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製のセミドラ
イブ口ッターを用いてニトロセルロースフィルター（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤ社）に移した。フィルターを、１時間メタ
ノールに浸した後、５分間２　５ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐ｝１１０．４）　／　２　０％メタノールに浸し泳
動ゲルと密着させた。これを上記緩衝液、及び２０％メ
タノールを含む０．　３　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
１０．０）と２　５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９
．　４　）　／　４　０ｍＭ６−アミノーｎ一カブロン
酸等の緩衝液に各々浸したろ紙ではさみブロッターに装
着した，６Ｖの定電圧を約１．５時間かけた後、フィル
ターを３％ゼラチンを含む２　０　ＲＩＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐＨ　７．　５　）　／　５００ｎ＋Ｍ　Ｎ
ａＣ１（ＴＢＳ）溶液中で３７゜Ｃ，１時間振盪した後
ＴＢＳ／０．０５％Ｔｅｙｅｅｎ−２０中で５分間振盪
することによりフィルターを洗浄した。次に抗ヒト血清
アルブミンウサギ抗体（カッペル社）を１％ゼラチンを
含むＴＢＳで２，０００倍に希釈した溶液４０ｄ中でフ
ィルターを室温で１晩振盪した。フィルターを０．０５
％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ　７．
　５　（Ｔ−ＴＢＳ））で５分間振盪しながら洗浄した
。この操作をもう一度繰り返した後、第二抗体（西洋ワ
サビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗
体、８１０−ＲＡＤ社製）を１％ゼラチンを含むＴＢＳ
で３　．　０００倍に希釈した溶液４０Ｉｄ中でフィル
ターを室温で１時間振盪した。次にＴ−ＴＢＳで５分間
ずつ２回およびＴＢＳで５分間１回上述のように洗浄し
た。当該バンド（ＩＳＡ）の検出は４−クロロナフトー
ル３０■を１０ｄのメタノールに解かした溶液とＴＢ５
　５０ａｔｅ、３０％過酸化水素３０ｕ１を混ぜた溶液
に浸漬することにより行い、発色反応は蒸留水で希釈す
ることにより停止させた。

（１）分子量 酵母菌培養液より単離したヒト血清アルブミンＡ試料を
２一メルカプトエタノールで還元し、モしてＳＤＳ処理
を施した後に、ＳＤＳ中１０％−２０％のポリアクリル
アミド濃度勾配ゲルに添加し、Ｌａｅｍ＋ｍｌｉ，　Ｕ
．Ｋ．　（Ｎａｔｕｒｅ，　２２７．　６８０−６８５
　（１９７０）　）に記載の条件で電気泳動を行った。

分子Ｍ標準としてホスホリラーゼｂ（分子量９４，００
０）　、牛血清アルブミン（分子量６７．０００）　、
オボアルブミン（分子量４３，０００）　、炭酸脱水素
酵素（分子量３０，０００）　、大豆トリブシンインヒ
ビター（分子量２０，０００）　、ラクトアルブミン（
分子！１４．４００）を使用し、クマシー・プリリシン
トブルー染色によりタンパク質の検出を行った。ヒト血
清より精製された市販の血清アルブミンを対照として同
時に泳動し、酵母により分泌された血清アルブミンＡと
その移動度を比較した。その結果、酵母菌産生ヒト血清
アルブミンＡとヒト血清アルブミンは同じ移動度を示し
、分子量は６７．０００であった。この結果を第３図に
示す。

（２）電気的性質 ＜Ｎａｔｉｖｅゲル電気泳動〉 酵母培養液より単離したヒト血清アルブミンＡ試料を、
６２．５ｎ＋Ｍ　｝リスー塩酸（ｐＨ６．８）、１５％
グリセロール、０．００１％プロモフェノールブルー溶
液に懸濁し、４−１５％ポリアクリルア亀ド濃度勾配ゲ
ル（ｐＨ８．４）を用いＤａｖｉｓ．　Ｒ．Ｊ．　（Ａ
ｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　１２１，　４０
４（１９６４）　）の方法により電気泳動を行い、市販
の血清より精製されたヒト血清アルブミンとその挙動の
比較を行った。この電気泳動においても酵母産生ヒト血
清アルブミンＡとその市販の血清より精製されたヒト血
清アルブミンは、同じ挙動を示した。この結果を第４図
に示す。

〈等電点電気泳動〉 等電点電気泳動は、ＬＫＢ社＾−ｐｈｏｌｉｎｅ　ＰＡ
Ｇｐｌａｔｅ　ｐＨ範囲３．　５　−　９．　５を用い
、同社のマニュアルにそって行った．等電点標準として
、同社ＰＩマーカー；Ｃ−フィコシアニン（ρ１４，７
５　，　４．８５）、アズリン（ｐ１５．６５）　、ブ
タトリフルオロアセチルミオグロビン（ｐ１５．９）、
ブタミオグロビン（ｐ１６．４５）　、ウマミオグロビ
ン（ｐＩ７．　３　）　、クジラ壽オグロビン（ｐ１８
．３）、およびチトクロムＣ　（ｐＩ１０．６）を使用
した。酵母産生ヒト血清アルブミンＡは、市販の血清よ
り精製されたヒト血清アルブミンと同様のパターンを示
し、ｐｌ４．８からｐｌ５．２の数本のバンドに分離し
た．この結果を第５図に示す。

（３）アミノ末端アξノ酸配列決定 酵母産生ヒト血清アルブミンＡ２０，ｑを用い、アブラ
イド・バイオシステム社製気相法プロテインシークエン
サー４７７Ａを用いて、同社のマニュアルに従ってア旦
ノ末端アミノ酸配列決定を行った．その結果、アξノ末
端アミノ酸より、Ａｓｐ−Ａｌａ｝１１ｓ−Ｌｙｓ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−＾ｒｇという
配列が同定され、すでに報告のあるヒト血清アルブミン
のアミノ末端の配列と完全に一致した．アミノ末端アミ
ノ酸の回収率を基礎として計算すると、用いた標品のア
ミノ末端アミノ酸は９５％以上そろっていると考えられ
る．また不完全なプロセッシングによるプレ配列、プロ
配列の残存は認められなかった． （４）カルボキシル末端アミノ酸配列決定カルボキシル
末端アミノ酸配列の決定は、以下の方法に従って行った
。

