JPH07110233B2 - リプレツシブルイ−ストプロモ−タ− - Google Patents

リプレツシブルイ−ストプロモ−タ−

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JPH07110233B2
JPH07110233B2 JP61201924A JP20192486A JPH07110233B2 JP H07110233 B2 JPH07110233 B2 JP H07110233B2 JP 61201924 A JP61201924 A JP 61201924A JP 20192486 A JP20192486 A JP 20192486A JP H07110233 B2 JPH07110233 B2 JP H07110233B2
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hybrid
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チバ・ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換DNA技術を用いるイースト宿主での異物で
ある（外来性の）ポリペプチドの製造に関する。更に詳
しくは、本発明を新規な上流活性配列、かかる上流活性
配列を包含するハイブリッドイーストプロモーター、イ
ースト細胞の形質転換に有用な新規なハイブリッドベク
ター、かかる形質転換されたイースト細胞およびイース
トに対して異物であるポリペプチドの製造のためのかか
る形質転換されたイースト細胞の使用に関する。
近年遺伝子工学の分野で多大な進歩があり、遺伝子的に
操作された微生物、殊にエンテロバクテリウム、エッシ
エリヒア・コリ（Escherichiacoli）の菌株および製パ
ン用イースト〔サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccha
romycescerevisiae）〕の菌株を用いるいくつかの系が
現在働いている。しかしながら、産業上蛋白質を経済的
かつ大規模に生産するのに適した追加の改善された系、
特に真核生物系、例えばイーストに対する要望がある。
現在、遺伝子クローニングに種々のイーストベクターを
用いることができる。イーストでの異質遺伝子の効率の
良い発現のために、構造コード配列を強力なイーストプ
ロモーターと組合せる必要があり、これらのプロモータ
ーは有利には遺伝子発現の外因性コントロールを可能と
する調節特性を示す必要がある。発現の効率（生成物形
成）は使用するプロモーターの強さの函数でありかつ比
例するので、遺伝子工学の分野での当業者は強力なプロ
モーター系の開発に特に留意している。
蛋白質をコードするクローニングされたイースト遺伝子
の試験管内での突然変異誘発および機能分析のためのイ
ースト細胞への再導入により、種々の必須のcis−作用
プロモーターエレメントの同定が可能となった〔参考ま
でに、L.グアレンテ（Cuarente）、セル（Call）、第36
巻、第799頁、1984年を参照〕。遺伝子の５′末端の蛋
白質コード領域に直ちにフランキング（flanking）して
いるエレメントで始り、これらのエレメントは次のもの
を包含している。
−時にはCAACAACAA（または関連配列）モテイフを包含
するむしろＡ−Ｔに富んだ５′転写されるリーダー領
域、 −通常異った強度のmRNAスタート部位の多重性を指示し
ている翻訳スタートコドンATGから約40〜60bp（時には
それ以上）に位置する転写開始点、 −本質的なRNAポリメラーゼII認識部位として働くもの
と予想される転写開始点から約40〜80bpに位置するTATA
ボックス（時には２個以上）、 −TATAボックスから約100−300bp上流に位置する上流活
性部位（UAS）、調節蛋白のための推定ターゲット部
位。
UASは原核生物にみられる調節部位とは区別される様式
で働き、そして哺乳動物系のエンハンサー部位により似
ている。更に詳しいデータは、陽性に作動する調節蛋白
（GAL4遺伝子生成物）が直接GAL−GAL10のUASと相互作
用をするイーストGAL−１、GAL7、GAL10クラスターから
得られる〔ジンジャー（Giniger）等、「セル」、第40
巻、第767頁、1985年〕。
イーストCYC1遺伝子のTATAボックスの前でGAL1〜GAL10
のUASをコードしているプロモーターセグメントを融合
することにより、ハイブリッドプロモーターが発生し、
その転写は今やGAL1〜GAL10のUASのコントロール下にあ
り、すなわち、そのものはGAL4遺伝子依存性である〔L.
グアレンテ等、プロク・ナツル・アカド・サイ・USA（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA）、第79巻、第7410頁、1984
年〕。同じような構築がCYC1およびLEU2のプロモーター
エレメントの融合により行われていた〔L.グアレンテ
等、セル、第36巻、第503頁、1984年〕。これらの実例
は共にプロモーターエレメントおよび蛋白コード配列を
包含し、そしてこれらの系がイーストに対して異質であ
る遺伝子でも働くとする証拠は得られていない。
最近公開された特許出願（PCT 84/4757）にはイースト
PGK遺伝子のUASエレメントが開示されている。−324と
−455との間（AGTから）に位置する必須プロモーターエ
レメントの存在が示されている。他のプロモーターの前
にこのエレメントを付加することは他のイーストプロモ
ーターの強度を増強すると述べられている。しかしなが
ら、この主張を実体化する実施例は示されてはなく、論
議は全く否定的なデータ（プロモーターの破壊）に基い
ている。エレメントがPGKプロモーターの本質的部分で
あることは十不可能であるが、このようなエレメントが
ハイブリッドプロモーターの部分として働くかどうかは
疑わしい。更に、PGKのUASは調節シグナルと連けいして
いない、すなわち特別な生理学的シグナルによって下流
コード配列の表現（転写）をコントロールし得ない。
グルコース分解性遺伝子のプロモーターのいくつかはグ
ルコースの存在下で誘導される。これらのプロモーター
は細胞がグルコースのない培地で生育すると潜在的には
とめられてしまう。これは、イースト宿主細胞を、細胞
内に蓄積する滞在的に有害なまたは致死性遺伝子生成物
に対して細胞を保護するために、グルコースを他の炭素
数（アセテート、グリセロール、ラクテート等）で置き
換えた培地中で形質転換させ、発生させなければならな
い。原形質体の再生〔A.ヒネン（Hinnen）等、プロク．
ナツル．アカド．サイ、USA、第75巻、第1929頁、1978
年〕または塩処理全細胞の再生〔伊藤等、J.バクテリオ
ル（Bacteriol）、第153巻、第163頁、1983年〕は細胞
の急速な発生およびコロニーの形成を可能とするために
一般に栄養分に富んだ培地で行われているので、現今使
用されているいずれの形質転換プロトコールも炭素源と
してグルコースを使用している。グルコースのない培地
での再生および回収は窮めて貧弱にしか働かない（もし
働いたとしても）ものと予想される。
発現の時機は、細胞が大量の異質蛋白に最もよく耐容し
得る場合のみ、すなわち生育期外に蛋白質を高いレベル
で生産するのを確実にするために、調節しなければなら
ないことが一般に当業者間で認められている。また、発
現の調節が微生物の生育に最も重要な炭素源、すなわち
グルコースの存在または不存在で左右されないことが望
ましい。イーストによる異質（foreign）遺伝子の都合
の良い、技術的に通用可能な発現のためのこれらの要件
を充足する調節可能な、かつ強力なプロモーター系は当
該分野でほどんど知られていない。それ故、かかるプロ
モーター系の開発が要望されている。
意外なことに、グリコール分解経路に包括される酵素の
発現をコントロールし、また一般に現在知られている最
強力のプロモーターに属すると思われるプロモーターの
TATAボックスと、その抑制または抑制解除が生育培地の
必須成分（例えば必須炭素または窒素源）の存在または
不存在に左右されない調節可能なプロモーターの上流プ
ロモーターエレメントとの組合せによって、技術的に適
用可能なプロモーター系に課せられた主要な要件を充足
する強力なハイブリッドプロモーターが誘導されること
が見い出された。
本発明の目的は、イーストでの異質遺伝子の効率の良い
発現のための酸ホスファターゼPH05遺伝子のUASのコン
トロール下におかれたハイブリッドプロモーター、殊に
グリコール分解性遺伝子のプロモーターの使用にある。
イーストPH05遺伝子の新たに単離されたUASシグナル、P
H05UASシグナルを包含するハイブリッドプロモーター、
かかるハイブリッドプロモーターを含有するハイブリッ
ドベクターおよびかかるハイブリッドベクターで形質転
換されたイースト（yeast）宿生は更に本発明の目的で
ある。
本発明の更に他の目的は前記のUASシグナル、ハイブリ
ッドプロモーター、ハイブリッドベクターおよび形質転
換されたイースト宿主の製法およびポリペプチドの生産
のための前記形質転換されたイースト宿主の使用にあ
る。
1.イースト酸性ホスファターゼ（PH05）遺伝子およびハ
イブリッドプロモーターの上流活性配列 本発明はイーストPH05遺伝子から誘導される上流活性配
列およびハイブリッドプロモーターを製造するためのそ
の使用に関する。
本発明に先立っては、イーストPH05遺伝子の転写を調節
する上流活性部位（または配列、「UAS」）が１個また
はそれ以上存在しているか否かは当業者には知られてい
なかった。PH05遺伝子はリプレッシブルイースト酸性ホ
スファターゼをコードしている。このものは無機りん酸
塩の高濃度下で抑制され、そして無機りん酸塩欠乏下で
は抑制が解除される〔B.メイハック（Meyhack）等、BMB
O−Ｊ、第１巻、第675頁、1982年〕。
PH05遺伝子の５′領域の分析により、PH05遺伝子の転写
を調節するcis−作用エレメントの同定が結果として得
られた。ファージベクターM13mp9（組換えベクターM13m
p9/PH05 Bam−Sal、欧州特許出願第143,081号参照）中
にクローニングされたPH05遺伝子の５′領域の623bp B
amH I−Sal IフラグメントをBam部位から出発してエキ
ソヌクレアーゼBa131で消化し、そして、他の実験ではS
al部位から出発して消化している。すなわち、一組の短
縮PH05プロモーターフラグメントが発生し、これらフラ
グメントは配列分析に付し、そして短縮末端に合成EcoR
Iリンカーを備えている。Sal部位で短縮されたフラグ
メント（「左手プロモーターフラグメント」）とBam部
位で短縮されたフラグメント（「右手プロモーターフラ
グメント」）との組合せによって、PH05プロモーター領
域の一組の欠失突然変異株が生成され、これらをPH05構
造遺伝子の発現を行う能力について試験する。ヌクレオ
チド−225乃至−263の間の欠失は酸性ホスフェート活性
の５倍の減少をもたらし、またヌクレオチド−361乃至
−392の間またはヌクレオチド−346乃至−369の間の欠
失は酸性ホスファターゼ活性の10倍の減少をもたらすこ
とが確認された（ヌクレオチドの番号付けについては、
添付の第１図を参照）。これらの効果はPH05発現に必須
である上流活性部位（UAS）に帰せられる。ヌクレオチ
ド−365の近辺のUASはPH05遺伝子の５′領域の286bp B
amH I−Cla Iフラグメント（ヌクレオチド−274乃至−5
41）に含まれ、UAS1（PH05）と称される。一方、ヌクレ
オチド−245の近辺のUAS領域はPH05遺伝子の５′の100b
p Cla I−BstE IIフラグメント（ヌクレオチド−174乃
至−273）に含まれ、UAS2（（PH05）と称される。
本発明は特にPH05遺伝子のヌクレオチド−174と−541と
の間のBamH I−BstE IIフラグメントに含まれる上流活
性配列（upstream activation sequence）UAS1（PH05）
およびUAS2（PH05）に関する。
更に、本発明はPH05遺伝子のヌクレオチド−274乃至−5
41の間のBamH I−Cla Iフラグメントに含まれる上流活
性配列UAS1（PH05）およびPH05遺伝子のヌクレオチド−
174乃至−273のCla−Ｉ−BstE IIに含まれる上流活性配
列UAS2（PH05）に関する。
特に好ましいのは上流活性配列UAS1（PH05）である。Ba
mH I−Cla Iフラグメント内のUAS1調節シグナルの正確
な位置を決定することができた。すなわちUAS1調節シグ
ナルは31bp DNAフラグメント（PH05プロモーター領域
の−381乃至−351位置）に含まれている。好ましくは、
フラグメントは適当な制限部位を含有する平滑末端リン
カーあるいは制限エンドヌクレアーゼ例えばEcoR Iに特
異的な食い違い（staggered）末端を一方の側に有して
ている。31bpフラグメントは次の配列を有している。
GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT USA1（PH05）および（または）UAS2（PH05）配列を含有
するDNAフラグメントの製造法は、PH05遺伝子を含むDN
A、PH05遺伝子またはその５′末端部分を適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで開裂し、そして所望のフラグメント
を単離することからなる。例えば、PH05プロモーターお
よびPH05コード領域の部分を包含するPH05（上述）の62
3bp BamH I−Sal Iフラグメントを制限エンドヌクレア
ーゼBamH IおよびBstE IIで消化し、そして両方の上流
活性部位を含有する生成した368bpサブフラグメントを
単離する。同様な方法で、上記BamH I−Sal Iフラグメ
ントをBamH IおよびCla IでまたはCla IおよびBstE II
で開裂するとUAS1（PH05）を含有する268pb BamH I−C
la IサブフラグメントおよびUAS2（PH05）を含有する10
0bp Cla I−BstE IIサブフラグメントがそれぞれ得ら
れる。フラグメントおよびサブフラグメントの単離およ
び精製は通常の手段例えばアガロースゲル電気泳動また
はポリアクリルアミド電気泳動により達成される。
本発明による上流活性部位を含有するDNAフラグメント
は、それ自体既知の方法（例えばエキソヌクレアーゼ、
例えばBal31による部分消化）によって短縮フラグメン
トのUAS機能が保持されるようにして短縮することがで
きる。短縮はフラグメントの５′末端または３′末端あ
るいは両側で行うことができる。UAS機能を保持してい
るこれらのサブフラグメントの選定は上述の如くして、
すなわちUASを含有する元の配列を短縮フラグメントで
置き換えそしてPH05構造遺伝子の発現を実施するための
能力について得られたPH05プロモーター欠失突然変異株
を試験することにより行われる。PH05遺伝子の上流活性
部位の一方または両方を含有する本発明によるフラグメ
ントおよびその短縮誘導体は、ハイブリッドプロモータ
ーの構築およびベクターへの接合を容易にするために一
方の端に連結された合成リンカー配列を有していてもよ
い。
PH05の上流活性部位を含有するDNAフラグメントならび
にその短縮誘導体はまた、当業者に周知の通常の技術を
用いる化学DNA合成によっても製造することができる。
適当な技術はS.A.ナラング（Narang）によって収集され
ていた［テトラヘドロン（Tetrahadron）、第39巻、第
３頁、1983年］。特に欧州特許出願第146,785号に記載
の方法を用いることができ、参考して、本文に挿入す
る。
本発明の更なる特徴は、ハイブリッドプロモーターおよ
びPH05遺伝子の上流活性部位を包含するハイブリッドモ
ーターの製造のためにPH05遺伝子の上流活性部位を用い
ることである。
本発明は、特にイーストPH05遺伝子の上流活性部位を包
含する５′上流プロモーターエレメントおよび翻訳スタ
ートコドンに近い機能性TATAボックスおよび末端を包含
する転写開始部位を包含するイーストPH05遺伝子以外の
イースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメントを包
含し、特にこれらからなるイーストハイブリッドプロモ
ーターに係るものである。
５′上流プロモーターエレメントは特に上に特定したDN
Aフラグメントの一つであり、特にUAS1（PH05）およびU
AS2（PH05）を含む368br BamH I−BstE IIフラグメン
トあるいはUAS1（PH05）を含む268pb BamH I−Cla Iフ
ラグメントあるいはUAS機能が保持されているその短縮
