JPH03232497A - 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は医薬品等に有用なＬ−グルタミンの発酵法によ
る製造方法に関する。より詳しくは本発明は、６−ジア
ゾ−５−オキソーノルロイシンに対して耐性を有するコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物を使用してＬ−グルタミンを効率的に製造する
方法に関する。

［従来技術の説明］ Ｌ−グルタミンを発酵法により製造する方法として従来
い（つか提案されている。それらの方法は、ブレビバク
テリウム属あるいはミクロコツカス属に属するＬ−グル
タミン生産能を有する菌株を過剰の窒素源の存在下で培
養する方法（特公昭３９−７３９１号公報）；前記菌株
を酸性条件下で培養する方法（特公昭４０−１２４７４
号公報）；前記菌株を特定量の重金属イオンの存在下で
培養する方法（特公昭４２−７５９５号公報、同４３−
６９９３号公報）等である。

これらの方法の他に次のような方法も提案されている。

即ち、コリネバクテリウム　グルタミカム、ミクロバク
テリウム　フラバムまたはブレビバクテリウム　フラバ
ムに属し、サルファ剤に対して耐性を有し、Ｌ−グルタ
ミン生産能を有する菌株を用いる方法（特公昭５１−４
４１９６号公報、同５３１７６７５号公報）；コリネバ
クテリウム属に属し、トリメトプリム、モノフルオロ酢
酸、弗化ナトリウムあるいはアザセリンに対して、耐性
を有し、Ｌ−グルタミン生産能を有する菌株を用いる方
法（特公昭６２−５１１１２号公報）；コ；ノネバクテ
リウム属に属するオレイン酸要求性変異株を用いる方法
（特公昭６３−１６０５９３号公報）等が提案されてい
る。

上述の方法によれば、それなりの収量でＬ−グルタミン
が得られるが、いずれの場合にあってもＬ−グルタミン
酸が可成りの量副生するという問題がある。この問題を
解決するについて、培地に過剰量のビオチンを添加する
方法が例えば特開昭６２−１８６７９６号公報により提
案されている。この方法によれば、Ｌ−グルタミン酸の
生成蓄積をある程度抑えることはできるが、いずれにし
ろ、依然可成りの量のＬ−グルタミン酸の副生があり、
且つＬ−グルタミンの収量が減退する場合がしばしばあ
る。

［発明の目的１ 本発明の目的は、Ｌ−グルタミンを効率よく多収量で得
ることができる方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、Ｌ−グルタミン酸の副生が顕著に
抑えられてＬ−グルタミンを効率よく多収量で得ること
ができる方法を提供することにある。

〔発明の構成・効果１ 本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた
結果、コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウ
ム属に属しかっ６−ジアゾ−５オキソ−ノルロイシン（
以後”　Ｄ　ＯＮ”と略称する。）に対する耐性が賦与
された菌株が該耐性を有しない菌株の場合に比べてＬ−
グルタミン生産能において顕著に優れていることを見い
出した。

本発明はこの知見を基に更なる検討を行った結果完成に
至ったものであり、その骨子は上述する内容のものであ
る。

即ち、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属し、ＤＯＮ　（即ち、６−シアシーＳ−オキソー
ノルロイシン）に対して耐性を有し、且つＬ−グルタミ
ン生産能を有する菌株を炭素源、窒素源及びその他の栄
養素を含有する培地中で培養してＬ−グルタミンを前記
培養物中に生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン
を採取することを特徴とするＬ−グルタミンの製造方法
。

本発明において使用する菌株としては、上述したように
、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属し、ＤＯＮに対し耐性を有し、Ｌ−グルタミン生産能
を有する菌株であればいずれのものであっても使用でき
る。

こうした菌株の選択分離は例えば次のようにして行なう
ことができる。

即ち、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属し、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミン酸生産
能を有する菌株を親株とし、これに公知の手法で変異誘
導処理を施して変異菌株を得る。この際の変異誘導処理
手法としては、紫外線照射処理、放射線照射処理、変異
誘起剤による処理等が好ましいものとして例示できる。

こうして変異誘導処理して得られる変異菌株の中からＤ
ＯＮに対して耐性を有する菌株を分離する。この際の分
離は、例えば、ＤＯＮを含有する培地で前記変異菌株を
馴致培養することによって分離する。

この際、使用するＤＯＮとしては、６−ジアゾ−５−オ
キソ−Ｌ−ノルロイシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｄ
−ノルロイシン及び６−ジアゾ−５−オキソ−Ｄ、Ｌ−
ノルロイシンが挙げられる。これらのＤＯＮの中、６−
ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンが好ましく使用
される。これらのＤＯＮは、親株の生育を阻害する濃度
、即ち、通７＃１〜１０００　ｍｇ／（２で使用される
。

なお、本発明においては、上述の人為的に処理して得ら
れる菌株以外に、自然界に存在する野生株の中から、Ｌ
−グルタミン生産能を有し且つＤＯＮに対し耐性を有す
るものをスクリーニングにより選択分離して得られる株
を使用することもちろん可能である。

本発明において使用する、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−グルタミン生産能を
有し且つＤＯＮに対し耐性を有する菌株の具体的代表例
として次のものを挙げることができる。

即ち、コリネバクテリウム　メラセコラ（徹工研菌寄第
５５８号）を親株とし、これから得られたＤＯＮ耐性変
異株コリネバクテリウム　メラセコラＤＨ３４４（微工
研菌寄第１１１１７号）、ブレビバクテリウムフラバム
（ＡＴＣＣ１３８２６）を親株とし、これから得られた
ＤＯＮ耐性変異株ブレビバクテリウムフラバムＤＨ１８
ｆ微工研菌寄第１１１１６号）等である。