〈カルボキシル末端フラグメントの調製〉酵母産生ヒト
血清アルブ旦ンＡ　８■（約１２０ｎｍｏＬ）を、ｆ！
．Ｓｔｅｅｒｓ，　Ｊｒ．，　ｅｔ．ａｌ．，　Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０．　２４７８の方法でプロモ
シアン分解し、さらにＣ．ＨＪ．旧ｒｓ，　”Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　，　Ａｃａｄｅ
ｎ＋ｉｃＰｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ．　Ｖｏｌ．
ｌ１，　ｐ．１９９（１９６７）の方法に従いＳＨ基を
還元カルボキシメチル化することによりプロモシアン分
解フラグメントにした．それから、ナカライテスク社製
Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　ＰａｃｋｅｄＣｏｌｕｌｌｎ　５０
８−３００　（４、６１，Ｄ．Ｘ　２５０ｍｍ）を用い
た逆相カラムクロマトグラフィーにより、ヒト血清アル
ブミン八のカルボキシル末端を含むフラグメントを得た
。フラグメントの同定は、そのア嵩ノ末端アミノ酸配列
を決定することにより行った。このようにして得られた
フラグメントのうち７．　４　ｎｍｏｌを２０ｍＭ塩化
カルシウムを含む、５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝
液（ｐＨ８。Ｏ）１０＃に溶解し、０．　５μｇのシグ
マ社製ＤＰＣＣ−　トリブシンを加え室温で５時間反応
させることにより消化した。得られた消化物の中から、
東ソー社製ＴＳＫ−ｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ（　４．　
６　１　．０．　Ｘ　１２０一）を用いた逆相カラムク
ロマトグラフィーによりしｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｓｅｒ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｌｅａというヒト血清アルブミンのカルボキシル末端
より１ｌ残基の配列を持つと思われるフラグメント５．
　Ｏ　ｎｍｏｌを得た。この配列はフラグメントのアミ
ノ酸末端からのアξノ酸配列の決定及びアミノ酸紐戒分
析により推定された。

くカルボキシペプチダーゼＰを用いたカルボキシル末端
の同定〉 上記のようにして得られたフラグメントのうち２ｎｍｏ
ｌを０．５ｎ一ｏｌずつ４本の試験管に分け、それぞれ
１０ｓＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．　５　）１
０ｌｌ１に溶解し、宝酒造社製カルボキシペブチダーゼ
Ｐ１２ｎｇを用いカルボキシル末端からの消化を行った
．４本の試験管をそれぞれ反応開始０分、３０分、６０
分、１２０分後に煮沸することにより、反応を停止した
．それぞれの時間に切り離されてきたアミノ酸を、Ｒ．
Ｌ．Ｈｅｉｎｒｉｋｓｏｎ，　Ｓ．Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｓ
ｈ，　Ａｎａｌ．ｂｉｏｃｈｅｍ．＋　１３６＋　６５
（１９８４）の方法に従いＰＴＣ化し、アブライド・バ
イオシステム社製１３０＾セバレーションシステムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより同定した。その
結果Ｏ分ではＬｅｕ５１７ｐｍｏｌ，　Ｇｌｙ６５ｐｍ
ｏｌ，　Ａｌａｌ３ｐｍｏｌ、３０分ではＬｅｕ６５８
ｐｓｏｌ，　ＧｌｙｌＯＯｐｍｏｌ，　Ａｌａｌ８ｐｍ
ｏｌ、６０分では゛Ｌｅｕ６８２ｐｍｏｌ，Ｇｌｙ７７
ｐｍｏｌ，ＡＩａｌ６ｐｍｏｌ、１２０分ではＬｅｕ８
４０ｐｍｏｆ，　Ｇｌｙｌ２１ｐｍｏｌ，　Ａ１ａ３１
ｐｍｏｌが同定された。これにより、カルボキシル末端
側からＬｅｕ−Ｇｌｙ−という配列になっていることが
確認され、アミノ酸配列決定及びアミノ酸組成分析の結
果と併せて考えると、カルボキシル末端の配列は正常の
ものと一敗していることが解った．（　５　”）　｝Ｉ
ＰＬｃ上の挙動 く逆相カラムクロマトグラフィー〉 高速液体クロマトグラフィー装置は、島津ＬＣ−６Ａ形
Ｇｒａｄｉｅｎｔ−ＬＣシステムを使用し、ＴＳＫ−ｇ
ｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ　ＲＰ力ラムを用いて分離
を行った．０．１％トリフルオ口酢酸水溶液で平衡化し
たカラムに酵母産生ヒト血清アルブミンＡ、市販の血清
より精製されたヒト血清アルブミン及び、その混合物を
添加し、０．１％トリフルオ口酢酸存在下アセトニトリ
ル濃度Ｏ−７０％の直線濃度勾配を６０分間で形成する
ことにより溶出を行った。この時の流速はｌｍｆ／ｎ＋
ｉｎであった． この条件で、酵母産生ヒト血清アルブミンＡは鋭い単一
のピークとして溶出し、そのカラム上での保持時間及び
ピークの形において市販の血清より精製されたヒト血清
アルブミンと区別できなかった。さらにこれらの混合物
も単一の鋭いピークとして溶出し、これら二つのヒト血
清アルブミンは逆相カラム上で全く同等の挙動を示すこ
とが証明された．この結果を第６図に示す。

（６）免疫学的性質 免疫拡散を、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，　Ｏ．　（Ｐｒ
ｏｇｒ，Ａｌｌｅｒｇｙ．６．　３０（１９６２）　）
に記載の条件で行った。沈降線形成後生理食塩水で脱蛋
白質を行い、その後クマシー・ブリリアント・ブルーに
よる沈降線の染色を行った．用いた抗血清は、Ｃａｐｐ
ｅｌ社より購入したウサギ抗一ヒト血清アルブミン抗血
清である。酵母産生ヒト血清アルブミンＡは、ヒト血清
より精製されたヒト血清アルブミンと完全に融合した沈
降線を形成し、この方法では抗原性における両者の違い
はみられなかった。結果を第７図に示す。

正常ヒト血清アルブ壽ンＡｃＤＮＡを含むクローンのブ
ラークハイブリダイゼーシジンによるスクリーニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣＩＩ社のλｇｉｌｌをベクタ一
として作威されたヒト肝ｃＤＮＡライブラリイーを用い
た。λｇｔｌｌ組換え体ファージを大腸菌Ｙ　１０９０
を宿主として感染させ、形質転換プラーク計５．５×１
０５個をＬＢ寒天培地上に形威させ組換え１）　Ｎ　Ａ
をメンプランフィルター（Ａｅ＋ｅｒｓｈａｍ社｝１ｙ
ｂｏ−ｎｄ−Ｎ）に移した後、ｌｔｐ放射性同位元素で
標識した合戒オリゴヌクレオチド３種（比活性≧１０′
ｃｐｍ／ｎ）をブローブとして用いスクリーニングした
（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９
６，　１８０−１８２（１９７７））　，この３種のブ
ローブは各々Ｌａｗｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ
　Ｒｅｓ　９．　６１０３−６１１４（１９８１）　）
によって報告されたヒト血清アルブミンｃＤＮＡの配列
のうち５′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴＧコドンより１
２ヌクレオチド上流からＡＴＧコドンの前のヌクレオチ
ドまでの部分）と翻訳領域（アミノ末端のメチオニンコ
ドンすなわちＡＴＧより９番目のアミノ酸ロイシンをコ
ードする部分）を含むもの（｝ＩＳＡ−　１　）、２４
８番目のグリシンから２６０番目のロイシンをコードす
るもの（ＨＳＡ−　２　”）　、並びに５１６番目のバ
リンからカルボキシル末端５８５番目のロイシンをコー
ドする部分とそれに続く６ヌクレオチドから成る３′一
非翻訳領域を含むもの（ＩＳＡ−　３　）と同じ配列で
ある。これらのブローブの塩基配列を第９図に示す。こ
のプローブの合或は自動ＤＮＡシンセサイザーにより行
い、標識は（γ−”Ｐ）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて行った。ＩＳＡ−２で陽性のシグナルを与
えた２００個のλｇｔｌｌクローンのうち４個のクロー
ンからＤＮＡをＵ８製〔旧ａｔｔｎｅｒらＳｃｉｅｎｃ
ｅ　２０２＋１２７９−１２８４（１９７Ｂ）　）　Ｌ
、これをＥｃｏＲ　Ｉで消化し、消化物のサザーンプロ
ットをＩＩＳＡ−２プローブとハイブリダイズさせた（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，５０３−
５１７（１９７５）　）。ハイブリダイズしたフラグメ
ントは３つのクローンから得られ各々１．８ｋｂ，１．
　４ｋｂ　，　１．　３ｋｂの長さであった。このうち
１．８ｋｂと１．３ｋｂの長さのフラグメントをρＵＣ
１９ヘクターにサブクローニングした．このサブクロー
ンをＨＳＡ−１と｝ＩＳＡ−３を各々プローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーション［Ｇｒｕｎｓ　ｔｅｉｎ
およびＨｏｇｎｅｓｓ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．　［ＩＳＡ　’７２＋　３９６１−３９６５
（１９７５）〕によりスクリーンした。この結果｝ＩＳ
Ａ　−３のみにハイブリダイズするクローンλｇｔｌｌ
（ＨＳＡ１−Ａ）が得られた。このクローンの各種ＤＮ
Ａ断片を塩基配列決定用ベクターＭ１３ｍｐｌ８および
ｅｉｐｌ９ＲＦ−ＤＮＡ上に移し、ダイデオキシヌクレ
オチドターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ．，　
Ｎｉｃｋｌｅｎ．　ｓ，およびＣｏｕｌｓｏｎ，　Ａ．
Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ
　７４＋５４６３−５４６７（１９７７）　）により塩
基配列を決定した。