誘導体例えばUAS1（PH05）を含む31bpフラグメントある
いはその更に小さいサブフラグメントである。
３′下流プロモーターエレメントは、好ましくは高度に
発現されるイースト遺伝子のプロモーター、殊にグルコ
ース分解酵素をコードしているイースト遺伝子のプロモ
ーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPHD）、３−ホスホ
グリセレートキナーゼ（PGK）、ヘキサキナーゼ、ピル
ヴェートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−
ホスホグリセレートムターゼ、ピルヴェートキナーゼ
（PyK）、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホ
グルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ遺伝子の
プロモーターから誘導される。３′−プロモーターエレ
メントは正しい転写開始および転写の正しいスタートポ
イント（主要mRNAスタートポイント）のために酵素ポリ
メラーゼIIを配置するに当り包含されているTATAボック
スを包含する。TATAボックスの下流には、３′−プロモ
ーターエレメントが、主要mRNAスタートと翻訳スタート
コドン（ATG）の間の領域、好ましくは翻訳スタートコ
ドンに接近する領域に伸びている。TATAボックスの上流
側で、３′−プロモーターエレメントは約50−150の原
塩基対を包含している。この上流DNA配列の正確な長さ
は重大なことではない。それはUASとTATAボックスとの
間の間隙に若干の融通性があると思われるからである。
本発明の好適な３′−プロモーターエレメントは当該分
野で既知の最強のイーストプロモーターの一つであるこ
とが知られているGAPDHプロモーターから誘導される
［酸素GAPDHはS.セレヴィシエの乾燥重量の約５％にの
ぼることができる。E.G.クレブス（Krebs）、J.ビオ
ル．ケム（J.Biol.Chem）、第200巻、第471頁、1953
年］。好ましくは、３′GAPDHプロモーターエレメント
はヌクレオチド−300乃至−180で始まり、GAPDH遺伝子
のヌクレオチド−１で終る。本発明の好ましい一態様で
は、３′プロモーターエレメントはGAPDH遺伝子のヌク
レオド−199乃至−１を包含している。本発明の他の好
ましい態様では、３′プロモーターエレメントはGAPDH
遺伝子のヌクレオチド−263乃至−１を包含している。
本発明のハイブリッドプロモーターは同じタイプの単一
UAS（PH05）または多重UAS（PH05）例えばUAS1（PH05）
を好ましくは頭部から尾部方向に配合されて含有してい
てもよい。３′プロモーターエレメントに関して、UAS
は純正なPH05プロモーターの方向に比して同一もしくは
逆の配向を有していてもよい。
本発明によるハイブリッドプロモーターの成分、すなわ
ちPH05のUASを含むプロモーターエレメントおよびTATA
ボックスを含むプロモーターエレメントは、合成リンカ
ーを介して、平滑末端結合により、あるいは可能ならば
自然発生相容制限部位を介して結合される。本発明のハ
イブリッドプロモーターの５′および３′末端は適当に
合成リンカーを有し、これによりベクターDNAへの結合
および３′末端で異型の蛋白質コード領域への接合を可
能とする。
本発明によるハイブリッドプロモーターはバイオテクノ
ロジーで使用可能なプロモーターに課せられているすべ
ての要件を満たしている。これらのプロモーターは強力
であり、生育培地の必須炭素または窒素源とは異る物質
によって誘起され、そして実験室および工業的規模で都
合良く取り扱われる。
本発明はまた、イーストPH05遺伝子の上流活性部位を包
含する５′上流プロモーターエレメント、ならびに機能
的TATAボックスを含み翻訳スタートコドンに接近して終
る転写開始部位からなるイーストPH05遺伝子以外のイー
スト遺伝子の３′下流プロモーターエレメントを包含す
るハイブリッドプロモーター製造法に関し、この方法は
イーストPH05遺伝子の上流活性部位を含有する５′上流
プロモーターエレメントを、機能的TATAボックスを包含
し、翻訳スタートコドンに接近した末端を有するPH05遺
伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロモーターエレ
メントに結合させることからなる。
本発明の好ましい態様では、プロモーターエレメントの
結合は合成リンカーを経て行われる。
PH05遺伝子以外のイースト遺伝子の上記下流プロモータ
ーエレメントは、主要mRNAスタートと翻訳スタートコド
ンとの間に拡がっている強力なイーストプロモーター、
例えば上述したものの１種を、エキソヌクレアーゼ、例
えばBal31で部分的に消化し、そして得られた５′平滑
末端を合成リンカーDNAに連絡することによって製造さ
れる。転写スタート部位およびTATAボックスを保持し、
TATAボックスに対して５′側の約50〜150基塩対の配列
を包含するプロモーターエレメントが選択される。選択
は、例えば得られたプロモーターエレメントを５′末端
で合成リンカー配列を認識している制限エンドヌクレア
ーゼにより、またプロモーターエレメントの３′末端で
合成リンカー配列を認識している制限エンドヌクレアー
ゼによって開裂し、そして得られたDNAフラグメントの
長さをアガロースゲル電気泳動を用いて測定することに
よって行われる。３′プロモーターエレメントは当業者
に既知の方法を用いて化学合成により製造することもで
きる。
本発明によるハイブリッドプロモーターはイースト中の
哺乳動物遺伝子の増進され、調節された発現に使用する
ことができる。
2.バイブリッドプロモーターのコントロール下異種ポリ
ペプチドをコードする遺伝子を含むハイブリッドベクタ
ー 本発明はまた１個または多重のDNA挿入を含むイースト
ハイブリッドベクターに関し、爾して各挿入はイースト
PH05のUASを伴う５′上流プロモーターエレメントおよ
び機能的TATAボックスを包含する転写開始部位を包含す
るPH05遺伝子以外のイースト遺伝子の３′下流プロモー
ターエレメントからなるハイブリッドプロモーターの転
写コントロール下にイーストに対して異種のポリペプチ
ドをコードしているDNA断片からなる。
本発明によるハイブリッドベクターはハイブリッドプラ
スミドおよび直鎖DNAベクターからなる群から選択され
る。
イーストに対して異種のポリペプチドをコードしている
DNA断片は種々のポリペプチドをコードしているDNA（遺
伝子）であり、これらのポリペプチドはグリコシル化ポ
リペプチド、特に高等真核生物、殊に哺乳動物、例えば
動物もしくは殊にヒト由来のもの、例えば栄養物の生産
のためにまた化学で酵素反応を達成するために使用し得
る酵素、あるいはヒトおよび動物の疾病の治療にまたは
その予防に有用で価値のある非酵素系ポリペプチド、例
えばホルモン、免疫調節、抗ウイルスおよび抗腫瘍作用
を有するポリペプチド、抗体、ウイルス性抗原、ワクチ
ン、凝固因子、食品等が包含される。
このようなポリペプチドの例には、インシュリン、成長
因子（例えば表皮、インシュリン様、マスト細胞、神
経）または形質転換成長因子、成長ホルモン例えばヒト
または牛成長ホルモン、インターロイキン例えばインタ
ーロイキン−１または−２、ヒトマクロファーシ遊走阻
止因子（MIF）、インターフェロン、例えばヒトα−イ
ンターフェロン（例えばインターフェロン−αＡ、α
Ｂ、αＤまたはαＦ）、β−インターフェロン、γ−イ
ンターフェロンあるいはハイブリッドインターフェロン
（例えばααＡ−αＤ−またはαＢ−α−Ｄ−ハイブリ
ッドインターフェロン）、肝炎ウイルス抗原、例えば肝
炎Ｂウイルス表面またはコア抗原あるいは肝炎Ａウイル
ス抗原、プラスミノーゲン活性化因子例えば組織プラス
ミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼ、腫瘍壊死因
子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドルフィン、免
疫グロブリン（例えば免疫グロブリンＤ、Ｅ、またはＧ
の軽鎖および（または）重鎖）、免疫グロブリン結合因
子、例えば免疫グロブリンＥ結合因子、カルシトニン、
ヒトカルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子、例えば
ファクターIVまたはVIII c、エグリン、例えばエグリン
Ｃ、デスルファトヒルデイン（例えばデスルファトヒル
デイン変異型HV1、HV2またはPA）、あるいはヒトスーパ
ーオキシドジムスターゼが包含される。好ましい遺伝子
はヒトα−インターフェロン、またはハイブリッドイン
ターフェロン、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−PA）、肝炎Ｂウイルス表面抗原（HBVsAg）、イン
シュリン様成長因子Ｉ、エグリンＣおよびデスルファト
ヒルデイン変異型HV1をコードしている遺伝子である。
ハイブリッドモーターは特に上に述べたものの一つであ
る。
本発明によるハイブリッドベクターは１個または多重の
DNA挿入を含有していてもよく、各挿入は就中ハイブリ
ッドプロモーターおよびイーストに対して異種のポリペ
プチドをコードしていDNA断片からなる。ハイブリッド
ベクターが多重DNA挿入、好ましくは２−４のDNA挿入を
含むときは、これらのものは直列配列でまたはハイブリ
ッドベクターの異なった位置に存在していてもよい。好
ましいハイブリッドベクターは１個のDNA挿入または直
列配列のDNA挿入を含有している。
本発明のハイブリッドベクターにおいて、イーストハイ
ブリッドベクターは実施可能なようにポリペプチドコー
ド領域に連結されてポリペプチドの有効な発現を確実に
している。本発明の好ましい一態様において、イースト
ハイブリッドプロモーターは接合部で挿入された翻訳ス
タートシグナル（ATG）を伴う成熟ポリペプチドのコー
ド領域に直接連結されている。イーストハイブリッドプ
ロモーターをポリブチドコード領域に結合している好ま
しい領域は内生（内在性）ATGに直に隣接している領域
である。
本発明の他の好ましい態様において、シグナル配列は構
成中に包含されている。適当なシグナル配列は例えばPH
05シグナル配列、イーストインベルターゼ遺伝子の配
列、あるいはα−ファクタープレープロ配列および発現
されるべきポリペプチドコード領域に自然に連結されて
いるシグナル配列である。あるいはまた、融合シグナル
配列を構築してもよい。シグナル配列と成熟ポリペプチ
ド配列との間の正確な開裂を可能とするこれらの組合せ
が好ましい。他の配列、例えば特定のプロセシングナル
を運んでいてもいなくともよいプローもしくはスペイサ
ー配列を、前駆体分子の正確なプロセシングを容易にす
るために構成中に包含させることもできる。あるいはま
た、融合蛋白質を発生させることもでき、これは生体内
または試験管内での適切な成熟を可能とする内部プロセ
シングシグナルを包含している。好ましくはプロセシン
グシグナルはLys−Arg残基を含有し、これは分泌経路に
よるイーストエンドペプチダーゼにより認識される。
遺伝子の発現に当り、遺伝子生成物は分泌経路に入り、
ペリプラスミックスペースに移送される。更に細胞壁を
通って培地中に排出されると、収率の相当な増大が可能
となる筈である。また、破壊すべき細胞を伴わないと、
採取方法は簡便化することができる。更にまた、ポリペ
プチドはＮ−末端での追加のメチオニンを伴わずして採
取することができる。それは成熟コード配列前の翻訳ス
タートシグナルとしてのATGの必要がないからである。
グリコシル化は分泌経路と組合さっているので、生成さ
れたポリペプチドはグリコシル化されているものと予想
される（但し、グリコシル化部位が存在することが条
件）。非グリコシル化ポリペプチドに対してグリコシル
化ポリペプチドがまさっているいくつかの特徴がある。
グリコシル化ポリペプチドは非グリコシル化ポリペプチ
ドよりも哺乳動物細胞からの純正なポリペプチドにより
よく類似している。更にまた、かかる蛋白質の３次構造
は多分グリコシル残基の存在にある程度依存するもので
ある。これらの分子に存在する炭水化物残基が化学的安
定性および薬理学的活性に好ましい影響を有しているも
のと予想される。
好ましくは、本発明のハイブリッドベクターは転写終了
およびポリアデニル化のための適切なシグナルを含むイ
ースト遺伝子の３′フランキング（flanking）配列をも
包含している。好ましい３′フランキング配列はイース
トPH05遺伝子の該配列であう。
本発明は、特に、イーストPH05遺伝子のUASを伴う５′
上流プロモーターエレメントと機能的TATAボックスを包
含する転写開始部位を包含するPH05遺伝子以外のイース
ト遺伝子の３′下流プロモーターエレメントとからなる
ハイブリッドプロモーター、前記バイブリッドプロモー
ターでコントロールされており、イーストに対して異種
のポリペプチドをコードしているDNA断片、ならびに適
切に配置されたイーストPH05遺伝子の転写終了シグナル
を含むDNA断片から本質的になる、直鎖状DNA分子に関す
る。
相同の３′および５′フランキング配列により、ポリペ
プチドコード領域を包含する全体の直線状DNAベクター
はイースト染色体中のPH05遺伝子座において安定して一
体化されている。
本発明は、特に、ハイブリッドプロモーターとは別に、
ポリペプチドコード領域および３′フランキング配列が
追加のDNA配列を含有している環状ハイブリッドプラス
ミドに関し、これらの追加のDNA配列はプロモーターの
機能すなわちポリペプチドコード領域の発現に対しては
必須でないかまたは重要性がより少ないものであるが、
例えば前記ハイブリッドベクターで形質転換されたイー
スト細胞の増殖に当り重要な機能を果たすこともある。
追加のDNA配列は原核生物および（または）真核生物細
胞から誘導され、そして染色体および（または）染色体
外のDNA配列を包含していてもよい。例えば、追加のDNA
配列はプラスミド、例えば細菌もしくは真核生物プラス
ミドDNA、ウイルスDNA、および（または）染色体DNA例
えば細菌、イーストまたは高等真核生物染色体DNAから
発していてもよい（またはそれらからなる）。好ましい
ハイブリッドプラスミドは細菌プラスミド、殊にエッシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）プラスミドpBR322
または関連プラスミド、バクテリオファージλ、イース
ト２μプラスミドおよび（または）イースト染色体DNA
から誘導される追加のDNA配列を含有している。
特に、追加のDNA配列はイースト複製オリジンおよびイ
ーストのための選択的遺伝的標識（遺伝的マーカー）を
担有している。イースト複製オリジン、例えば染色体自
律複製断片（ars）を含むハイブリッドプラスミドは、
形質転換後イースト細胞内に染色体外として維持され、
そして有糸分裂で自律複製される。イースト２μプラス
ミドDNAに相同な配列を含むハイブリッドプラスミドも
同じく使用することができる。これらのハイブリッドプ
ラスミドは細胞内に既存の２μプラスミド中に組換えさ
れることにより一体化し、そして自律複製する。２μ配
列は高頻度形買転換プラスミドに特に適していて、高い
コピーナンバーを生じる。
イーストの選択性遺伝的マーカーについては、マーカー
の表現型発現の故に形質転換体の選択を容易にするいず
れのマーカー遺伝子をも使用することができる。イース
トの適当なマーカーは特に抗生物質耐性を発現している
もの、あるいは、栄養要求イースト変異種の場合、宿主
遺伝的欠陥を相補する遺伝子である。相当する遺伝子
は、例えば抗生物質シクロキシイミドに対して耐性を付
与するか、または栄養要求イースト変異株にプロトトロ
ピーをもたらす、例えばURA3、LEU2、HIS3またはTRP遺
伝子である。マーカーとして自律複製断片と組合されて
いる構造遺伝子を使用することも可能である（但し、形
質転換される宿主がマーカーで発現される生成物に対し
て栄養要求変異株であることが条件）。
有利には、本発明のハイブリッドプラスミドに存在する
追加DNA配列はまた複製オリジンおよび殺菌宿主、特に
エッシェリヒア・コリの選択的遺伝的マーカーを包含し
ている。E.コリ複製オリジンおよびイーストハイブリッ
ドベクター中のE.コリマーカーの存在と組み合わさって
有用な特徴がある。まず、E.コリでの生育および増幅に
より大量のハイブリッドベクターDNAを得ることがで
き、また第二にハイブリッドベクターの構築は、E.コリ
に基づくクローニング技術の全レパートリーを利用して
E.コリで都合よく行われる。抗生写質、例えばテトラサ
イクリンおよびアンピシリンに対する耐性を付与するE.
コリ遺伝子マーカーおよびE.コリ複製オリジン両者を含
むE.コリプラスミド、例えばpBR322等は、イーストハイ
ブリッドベクターの部分として有利に使用される。
例えば複製オリジンならびにイースおよび細菌宿主のた
めの遺伝的マーカー（上記参照）を含む追加DNA配列を
以下「ベクターDNA」と称し、このものはイーストプロ
モーターおよびポリペプチドコード領域と共に本発明の
ハイブリッドプラスミドを形成している。
好ましい態様では、本発明は、イーストハイブリッドプ
ロモーターおよび異種ポリペプチドをコードしているDN
A配列からなり、イースト宿主において複製および表現
型選択をなし得るハイブリッドプラスミドに関する。前
記DNA配列は、転写スタートおよび終了シグナルならび
に翻訳スタートおよびストップシグナルと共に、前記ハ
イブリッドプラスミド中に、形質転換されたイースト菌
株において前記ポリペプチドを生産するように発現され
るように、該ハイブリッドプロモーターのコントロール
下におかれている。
本発明のハイブリッドベクターは当該分野で既知の方法
によって製造される。例えば、イーストPH05遺伝子のUA
Sを伴う５′上流プロモーターエレメントと、機能的TAT
Aボックスを包含する転写開始部位を包含するPH05遺伝
子以外のイースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメ
ントとからなるハイブリッドプロモーター、イーストに
対して異種のポリペプチドをコードしているDNA断片お
よびイースト遺伝子の３′フランキング配列を連結し
て、前記DNA断片が前記ハイブリッドプロモーターの転
写コントロール下にあるように、そして任意に生産され
た１個またはそれ以上の直鎖状DNAをベクターDNAに導入
することによって製造される。
少なくとも１個の制限部位、好ましくは２個以上の制限
部位を有する好都合に地図のかかれた直線状または好ま
しくは環状ベクターDNA、例えば細菌プラスミドDNA等
（上述参照）を使用することができる。有利には、ベク
ターDNAは既に複製オリジンおよびイーストおよび（ま
たは）細菌宿主のための遺伝的マーカーを含有してい
る。ベクターDNAは適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて開裂される。制限されたDNAを就中イーストハイブ
リッドプロモーターを含む直線状DNAフラグメントに、
そしてポリペプチドをコードしているDNA断片に結合さ
せる。ハイブリッドプロモーターおよびポリペプチドコ
ード領域の連結前後（あるいは同時にも）に、複製オリ
ジンおよび（または）イーストもしくは殺菌宿主のマー
カーを導入することも可能である。いずれにしても、制
限およびアニーリング条件は、ベクターDNAとハイブリ
ッドプロモーターの本質的な機能を干渉しないような仕
方で選択しなければならならい。ハイブリッドベクター
は順次構成されてもよいし、または関係のある全配列を
含む２つのDNA断片を結合させることによって構成され
てもよい。
試験管内でDNA断片を接合するのに種々の技術を使用す
ることができる。ある種の制限エンドヌクレアーゼによ
り生成される平滑末端（完全に塩基対となっているDNA
二重らせん）を直接T4DNAリガーゼで結合してもよい。
より普通には、DNA断片を一本鎖付着端を経て連結し、
そしてDNAリガーゼ例えばT4DNAリガーゼにより共有閉鎖
する。このような一本鎖「付着末端」は、DNAを食違い
末端を生じる他の組のエンドヌクレアーゼで開裂するこ
とによって形成することができる（DNA二重らせんの二
本の鎖は二、三のヌクレオチドの距離で異った点で開裂
される）。一本鎖はまた末端トランスフェラーゼを用い
てヌクレオチドを平滑末端もしくは食違い末端に付加す
ることにより（「ホモポリマーテイリング」）、あるい
は平滑末端をもつDNA断片の一本の鎖を適当なエキソヌ
クレアーゼ例えばλ−エキソヌクレアーゼで単にかみも
どすことにより形成させることもできる。食違い末端の
生成のための更に好ましいアプローチは、平滑末端をも
つDNA断片に、食違い末端を形成するエンドヌクレアー
ゼのための認識部位を含む化学的に合成されたリンカー
DNAを結合させ、生ずるDNAを各エンドヌクレアーゼで消
化することにある。
有効に発現されるために、遺伝子は転写（イーストハイ
ブリッドプロモーター）および翻訳機能を含む配列に関
して適正に位置していなければならない。まず、ハイブ
リッドプロモーターを包含するDNA断片とポリペプチコ
ード領域との結合は適正な配向で行われなければならな
い。二つの配向が可能なときは、正しい方を通常の制限
分析によって定める。誤って配向されたポリペプチド遺
伝子挿入を含むハイブリッドベクターは、適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで遺伝子挿入を切除し、そして遺伝子
をハイブリッドベクターフラグメンと再結合することに
よって再配向する。いずれにしても、末端に異った制限
部位をそれぞれ有する２種のDNA断片を結合することに
よって不適切な配向は避けられる。更にまた、ハイブリ
ッドベクターの構成は正しい転写開始、終了を可能とす
るような方法で行われなければならない。後者の点につ
いては、転写は好ましくはイースト染色体DNAまたはイ
ースト２μプラスミドから誘導されるDNAで終るべきで
ある。第二に、適切なリーデングフレームが確立されな
ければならない。有利には、転写はイースト遺伝子、例
えばPH05またはTRP1の転写終了シグナルを含むDNA配列
で終る。通常、プロモーター領域およびポリペプチド領
域のヌクレオチド配列は結合前に知られており、または
容易に定められるので、正しいリーディングフレームを
確立するのに問題はない。
成熟ポリペプチドの直接発現が所望されるときは、シグ
ナル配列またはその部分（ハイブリッドプロモーター領
域に任意に続いているか、そして／または成熟ポリペプ
チドコード領域に任意に先行している）を、例えばエキ
ソヌクレアーゼ（例えばBal31）で消化して除去してお
く必要がある。イーストプロモーターをポリペプチドコ
ード配列に直接結合するための好ましい領域は主要mRNA
スタートとATG翻訳スタートコドンとの間にある。この
領域で接合するには、ポリペプチドコード配列は翻訳開
始のためのそれ自体のATGを有していなければならない
か、そうでないときは追加の合成オリゴヌクレオチドを
用意する必要がある。イーストハイブリッドプロモータ
ーはまた、結合分子として合成オリゴテオキシヌクレオ
チドによってポリペプチドコード配列に連結してもよ
い。それで、ハイブリッドプロモーター領域は、可能な
らばその３′末端に制限してもよく、その結果所定の数
の塩基対を欠除する。同様に、ポリペプチドコード配列
はその５′−末端近くに制限されてもよい。次に、合成
オリゴデキオシヌクレオチドを、結合オリゴデオキシヌ
クレオチドを介してイーストハイブリッドプロモーター
とポリペプチドコード配列を連結するとき、失われた塩
基対がATG翻訳開始シグナルを包含して回復し、そして
ポリペプチドコード配列がプロモーターに関連して適性
なリーデングフレームにあるような方式で構成すること
ができる。
所望のハイブリッドベクターを含む結合混合物は直接形
質転換工程に用いられ、あるいはまず例えば電気泳動に
よってハイブリッドベクターを富化し、そして次に形質
転換に用いる。
中間生成物、例えば本質的な機能の一つまたはそれ以上
をなお欠除しているベクター、ならびに本発明の最終ハ
イブリッドベクターは、上述の理由から任意に細菌宿主
特にE.コリに形質転換される（例えば、中間生成物およ
びハイブリッドプラスミドの大量生産）。殺菌ベクター
（例えばE.コリプラスミドpBR322）、および殺菌複製オ
リジンおよび遺伝的マーカーを含むそのフラグメント
は、かかる理由から最も好ましいベクターである。この
殺菌ベクターを用いる場合、イーストハイブリッドベク
ター製造の最終工程はイーストの遺伝子マーカーおよび
複製オリジンの導入をも包含している。
3.ポリペプチドコード配列を含有するハイブリッドベク
ターによるイーストの形質転換 本発明の別の特徴は、イーストに対して異種のポリペプ
チドを生産し得る形質転換されたイースト細胞の製法を
包含し、この方法はイースト細胞を１個または多重のDN
A挿入を含むハイブリッドベクターで形質転換すること
からなり、各挿入は、イーストPH05遺伝子のUASを伴う
５′上流プロモーターエレメントと、機能的TATAボック
スを包含する転写開始部位を包含するPH05遺伝子以外の
イースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメントとか
らなるハイブリッドプロモーターの転写コントロール下
に、イーストに対して異種のポリペプチドをコードして
いるDNA断片を包含している。
有用なイーストにはサッカロミセス（Saccharo−myce
s）、クルイヴェロミセス（Kluyveromyces）、カンジダ
（Candida）、ロドトルラ（Rhodotorula）、トルロプシ
ス（Torulopsis）属および関連した属の種が包含され
［J.ロッダー（Lodder）、「ザ・イースト」（The Yeas
ts）、アムステルダム、1971年］、特にサッカロミセス
・セレヴィシエの菌株があげられる。
ハイブリッドベクターでのイーストの形質転換は当該分
野で既知の方法、例えば、ヒネン（Hinnen）等［プロ
ク．ナツル．アカド．サイ、USA、第75巻、第1929頁、
（1978年）］によって記載の方法に従って行うことがで
きる。この方法は次の３工程に分けることができる。
（１）イースト細胞壁またはその部分の除去。
（２）PEG（ポリエチレングリコール）およびCa2+イオ
ンの存在下、形質転換DNAにより「裸の」イースト細胞
（スフェロプラスト）の処理。
（３）細胞壁の再生および寒天の固体層での形質転換さ
れた細胞の選択。
好ましい方法： ad（１）；イースト細胞壁を、種々のグルコシダーゼ製
剤、例えばカタツムリ腸液［例えば、グルスラーゼ（Gl
usulase）またはヘリカーゼ（Helicase）、あるいは浸
透圧的に安定化された溶液（例えば1Mソルビット）中の
微生物から得られる酵素混合物［例えばチモリアーゼ
（Zymolyase）］を用いて酵素的に除去する。
ad（２）：イーストスフェロプラストをPEGの存在下で
凝集させ、そして細胞質膜の局所融合を誘起する。「融
合様」条件の発生は重大であり、そして多くの形質転換
されたイースト細胞は形質転換の過程でデイプロイド
（diploid）またはトリプロイド（triploid）にさえな
る。融合スフェロプラストの選択を可能とする操作は形
質転換体を富化するのに使用することができる。すなわ
ち、形質転換された細胞は予備選択された融合生成物の
間で容易にスクリーニングすることができる。
ad（３）：細胞壁を伴わないイースト細胞は分裂しない
ので、細胞壁が再生されなければならない。この再生は
通常スフェロプラストを寒天に埋込むことによって行わ
れる。例えば、溶融寒天（約50℃）をスフェロプラスト
を混合する。溶液をイースト生育温度（約30℃）に冷却
すると、固定層が得られる。この寒天層はスフェロプラ
ストから必須巨大分子の急速な拡散および損失を防止
し、そしてこれによって細胞壁の再生を容易にするもの
である。しかしながら、細胞壁再生はまた予備形成され
た寒天層の表面にスフェロプラストをプレートとするこ
とによって得られる（効率はより低いが）。
好ましくは、再生寒天は形質転換された細胞の再生およ
び選択を同時に可能とするような方法で製造される。ア
ミノ酸生合成経路の酵素をコードしているイースト遺伝
子は一般に選択性マーカー（上述）として使用されるの
で、再生は、好ましくはイースト最小培知寒天で達成さ
れる。非常に高い再生効率が要求されるときは、次の２
工程の操作が有利である：（１）栄養豊富な複合培地で
の細胞壁の再生および（２）細胞層を選択性寒天プレー
トにレプリカ平板とすることによる形質転換された細胞
の選択。
ハイブリッドベクターがマーカー遺伝子を含有していな
いときは、形質転換された細胞はまた代替的方法によっ
て同定することができる。このような方法は、例えば、
ハイブリッドベクターの配列と相同性の標識DNAフラグ
メントによる正常部位（in situ）雑種形成［例えば、
ヒネン等による、上述］、正常イムノアッセイ（但し導
入遺伝子の生成物の抗体が入手可能な場合）あるいは形
質転換性プラスミドによりコードされている遺伝子生成
物を測定するその他のスクリーニング方法が包含され
る。
あるいはまた、イーストは本発明によるハイブリッドベ
クターおよびイーストのための遺伝的マーカーを含有す
る第二のベクターで共形質転換（co−transformed）す
ることができる。２種の異ったベクターが共通したDNA
配列を有するときは（これはベクターに存在するバクテ
リアル配列（bacterial sequences）であり得る）、組
換えは融合選択可能なハイブリッド分子となるように生
じる。
イーストはまた、イーストハイブリッドプロモーター、
前記ハイブリッドプロモーターによりコントロールされ
る異種ポリペプチドコード領域およびイーストPH05遺伝
子の転写終結シグナルからなる直鎖DNAベクターならび
にイーストのための選択的マーカーを含むベクターで共
形質転換することもできる。共形質転換により、直接選
択することのできないDNAをとりあげたイースト細胞に
対して富化を行い得る。コンピテント細胞は任意のタイ
プのDNAをとり上げるので、選択的ベクターで形質転換
された細胞の高い％は任意の追加のDNA（例えば上記直
線DNA）をもとり込む（harbor）。十分に長い相同の配
列（例えば長さ約20−100のデオキシヌクレオチド）に
より、ポリペプチド遺伝子は安定して宿主染色体と一体
化される。本発明の特定の構成はPH05遺伝子の染色体の
位置で、すなわちイースト染色体IIで相同遺伝子との安
定な一体化を与える。
本発明によるハイブリッドプラスミドを含む得られたイ
ースト菌株は、当該分野で既知の方法を用いて当然変異
および選択により異種ポリペプチドの生産に当り改善さ
れている。突然変異は例えばUV照射によりまたは適当な
化学薬剤によって行うことができる。
本発明によるハイブリッドベクターによる形質転換およ
び炭素源としてグルコースを含む栄養に富んだ培地での
細胞壁の再生は、好都合に行うことができ、また、細胞
内に潜在的な致死遺伝子生成物の蓄積を防止するために
グルコースを含まない培地で行わなければならないグル
コースで誘起され得る通常のプロモーターを含むハイブ
リッドベクターで行なわれる対応する工程よりも、実質
的に容易であることがわかる。
本発明はまたハイブリッドベクターで形質転換されたイ
ースト宿主に関し、該ベクターは１個または多量のDNA
挿入を含有し、各挿入は、イーストPH05遺伝子のUASを
伴う５′上流プロモーターエレメントと、機能的TATAボ
ックスを包含する転写開始部位を包含するPH05遺伝子以
外のイースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメント
とからなるハイブリッドプロモーターの転写コントロー
ル下に、イーストに対して異種のポリペプチドをコード
しているDNA断片を包含し、またその突然変異体に関す
る。
4.形質転換されたイースト細胞の培養および発現ポリペ
プチドの単離 更に本発明はイーストに対して異種のポリペプチドを生
産する方法に関し、本発明の方法は、一つまたは多重DN
A挿入を含むハイブリッドベクターで形質転換されたイ
ースト菌株（而して各挿入は、イーストPH05遺伝子のUA
Sを伴う５′上流プロモーターエレメントと、機能的TAT
Aボックスを包含する転写開始部位を包含するPH05遺伝
子以外のイースト遺伝子の３′下流プロモーターエレメ
ントとからなるハイブリッドプロモーターの転写コント
ロール下に、イーストに対して異種のポリペプチドをコ
ードしているDNA断片からなる）またはその突然変異体
を培養し、そして発現ポリペプチドを単離することを特
徴とする。
本発明による形質転換されたイースト細胞は、炭素、窒
素、無機塩の同化可能な源および必要に応じて生育促進
物質を含む液体培地中で当業者に既知の方法で培養す
る。
種々の炭素源が使用可能である。好ましい炭素源の例に
は同化可能な炭水化物、例えばグルコース、マルトー
ス、マンニットまたはラクトース、あるいは酢酸塩、例
えば酢酸ナトリムウがあり、これらは単独または適当な
混合物で使用することができる。適当な窒素源には、例
えばアミノ酸、例えばカサミノ酸、ペプチドおよび蛋白
質およびそれらの分解産物、例えばトりプトン、ペプト
ンまたは肉エキス、更には酵母エキス、麦芽エキス、コ
ーン・スチープ・リカー、ならびにアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムまたは硝酸ア
ンモニウムが包含され、これらは単独でまたは適当な混
合物で使用することができる。使用し得る無機塩には、
例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカル
シウムの硝酸塩、塩化物、りん酸塩、および炭酸塩が包
含される。更に、栄養培地はまた成長促進物質を含有し
ていてもよい。成長を促進する物質には、例えば成長促
進剤、微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、あるい
は個々のアミノ酸が包含される。
本発明によるハイブリッドプロモーターは調節されてい
るので、栄養培地の組成は生長相に適合するようにしな
ければならない。生長期の間に、高ホスフェート濃度下
で本発明によるハイブリッドプロモーターは実質的に低
減される。例えば、PH05のUASを伴うPH05の５′上流プ
ロモーターエレメントと、TATAボックスを伴うGAPDHの
３′下流プロモーターエレメントとを包含する本発明の
最も好ましいハイブリッドプロモーターは、これらの条
件下では約50培に低減してしまう。従って、潜在的に有
毒な遺伝子生成物は極めて低い率で合成されるだけであ
り、そして細胞代謝に対する有毒な効果が最小限とな
る。十分な細胞密度に達したときに、栄養培地中の無機
りん酸塩レベルが好ましくは低下する（低Pi培地）。こ
こで、本発明によるハイブリッドプロモーターは上昇し
（抑制解除され）、そしてmPNAトランスクリプトの最高