一方ＨＳ＾−２をプローブとして行ったλｇｔｌｌクロ
ーンのブラークハイプリダイゼーションにおいて陽性の
シグナルを与えたクローンのうち２０個についてＨＳＡ
−１をプローブとして再びブラークハイプリダイゼーシ
ジンを行い、１個の陽性のシグナルを与えるクローンλ
ｇｔｌｌ（｝ＩｓＡ　−　Ｂ　）を得た。

これからファージＤＮＡを調製しＥｃｏＲ　Ｉ消化物に
ついてＩＳＡ−１をプローブとして用いサザーンハイブ
リダイヒ゛−ションを行い、１．２５ｋｂのフラグメン
ト（ＩＩｓＡ−ＩＩ）がブローブとハイブリダイズする
ことを確認した。このフラグメントの塩基配列をダイデ
オキシヌクレオチドターミネーション法で決定した，　
　ＨＳＡ−［［はＩＩｓＡ−３プローブとは交雑しなか
った．この結果ＨＳ＾−■はカルボキシル末端側をコー
ドする部分を欠き、ＨＳＡ　Ｉ−Ａはヒト血清アルブミ
ンのアミノ末端側をコードする部分を欠き、さらに３０
４番目のセリンをコードするコドン（ＴＣＡ　）が翻訳
終止コドンのオパールコドンＴＧＡに変化していること
がわかった。この２つのＤＮＡフラグメントの制限酵素
地図を第８図に示す．酵素認識サイトの正確な位置はＲ
終的な塩基配列から得た． 第８図からわかるようにＨＳＡ　Ｉ−Ａと｝ＩＳＡ　Ｉ
Ｉの２つのＤＮＡを適当な位置（例えばＸｂａ　ＩやＰ
ｓｔｌサイト）で切断し互いに再結合すればシグナルベ
ブチドやプロ配列の結合したヒト血清アルブミンの前駆
体タンパク質の全長をコードできるｃＤＮＡを構築する
ことができる。

皇盈開盗７”　−　スミＩＩｃ−ＩＳＡ−ＣＩ（７）　
　　　　　０大腸菌アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏ
Ａ）のシグナルベプチドと正常ヒト血清アルブミンＡが
融合したタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラス箋
ドｐＵｃ−ｐｈｏＡ４＋ｓＡ−Ａを次の様にして造威し
た。

ヒト肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たＨＳＡｃＤＮＡ
を含むクローンλｇｔｌｌ（ＩＩＳＡ−　ｎ　）からＥ
ｃｏＲ　ｒとＸｂａ　１消化によって生じるフラグメン
トを調製し、これをｐｔｌｃ１９ブラスミドのＥｃｏＲ
　ＩとＸｂａ　Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラ
グメントとＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ組換
えブラスミドｐ［ＪＣ−｝ＩＳＡ−ＥＸを構築した。

このブラスミドから八ｈａＩ［ＩとＳａｌ　ｌの二重消
化により生ずる小さい方のフラグメントを精製した．こ
のフラグメントは成熟正常ヒト血清アルブ逅ンＡタンパ
ク質の１２番目のＬｙｓから３５６番目のＴｈｒまでを
コードする。戒熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク質
をアミノ末端からコードする遺伝子を構築するために５
′端に相当するＤＮＡ配列を、化学合威したフラグメン
１２本をアニールすることにより作威した。この合戒Ｄ
ＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペブチ
ドをコードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ　
ＩＩ及びＣｌａ　Ｉ酵素切断によって生ずる粘着末端配
列ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルブミンＡ
タンパク質の１番目のアξノ酸Ａｓｐから１１番目のア
ミノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している。

このア二一ルさせたＤＮＡ配列にＴ４ボリヌクレオチド
キナーゼを作用させて５′端をリン酸化させたものと、
ｐＵｃ−ＨＳＡ−ＥＸから生じたＡｈａ　［［［　／　
Ｓａｌ　（二重消化物とを混合し、さらにこれに大腸菌
のマルチコピークローニングベクターの代表的なものの
一つｐＡＴ１５３　（Ａｍｅｒｓｈａｎ＋社製、Ｔｗｉ
ｇｇ，　Ａ．Ｊ．及びＳｈｅｒｒａｔｔ，　Ｄ，Ｎａｔ
ｕｒｅ　２８３　２１６−２１８．　１９８０）のＣｌ
ａ　Ｉ／Ｓａｉｌの二重消化物のうち大きなフラグメン
トと混合し、この３者をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより結
合させ、組換えプラスξドｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸを得た
。このブラスミド上で正常ヒト血清アルブミンＡの１位
のアミノ酸Ａｓｐからｌ１位のアミノ酸Ｐｈｅをコード
するＤＮＡ配列がつながった。ｐＡＴ−｝１ｓＡ−ＣＸ
をＥｃｏＲ　Ｉ　／　Ｘｂａ　Ｉで二重消化し、正常ヒ
ト血清アルブミンＡのＡｓｐ　１　〜Ｐｈｅ３５６をコ
ードするＤＮＡ配列を含む小さい方のフラグメントを得
た。

一方１１５Ａ−Ａのカルボキシル末端側をコードするｃ
ＤＮＡは、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たクロ
ーンλｇｔｌｌ（｝ＩＳＡ　Ｉ−Ａ）から外来ｃＤＮＡ
配列の挿入されているＥｃｏＲ　ｌフラグメントを調製
し、ｐＵｃ１ＢブラスミドのＥｃｏＲ　Ｉサイトに挿入
することにより組換えプラスミドｐＵｃ−ＨＳ＾−１中
にクローニングした。