レベルが得られる。
培養は通常の技術を用いて行われる。培養条件、例えば
温度、培地のpHおよび醗酵時間は、所望のポリペプチド
の最高レベルが生成されるような方法で選択される。一
般に、生育は、好気条件下振とうもしくはかくはんを伴
う深部培養で約25−35℃で温度で４−８のpH値、例えば
約pH7で、約４−20時間、好ましくは所望の蛋白質の最
大収率に達するまで行われる。
所望により、発現ポリペプチドの単離、精製は当業者に
既知の方法に従って行われる。
形質転換された細胞が好都合な細胞密度に生育した後、
発現蛋白質の採取のための第一工程は細胞内部から蛋白
質を遊離させることにある。たいていの操作では、細胞
壁をまず例えばグルコシダーゼによる酵素的消化により
除去する。次に得られたスフェロプラストを洗浄剤、例
えばトライトン（Triton）で処理する。あるいはまた、
機械的力、例えばせん断力（例えばＸ−プレス、フレン
チ−プレス）あるいはガラスビーズとの振とうが細胞を
破壊するのに適している。得られた混合物を通常の手
段、例えばポリエチレンイミンでの処理により非蛋白質
性材料の大部分の除去、硫酸アンモニウムまたはトリク
ロロ酢酸による溶液の飽和による蛋白質の沈殿、ゲル電
気泳動、透析、クロマトグラフィー、例えばイオン交換
クロマトグラフィー、サイズ−排除クロマトグラフィ
ー、HPLCまたは逆相HPLC、適当なセファデックス（Seph
adex）カラムでの分子サイジング等によって、所望のポ
リペプチドについて富化する。予備精製された生成物の
最終精製は、例えば抗体親和クロマトグラフィーを用い
て達成される。
所望のポリペプチドがイースト細胞により細胞壁間のス
ペースに分泌された場合、簡易化プロトコールを使用し
得る。ポリペプチドは細胞壁の酵素的除去により、ある
いは化学薬剤、例えばチオール試薬またはEDTAによる処
理により（ポリペプチドを放出せしめる細胞壁損傷を生
じ得る）、細胞溶解なしに採取することができる。ポリ
ペプチドが培地中に分泌される場合は、そのものは直接
培地から採取することができる。
得られたグリコシル化および未グリコシル化蛋白質の混
合物は、例えばコンカナバリン−Ａセファロース（Seph
arose）カラムでのクロマトグラフィーにより分離する
ことができる。未グリコシル化生成物はカラムを通過
し、これに対してグリコシル化生成物は選択的に吸着さ
れ、そして通常の手段、例えばケイオトロピック剤（ch
aotropicagent）例えばKSCNと組合せたα−メチルマン
ノミドで溶出することができる。
グリコシル残基は酵素的に、例えばエンドグリコシダー
ゼＨまたはＦの作用により、除去することも可能であ
る。この方法により実質的に純粋な形態で未グリコシル
化生成物の生産が可能である。
本発明は更に本発明の方法に従って製造されるポリペプ
チドに関する。
本発明は特にPH05の上流活性配列、ハイブリッドプロモ
ーター、ハイブリッドベクター、形質転換されたイース
ト細胞およびそれらの製法ならびに実施的に記載の如く
イーストに対して異種のポリペプチドの製法に関する。
以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのもので
あるが、本発明を限定するものと解すべきではない。
実験の部 実施例1:PH05プロモーター欠失の構成 ａ）Bal31消化 第１図に示したPH05のBamH I−Sal Iフラグメントを含
む組換えファージM13mp9/PH05Bam−SalをPH05プロモー
ターの源として使用する（欧州特許出願第143,081号参
照）。ファージDNA（RF;複製型）20μｇを制限エンドヌ
クレアーゼSal Iで消化すると約9kbの直鎖DNAが得られ
る。フェノール／クロロホルムで抽出後、DNAをエタノ
ールで沈殿させる。DNAを0.5μg/mlの濃度で10mMトリス
pH8.0に再懸濁する。Sal I開裂DNA16μｇを20mMトリスp
H8.0、199mM NaCl、12mM MgCl2、12mM CaCl2および1
mM EDSTAの100μ中の2UのエキソヌクレアーゼBal31
（BRL）で消化する。各２μgDNAアリコートを30℃での
培養１、２、３、４、５および６分後に取り出し、そし
て直ちにフェノール50μおよびTNE60μと混合す
る。フェノール／クロロホルムでの抽出およびエタノー
ル沈殿後、DNAを100μg/mlの濃度で10mMトリスpH8.0に
再懸濁する。Bal31によるエキソヌクレアーゼによる開
裂の程度を分析するために各時点からのDNA0.5μｇをエ
ンドヌクレアーゼBamH Iで消化し、そしてトリスほう酸
塩緩衝剤、pH8.3（90mMトリス・HClpH8.3、90mMほう
酸、2.5mMEDTA）中と1.5％アガロースゲルで分析する。
Bal31消化の１分当り、フラグメントの各末端から平均
して100bpが除去される。
ｂ）Bal31処理DNAに対するEcoR Iリンカーの付加 EcoR Iリンカー（５′−GGAATTCC−３′、BRL）の2A260
ユニットを10mMトリス、pH8、1mM EDTAの250μに再
懸濁する。EcoR Iリンカーの２μｇを60mMトリス、pH7.
5、10mM MgCl2、15mM DDT、10μＭ ATPおよび33UのT
4ポリヌクレオチドキナーゼ〔ベーリンガー（Boehringe
r）〕の75μ中でキナーゼ処理する。37℃で１時間
後、混合物を室温に冷却し、次に−20℃で保存する。
アニーリングした二本鎖のEcoR Iリンカーを平滑末端で
Ba131処理DNAフラグメントに結合させる。Ba131処理DNA
（実施例1a参照）の0.5μｇを60mMトリスpH7.5、10mM
MgCl2、10mM DTT、4mM ATPおよび600UのT4DNAリガー
ゼ〔バイオラブズ（Biolabs）〕の20μ中で50倍過剰
のキナーゼ処理EcoR Iリンカーと室温で16時間培養す
る。T4DNAリガーゼの失活後（65℃で10分間）、過剰のE
coR Iリンカーを50μ容量で50UのEcoR I（ベーリンガ
ー）で開裂する。DNAをフェノール／クロロホルムで抽
出し、エタノールで沈殿させ、そして10mMトリス、1mM
EDTA（＝TE）に再懸濁する。次に、DNAを五単位のBamH
I（バイオラブズ）で開裂し、そして混合物をトリス−
ほう酸塩緩衝剤（上述のところを参照）中の1.5％低融
点アガロースゲル〔シグマ（Siguma）〕に適用する。バ
ンドをエチジウムプロマイドで染色し、そして366nmで
長波UV光下で可視化する。約100bpと600bpとの間の広い
拡散バンドパターンをゲルから切りとし、そしてDNAを
次の如くして抽出する。アガロースの片を65℃で液化
し、500mM NaClに調整し、そして65℃で20分間培養す
る。フェノール１容量（10mMトリス・HCl pH7.5、1mM
EDTA、500mM NaClで平滑化した）を加える。水相を
フェノールで２回そしてクロロホルムで１回再抽出す
る。DNAを冷無水エタノール2.5容量で沈殿させ、そして
遠心分離で採集する。DNAペレットを冷80％エタノール
で洗い、次に真空乾燥する。DNAを10μ TEに再懸濁す
る。
ｃ）M13mp9への結合 M13mp9のRFの３μｇを50μ容量でEcoR I（バイオラブ
ズ）15単位およびBamH I（ベーリンガー）15単位で消化
する。フェノール抽出およびエタノール沈殿後、DNAを5
0μ TEに再懸濁する。切断ベクターDNA5μ（約200
ng）を上記試料（実施例1bに記載した種々のBa131消化
物から得られるDNAフラグメント）10μと混合し、15
時間、60mMトリス/HCl、pH7.5、6mM MgCl2、10mM DT
T、1mM ATPおよび200UのT4DNAリガーゼの存在下、20μ
の総容量で結合させる。菌株E.コリ（E.coli）JM101
の能力細胞の形質導入は、ニュー・イングランド（New
England）バイオラブズで刊行されたマニュアル「M13ク
ローニング・アンド・シークェンシング・システム」
（M13cloning and sequencing system）に従って行う。
多数の白色プラークからのファージが生長し、そして制
御酵素EcoR IおよびBamH Iでの開裂によってそれらのDN
A挿入のサイズを分析する。
ｄ）サンガー（sanger）配列決定によるBal31欠失終点
の測定（Sal I部位からの欠失） 上記アニュアルに記載の如くサンガー等〔プロク．ナシ
ナル．アカド．サイ、USA（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、第74巻、第5463頁、1977年〕のジデオキシDNA配列
システムを用いて塩基配列決定を行う。欠失終末点を以
下に示す。
ｅ）サンガー配列決定によるBal31欠失終末点の測定（B
amH I部位からの欠失） M13mp9 PH05 Bam−SalをBamH Iで切断する以外はａ−
ｃに記載の如く同じようなセットのBal31の欠失を行
う。Bal31消化分子をEcoR IおよびSal Iで切断し、そし
て発生したフラグメントをEcoR IをおよびSal Iで消化
したM13mp9にクローニングする。欠失終末点を以下に示
す。
ｆ）内部PH05プロモーター欠失の構成 ｄ）で記載したBal31欠失セットでは末端がEcoR I部位
である「左手」PH05プロモーターフラグメントが生成
し、またｅ）で記載したBal31欠失セットではEcoR I部
位が未端である「右手」RH05プロモーターフラグメント
が生成する。種々の位置の「左手」および「右手」を組
合せることにより、欠失DNAの部位にEcoR Iリンカー断
片を含有する内部欠失が生成される。個々の内部欠失
は、制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびBamH I（左
手）またはEcoR IおよびSal I（右手）によるM13mp9誘
導体から「左手」および「右手」を切断し、そしてｂ）
に記載の如く軟アガロースゲル電気分解を経て相当する
フラグメントを単離することによって構成される。等モ
ル量の「左手」「右手」および200ngのBamH IおよびSal
I消化M13mp9ベクターDNAをｃ）に記載の如く結合す
る。E.コリJM101に形質導入した後白色プラークをとり
上げ、RFを生成させ、そして制限分析（BamH I、Sal
I、EcoR I）により分析する。次の手が結合されて特定
の内部欠失（第１図参照、ヌクレオチドの番号付け）が
生成される。
実施例2:PH05プロモーターの内部欠失の生体内分析 実施例1f）に記載した種々の欠失を、野生型PH05Bam−S
alフラグメントを欠失バージョン（version）で置き換
えることによりプラスミドpJDB207/PH05〔R.ハグエナウ
エル−ツアピス（Haguenaner−Tsapis）およびA.ヒネン
（Hinnen）、モレキュラ・アンド・セルラ・バイオロジ
イ（Molecular and Cellular Biology）、第４巻、第26
68−2675頁、1984年〕にクローニングする。イースト菌
株S.セレヴィシエ（S.cerevisiae）AH216（欧州特許出
願第143,081号参照）の形質転換後、酸ホスファダーゼ
活性をトエ（Toh−ｅ）等により記載されたようにして
〔J.バクテリオル（Bacteriol）、第113巻、第727頁、1
973年〕測定する。欠失△11および△12は約10倍のPH05
活性の減少を示し、そしてPH05発現に必須である上流領
域（「上流活性部位」、UAS）を定義する。同じような
低下効果が欠失△17（約５倍の減少）およびTATAボック
ス欠失△23−△26（約30倍の減少）について認められ
る。他の全ての欠失はほぼ野生型レベルの活性を示す。
これらの結果から、PH05の発現のための必須情報の３領
域が次の位置に存在していることをが示唆される。
1.位置−349と−383との間（UAS1） 2.位置−225と−263との間（UAS2） 3.位置−87と−125との間（TATAボックス） PH05のUAS1またはUAS2またはUAS1とUAS2を含有するフラ
グメントは、適当なエンドフクレアーゼで開裂すること
により組換えファージM13mp9/PH05Bam−Sal（実施例１
参照）から生産することができる。
UAS1は次の式を有する268bp BamH I−Cla Iフラグメン
トに含まれている。
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTG
GAAGTCATCTTATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGT
CGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTG
TCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCA
ACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATA
GGCAATCTCTAAATGAAT, UAS2は次の式を有する100bp Cla I−Bst IIIフラグメ
ントに含まれている。
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATG
ATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG UAS1およびUAS2共に次の式を有する368bp BamH I−Bst
E IIIフラグメント中に存在している。
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTG
GAAGTCATCTTATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGT
CGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTG
TCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCA
ACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATA
GGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTA
GCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACA
TGCCAAATTATCAAATTG. 実施例3:融合PH05−GAPDHハイブリッドプロモーターの
構成 実施例１および２では、PH05遺伝子の位置−365のまわ
りの領域〔UAS1（PH05）〕および位置−180のまわりの
別の領域〔UAS2（PH05）〕を調整機能を有するUASのた
めの可能な候補とする。UAS1（PH05）は268bp BamH I
−Cla Iフラグメント中に含まれ、一方UAS1（PH05A）お
よびUAS2（PH05）両者は368bp BamH I−BstE IIフラグ
メント中に含有される。これらの二つのフラグメントは
各々GAPDHのTATAボックスおよび転写開始部位を包含す
る２種の異ったGAPDH下流プロモーターエレメントに融
合される。
ａ）イースト遺伝子ライブラリーの構成 野生型サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces
cereviside）菌株S288Cからの総高分子量イーストDNA
〔M.V.オルセン（OIsen）等、J.モル、ビオル（J.Mol.B
iol.）、第132巻、第387頁、1979年〕30μｇを供給業者
の指示の如くEcoR Iメチル化緩衝剤250μ中ECoR Iメ
チラーゼ（ニューイングランド、バイオラブズ）２単位
と共に37℃で30分間培養する。DNAをエタノールで沈殿
させ、25mMトリス・HClpH8.5、2mM MgCl2（EcoRI＊緩
衝液）〔H.メイヤー（Meyer）、FEBSLett.、第90巻、第
341頁、1979年〕500μに再懸濁し、DNAフラグメント
のサイズ分布が30−50kb範囲の最大値を有するまでEcoR
I（ベーリンガー）で消化する（λDNAのXho I消化によ
り適当な33kbおよび17kbマーカーが提供される）。EcoR
I＊条件下で消化したイーストDNAをSW40ローターで3
8′000rpmで６時間ショ糖勾配（10mMトリス・HCl pH7.
5、1mM EDTA）でサイズ分別する。30フラクション、各
0.4mlを、勾配のトップから集める。フラクション16は
サイズ30−40kbのDNAフラグメントを含有している。こ
のフラクションのDNA（３μｇ）をエタノールで沈殿さ
せ、そしてEcoR Iで直線化したコスミッドベクターpYcl
〔B.ホーン（Hohn）等、「ゼネティック・エンジニアリ
ング（Genetic Engineering）」、第２巻、第169頁、ニ
ューヨーク1980年〕の1.μｇに総量15μ中で結合させ
る。結合は供給業者が記載している緩衝剤を用いて300U
T4 DNAリガーゼ（ニューイングランドバイオラブ
ズ）で実施する。DNAを試験管内でバクテリオファージ
λ〔B.ホーン．「メソド・イン・インチモロジイ」（Me
thodsin Enzymology）、第68巻、第299頁、ニューヨー
ク1979年〕にパッケージする。組立ファージを用いてE.
コリ菌株HB101（▲ｒ ｋ▼、▲ｍ ｋ▼、leu 、pro
、recA）に形質導入する。形質導入の効率はpYclベク
ター１μｇ当り約5000アンピシリン耐性コロニーであ
る。
3000ampRコロニーをとりあげ、100μg/mlアンピシリン
を含有するLB培地〔10gバクト（Bacto）−トリプトン
〔ディフコ（Difco）〕、5gバクト・イースト・エクス
トラクト（Bacto Yeast Extract）（ディスコ）、10g
NaCl〕中マイクロタイターディッシュのウエルで個々に
生育させる。
ｂ）イーストGAPDH遺伝子の単離 上記の遺伝子ライブラリーを次の構造５′−GGTCCATCTT
CCACCGCCCC−３′を有する合成オリゴヌクレオチド〔板
倉等、J.アム．ケム．ソク（J.Am.Chem.Soc.）、第97
巻、第7327頁、1975年;J.F.M.デ・ローイ（de Rooij）
等、レクル・トラブ・キム・ペイス−バス（Recl.Trav.
Chim.Pays−Bas）、第98巻、第537頁、1975年、ホスホ
トリエステル法を用いて製造〕でスクリーニングする。
オロゴヌクレオチリ10μｇをマニアテイス（Maniatis）
等によって記載されている如く〔「モレキュラー・クロ
ーニング」（Molecular Cloning）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボ（Cold Spring Harbor Lab.）、1
982年、第125頁〕総50μ容量でT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ベーリンガー）γ−32P−ATP（3000Ci/m mol、
10μCi/μアメルシャム）10μを用いてキナーゼ処
理する。同じ筆者が記載している如く（上記文献、第31
2頁）コロニー交雑を行う。陽性コロニーをコダック（K
odak）Ｘ−5X線フィルムを用いるオートラジオグラィー
を用いて検定する。プラスミドDNA単離（欧州特許出願
第100,561号参照）によりGAPDHをコードしている2100bp
Hind IIIフラグメントを含むハイブリッドクローンが
生成する〔J.P.ホランド（Holland）等、J.ビオル．ケ
ム（J.Biol.Chem.）、第254巻、第9839頁、1979年〕。
クローニングされたDNAが真正であることの最終の立証
は、二重鎖DNAについてG.F.ホング（Hong）が報告して
いるジデオキシ塩基配列決定プロトコール〔バイオサイ
エンス・レポーツ（Bioscience Reports）、第１巻、第
243頁、1981年〕と組合せた上述のオリゴヌクレオチド
を用いるDNA塩基配列決定実験に由来する。クローニン
グされたGAPDH遺伝子はホーランド等によって報告され
ているpgap491と同じ塩基配列を有している〔J.ピオ
ル．ケム、第255頁、第2596頁、1980年〕。
ｃ）GAPDH下流プロモーターエレメントの製造（第２図
および第３図参照） GAPD遺伝子（第２図参照）のATGから−27乃至−675の位
置を包含する649bp Taq Iフラグメントを、上記ハイブ
リッドプラスミドをTaq I（ニューイングランドバイオ
ラブズ）で消化し、1.2％軟アガロースゲルでDNAフラグ
メントを分離し、そしてDNAを熱フェノールで抽出する
ことによって単離する（実施例１参照）。Taq Iフラグ
メントのクローニングはpBR322のCla I部位に行われ:pR
B322の１μｇを供給業者の指示どおりCla I（ニューイ
ングランドバイオラブズ）の３単位で開裂する。フェノ
ール処理され、切断されたベクター300ngを、総容量20
μでT4DNAリガーゼ200Uを用いて挿入DNA（649bp Taq
フラグメント）約300ngに結合させる。アンピシリン耐
性に対してE.コリHB101への形質転換を行う。プラスミ
ドDNAを制限分析〔Talq I、Dra I〕により製造し、分析
する。Taq Iフラグメントの配向はプラスミドのBamH I
部位と組合せた制限エンドヌクレアーゼDra Iを用いて
確認し、そしてpBR322のHind III部位に近い−675位のT
aq I部位を有するプラスミドを選定する。pBR322/GAPDH
と称するこのプラスミドをBamH I（ニューイングランド
バイオラブズ）を用いて直線状化し、Bgl IIリンカー
（５′−CAGATCTG−３′、ニューイングランドバイオラ
ブズ）を用いる以外は実施例１の如くしてBal31での消
化を行う。そして消化されたプラスミドを総容量20μ
で５μg/の濃度で直接環化する。Bal31短縮Taqlフラ
グメントのサイズを制限分析（Bal IIおよびHind IIIを
使用する）により測定する。ATG上流からGAPDHプロモー
ター中に約200bpおよび265bp伸びているDNAフラグメン
トを含む２種のクローンを選定する。両者のフラグメン
トは約−149bpで推定TATAボックスを含有している。こ
れらのクローンはDNAのpBR322由来部分になお複製の源
を含有し、そしてそれぞれpGAPDH−ＦおよびpGAPDH−Ｆ
と称する。
ｄ）下流GAPDHエレメントとPH05のUAS1（PH05）および
エグリンＣの蛋白質コード領域との組合せ） Ｉ）GAPDHエレメント（第３図参照） GAPDH遺伝子のATGの−27位乃至近接する位置でのTaq I
部位からGAPDHプロモーターエレメントを伸長させるた
めに次の構造を有する２種の合成相補オリゴヌクレオチ
ドを合成する。
５′CGAATAAACACACATAAATAAAG ３′ ３′ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA5′ これらのオリゴヌクレオチドにより末端EcoR I部位の発
生を伴って−26位乃至−５位の純正なGAPDHプロモータ
ー塩基配列を提供する。プラスミドpGAPDE−Ｅおよび−
Ｆの各２μｇを50μのTaq I 6単位で消化し、そして
得られた混合物をフェノール処理し、エタノール沈殿
し、そして水10μに再懸濁する。合成オリゴヌクレオ
チドを、10mMトリス・HCl pH7.5、10mM MgCl2、50mM
NaClを含む溶液100μに各一本鎖２μを混合し、9
0℃に３分間加熱し、そして溶液を室温にゆっくりと冷
却（約３時間以内）することによってアニーリングす
る。Taq I消化プラスミド各１μをT4DNAリガーゼ800U
を用いて約18時間20μ容量のアニーリングしたオリゴ
ヌクレオチド約20倍モル過剰量と混合する。混合物全体
をBal II（ニューイングランドラブズ）３単位で消化す
る。DNAスラグメントを1.5％軟化アガロースゲルで分解
する。それぞれ約200bpおよび265bpのBgl II−EcoR Iフ
ラグメントをゲルから切断し、抽出し、そしてエタノー
ル沈殿する。
プラスミドpGAPDH−ＥをBgl IIおよびEcoR Iで消化し、
そして大型の（約3.5kb）フラグメントを単離する。こ
のフラグメントをベクターとして使用して、上述したの
と同じ結合、形質転換およびプラスミド単離条件を用
い、265bpおよび200bp Bgl II−EcrR Iフラグメントに
クローニングする。生産されたプラスミドをpGAPDH−EU
およびpGAPHD−FLと称する。pGAPDH−ELおよびpGAPDH−
FLにクローニングされたBgl II−EcoR Iフラグメントの
DNA配列を第４図に示す。フラグメントの正確なサイズ
はそれぞれ266bpおよび201bpである。
II）UASZ（PH05）調節エレメント プラスミドp31/Y（欧州特許出願第100,561号参照）３μ
ｇをCla I（ニューイングランドラブズ）６単位で消化
する。３′劣性末端をマニアテイス（上述）に従って、
E.コリDNAポリメラーゼＩ〔ベテスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）〕のク
レナウ（Klenow）フラグメントとの反応で満たす。Bgl
IIリンカー（５′−CAGATCTG−３′）を実施例１の如く
加える。DNAをSal IおよびBgl II（ニューイングランド
バイオラブズ）で消化し、そして１％軟マガロースゲル
で処理する。548bpフラグメントを上述の如くゲルから
切断し、フェノール処理し、そしてエタノール沈殿す
る。
III）プラスミドpJDB207R/PH05−EGLの構成（第５図参
照） このプラスミドはエグリン（eglin）Ｃコード領域およ
びPH05形質転換ターミネーターからなるDNAフラグメン
トの源である。
Ａ）pJDB207ベクターフラグメントの単離 プラスミドpJDB207R/IF（α−３）（欧州特許出願第10
0,561号）６μｇを制限エンドヌクレアーゼBamH Iで完
全に消化する。サイズ6.85kbおよび1.15kbの得られたDN
Aフラグメントをエタノールで沈殿させ、そして50mMト
リス−HCl pH8.0の400μに再懸濁させる。仔牛腸ア
ルカリホスファターゼ（ベーリンガー、マイハイム）4.
5単位を加える。混合物を37℃で１時間培養する。次に
ホスファターゼを65℃で１時間培養して不活化する。溶
液を150mM NaClに調節する。DNA溶液を150mM NaClお
よび1mM EDTAを含む10mMトリス−HCl pH7.5で平衡化
したDE52〔ワットマン（Whatman）〕陰イオン交換体100
μベッドにかける。同じ緩衝剤で洗滌した後、DNAを
1.5M NaCl、10mMトリス−HCl pH7.5、1mM EDTAの400
μで溶解し、そしてエタノールで沈殿させる。大型の
6.85kb BamH Iフラグメントをトリス−ホウ酸塩−EDTA
緩衝剤pH8.3中0.6％低融点アガロースゲルで小型のフラ
グメントから分離する。
Ｂ）534bp PH05プロモーターフラグメントの単離 プラスミドp31/R（欧州特許出願第100,561号）10μｇを
制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化す
る。得られた３種のフラグメントをトリス−ほう酸塩−
EDTA緩衝剤pH8.3中0.6％低融点アガロースゲルで分離す
る。534bpBamH I−EcoR Iフラグメントを単離し、この
ものはmRNAスタート部位を包含するPH05プロモーターを
含有している。
Ｃ）エグリンをコードしている配列を含有する221bp D
NAフラグメントの単離 プラスミドpML147（欧州特許出願第146,785号）８μｇ
を制限エンドヌクレアーゼBamH IおよびEcoR Iで消化す
る。得られた２種のDNAフラグメントをトリス−ほう酸
塩−EDTA緩衝剤pH8.3中0.6％低融点アガロースゲルで分
離する。221bpフラグメントを単離する。
Ｄ）DNAフラグメントの結合 適当な接着末端を有する上記３種のフラグメント（実施
例３、ｄ、III A−Ｃ）を一つの反応で結合させる。6.8
5kb BamH Iベクターフラグメント0.1pmole（0.45μ
ｇ）、534pb BamH I−EcoR I PH05プロモータフラグメ
ント0.2pmole（70μｇ）およびpML147の221bpEcoR I−B
amH Iフラグメントの0.2pmole（29ng）を結合させる。
３種のDNAフラグメント全部は低融点アガロースの小さ
いゲルブロック中に含まれる。アガロースゲルの３片を
プールし、65℃で液化し、そして２倍に希釈する。結合
は、15℃で16時間、60mMトリス−HCl pH7.5、10mM Mg
Cl2、10mM DTT、1mM ATPおよびT4DNAリガーゼ（ベー
リンガー、マンハイム）16単位を含む総量270μ中で
行われる。結合混合物の10μアリコートをカルシウム
処理した形質転換コンピテントE.コリHB101細胞100μ
に加える。
24の形質転換されたampRコロニーをアンピシリン100μg
/mlを含むLB培地で個々に成育させる。プラスミドDNAを
ホルムズ等の方法〔アナル．ビオヘム．第114巻、第193
頁、1981年〕に従って製造し、そしてHind III/EcoR I
二重消化により分析する。600bp EcoR I−Hind IIIフ
ラグメントの出現は、特別なクローンが正しい配向で発
現ベクターに挿入されたPH05プロモーター−エグリンＣ
−DNAフラグメントを有することを指示している。予想
どおり、クローンの約50％は右配向に挿入を有してい
る。これらのクローンの一つを単離し、そしてpJDB207R
/PH05−EGLと称する。
プラスミドpJDB207R/PH05−EGLの６μｇを制限エンドヌ
クレアーゼHind IIIおよびSal Iで完全に消化する。大
型の6.1kb（ベクター部分）フラグメントを軟アガロー
スゲル電気泳動、フェノール抽出およびエタノール沈殿
により単離する。ベクターDNAを水20μに再懸濁す
る。エグリンフラグメントがHind IIIおよびEcoR IでpJ
DB207R/PH05−EGLを消化することによ生成される。得ら
れた600bpフラグメントを軟アガロースゲル電気泳動、
フェノール抽出およびエタノール沈殿により分離する。
エグリンフラグメントをH2Oの20μに再懸濁する。
IV）UAS1（PH05）エレメントを用いるフラグメントの結
合（第６図参照） 次の４種の成分を用いて結合を行う。6.1kb Hind III
−Sal Iベクターフラグメント0.5μｇ、600bp EcoR I
−Hind IIIエグリンＣフラグメント100ng、pGAPDH−EL
の266bp Bgl II−EcoR Iフラグメント200ngおよびUAS1
（PH05）を包含する548bp Sal I−Bgl II−EcoR Iフラ
グメント100ng。結合は上述の如くして行う。アンピシ
リン耐性に対するE.コリHB101の形質転換、プラスミド
単離、および陽性クローンの制限分析は制限エンドヌク
レアーゼHind III、EcoR I、Bgl IIおよびSal Iを用い
て先に述べた如くして行う。１種の陽性クローンを選定
し、そしてpJDB207/PAPEL−EGL（UAS1）と称する。
pGAPDH−FLの201bp Bgl II−EcoR Iフラグメントを用
いて類似の構築を行う。生成されたプラスミドをpJDB20
7/RAPFL−EGL（UAS1）と称する。
Ｖ）UAS1（PH05）およびUAS2（PH05）エレメントによる
ハイブリッドの構築 上記プラスミド（IV参照）３μをBgl IIで消化する。
フェノール抽出およびエタノール沈殿後、DNAを水に再
懸濁する。３′劣性（recessed）末端をII）で述べた如
くクレナウDNAポリメラーゼで満たす。プラスミドを70
℃で10分間加熱して酵素を不活化する。Sal I（バイオ
ラブズ）で消化した後、大型のフラグメント（約7.2k
b）を軟アガロースゲル電気泳動およびフェノール抽出
で単離し、そしてエタノール沈殿したDNAを水に再懸濁
する。同様にして、プラスミドp31/YをBstE IIで消化
し、DNAポリメラーゼ（クレナウフラグメント）で処理
し、そしてSal Iで開裂する。651bpフラグメントを上述
の如くして単離する。上記ベクターDNA200ngと651bpフ
ラグメントとの結合により次のプラスミドが得られる。
pJDB207/PAPEL−EGL（UAS1＋UAS2）（pGAPDH−ELからの
266bp Bgl II−EcoR Iフラグメントの包含） pJDB207/APAPFL−EGL（USA1＋USA2）（pGAPDH−FLから
の201bp Bgl II−EcoR Iフラグメントを包含） 実施例4: ａ）サッカロミセス・セレヴィシエGRF18の形質転換 実施例3d IVおよび3d Vの４種のプラスミドをそれぞ
れ、ヒネン等〔プロク、ナツル．アカド．サイ.USA、第
75巻、第1929頁、1978年〕によって記載された形質転換
プロトコールを用いて、サッカロミセス・セレヴィシエ
菌株GFR18（α,his3−11、his3−15、leu2−３、leu2−
112、canR）に導入する。形質転換されたイースト細胞
をロイシンを欠除したイースト最小培地プレートで選定
する。単独形質転換イーストコロニーを単離し、そして
サッカロミセス・セレヴィシエGRF18/pJDB207/PAPEL−E
GL（UAS1）、PAPEL−EGL（UAS1）、/PAPEL−EGL（UAS1
＋UAS2）および/PAPEL−EGL（UAS1＋UAS2）と称する。
ｂ）形質転換体の醗酵 ４種のS.セレヴィシエGRF18形質転換体の細胞のそれぞ
れをイースト最小培地（ディフコ・イースト．ナイトロ
ジエン・ベース、アミノ酸を含まない、２％グルコース
および2.0mg/ Ｌ−ヒスチジン添加）中で３×107細
胞/mlの密度に30℃で24時間振とうして50mlエルレンマ
イヤーフラスコ中で生育させる。細胞を0.9％NaClで洗
い、高Pi培地（上述のとおり）50mlおよび（NH4）2S
O4、２％グルコースおよび1g/ Ｌ−ヒスチジンの代
りに0.03g/ KH2PO4、1g/ KCl、10g/ Ｌ−アス
パラギンを含むディフコ・イースト・ナイトロジエン・
ベース培地（アミノ酸含有しない）の処方に従って調製
した低Pi最小培地50mlに接種するのに使用する。培地を
0.03の出発OD600に接種する。細胞を30℃で24時間500ml
フラスコで生育させる（OD600nm＝1.8、低Pi倍地、OD
600nm＝3.0、高Pi倍地）。
ｃ）エグリンＣ力価の測定 細胞が上述の細胞密度（OD）に達したときに、細胞をと
り入れ、遠心分離しそしてガラスビーズで破壊する。混
合物をU.シーミュエラー（Seemueller）等の方法〔ホッ
ペーザイラー（Hoppe−Seyler）のZ.フイジオル・ケム
（Z.Physiol.Chem.）、第358巻、第1105頁、1977年〕に
従ってヒト白血球エラスターゼ抑制を測定することによ
りエグリン活性を検定する。次の活性が得られる。
実施例5:PH05−GAPDHハイブリッドプロモーターのコン
トロール下でのデスファルトヒルデインの発現 I.デスルファトヒルデインHV1遺伝子の５′末端でのヌ
クレオチド配列の調節 デスルファトヒルデインをコードしているヌクレオチド
配列（欧州特許出願第168,342号参照）は、最終遺伝子
生成物のNH2末端バリンを示すGTTで始まる。E.コリでの
通常のサブクローニングおよび発現のために、コード配