これより｝ＩＳＡ−Ａの３５８番目のアミノ酸Ｌｅｕか
らカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコードし、
さらに３′側の非翻訳領域６２ヌクレオチドを含むＸｂ
ａ　Ｉ　／Ｈｉｎｄ！ＩＩの二重消化物を調製した．こ
れをｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸより得たｔｉｃｏＲ　Ｉ　／
　Ｘｂａ　Ｉ二重消化物及びｐＵｃ１８のＥｃｏＲ　Ｉ
　／　Ｈｉｎｄ　Ｉ［［二重消化物のうち大きなフラグ
メントと混ぜてＴ４　ＤＮ＾リガーゼにより連結反応を
行い、戒熟正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡ全体を
含む組換えプラスミドｐＵｃ−ＨＳＡ−ＣＨを得た。

戒熟正常ヒト血清アルブミン八の全アミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第１１−１図〜第１ｌ−３図に示す。

Ｅピ４例』４　ブレプロ　　　コー　　る人　ＤＮＡ次
の配列を有する４種類のオリゴヌクレオチド：１．＾Ａ
ＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴ
ＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴ２．　　ＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣ
ＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴ
ＴＣＡＴＧ３．　　ＣＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴ
ＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＣＧ４．
ＣＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡ
ＡＧＣＡＧＡＡＧを、Ｍａｔｔｅｕｃｃｆ＋　ｆｉ．Ｄ
．及びＣａｒｕＬｈｅｒｓ，　Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２Ｌ　７１９（１９８０
）に記載されているホスホアミダイト法により、自動Ｄ
ＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｋｏｓｙｓｔｅｍｓモ
デル３８０Ｂ）を用いて合成した．オリゴヌクレオチド
断片をＴ４ボリヌクレオチドキナーゼにより５′−リン
酸化した後、アニーリングせしめ、次にＴ４ＤＮＡ　リ
ガーゼにより連結して、ブレプロ配列をコードする一個
の二本鎖ＤＮＡを得た。

正常ヒト′血清アルブミンＡのｃＤＮＡを含むプラス名
ドｐＵｃ−ＨｓＡ−ＣＨ　（参考例２）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲ　Ｉ及びＣｌａ　Ｉで二重消化して大きい方のフラ
グメントを得、これを前記の合成ＤＮＡとＴ４　ＤＮＡ
リガーゼにより結合させブラスミドｐｔｌｃ−｝ＩＳＡ
−ＥＨを作成した．ｐＵＣ−　ＩＳＡ−Ｅ｝Ｉプラスミ
ドをｔ！ｃｏＲ　Ｉで処理し開環し、バクテリアアルカ
リ性ホスファターゼで５′−リン酸基を除去後、 の配列から成るＸｈｏ　Ｉ認識部位を含むＸｈｏ　Ｉリ
ンカーとＴ４　ＤＮＡリガーゼにより結合させ環状ブラ
スミドｐＵｃ−Ｘ−ＩＳＡを作威した． ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡの３′側領域を含有す
るλｇｔｌｌ（ＨＳ＾−ＩＡ）　（参考例ｌ、第８図）
をＥｃｏＲ　Ｉにより消化してヒト血清アルブミンＡの
ｃＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントを得、これをＥ
ｃｏＲ　Ｉにより切断したブラスミドｐｌｌｃ１８に連
結してブラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−　１　’を得た．こ
のプラスξドｐＵＣ−｝ＩＳＡ−　１　’を旧ｎｄｌＩ
Ｉで切断しＨＳＡのボリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナ
ルを含む小さい方のフラグメントを得て、これを旧ｎｄ
Ｉ［Ｉ処理で開環しアルカリ性ホスファターゼで処理し
て末端の５′リン酸基を除去したｐ［Ｉｃ−Ｘ−ＨＳ＾
に組み込みｐＬｌｃ−Ｘ−ＨＳＡ−Ａプ−ｙスミドを作
威した。

参光班裏　ブースξ　ＪＤＢ−ＮｅＯの　　　　１３基
本となる大腸菌一酵母菌シャトルベクターとして市販さ
れているブラスミドｐＪＤＢ２０７　（アマシャム）を
使用した．また、Ｎｅｏ　（ア果ノグルコシドホスホト
ランスフェラーゼ３’　　（１））遺伝子源として市販
されているブラスミドｐＮ［！Ｏ　（ファルマシア）を
使用した．ブラスミドｐＮＥＯを旧ｎｄＩ［Ｉ及びＥｃ
ｏＲ　ｌにより二重消化し、大きい方のフラグメントを
得た．次に、下記の配列： を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、前記ｐＮＥｏの
大きい方のフラグメントにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て連結・環状化してプラスミドｐＮｅＯ−ＰＬを得た．
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは５′一末端にＥｃｏＲ
　Ｉ粘着末端配列を有し、３′一末端に旧ｎｄｎｌ末端
を有するほか、内部に旧ｎｄｌｌｌ，Ｘｈｏｌ及びＳｅ
ｂａ　１部位を有する．従って前記ブラスミドｐＮｅＯ
−ＰＬはＮｅｏ遺伝子の上流に複数の制限酵素切断部位
を有する．次に、このプラスミドｐＮｅｏ−ＰＬを１１
ｊｎｄｌｔｌ及びＢａｇ｝Ｉ　Ｉにより二重消化し、１
．　４　ｋｂフラグメントを得た。プラスξドｐＪＤＢ
２０７を旧ｎｄ［［及びＢａｍＨ　ｌにより二重消化し
、２角酵母複製起点及び標識遺伝子ＬＥＩＩ２等を含有
するベクターフラグメントを得た．次に、これらのフラ
グメントをτ４　ＤＮＡリガーゼにより連結することに
よりプラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏを得た。

？母菌ＡＨ２２株の染色体ＤＮＡ　１００ｎを１ユニッ
トのＳａｕ３ＡＩと３７゜Ｃ、１５分反応させた（２０
０ｍの５　　０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５
），　　　７ａ＋Ｍ　　ＭｇＣ１■　　５　　（１＋Ｍ
ＮａＣＩ中）．１０Ｊの０．　５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ
　８．　０　＞を加え、６５゜ＣＩＯ分反応させ、酵素
を失活させた．５％シａｔＪａ−ＴＥ　（ＴＥ　：　１
　０ｓＭ　Ｔｒｔｓ−１１ｃＩ（ｐＨ７．　５　）１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ）と２０％シ！ＩＫ！−ＴＥを用い、密
度勾配を全量１２ｄで作製した．この勾配の上に上記反
応液を重層し、ベックマン社のＳ−４１ローターを用い
、２２Ｋｒｐ一で１５時間、１６゜Ｃで遠心した。

遠心後、各分画について電気泳動を行い、１５ｋｂ〜２
０ｋｂのフラグメントを含む両分に５０バの３Ｍ酢酸ナ
トリウム液（ｐ｝１５．２）を加え、次に１１Ｒ１のエ
タノールを加え、よく混合した後、−２０゜Ｃに一夜静
置し、ＤＮＡを沈澱させた．遠心（　１　５　Ｋｒｐｍ
，５分、４゜Ｃ）により、ＤＮＡ沈渣を回収した。この
沈渣を７０％エタノールで洗った後、減圧乾燥した．以
上の操作により、５＃ｇのＤＮＡを得た。