列をEcoR I制限部位およびATG開始コドンを包含する８
個のヌクレオチドにより５′末端で伸長しておいた。PH
05シグナルペプチドをコードする配列に対するヒルデイ
ンコード配列のフレーム融合での正確さのためにこれら
の追加のヌクレオチドを除去しなければならない。これ
は、EcoR I制限部位を平滑末端部位に変換し、Hga I認
識部位を含む合成オリゴヌクレオチドを、Hga Iによる
次の開裂が直ちにGTTコドンの上流で生じるような位置
に付加することによって達成される。
デスルファトヒルディン遺伝子の前のHga I制限部位の
導入（第７図参照） プラスミドpML310（欧州特許出願第163,342号）８μｇ
を制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで完全に消化する。DN
A（pML310/EcoR I）をフェノール／クロロホルムで抽出
し、そしてエタノールに沈殿させる。５′オーバーハン
ギング（overhanging）末端をヌクレアーゼS1で除去す
る。pML310/EcoR I DNAの４μｇを250mM NaCl、1mM
ZnSO4、30mM酢酸ナトリウムpH4.6の100μ中ヌクレア
ーゼS1（シグマ）の20U/mlで45分間37℃で消化する。DN
Aをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノ
ールで沈殿させる。DNA（pML310/EcoR I/S1）を50mMト
リス・HCl pH8.0の100μに再懸濁し、そして37℃で
１時間仔牛腸アルカリホスファターゼ（CIAP、ベーリン
ガー）の２単位で培養する。酵素を65℃で1.5時間不活
性化する。
培養混合物中のNaCl濃度を150mMに調節する。除ホスホ
リル化DNA（pML310/EcoR I/S1/CIAP）を低塩緩衝剤（15
0mM NaCl、10mMトリス・HCl pH8.0、1mM EDTA）でDE
52（ワットマン）イオン交換カラムに吸着させることに
よって精製し、そして高塩緩衝剤溶液（1.5M NaCl、10
mMトリス・HClpH8.0 1mM EDTA）で溶出する。DNAをエ
タノールで沈殿させ、そして0.8mg/mlの濃度でH2Oに再
懸濁した。
式 ５′−AGCGTCGACGCT−３′ を有するオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル法
〔板倉等、J.アム、ケム、ソク．第103巻、第706頁、19
81年〕により合成する。オリゴヌクレオチドの配列は制
限エンドヌクレアーゼHag Iのための認識部位−GACGC−
を含有する自己相補体である。２個の一本鎖のアニーリ
ングは12塩基対の二本鎖DNAリンカーに導く。
合成一本鎖オリゴヌクレオチド1.2μｇを30分37℃で60m
Mトリス・HCl pH7.5、10mM MgCl2、5mM DTT〔γ−32
p〕ATP（3000Ci・m mol-1、アメルシャム）の30μCiお
よびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）６単
位の10μ中でリン酸化する。次に、0.5mM ATPの存在
下に37℃で15分間チェースする。更に、混合物を75℃で
10分間培養して酵素を不活性化し、次にアニーリングの
ために室温に冷却する。
0.6μｇ（170p mol）の32P−標識リンカーDNAをpML310/
EcoR I/S1/CIAPの2.4μｇ（1.75p mol末端）と混合し、
そして15℃で20時間60mMトリス・HCl pH7.5、10mM Mg
Cl2、5mM DTT、3.5mM ATP、T4DNAリガーゼの800単位
（バイオラブズ）の20μで結合させる。リガーゼを85
℃で10分間不活性化し、そしてリンカー分子の過剰量を
10mM EDTA pH7.5、300mM酢酸pH6.0およびイソプロパ
ノール0.54容量の存在下DNAの沈殿により除去する。室
温で30分後、DNAをペレットにし、結合混合物（上述の
如く特定）45μに再懸濁させ、そして６時間15℃で結
合させて環状DNAを形成させる。
結合混合物を１μおよび３μアリコートをカルシウ
ム処理した、形質転換コンピテントE.コリHB101細胞
〔D.ハナハン（Hanahan）の方法、J.ビオル．ケム．第1
66巻、第557頁、1983年〕100μに加える。細胞を30分
間氷上に放置し、次に42℃で３分間培養し、２分間氷上
で冷却し、次にSOCメデイウム400μ中37℃で１時間培
養する。細胞を各100μ中で懸縮し、そしてアンピシ
リン50μ/mlを含むLB寒天プレートにのせる。
12個の形質転換したampRコロニーをアンピシリン100μg
/mlを含むLB培地に個々に生育させる。プラスミドDNAを
D.S.ホルムズ（Holmes）等〔アナル．ビオ．ケム、第11
4巻、第193頁、1981年〕の方法に従って製造する。合成
オリゴヌクレオチドリンカーの存在は、ヒルデインのコ
ード鎖にハイブリダイズするプライマーとして一本鎖DN
Aフラグメントを用いるDNA塩基配列決定により確認され
る。ヒルディン遺伝子の前に正しい位置でDNAリンカー
を含む１種のクローンをpML310Lと称する。
II.PH05シグナル配列およびデスルファトヒルディン構
造遺伝子の融合 ａ）0.2kbデスルファトヒルディンフラグメントの単離
（第７図参照） プラスミドpML310Lの12μｇを制限エンドヌクレアーゼB
amH IおよびPvu Iで完全消化する。DNAをフェノール／
クロロホルムにより抽出し、そしてエタノール沈殿した
後、２個の制限フラグメントをトリス−ほう酸塩−EDTA
緩衝剤pH8.1中1.2％アガロースゲルで分離する。エチウ
ムブロマイド染色した0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメ
ントをゲルスライスに分離する。DNAを0.2×TBE緩衝剤3
mlを満たした透析バッグ中で電気溶出する。閉じたバッ
グをTBE緩衝剤pH8.3（90mMトリス−ベース、90mMほう
酸、2.5mM EDTA）中に浸漬する。100mAで30分後、電流
の極性を反対にして透析膜からDNAをはじくようにす
る。透析バッグ中のゲルスライスを囲んでいる緩衝剤を
回収し、150mM NaClに調節し、そしてDE52（ワットマ
ン）イオン交換カラム中を通す。DNAを高塩緩衝剤（1.5
M NaCl、10mM トリス・HCl pH8.0、1mM EDTA）で溶
出し、エタノールで沈殿させ、そして0.1mg/mlの濃度で
H2Oに再溶解する。
pML310Lの0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメントを更に制
限エンドヌクレアーゼHga Iで消化する。この消化によ
り、成熟デスルファトヒルディンのための完全なコード
配列を含有する198bp Hga I−BamH Iフラグメントが発
生する。追加のAlu I消化は198bpHga I−BamH Iフラグ
メントに触れないが、同様なサイズの別のHga Iフラグ
メントを除去する。
0.2kb Hga I−BamH IフラグメントをTBE緩衝剤中1.5％
アガロースゲルで他のフラグメントから分離し、そして
電気溶出（上述のとおり）に単離する。DNAをDE52イオ
ン交換クロマトグラフィーおよびエタノール沈殿により
精製する。DNAを30μ/ml（0.2p mol/μ）の濃度でH
2Oに再懸濁する。
ｂ）PH05シグナル配列の部分を伴うPH05プロモーター領
域の単離（第８図参照） プラスミドp31/PH05−TPA18（欧州特許出願第143,081
号）は、フレームで異質構造遺伝子（ｔ−PA）に融合し
たPH05プロモーターおよびPH05シグナル配列を有してい
る。584bp BamH I−Bal IフラグメントはPH05プロモー
ターおよびPH05シグナル配列の全部を含有し、但し３′
未満に８個のヌクレオチドを含有している。
p31/PH05−TPA18 DNAの８μｇを制限エンドヌクレアー
ジBal Iで消化する（37℃で16時間）。DNAをフェノール
／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製す
る。DNAを0.7mg/mlの濃度でH2Oに再懸濁する。
PH05シグナル配列とデスルファトヒルディンのコード領
域との間の正しい連接は式 （１）５′−CCAATGCA−３′ （２）３′−GGTTACGTCAACA−５′ を有する合成リンカーにより提供される。
リンカー（５′−CCAATGCA）の５′末端での８個のヌク
レオチドはBal I部位からプロセッシング部位のPH05シ
グナル配列の部分を表わしている。オリゴヌクレオチド
（２）の５′オーバーハンギング５個のヌクレオチドは
デスルファトヒルディンコード配列の５′末端でHga I
開裂部位に入っている。
個々の一本鎖オリゴヌクレオチド（１）および（２）は
ホスホトリエステル法（板倉等、上述）により合成され
る。オリゴヌクレオチド（１）および（２）の1.1μｇ
および1.8μｇをそれぞれ実施例に記載の如く個別に
５′末端でりん酸化し、等モル量で混合し、そしてアニ
ーリングする。
りん酸化二本鎖リンカーDNA1.3μｇ（200p mol）を15℃
で16時間60mMトリス・HCl pH7.5、10mM MgCl2、3.5mM
ATP、5mM DTTおよび1400単位のT4DNAリガーゼ（バイ
オラブズ）の40μ中、Bal I開裂p31/PH05−TPA18の７
μｇ（1.8p mol）と結合させる。リガーゼを85℃で10分
間不活性化する。リンカーの過剰量を10mM EDTA、300m
M酢酸ナトリウムpH6.0およびイソプロパノール0.54容量
の存在下にDNAの沈殿により除去する。DNAを再懸濁し、
そして更にエンドヌクレアーゼBamH Iで消化する。DNA
をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノー
ル沈殿した後、２種の制限フラグメントをトリス−ほう
酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中1.2％アガロースゲルで分離す
る。0.6kbフラグメントをゲルから単離する。DNAを電気
溶出し、そして更にDE52イオン交換クロマトグラフィー
およびエタノール沈殿により精製する。0.6kb BamH I
−Hga I DNAフラグメントを40μg/mlの濃度でH2Oに再懸
濁する。
ｃ）pJDB207イーストベクターフラグメントの単離（第
８図参照） プラスミドpJDB207R/PH05−TPA（12−２）DNA（欧州特
許出願第143,081号）９μｇを制限エンドヌクレアーゼB
amH Iで消化する。完全消化時、DNAをフェノール／クロ
ロホルムで抽出し、そしてエタノール沈殿させる。DNA
を0.1mg/mlの濃度で50mMトリス・HCl pH8.0に再懸濁
し、そして37℃で１時間仔牛腸アルカリホスファターゼ
７単位で消化する。ホスファターゼを1.5時間65℃で不
活性化し、そしてDNAをDE52イオン交換クロマトグラフ
ィー（実施例5I参照）およびエタノール沈殿で精製す
る。6.8kb大型BamH Iフラグメントをトリス−ほう酸塩
−EDTA緩衝剤pH8.3中1.2％アガロースゲルで分離する。
DNAを電気溶出し、そしてDE52イオン交換クロマトグラ
フィーおよびエタノール沈殿により精製する。DNAを0.4
mg/ml（0.1p mol/μ）の濃度で水に溶解する。
ｄ）pJDB207イーストベクターフラグメントへのPH05プ
ロモーターフラグメントおよびデスルファトヒルディン
構造遺伝子の結合（第８図参照） pJDB20イーストベクター、PH05シグナル配列を有するPH
05プロモーターフラグメントおよびデスルファトヒルデ
ィン構造遺伝子をすべてDNAフラグメントとして単離し
（実施例5II a−ｃ）、これらフラグメントは結合して
発現プラスミドを形成する。
P31/PH05−TPA18の0.6kb BamH I−Hga Iフラグメント
0.3p molおよびpML310Lの0.2kb Hga I−BamH Iフラグ
メントの0.3p molを、15℃で20時間60mMトリス・HCl p
H7.5、10mM MgCl2、5mM DTT、1mM ATPおよび400単位
のT4DNAリガーゼの10μ中でpJDB207R/PH05−TPA（12
−２）の6.8kb BmaH Iフラグメントに結合する。
結合混合物の１μアリコートをハナハン（上述）に従
って製造した形質転換コピテントE.コリHB101の100μ
に加える。形質転換プロトコールはまたこの刊行物から
採用する。細胞をアンピシリン50μg/mlを含むLB寒天プ
レート上にならしておく。
24ampRコロニーを個別にアンピシリン100μg/ml含有LB
培地で生育させる。プラスミドDNAを制限エンドヌクレ
アーゼPst Iで開列することにより挿入のサイズおよび
配向を分析する。挿入の正しい配向を有する単一クロー
ンをpJDB207/PH05−HIRと称する。
III）プラスミドpJDB207/PH05（Eco）−HIRの製造（第
９図参照） PH05シグナル配列を含有するデスルファルトヒルディン
のコード領域（プラスミドpJDB207/PH05−HIRの如く）
にUAS（PH05）−GAPDHハイブリッドプロモーターエレメ
ントの好都合な接合のために、EcoR I制限部位をmRNAス
タート部位とコード領域のATGとの間で５′−非翻訳領
域に導入する。
プラスミドpJDB207/PHO−HIRの15μｇを制限エンドヌク
レアーゼDra I（ベーリンガー）で消化する。得られた
４個のフラグメントをトリス−ほう酸塩−EDTA緩衝剤中
0.8％アガロースゲルで分離する。4.2kb DNAフラグメ
ントをゲルから採取し、電気溶出し、そしてエタノール
で沈殿させる。DNAを0.6mg/mlの濃度でH2Oに再懸濁させ
る。
次の式 ５′−AATTCGATTACCAATGTTT3′ ３′− GCTAATGGTTACAAA−５′ を有する２種の合成オリゴヌクレオチド（それぞれ2.3
μｇおよび2.9μｇ）を各々60mMトリス pH7.5、10mM
MgCl2、5mM DTT、0.5mM ATPおよび20UのT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（ベーリンガー）の20μ中でキナーゼ
処理する。37℃で45分後に、双方の反応混合物を合し、
75℃に10分間加熱しそして室温に冷却する。アニーリン
グしたオリゴヌクレオチドリンカーを−20℃で保存す
る。
4.2kb Dra I DNAフラグメントの6.5μｇ（2.3p mol）
を、60mMトリスPH7.5、10mM MgCl2、5mM DTT、3.5mM
ATPおよび800UのT4DNAリガーゼ（バイオラブズ）の50
μ中で70培過剰のキナーゼ処理し、そしてアニーリン
グしたオリゴヌクレオチドリンカーと共に15℃で16時間
インキュベートする。T4DNAリガーゼを85℃で10分間不
活性化した後、過剰のリンカーを10mM EDTA、300mM酢
酸ナトリウムpH6.0およびイソプロパノール0.54容量の
存在下DNAの沈殿によって除去する。DNAをEcoR Iおよび
Hind IIIで消化する。得られたフラグメントをトリス−
ほう酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中１％アガロースゲルで分
離する。643bpフラグメントをゲルから電気溶出および
エタノール沈殿により採取する。DNAを0.1p mol/μの
濃度で再懸濁する。EcoR I−Hind IIIフラグメントはPH
05シグナル配列、デスルファトヒルディンのコード配列
およびPH05転写ターミネーターを含有する。
534bp PH05プロモーターフラグメントはプラスミドp31
/R（欧州特許出願第100,561号）から単離する。
p31/Rの10μｇを制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびB
amH Iで消化する。得られた３個のフラグメントをトリ
ス−ほう酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中0.6％低融点アガロー
スゲルで分離する。mRNAスタート部位を包含するPH05プ
ロモーターを含む534bp BamH I−EcoR Iフラグメント
を単離する。
ベクターフラグメントをプラスミドpJDB207/PH05−HIR
から単離する。このプラスミド６μｇをBamH IおよびHi
nd IIIで消化する。大型の6.5kb BamH I−Hind IIIフ
ラグメントをトリス−ほう酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中の
0.6低融点アガロースゲルで小さいフラグメントから分
離する。
適当な接着末端を有する上記の３個のDNAフラグメント
を次の反応で縮合させる。534bp BamH I−EcoR I PH0
5プロモーターフラグメント0.2p mol（70ng）、643pb
EcoR I−Hind IIIフラグメント（ヒルディンコード配
列）0.2p mol（85ng）、および6.5kb BamH I−Hind II
Iベクターフラグメント0.1p mol（0.4μｇ）を60mMトリ
スpH7.5、10mM MgCl2、5mM DTT、1mM ATPおよび400U
のT4DNAリガーゼの10μ中15℃で６時間結合させる。
結合混合物の１μアリコートをカルシウム処理した形
質転換コピテントE.コリHB101細胞100μに加える。
12個の形質転換されたampRコロニーをアンピシリン100
μg/mlを含むLB培地で個別し生育させる。プラスミドDN
Aをホルムズ等〔アナル・ピオヘム、第114巻、1981年、
第193頁〕の方法に従って製造し、そしてEcoR IおよびB
amH I制限消化物により分析する。予想される制限フラ
グメントを有する１個のクローンを単離し、そしてpJDB
207/PH05（Eco）−HIRと称する。
IV）UAS1（PH05）−GAPDHハイブリッドプロモーターの
デスルファトヒルディンの蛋白コード領域への結合 プラスミドpJDB207/PH05（Eco）−HIRの15μｇをEcoR I
およびHind IIIで消化する。DNAフラグメントをトリス
−ほう酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中１％アガロースゲルで
分離する。643bpフラグメントをゲルから単離し、電気
溶出し、そしてエタノールで沈殿させる。DNAを0.1p mo
l/μの濃度でH2Oに再懸濁させる。
プラスミドpJDB207/PH05−HIRの６μｇを制限エンドヌ
クレアーゼHind IIIおよびSal Iで完全に消化する。大
型の6.3kbフラグメント（ベクター部分）を軟アガロー
スゲル電気泳動、フェノール抽出およびエタノール沈殿
により単離する。ベクターDNAフラグメントを0.05p mol
/μの濃度でH2Oに再懸濁する。
フラスミドpGAPDH−EL（実施例3dI）10μｇをBgl IIお
よびEcoR Iで消化する。266bp Bgl II−EcoR Iフラグ
メントをトリス−ホウ酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中1.2％ア
ガロースゲルで分離し、ゲルから電気溶出し、そしてエ
タノールで沈殿させる。DNAを0.3p mol/μの濃度でH2
Oに再懸濁させる。
UAS1（PH05）を包含する548bp Sal I−Bgl IIフラグメ
ント0.3p mol、pGAPDH−ELの266bp Bgl II−EcoR Iフ
ラグメント0.3p mol、pJDB207/PH05（Eco）−HIRの643p
b EcoR I−Hind IIIフラグメント0.3p molおよび6.3kb
Sal I−Hind IIIベクターフラグメント0.12p molを、
15℃で６時間、60mMトリス、pH7.5、10mM MgCl2、5mM
DTT、1mM ATPおよびT4DNAリガーゼ（バイオラブズ）
400Uの20μ中で結合させる。結合混合物の１μおよ
び３μのアリコートをカルシウム処理E.コリHB101細
胞100μに加える。ampRコロニーからのプラスミド単
離、およびSal I、Bgl II、およびHind IIIによる制限
分析は上述の如くとして行われる（実施例3d III）。１
個の陽性クローンを選定し、そしてpJDB207/PAPEL−HIR
（UAS1）と称する。pGAPDH−FLから単離した201bp Bgl
II−EcoR Iフラグメントで類似の構築を行う。１個の
選定されたプラスミドをpJDB207/PAPFL−HIR（UAS1）と
称する。
Ｖ）UAS1（PH05）−UAS2（PH05）−GAPDHハイブリッド
プロモーターのデスルファトヒルディンの蛋白コード領
域への結合 プラスミドpJDB207/PAPEL−HIR（UAS1）およびpJDB207/
PAPFL−HIR（UAS1）各３μｇをBgl IIで消化する。フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿後、DNAの３′劣性末
端をマニアティス等に従って（上述）E.コリDNAポリメ
ラーゼ（クレナウフラグメント；ベテスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ）との反応でみたす。酵素を10分間70℃
で不活性化する。DNAを更にSal Iで消化し、そして大型
の7.2kbフラグメントを軟アガロースゲル電気泳動、フ
ェノール抽出およびエタノール沈殿により単離する。各
フラグメントを0.05p mol/μの濃度でH2Oに再懸濁す
る。フラグメントはヒルディンコード領域、ベクター配
列の大部分、ならびにpGAPDH−ELまたはpGAPDH−FLから
単離された２種の異ったGAPDHプロモーターエレメント
のいずれか一方を含有する。
プラスミドp31/Y（欧州特許出願第100,561号）をBstE I
Iで消化し、上述の如く、E.コリDNAポリメラーゼ（クレ
ナウフラグメント）と共に培養しそしてSal Iで開裂す
る。649bpフラグメントを軟アガロースゲルで分離し、
そしてフェノール抽出およびエタノール沈殿で採取す
る。
p31/Yの649bpフラグメント0.3p mol〔UAS1−UAS2（PH0
5）プロモーターエレメントを包含〕および7.2kbフラグ
メントの一方の0.15p molを上述の如く結合させ、E.コ
リHB101を形質転換する。プラスミドをampRコロニーか
ら製造し、そして制限消化物により分析する。単一クロ
ーンヲ選択し、そしてそれらのプラスミドDNAをpJDB207
/PAPEL−HIR（UAS1＋UAS2）およびpJDB207/PAPFL−HIR
（UAS1＋UAS2）と称する。
実施例6:31bp DNA配列はホスフェートコントロールエ
レメントとして作用するのに十分である ２種のフランキング（flanking）欠失△10および△13
（実施例1f参照）により定められるPH05プロモーター
（−381乃至−351位置）の上流領域からの31bp配列は潜
在的に調節シグナルを含有し得る。これは次の構造 ５′−AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG−３′ ３′− GCTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGTCTTAA−
５′ を有する２種の相補オリゴヌレオチドを化学的に合成す
ることにより試験することができる。
この配列はEcoR I制限部位にフランキングする31bp配列
を含有している。EcoR I部位は配列の重合を容易にして
マルチマーの形成を可能とする。
ａ）31bpエレメントのベクターLT98へのクローニング ２種の合成オリゴヌクレオチドの50p molを、各々60mM
トリスpH7.5、10mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM ATPおよ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）20Uの2
0ml中でキナーゼ処理する。37℃で45分間後、両方の反
応混合物を合し、10分間75℃に加熱しそして室温に冷却
する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを−20℃で
保存する。キナーゼ処理し、アニーリングしたオリゴヌ
クレオチド7.5p molを上述の如く（実施例5III）総容量
15μで30分間結合させた。次に、EcoR I切断LT98ベク
ターDNA〔ディクソン（Dixon）等、「ジーン」、第25
巻、第189頁、1983年〕５μを加え（0.075p mol）、
そして計６時間培養を続ける。E.コリHB101に形質転換
させた後、プラスミドを単離し、そしてBamH Iで消化し
て分析する。この分析によって、挿入の全長についての
データが得られ、またクローニングされたEcoR Iフラグ
メントの数の推測が可能となる。１、２、３、４または
5EcoR Iフラグメントを有する個々のプラスミドを選定
し、そしてDNA塩基配列決定（サンガー法）により、多
重31bpエレメントが頭部から尾部方向にクローニングさ
れていることが示される。
ｂ）pJDB207へのクローニング 31bpオリゴマーを、GAPDHプロモーターのＦエレメント
の上流を挿入することにより、プロモーターコントロー
ル機能を試験する。プラスミドpJBD2−7/PAPFL−EGL（U
AS1）を短縮して欠失UAS1エレメントを有するプラスミ
ドを生成させる。このプラスミドをSal IおよびBal II
で消化し、ゲル精製し、大型ベクターフラグメントを単
離する。独立した反応混合物において、同一プラスミド
をBamH Iで消化する。劣性３′末端を４種の全dNTPを用
いてクレナウ（Klenow）DNAポリメラーゼで満たす。平
滑末端の部位をホスホリル化したBgl IIリンカー（CAGA
TCTG、バイオラブズ）で伸長し、そしてSal IおよびBgl
IIで消化した後、約400bpの長さを有するDNAフラグメ
ントをゲル精製によって単離する。大型のベクターフラ
グメントをT4DNAリガーゼを用いて約400bp Sal I−Bgl
IIフラグメントと結合させる。E.コリHB1010の形質転
換およびプラスミド単離後、プラスミドをPH05UASなし
で得る。このプラスミドをpJDB207/GAPFL−EGLと称す
る。このプラスミドをBgl IIで消化し、そして31bpオリ
ゴマーをクローニングするためのベクターとして役立つ
ものである。１、２、３、４またはＳオリゴヌクレオチ
ド挿入を含有するLT98をBamH Iで消化する。種々のサイ
ズのフラグメントをゲル精製によって単離し、そしてBg
l II切断pJDB207/GAPEL−EGLに独立して結合させる。結
合ミックスをBgl IIで消化してDNA挿入を伴わない所望
しない再結合ベクターを除去し、そしてE.コリHB101を
形質転換するのに使用する。得られたプラスミドをSal
およびDra Iによる制限分析により分析する（GAPDHプロ
モーター部分内の部位）。イースト菌株GRF18の形質転
換後、エグリンＣ力価を実施例4Cに記載の如く測定す
る。醗酵46時間後の次の特定の活性が測定される。
実施例7:PAPELプロモーターからのインシュリン様成長
因子１（IGF−１）の発現 欧州特許願第123,228号に記載されているプラスミドpAB
113−IGF−１をPst Iで消化する。次の式を有する２種
の合成オリゴヌクレオチド（50p mol） AATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA GTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG をそれぞれ上記の如くキナーゼ処理し、そしてアニーリ
ングする。アニーリングされた二本鎖アダプターをEcoR
IおよびBamH Iで消化したPst I切断プラスミドに結合
させる。そして約800bp EcoR I−BamH Iフラグメント
をゲル精製により単離する。プラスミドpJDB207/PAPFL
−EGL（USA1）をSal IおよびEcoR Iで消化し、そして約
700bpフラグメントをゲル精製により単離する。トリプ
ル結合において、プラスミドpC1/1（欧州特許出願第12
3,228号;BamH IおよびSal Iで消化、ベクターゲル精
製）0.5μｇを２種のより小さい遺伝子およびプロモー
ター部分の各100ngの結合させる。E.コリ形質転換後、
プラスミドをEcoR I.BamH IおよびSal I消化で分析す
る。イースト菌株AB103〔ATCCにNo.20673で寄託；複合
培地で一夜イースト細胞を生育させることによりpYIGF
−１−10の不稔、そしてヒネン等〔プロク．ナツル．ア
カド、サイ、USA、第75巻、第1929頁、1978年〕に記載
の如くコロニー交雑によりIGF−１プラスミドの存在に
ついて個々のコロニーをテストする〕形質転換によっ
て、形質転換体が得られ、このものは放射標識IGF−１
を用いる通常の拮抗放射線免疫検定法で測定される如く
誘起（低Pi）条件（1mg/）のみでIGF−１を生成する
〔アンダーソン（Anderson）等、「ソマトメディンズ／
インシュリン−ライク・グロース・ファクターズ」（So
matomedins/Insulin−Like Growth Factors）、スペン
サー（Spencer）、E.M.編、クルター・デ・グルイター
（Walter do Gruyter）〕。クローンをpC1/1/PAPFL−IG
F−１（UAS1）と称する。
実施例8:PH05−GAPDHハイブリッドプロモーターのコン
トロール下での組織プラスミノーゲン活性因子（ｔ−P
A）の発現（第10図参照） プラスミドpJDB207/PH05−TPA18（欧州特許出願第143,0
81号）12μｇを制限エンドヌクレアーゼSa IIおよびHin
d IIIで完全消化する。得られた２種のDNAフラグメント
をトリス−ほう酸塩−EDTA緩衝剤pH8.3中0.8％アガロー
スゲルで分離する。小さい2.6Kb Sal I−Hind IIIフラ
グメントを電気溶出、フェノール抽出およびエタノール
沈殿により単離する。更にDNAをBal Iで消化する。PH05
シグナル配列の部分、ｔ−PAのコード配列およびPH05タ
ーミネーターを有する1.8kbフラグメントを上述の如く
単離、精製し、そして0.1p mol/μ濃度でH2Oに再懸濁
する。
ハイブリッドプロモーターフラグメントをプラスミドpJ
DB207/PAPEL/HIR（UAS1＋UAS2）から単離する（実施例5
V参照）。プラスミドDNAの12μｇをSal IおよびHind II
Iで消化する。得られた1.5kbフラグメントを更にBal I
で消化する。ハイブリッドプロモーターおよびPH05シグ
ナル配列の部分を包含する920bpフラグメントを1.5％ア
ガロースゲルで単離する。DNAを電気溶出、フェノール
抽出、エタノール沈殿し、そして0.1p mol/μの濃度
でH2Oに再懸濁する。
920bp Sal I−Bal Iフラグメント0.2p mol、1.8kb Ba
l I−Hind IIIフラグメント0.2p molおよびSal I、Hind
III、開裂ベクターpJDB207の0.1p molを総量10μで1
5℃で16時間結合させる。結合混合物の１μアリコー
トをカルシウム処理した形質転換コンピテントE.コリHB
101細胞100μに加える。
12の形質転換されたampRコロニーを個々にアンピシリン
100μg/mlを含むLB培地で生育される。プラスミドDNAは
ホルムズ（Holmes）等の方法〔アナル・ビオケム、第11
4巻、第193頁、1981年〕に従って製造し、そしてPst I
およびBamH I/EcoR I制限消化物により分析する。予想
制限フラグメントを有する一つのクローンを単離し、そ
してpJDB207/PAPEL−TPA（UAS1＋USA2）と称する。
類似の構築をUAS1（PH05）エレメントについて行う:pJD
B207/PAPFL−HIR（UAS1）の820bp Sal I−Bal Iフラグ
メント（実施例5IV）を単離し、そして1.8kb Bal I−H
ind IIIフラグメンとおよびSal I、Hind III開裂ベクタ
ーに結合させる。得られたプラスミドをpJDB207/PAPFL
−TPA（UAS1）と称する。
pJDB207/PAPEL−HIR（UAS1）またはpJDB207/PAPEL−HIR
（UAS1＋UAS2）（実施例５）から単離した相当するフラ
グメントで類似の構築を行う。得られたプラスミドをpJ
DB207/PAPEL−TPA（UAS1）およびpJBD207/PAPEL−TPA
（UAS1＋UAS2）と称する。
実施例9:PH05−GAPDHハイブリッドプロモーターのコン
トロール下でのポリペプチドの発現 ａ）サッカロミセス・ゼレヴィシエGRF18の形質変換： 次のプラスミドでサッカロミセス・セレヴイシエ菌株GR
F18（α、his3−11、his3−15、leu2−３、leu2−112、
canR）を形質変換させる。
pJDB207/PAPEL−HIR（UAS1） pJDB207/PAPFL−HIR（UAS1） pJDB207/PAPEL−HIR（UAS1＋UAS2） pJDB207/PAPFL−HIR（UAS1＋UAS2） pJDB207/PAPFLI（＋）−EGL pJDB207/PAPFLI（−）−EGL pJDB207/PAPFLII（＋）−EGL pJDB207/PAPFLIII（−）−EGL pJDB207/PAPFLIV（＋）−EGL pJDB207/PAPFLV（−）−EGL pJDB207/PAPEL−TPA（UAS1） pJDB207/PAPFL−TPA（UAS1） pJDB207/PAPEL−TPA（UAS1＋UAS2） pJDB207/PAPFL−TPA（UAS1＋UAS2） pC1/1/PAPFL−IGF−１（UAS1） ここではヒネン（Hinnen）等の報告〔プロク．ナツル．
アカド．サイ.USA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第75
巻、第1929頁（1978年〕の形質転換プロトコールを使用
する。形質転換イースト細胞をロイシンを欠除している