このＤＮＡ１ｇを２ｎのＥＭＢＬ　３のアーム（Ｓ　ｔ
ｒａ　ｔｅｇｅｎｅ社製）、及び３５０ユニットの７４
　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）と混ぜ、１６゜Ｃで一夜反
応させた〔反応液＝１０ｍの５　　０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７．５　　）　　　．　　１　　０ｍＭ
　　ＭｇＣ１ｚ，１０■ＭＤＴＴ，１■門＾ＴＰ）。上
記反応液ｌＩＪ１を用い、ＧＩＧＡ−ＰＡＣＫ　Ｐｌｕ
ｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，　ｉＧＰ６−Ｐ）に
より、インビト口・バッケージング反応を行った。

その結果、３　Ｘ　１　０’ｐｆｕの、大腸菌Ｐ　２３
９２株（ｈｓｄＲ　５１４（ｒｋ−．　　ｓｋ”）．　
　ｓｕｐＥ４４．　　ｓｕｐＦ５８，　　ｌａｃＹＩ，
ｇａｌＫ２，　ｇａｌＴ２２，　ｍｅｔＢ１，　ｔｒｐ
Ｒ５５，　（Ｐ２））に感染しうるファージを得た，　
１０００ｐｆｕのファージを５０ｄのＰ　２３９２細胞
に加え、３７゜Ｃで２０分反応させた後、２．　５　ｄ
のＬ−Ｔｏｐ−Ａｇａｒｏｓｅ　（Ｌ　Ｂ培地（１％ト
リブトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）中０．
７％アガロース）と共に、直径９０ｍのし−プレート（
ＬＢ培地＋１．５％寒天）にまいた。このようなプレー
トを５枚用意し、３７゜Ｃにて一夜培養し、プラークを
形威させた。ブラークの形或されたプレートを１時間４
℃で保存した．Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（アマシャム）をア
ガロース面に密着させ、室温に２分静置した．膜をアガ
ロースからはがし、接着面を上に、０．　５　Ｎ　Ｎａ
ＯＨ，　　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１を浸した，３ＭＭフィルタ
ー（Ｗｈａｔｍａｎ）上に５分間置いた．膜を０．　５
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．　２　）　　，　１
．　５Ｍ　ＮａＣ１に浸した３ＭＭフィルター上に移し
、５分静置した，２ＸＳＳＣ液で膜を洗い、風乾させた
。

風乾した膜をサランラップで包み、Ｕ■照射し、ＤＮＡ
を膜に固定した。この膜を、ＡＤＣ　１遺伝子の翻訳領
域のアミノ末端より１０残基に相当する塩基配列を化学
合成したブローブＡＤＨ（５’ＡＴＧＴＣＴ　ＡＴＣ　
ＣＣＡ　ＧＡ＾＾ＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴ
Ｔ）とハイブリダイズさせた．ＩＩＩを洗浄後サランラ
ップに包み、ＸＲＡ−　５フィルム（コダック社）にＶ
！着させ、Ｉｎｔｅｎｓｉｆｙ　ｓｃｒｅｅｎを用い、
−７０℃にて５時間露光させた． 現像後、ハイブリダイゼーションシグナルを与えたブラ
ークをパスツールピペットの先でかきとり、　１００ｐ
ＺのＴＭ液（　ｌ　Ｏ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ
Ｈ　７．　５　）１　０ｍＭ　ＭｇＣＩ，）に懸濁し、
室温に２０分間静置した．懸濁液０．　５　ｄを１ＩＩ
１のＴＭ液で希釈し、そのうち５パを前述した方法で大
腸菌Ｐ　２３９２に感染させ、直径９０ｍのプレートに
まきブラークを形威させた．形威させたプラークは、再
度上記のようにプラークハイブリダイゼーションを行い
、単一ブラークからなるポジティブクローンを得た．ボ
ジティププラークをパスツールピペットの先でかきとり
、５０Ｉ１ｌのＰ　２３９２細胞に加え、３７゜Ｃで２
０分間静置した後、液を２−のＬＢ培地、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＳＯ４に加え、３７゜Ｃで６時間振とう培養した．ク
ロロホルムを１００ｍ加え、ボルテックスミキサーにか
け完全に溶菌させ、２．５０Ｏｒｐｍで５分遠心し、上
清を得た。この上清中に１０１０オーダーのファージが
含まれていた。この上清８００　ｍに１００μｌの５Ｍ
ＮａＣＩを加え、次に５４０ｄのイソブロパノールを加
えよくまぜ、−２０″Ｃで２０分間静置した．遠心し、
得た沈渣を５００　Ｉｔｌの７０％エタノールで洗い、
２００ハのＴＥに溶解させた。

１ｊｄ（６０ユニット／ｄ）のＤＮａｓｅ　１　（宝酒
造〕と、２Ｉ１ｌのＩ　Ｍ　ＭｇＣｈを加え、３７゜Ｃ
で３０分反応させた。１００μｌのＴＥ飽和フェノール
を加え、ボルテックスミキサーで混合した，　　ｌ　２
Ｋｒｐｎ＋、５分遠心し、得られた水層をフェノール／
クロロホルム（１：１）で一回抽出した．得られた水層
に２０ｊ１ｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加
え、さらに５００ＩＪ１のエタノールを加え、遠心して
ＤＮＡを沈澱させた．得られた沈渣を７０％エタノール
で洗った後、減圧乾燥させ、そして５０ｄのＴＥに溶解
した。この操作でｌｎ相当のファージＤＮＡが得られた
。得られた溶液２０μ１に、２．２μの１０倍濃度Ｅｃ
ｏＲ　Ｉ　１１街液（０．　５　Ｍ　ＮａＣｌ　，　０
．　５Ｍ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＩ　（ｐＨ７．　５　）　
　，　７　０ｄ　ＭｇＣｈ）を加え、１μｌ（５ユニッ
ト／ＩＩ１）のＥｃｏＲｌ（ニツボンジーン）とｔｙの
１０■／ｄのＲＮａｓｅＡ（Ｓｔｇｍａ）を加え、３７
゜Ｃで１時間反応させた。反応後、０．７％アガロース
電気泳動を行い、常法に従い、ＤＮＡバンドをｌｌｙｂ
ｏｎｄ　Ｎｌｌにブロッテイングした。ＤＮＡの結合し
たＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜は、ブラークハイブリダイゼーシ
ョンと同一の条件でハイブリダイゼーションを行った．
このようにして得られたいくつかのクローンのうち、λ
−ＡＤＩでは、８．４ｋｂのＥｃｏＲ　ｌフラグメント
にプローブが結合することが分かった。

残りのＤＮＡ溶液のうち２０ＩＪ１を、前述の条件下で
、ＥｃｏＲ　Ｉにより切断し、０．７％アガロースゲル
電気泳動でフラグメントを分離した。８．　４　ｋｂＥ
ｃｏＲＩフラグメントを含むアガロース断片を切り出し
、グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ　ＣｌｅａｎＴ′４，　
Ｂｉｏ−１０１社）により、ＤＮＡをアガロースから分
離、精製した。

１０ＪｌｌのＴＥ中に溶出されたＤＮＡを、ＥｃｏＲ　
Ｉで切断したｐＵｃ１９と連結反応させ（　３　０　ｎ
ｇ　ｐＵｃ１９，５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）
Ｈ’７．５　）　　，　１　０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　．　
１　０ｍＭ　ＤＴＴ，　　ｌ−＾ＴＰ，　　３５０ユニ
ットＴ４　ＤＮＡリガーゼ／３０ｌ中、１６゜Ｃ、２時
間）、反応液５Ｉ１１を用いて大腸菌ＪＭ１０７を形質
転換させた．形質転換した大腸菌を５０肩／　ｙｒｉ　
Ｘ　−Ｇａｌ　（　５−ブロモー４−クロロ−３−イン
ドリルーβ一Ｄ−ガラクトシド）、５，ＭＩＰＴＧ（イ
ソプロビルーβ一Ｄ−チオガラクトビラノシド）、ｓｏ
Ｉ４／ａｄアンビシリンを含むＬ一プレート（Ｘ−Ｇプ
レート）にまき、コロニーを形成させた．発色していな
いクローンを５０趨／−アンピシリンを含む５−のＬＢ
培地に接種し、３７“Ｃで一夜培養し、菌を増殖させた
。ミニプレパレーション法によりＤＮＡを調製し、最終
的に得られたエタノール沈澱を５０ｕ１のＴＥに溶解さ
せた。調製したＤＮＡの内５バをＥｃｏＲ　Ｉで切断し
（５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．　５　）　
　．　７ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ　，　５　０ｍＭ　ＮａＣ
１　，　１　ｔａｇ／ｔｄ　ＲＮａｓｅＡ　，　　５ユ
ニットＥｃｏＲ　Ｉ／１５Ｉ１ｌ），０．７％アガロー
スゲル電気泳動を行い、８．４ｋｂのＥｃｏＲ　Ｉフラ
グメントがＰＬＩＣに挿入されていることを確かめた。

さらに、サザーン法により、このフラグメントがプロー
ブと結合することを確かめた。このようにして得られた
クローンｐＥｃＯ８．４のＤＮＡを精製し、０．　５　
１！ｇをＳａｕ３ＡＩで完全分解し（５　０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ４１Ｃｌ（ｐｌｌ７．　５　）　　，　５　０ｍＭ
ＮａＣｌ　．　７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ，　４ユニットＳａ
ｕ３ＡＩ／　１　５　ｔｔｌ中、３７゜Ｃ，２時間）、
０．７％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡフラグメ
ントを分離した。１．６ｋｂフラグメントを含むアガロ
ース断片より、ＣｅｎｅＣｌｅａｎ”により、ＤＮＡを
１０ｍＴＥ中に回収した．これをＢａｍＨ　Ｉで切断し
たｐＵｃ１１９と連結反応させ、反応液の５ｊ１１を用
い、大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した．形質転換した
大腸菌をＸ−Ｇプレートにまき、コロニーを形威させた
。発色しないコロニーのＤＮＡをミニプレパレーション
で調製し、分析を行った，５Ｉ１１ＤＮＡをＥｃｏＲ　
Ｉと旧ｎｄｌｌｌで切断したもの（５ユニットＥｃｏＲ
　Ｉ　ｓ　５ユニットｌｌｉｎｄＩ［Ｉ）、及び６ユニ
ッ斗Ｓｐｈ　Ｉで切断したものをそれぞれゲル電気泳動
で分析し、前者においては１．６ｋｂのフラグメント、
後者においては、１．０ｋｂのフラグメントを生ずるク
ローンを選別した。このようにして得られたクローン、
ｐＳａｕ　１．　６のＤＮＡを調製し、以下の実験に用
いた。

ＤＮＡ５ｇをＳｍａ　ＩとＳａｃ　Ｉで切断した（１０
＋ｓＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｌ｛７．　５　）　　，　
２　０＋ＭκＣｌ　，　７ｓＭ　ＭｇＣ１ｚ、２０ユニ
ットＳｅａ　Ｉ、２０ユニットＳａｃｌ／５０μ，３７
゜Ｃ、２時間）．反応終了後、フェノールクロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。Ｄ
ＮＡ沈渣を５０〆のＥｘｏ　ｍ緩衝液（５　０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ｝１８．　０　）　　．　　１００
ｄ　ＮａＣｌ　，５ｍＭ　ＭｇＣｌｘ　，　１　０ｍＭ
　２一メルカブトエタノール）に溶解させた．もう一本
のチューブに５０ｍのＭＢ緩衝液〔４０ＩＩＭ酢酸ナト
リウム（ｐＨ４．５）、１００＋ｓＭ　ＮａＣｌ　，　
２ｍＭ　ＺｎＣ１ｇ　．　１　０％グリセロール〕を入
れ水中に置いた。ＤＮＡ液に１８０ユニットのＦ！ｘｏ
ＩＩＩヌクレアーゼ（宝酒造）を加え、３７゜Ｃに保温
した。酵素添加後３０秒ごとに５ｄをサンプリングし、
ＭＢｌ！衝液の入ったチューブに移した．サンプリング
終了後、氷上のチューブを６５゜Ｃ、５分保温し、次に
３７゜Ｃに冷し、５０ユニットのマング・ビーンヌクレ
アーゼヲ加エ、３７゜Ｃ、３０分保温した．反応後、こ
の液をＴＥで飽和させたフェノールで抽出し、エタノー
ル沈澱でＤＮＡを回収した．回収したＤＮＡを３０ｍの
ＴＥに溶解させた。ＩＩ１１をとり２ｌのＩＯＸライケ
ーシッン液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．
　５　）　　．　１００ｍＭ　ＭｇＣｈ．１００ｓＭ　
ＤＴＴ　．　１　０ｓＭ　ＡＴＰ）を力■え、１６ｍの
ＴＥ，１μの７４　ＤＮＡリガーゼ（３５０ユニット／
Ｉ１１）を加え、１６゜Ｃで一夜保温した。次に、７０
゜Ｃにて１０分間保温し、リガーゼを失活させた後、０
．２ＭＫＣＩを２ｊ１１、Ｓｖ＊ａ　ｌをｌｕＩ（１０
ユニット／ＩＩ！〕加え、３７゜Ｃ、１時間保温した。