イースト最小培地プレートで選定する。単一の形質転換
イーストコロニーを単離し、そして次のとおり命名す
る。
ｂ）形質転換体の醗酵 S.セレヴィシエGRF18形質転換体の細胞をそれぞれ30
℃、24時間の振とうを伴う50mlエルレンマイヤーフラス
コ中イースト最小培地〔２％グルコースおよび20ml/
Ｌ−ヒスチジンを加えたディフコ・イースト・ナイロ
ジェン・ベース（Difco Yeast Nitrogen Base）、アミ
ノ酸を伴わない〕10mlで３×107細胞/mlの密度に生育さ
せる。細胞を0.9％NaClで洗い、そして（NH4）2SO4、２
％グルコースおよび1g/ Ｌ−ヒスチジンの代りに0.0
3g/ KH2PO4、1g/KClおよび10g/ Ｌ−アスパラギ
ンを含むディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベース
培地（アミノ酸を含まず）の処方に従って調製した低Pi
最小培地50mlに接種するのに使用する。培地は４×106
細胞/mlの細胞密度まで接種し、そして30℃で200nevs/
分で42時間までかくはんする。
ｃ）発現遺伝子生成物の力価 イーストは培地中にデスルファトヒルディン化合物を分
泌する。22時間醗酵後、試料10mlを培地からとり、そし
て脱塩およびボンド・エルト（Bond Elut）Ｃ−18カラ
ム〔1ml、アナリテイケム・インターナショナル（Analy
tichem International〕で濃縮することにより蛋白に対
して富化する。カラムを水−アセトニトリル（9:1）−
0.1％トリフルオロ酢酸1.5mlで二度洗滌する。デスルフ
ァトヒドリン化合物をカラムから水−アセトニトリル−
0.1％トリフルオロ酢酸（6:4v/v）で溶出する。溶出液2
mlをスピード・バック・コンセントレーター（Speed Va
c concentrator）で最終容量400μに濃縮する。デス
ルファトヒルディンは、HPLC分析、デスルファヒルディ
ン標品との比較およびトロンビン抑制検定〔M.U.ベルグ
マイヤー（Bergmeyer）編、「メソド・イン・エンザイ
マティック・アナリシス」（Methods in Enzymatic Ana
lysis）、第II巻、第314−316頁、フェルラグ・ヘミエ
（Verlag Chemie）、ワインハイム（weinheim）（FR
G）、1983年〕により同定する。
結果を表１に示す。
組織プラスミノーゲン活性因子（ｔ−PA）はイースト細
胞に蓄積する。細胞抽出物を製造し、そしてｔ−PA活性
を次の如く測定する。１−２×107/mlの細胞密度で低Pi
培地〔B.メイハック（Meyhack）等、EMBO−J.第１巻、
第675頁、1982年〕35mlから細胞を3000rpmで10分間ソル
バル（Sorvall）SS34ローターで遠心分離することによ
り採集する。細胞を培地の塩成分を含む緩衝剤（すなわ
ち、アミノ酸、グルコース、ビタミン、微量元素を伴わ
ない）で洗滌する。細胞を室温で５分間3000rpmで遠心
分離する。沈降細胞を冷却66mMりん酸ナトリウム緩衝剤
pH7.4および0.1％（v/v）トライトン（Triton）×−100
計4ml量に再懸濁した。細胞懸濁液を30mlコレックス・
チューブに移し、ガラスビーズ（直径0.4mm）8gを加
え、そして懸濁液を全速で４分間ボルテックス・ミキサ
（Vortex Mixer）〔サイエンティフィック・インスツル
メンツ・インコーポレーテッド（Scientific Instrumen
ts Inc.）、USA〕で振とうし、そして次に氷浴で冷却す
る。この操作により細胞の90％以上が破壊される。細胞
片およびガラスビーズをソルバールHB−４ローターで４
℃で8000rpmで10分間遠心分離により沈降する。上澄液
をエツペンドルフ・チューブに移し、液体窒素で凍結
し、そして−60℃保存する。
若干の変形をしたランビイ（Ranby）の方法〔ビオヒム
・ビオフィズ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta.）第704
巻、第461頁、1982年〕に従って、ｔ−PA活性を測定す
る。Ｄ−Val−Len−Lys−pNA〔カビ（Kabi）Ｓ−2251〕
を基質として使用する。405nmでの吸収を非特異的開裂
に対して補正し、そしてウロキナーゼ標準品と関連づけ
る。結果を表２に示す。
実施例10:形質転換されたイースト菌株からのIGF−１の
単離および特徴化 ａ）培地からのIGF−１の単離 イースト菌株pC1/1/PAPFL−IGF−１（UAS1）を60時間培
養する。培地３をとり、実施例９に記載の如く遠心分
離する。上澄液2mlの逆相HPLCによる分析では1mg/IGF
−１力価を生じる。上澄液をpH3.0でSP−セファデック
ス（Sephadex）Ｃ−25〔ファルマシア（Pharmacia）〕2
0mlで処理しそして４℃で60分間かくはんする。吸着さ
れたIGF−１を酢酸ナトリウム緩衝液勾配（50mM、pH3.0
〜pH9.0）により洗滌樹脂から溶出し、そして更に２段
階のイオン交換で精製する。第一段階はCM−52カラム
（ワットマン、1.5cm×8.5cm、勾配、緩衝剤A20mM NH4
OAc pH4.0;緩衝剤B100mM NH4OAc pH6.8）で実施す
る。第２段階はDE−53陰イオン交換カラム（ワットマ
ン）（条件:1.5cm×10.5cmカラム、流量1ml/分、勾配、
緩衝剤A20mM NH4OAc PH9.0:緩衝剤B200mM NH4OAc p
H6.5）で達成される。最終の精製は半調製用RP−HPLCカ
ラムで行われる。21.3分の滞留時間で活性フラクション
が溶出し、95％純度のIGF−１の1.1mgが得られる。実験
条件：バイダック（Vydac）218T510 RP−HPLCカラム、
10×250mn;分離当りのアリュート部分（200μ濃縮1:1
0）;AUFS0.5、220nm;流速:3ml/分、溶離液:A:0.1％トリ
フルオロ酢酸、３分35％Ｂ、次に35％の間に45％Ｂに増
大。得られたフラクションを1:1希釈し、凍結乾燥す
る。
ｂ）菌株pC1/1/PAPFL−IGF−１（UAS1）の醗酵からのIG
F−１の特性 培地（実施例10a参照）から単離されたIGF−１をRP−HP
LC分析に従って血清からのIGF−１標品と得られる。
等電点pI:8.6（等電フオーカシング、蛋白のTCA沈殿） アミノ酸組成の決定 純粋なIGF−１の約2.5μｇの110℃で6NHClで24時間加水
分解し、次にチャン（Chang）等により報告〔DABS−C1
方法；「メソド・イン・エンチモロジイ」（Methods in
Enzymology）、第91巻、第41頁、1983年〕されている
ように分析する。加水分解物は次の組成を有している。アミノ酸 加水分解物 アミノ酸 加水分解物 AsP 5.7 （５） Ile 0.7 （１） Thr 3.2 （３） Leu 5.9 （６） Ser 5.2 （５） Tyr 2.8 （３） Clu 6.5 （６） Phe 3.9 （４） Pro 5.3 （５） His − − Gly 7.2 （７） Lys 3.0 （３） Ala 6.1 （６） Arg 6.0 （６） Val 2.7 （３） Met 0.9 （１） Gystin 2.2 （３） 計 （70） 部分配列分析 純粋なIGF−１の70μｇ（10n mol）をエドマン（Edma
n）に従って通常の配列解析にかける。Ｎ−末端PTH−ア
ミノ酸はRP−HPLCによって測定する。
結果 n.d.:測定せず ＊:Cys（６）およびCys（18）は別個にヨウ素アセトア
ミドによるカルボキシメチル化により測定する。
アミノ酸１−50からの部分配列はこのようにしてIGF−
１標品の公知の一次配列と同定される。
Ｃ−末端分析 純粋なIGF−１をカルボキシペプチダーゼＹで消化し、
そして遊離アミノ酸をアミノ酸アナライザーで測定する
〔J.Y.チャン.R.クネデル（Knedel）、D.G.ブラウン（B
raun）、バイオケム（Biochem）.J.第199巻、第547頁参
照〕。
結果 アミノ酸 70 ５分消化：−Ala 120分消化:Ser−Ala 見かけ分子量 IGF−１（30μｇ）をSDS尿素ゲル〔SUSDゲル；カイト
（Kyte）等、アナル：ビオケム（Anal.Biochem.）、第1
33巻、第515頁、1983年参照〕で分析する。6000〜7000
ダルトンの見かけ分子量に相当する単一バンドが認めら
れる。
FAB−MSによる分子量測定 IGF−１をファスト・アトム・ボンバードメント・ポジ
ティブ・イオン・マス・スペクロメトリー（fast atom
bombardment positive ion mass spectrometry）（FAB
−MS）にかける。装置：マンチェスター、VG−アナリテ
ィカル・リミッテッド（VG−Analytical Ltd.）のZAB−
HFマス・スペクトロメーター；マトリックス：チオグリ
セロール；キヤノンボンバード；イオンエネルギー3Ke
V;外部検量:Cs30J29（分子量:7667.4） 実験式:C331H518N94O101S7 分子量（計算値）:7648.71 〃 （実験値）:7648.07
【図面の簡単な説明】
第１図はPH05プロモーター領域のBamH I−Sa IIフラグ
メントのDNA配列を示す。 第２図はGAPDHのプロモーター領域のDNA配列〔クローン
491、G.A.ビターBitter）等、ジーン（Gene）、第32
巻、第263頁、1980年参照〕を示す。 第３図はプラスミドpGAPDH−ELの生産を図示する。 第４図は本発明で用いるGAPDH遺伝子の３′プロモータ
ーエレメントを示す。 第５図はプラスミドpJDB207R/RH05−EGLの生産を示すダ
イヤグラムを示す。 第６図はプラスミドpJDB207/PAPEL−EGL（UAS1）の構成
を示す。 第７図は成熟デスルフトヒルディンをコードしているDN
Aフラグメントの単離を示す図式を示す。 第８図はプラスミドpJDB207/PH05−HIRの製造を図示す
る。 第９図はプラスミドpJDB207/PH05（Eco）−HIRの構成を
図示する。 第10図はプラスミドpJDB207/PAPEL−TPA（UAS1＋UAS2）
の構成を示す図式を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１図のイーストPH05遺伝子のヌクレオチ
    ド−174と541との間のBamH I−bstE IIフラグメントに
    含まれる、上流活性配列UAS1（PH05）および／またはUA
    S2（PH05）を含む５′上流プロモーターエレメント。
  2. 【請求項２】上流活性配列UAS1（PH05）を含む５′上流
    プロモーターエレメントが、イーストPH05遺伝子のヌク
    レオチド−274と−541との間のBamH I−Cla Iフラグメ
    ントである、特許請求の範囲第１項記載の５′上流プロ
    モーターエレメント。
  3. 【請求項３】上流活性配列UAS1（PH05）を含む５′上流
    プロモーターエレメントが、式 GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT のDNAである、特許請求の範囲第１項記載の５′上流プ
    ロモーターエレメント。
  4. 【請求項４】上流活性配列UAS2（PH05）を含む５′上流
    プロモーターエレメントが、イーストPH05遺伝子のヌク
    レオチド−174と−273との間のCla I−BStE IIフラグメ
    ントである、特許請求の範囲第１項記載の５′上流プロ
    モーターエレメント。
  5. 【請求項５】第１図のイーストPH05遺伝子のヌクレオチ
    ド−174と−541との間のBamH I−BstE IIフラグメント
    に含まれる上流活性配列を含む５′上流プロモーターエ
    レメント、および第２図のイーストGAPDH遺伝子のヌク
    レオチド−300乃至−180で始まり、ヌクレオチド−１で
    終るイーストGAPDH遺伝子の３′下流プロモーターエレ
    メントからなる、イーストハイブリッドプロモーター。
  6. 【請求項６】５′上流プロモーターエレメントが、イー
    ストPH05遺伝子のヌクレオチド−174と−541との間のBa
    mH I−BStE IIフラグメントである、特許請求の範囲第
    ５項記載のハイブリッドプロモーター。
  7. 【請求項７】５′上流プロモーターエレメントが、イー
    ストPH05遺伝子のヌクレオチド−274と−541との間のBa
    mH I−Cla Iフラグメントである、特許請求の範囲第５
    項記載のハイブリッドプロモーター。
  8. 【請求項８】５′上流プロモーターエレメントが、式 GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT のDNAである、特許請求の範囲第５項記載のハイブリッ
    ドプロモーター。
  9. 【請求項９】５′上流プロモーターエレメントが、イー
    ストPH05遺伝子のヌクレオチド−174と−273との間のCl
    a I−BstE IIフラグメントである、特許請求の範囲第５
    項記載のハイブリッドプロモーター。
  10. 【請求項１０】３′下流プロモーターエレメントが、イ
    ーストGAPDH遺伝子のヌクレオチド199乃至−１である、
    特許請求の範囲第５項記載のハイブリッドプロモータ
    ー。
  11. 【請求項１１】３′下流プロモーターエレメントが、イ
    ーストGAPDH遺伝子のヌクレオチド−263乃至−１であ
    る、特許請求の範囲第５項記載のハイブリッドプロモー
    ター。
  12. 【請求項１２】第１図のイーストPH05遺伝子のヌクレオ
    チド−174と−541との間のBamH I−BstE IIフラグメン
    トに含まれる上流活性配列を含む５′上流プロモーター
    エレメント、および第２図のイーストGAPDH遺伝子のヌ
    クレオチド−300乃至−180で始まりヌクレオチド−１で
    終る３′下流プロモーターエレメントからなるハイブリ
    ッドプロモーターの転写コントロール条件下で、イース
    トに対して異種のポリペプチドをコードしているDNA断
    片の１個または複数のDNAを挿入したイーストハイブリ
    ッドベクター。
  13. 【請求項１３】５′上流プロモーターエレメントが、イ
    ーストPH05遺伝子のヌクレオチド−174と−541との間の
    BamH I−BstE IIフラグメントである、特許請求の範囲
    第12項記載のハイブリッドベクター。
  14. 【請求項１４】５′上流プロモーターエレメントが、イ
    ーストPH05遺伝子のヌクレオチド−274と−541との間の
    BamH I−Cla Iフラグメントである、特許請求の範囲第1
    2項記載のハイブリッドベクター。
  15. 【請求項１５】５′上流プロモーターエレメントが、式 GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT のDNAである、特許請求の範囲第12項記載のハイブリッ
    ドベクター。
  16. 【請求項１６】５′上流プロモーターエレメントが、イ
    ーストPH05遺伝子のヌクレオチド−174と−273との間の
    Cla I−BstE IIフラグメントである、特許請求の範囲第
    12項記載のハイブリッドベクター。
  17. 【請求項１７】３′下流プロモーターエレメントが、イ
    ーストGAPDH遺伝子のヌクレオチド199乃至−１である、
    特許請求の範囲第12〜16項のいずれか１項記載のハイブ
    リッドベクター。
  18. 【請求項１８】３′下流プロモーターエレメントが、イ
    ーストGAPDH遺伝子のヌクレオチド−263乃至−１であ
    る、特許請求の範囲第12〜16項のいずれか１項記載のハ
    イブリッドベクター。
  19. 【請求項１９】イーストハイブリッドプロモーターが、
    成熟ポリペプチドのコード領域に直接結合している、接
    合点に翻訳開始コドンATGを有する特許請求の範囲第12
    項記載のハイブリッドベクター。
  20. 【請求項２０】ポリペプチドコード領域が、シグナル配
    列を有するポリペプチドをコードしている、特許請求の
    範囲第12項記載のハイブリッドベクター。
  21. 【請求項２１】第１図のイーストPH05遺伝子のヌクレオ
    チド−174と−541との間のBamH I−BstE IIフラグメン
    トに含まれる上流活性配列を含む５′上流プロモーター
    エレメント、および第２図のイーストGAPDH遺伝子のヌ
    クレオチド−300乃至−180で始まりヌクレオチド−１で
    終る３′下流プロモーターエレメントからなるハイブリ
    ッドプロモーターの転写コントロール条件下でイースト
    に対して異種のポリペプチドをコードしているDNA断片
    の１個または複数のDNAを挿入したハイブリッドベクタ
    ーで形質転換された、イースト宿主。
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