次に７０゜Ｃにて５分間保温し、水中に移した。

これを用い、ＭＶ１１８４を形質転換させ、形質転換体
を一夜３７゜Ｃで培養し、コロニーを形威させた。

コロニーからＤＮＡを調製し、欠失変異が生じているク
ローンを検出した。次に、欠失の起こっているクローン
の一本鎖ファージＤＮＡを調製した。

ファージＤＮＡは、７−Ｄｔ！ＡＺＡ−ジデオキシ・シ
ークエンシングキット（宝酒造）を用い、メーカ−マニ
ュアルに従い、配列決定を行い、ＡＴＧより上流−１０
ｂｐまで欠失したクローンｐＤＥ６−１０を得た。ｐＤ
Ｅ６−１０のＤＮＡを調製し、１，ｑＤＮＡをＥｃｏＲ
　ｌで完全消化し、１００ＩＩ１のＴＥに溶解させた．
この溶液２パに１００ｎｇのＸｈｏリンカー（ＡＡＴＴ
ＧＣＴＣＧＡＧＣ）を加え、１ｍの１０×ライゲーショ
ン液、１μのＴ４ＤＮＡ　リガーゼ（３５０ユニット）
、６Ｊ１１の滅菌蒸留水と混合し、計ｌＯＩｉの反応液
中で連結反応させた（１６゜Ｃ、２時間）。７０゜Ｃに
てＩＯ分間保温し酵素を失活させ、ｌＩＪ１の０．５　
Ｍ　ＮａＣ１、５ユニットのＥｃｏＲ　Ｉを加え、３７
゜Ｃ３０分間保温した後、これを用いて、大腸菌ＭＶ１
１８４を形質転換させた．得られたコロニーからＤＮＡ
を調製し、ＥｃｏＲ　Ｉで切断されず、Ｘｈｏ　Ｉで切
断されるクローンを選別した。このようにしてｐＤＥ６
−　１０　（Ｘｈｏ）　（プロモーターカセットベクタ
ー）を得た． このベクターｐＤＥ６−　１０　（Ｘｈｏ）を含有する
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８
４／ｐＤＥ６−１０（Ｘｈｏ）は工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第１０３１１号（ＦＥＩＩＭ　
Ｐ−１０３１１）として寄託されている。

０１貫７，　　　　ＡＤＨＩターミネーター配　のクロ
ｐＥｃＯ８．　４　　ｔ　ｎを４ユ−１−　ットのＢａ
ｌｌで切断した（　１　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
｝１７．　５　）　，　１　ｍＭ　ＭｇＣｈ／２０ｄ．
３１゜Ｃ，１時間）。次に、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌを３パ加
え、４ユニットのｓｐｈ　Ｉを加え、ｌ時間３７℃に保
温した．反応後０．　７％アガロースゲル電気泳動を行
い、ｌｋｂのフラグメントを分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａ
ｎでＤＮＡを抽出した。回収したＤＮＡを、ｓｐｈ　Ｉ
とＳａｉａ　Ｉで切断したｐＵｃ１１Ｂと連結反応させ
、ＭＶ１１８４を形質転換させた。形質転換クローンか
らＤＮＡを調製し、フラグメントの挿入されたクローン
を捜した。このＤＮＡを調製し、ＩｇＤＮＡをｓｐｈ　
Ｉ及び旧ｎｄ■で切断し（　ｌ　ＸＥｃｏＲ　Ｉ　１１
衝液、４ユ−１−７トＳｐｈｉｌ２ユ−１−　ｙトｌＩ
ｉｎｄｌＩ［　）　、１．　２％アガロースゲル電気泳
動を行い、０．３３ｋｂフラグメントを単離し、そして
Ｇｅｎｅ　ＣｌｅａｎによりＤＮＡを抽出した．これを
、プラス亀ドｐＭＭＴＶ−ＰＬＩを｝ＩＬｎｄｌｌｌ及
びＳｐｈ　Ｉにより二重消化して得られた５．７ｋｂフ
ラグメン｝５０ｎｇと連結反応（全反応溶液量２０Ｉｌ
１）させた。

反応後、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、アンビシリ
ンを含むＬ−プレート（Ｌ−ａｍ＋ｐプレート）上でコ
ロニーを形成させた．コロニーよりＤＮＡを調製し、制
限酵素分析により挿入ＤＮＡを調べ、目的とするフラグ
メントが挿入されたクローンを得た．そのクローンから
ＤＮＡを調製し、その０．　５ｎを旧ｎｄｌｌｌで切断
した。７　０　’Ｃ　５分保温して、氷上に移し、１ｎ
の１　ｍＭ　ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ｄＣ
ＴＰ，ｄＴＴＰを各々１ｍＭ含む）、と２ユニットのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ　（κｌｅｎｏｗフラグメント）（
宝酒造）を加え、３７゜Ｃで３０分間保温した。フェノ
ール．クロロホルムで除蛋白後、ＤＮＡをエタノールで
沈澱させた．ＤＮＡを１０ｍの１×ライゲーシッン液に
溶かし、３５０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、ｌ
６゜Ｃで一夜保温した．７０゜Ｃでｉｏ分間処理し、リ
ガーゼを失活させた後、０．　５　Ｍ　ＮａＣｌを１．
　２　Ｊ１１、Ｈｉｎｄｎｌを１２ユニット加え、３７
゛Ｃで３０分間処理した。これを用い、大腸菌ＪＭ１０
７を形質転換させた，　　Ｌ−ａｍｐプレートに形威さ
れたコロニーの一部をＬ−ａｍｐ液体培地（Ｌ−ａｍｐ
プレートから寒天を除いたもの）中で培養し、得られた
菌体からＤＮＡを調製し、旧ｎｄｌＩ［サイトが失われ
たものを得た．次に、０．　５　ｎ　ＤＮＡを４ユ−１
−　ｙトのＢａｍＨ　Ｉ、１２単位のｓｐｈ　Ｉで切断
した（　１　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ＩＩＣＩ　（ｐＨ７
．５）　　．　１５０ｍＭ　ＮａＣ１　，　７ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌｚｌ　．　　１．４％アガロースゲル電気泳動で
、０．３４ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し、Ｇｅｎ
ｅ　ＣｌｅａｎでＤＮＡを１０μｌＯＴＥ中に回収した
。これを３０ｎｇのｐＴＡｌ５３を、ＢａｍＨ　Ｉ及び
ｓｐｈ　Ｉで切断して得た３．５ｋｂフラグメントと連
結反応させた． 反応液で大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、Ｌ−ａｍｐ
プレートにコロニーを形威させた．コロニーの一部をＬ
−ａｍｐ液体培地中で培養し、得られた菌体からＤＮＡ
を調製し、０．４２ｋｂのサイズＲａｍ）＋　１−Ｓａ
ｌ　Ｉ二重消化物（ＤＮＡフラグメント）を与えるクロ
ーンをさがした．クローンから得られたＤＮＡ０．５ｎ
を、ＢａｍＨ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉで切断し、１．４％ア
ガロースゲル電気泳動により、０．　４２ｋｂフラグメ
ントを分離し、Ｇｅｎｅ　Ｃｌｅａｎにより５ＩＩ１の
ＴＥ中に回収した。これを、ＢａｍＨ　Ｉ　−　Ｓａｌ
　Ｉで切断したＬｏｎｇのｐｔｌｃ−１１９と連結反応
させた．反応液１ｄを用い、大腸菌ＭＶ１１８４を形質
転換させ、ＸＧプレートにまき、コロニーを形威させた
．白色のコロニーより、ＤＮＡ＠ｔＡ製し、フラグメン
トの挿入されたものを得た（ｐＵｃ−ＡＴＥ　；ターミ
ネーターカセット・ベクター）． このベクターｐＵｃ−ＡＴＥを含有する大腸菌Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ並旦門Ｖ１１８４（ｐＵｃ−ＡＴＥ）は
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０３
１０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３１０）として寄託されて
いる． プロモーターカセットベクターｐＤＥ６−　１０　（Ｘ
ｈｏ）０．５ｎをＨｉｎｄｌ［［及びＸｈｏ　Ｉで切断
し、０．７％アガロースゲル電気泳動により１．６ｋｂ
のフラグメントを分離した。一方、ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ　
０．　５　Ｎを旧ｎｄＩ［及びＸｈｏ　Ｉで切断し、８
ｋｂフラグメントを分離した。

両者を連結し大腸菌ＪＭ１０７に導入し、アンビシリン
耐性コロニーヲ得た．コロニーよりＤＮＡをＩ、挿入フ
ラグメントを確認した（ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ）　．
ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ　Ｏ．　５　ｎをＢａｍＨ　Ｉ及びＳ
ａｌｌで切断し、約８ｋｂのフラグメントを分離した。

一方１ｕ＋＋のｐＵＥ−ＡＴＥをＢａｓＨ　Ｉ及びＳａ
ｌ　Ｉで切断し、０．４２ｋｂのフラグメントを分離し
た．両者を連結し、形威されたプラスミドにより大腸菌
ＪＭｌ０７を形質転換させ、アンピシリン耐性コロニー
を得た。これらのコロニーよりＤＮＡを調製し、目的の
プラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥを有していること
を確かめた。ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥ　Ｏ．　５　Ｉ
ｆｌを旧ｎｄｎｌ及びＸｈｏ　Ｉで切断し、約８ｋｂの
フラグメントを得た。一方、ｐＤＥ−６−１０（Ｘｈｏ
）より、１．６ｋｂの旧ｎｄｎｌ−Ｘｈｏｌフラグメン
トを回収した．両者を連結し、形威されたプラスミドに
より大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させた。アンビシリン
耐性コロニーのＤＮＡを調べ、目的のプラスごド（ｐＡ
Ｈ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴＥ）を有しているクローンを
見つけた． このベクターを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉＪＭ１０７／ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴ
Ｅは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
０３０９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３０９）として寄託さ
れている。

参Ａ朋文　　　ブースミ゛の　　　　ｌ７前記の様にし
て調製した、Ｎｅｏ遺伝子の上流にＡＤＨプロモーター
を有し、そしてＮｅｏ遺伝子の下流にＡＤＨターミネー
ターを有するプラスミドｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴ
ＥをＸｈｏ　Ｉ及びＢａｍｌｌ　Ｉにより二重消化する
ことによりＮｅｏ遺伝子が除去されたベクターフラグメ
ントを得た．他方、ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡを
含有するブラスミドｐｌｌｃ−ＸＨＳＡ−Ａ（実施例３
）をＸｈｏ　Ｉ及びＢａＩＩＩ｝Ｉ　Ｉで二重消化し、
人工リーダー配列を含むプレプロヒト血清アルブミンＡ
のｃＤＮＡ及びボリＡを含有するフラグメントを得た。

これらを７４　ＤＮＡリガーゼにより連結することによ
り、発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＮＳＡ−Ａを得
た。

このプラスミドを含有する酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２／ｐＪＤＢ−ＡＤ
Ｈ，ＩＳＡ−Ａは、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１０３０７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３０７
）として寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＡＴ−ｎＨＳＡの作製の過程を
示す． 第２図は、発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｎｌｌｓ
＾−Ａの作製の過程を示す。 第３図は、ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含む形質転換
体ＡＨ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｎ｝ＩＳＡ−Ａ）の培
養により産生された正常成熟ヒト血清アルブミンＡをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、クマシー・
ブリリアント・ブルー染色により検出したものを示す。 第４図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト血
清由来ヒト血清アルブミンのＮａｔｉｖｅボリアクリル
アξド濃度勾配ゲル電気泳動における挙動を比較した結
果を示す。 第５図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト血
清由来ヒト血清アルブミンとを等電点電気泳動にお２い
て比較した結果を示す．第６図は、酵母産生正常ヒト血
清アルブミンＡとヒト血清由来ヒト血清アルブミンの逆
相クロマトグラフィーにおける挙動を比較したものであ
る．第７図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒ
ト血清由来ヒト血清アルブごンとをＯｕｃｂ　ｔｅｒｌ
ｏｎｙ法により比較した結果を示す． 第８図はこの発明の正常ヒト血清アルブミンＡの全体を
コードするｃＤＮＡ（ＨＳＡｃＤＮＡ）　、並びにこの
ｃＤＮＡの造威に使用された、３′末端側をコードする
ｃＤＮＡ（ｔｌｓＡ−ｒＡ）及び５′末端側をコードす
るｃＤＮＡ０１ＳＡ−　ｎ　）の制限酵素地図を示す。 第９図は、ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した３種のブローブの塩基配列を示す。 第１０図は、プラスミドｐＵｃ−ＨＳＡ−ＣＨの作製の
過程を示す。 第１１−１図〜第１１−３図は、ヒト血清アルブミンＡ
の全体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。 第１２図は、プラスミドｐｔｌｃ−Ｘ−ＨＳＡ−Ａ　（
７）作製の過程を示す． 第１３図はプラスミドｐＪＤＢ−ＮｅＯ作製の過程を示
す． 第１４−１図及び第１４−２図は本発明のＡＤＨ　Ｉプ
ロモーターカセットベクターｐＤＥ６−　１０　（Ｘｈ
ｏ）の作製の過程を示す。 第１５−１図及び第１５−２図は、ＡＤＨ　！ターミネ
ーターカセットベクターｐＵＣ−ＡＴＨの作製の過程を
示す。 第１６図は、酵母用発現ベクター（ＡＤＨ　ｆサンドイ
ツチベクター）　ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−＾ＴＨの作
製の過程を示す。 第１７図は、発現ブラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＩＳＡ
−八の作製の過程を示す．

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト血清アルブミンＡのプレプロ配列をコードして
   いるｃＤＮＡと該ｃＤＮＡの下流に存在するヒト血清ア
   ルブミンＡをコードするｃＤＮＡとを有するＤＮＡ。 ２、ヒト血清アルブミンＡのプレプロ配列をコードして
   いるｃＤＮＡ、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤ
   ＮＡ、及びポリ（Ａ）配列をこの順序で有するＤＮＡ。 ３、前記プレプロ配列をコードしているｃＤＮＡが次の
   式： ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　Ａ
   ＴＴ　ＴＣＣ　ＣＴＴ　ＣＴＴＴＴＴ　ＣＴＣ　ＴＴＴ
   　ＡＧＣ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＴＣＣ　ＡＧＧ　
   ＧＧＴＧＴＧ　ＴＴＴ　ＣＧＴ　ＣＧＡ で表わされる、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。 ４、酵母で機能し得るプロモーターとターミネーターと
   の間に請求項２に記載のＤＮＡが発現可能な方向に挿入
   されている発現プラスミド。 ５、請求項３に記載の発現プラスミドにより形質転換さ
   れた酵母。 ６、請求項５に記載の酵母を培養し、成熟ヒト血清アル
   ブミンＡを産生・分泌せしめ、これを採取することを特
   徴とする成熟ヒト血清アルブミンＡの製造方法。