本発明において使用する上記ＤＯＮ耐性株は、上述した
方法により採取することができるが、その具体的内容を
以下の採取例により説明する。

振取土ユ コリネバクテリウム　メラセコラ（微工研菌寄第５５８
号）を親株にしたＤＯＮ耐性株の採取前記コリネバクテ
リウム　メラセコラの菌株をニトロソグアニジン処理（
１００ｍｇ／、ｅ　：　３０分間）した後、下記の組成
の寒天培地に菌数約４Ｘ１０’個を塗布し、５〜１０日
間３２℃にて培養した。

壇上Ｊ１成 グルコース　　　　　　　　　　　　０１％硫酸アンモ
ニウム　　　　　　　　　０３％Ｎ　ａｘ　３０４　　
　　　　　　　　　０．２％ＫＨ２Ｐ０．　　　　　　
　　　　　０．１％ＫａＨＰ０．　　　　　　　　　　
　０．３％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，ＯＯ，０５％ビオ
チン　　　　　　　　　　　　５０ｕｇ／ｉＤ　ＯＮ　
　（６−ジアゾ−５−オＮソーＬ−ノルロイシン）　　
　　　ｌｏｏｍｇ／ｊ２寒天　　　　　　　　　　　　
　　　２．０％（ｐＨ７，ＯＮａ０Ｈ） その結果、５３個のコロニーが出現した。これらをＤＯ
Ｎ耐性株とて分離した。

１肛±ユ ブレビバクテリウム　フラバム　ＡＴＣＣ：　１３８２
６を親株にしたＤＯＮ耐性薗の採取 前記ブレビバクテリウム　フラバムの菌株をニトロソグ
アニジン処理　ｆ１００ｍｇ／ｆ２：３０分間）した後
上述と同様の寒天培地に約４　Ｘ　ｔｏ’個塗布し５〜
１０日間３２℃にて培養したところ、３２個のコロニー
が出現した。

これらをＤ　ＯＮ　ｉｊＩ性株として分離した。

それぞれの菌株をブイヨンスラントで、３２℃の温度で
２４時間培養し、得られた菌体を無菌水に懸濁し、ＤＯ
Ｎ　（６−ジアゾ−５−オキソ−し−ノルロイシン）を
第１表に示す温度で含有した上述の寒天土音地にｌ！１
体を１０′個／プレートの濃度となるように接種して３
２℃の温度で４２時間培養を行って生育の有無を調べた
。その結果は第１表に示すとおりであった。なお、採取
例１で得た５３個のコロニーからする菌株については、
その一部を選択して供試した。第１表に示す結果から明
らかなように、供試した採取例１で得た菌株は全て、親
株の生育が阻害される１００ｍｇ／ｆ２のＤＯＮ濃度の
プレートで良好に生育した。

（２）ブレビバクテリウム　フラバム　ＡＴＣｏ　１３
８２６の　　　び採取例２で　た　　についての　察そ
れぞれの菌株をブイヨンスラントで、３２℃の温度で２
４時間培養し、得られた菌体を無菌水に懸濁し、ＤＯＮ
　（６−ジアゾ−５−オキソ−し−ノルロイシン）を第
２表に示す濃度で含有した上述の寒天培地に菌体を１０
７個／プレートの濃度となるように接種して３２℃の温
度で４２時間培養を行って生育の有無を調べた。その結
果は第２表に示すとおりであった。なお、採取例２で得
た３２個のコロニーからする菌株については、その一部
を選択して供試した。第２表に示す結果から明らかなよ
うに、供試した採取例２で得た菌株は全て、親株の生育
が阻害される１００ｍｇ／βのＤＯＮ濃度のプレートで
良好に生育した。

（以下余白） 第１表 第２表 のＬ−グルタミン についての それぞれの菌株を後述する実施例１と同様にして培養し
、Ｌ−グルタミンの生産性を調べた。その結果第３表に
示す結果が得られた。第３表に示した結果から次のこと
が判明した。即ち、親株である前記コリネバクテリウム
　メラセコラの場合、Ｌ−グルタミン酸が多量生成し、
Ｌ−グルタミンの生成量は極めて少ない。これに対し、
供試したＤＯＮ耐性菌株については、全て、Ｌ−グルタ
ミンが多量生成し、Ｌ−グルタミン酸の生成は顕著に少
ない。そして、供試したＤＯＮ耐性菌株の中、コリネバ
クテリウム　メラセコラＤＨ３４４の場合、Ｌ−グルタ
ミンの生成量は特に顕著で、Ｌ−グルタミン酸の生成は
極めて少ないことが判った。該コリネバクテリウム　メ
ラセコラＤＨ３４４を代表株として通商産業省工業技術
院微生物工業研究所に平成元年１１月１６日付けで徹工
研菌寄第１１１１７号ｆＦＥＲＭ　Ｐ−１１１１７）と
して寄託しである。

それぞれの菌株を後述する実施例１と同様にして培養し
、Ｌ−グルタミンの生産性を調べた。その結果第４表に
示す結果が得られた。第４表に示す結果から次のことが
判明した。即ち、親株である前記ブレビバクテリウム　
フラバムの場合、Ｌ−グルタミン酸の生成は多く、Ｌ−
グルタミンの生成は極めて少ない。これに対し、供試し
たＤＯＮ耐性菌株については、全て、Ｌ−グルタミンが
多量生成し、Ｌ−グルタミン酸の生成は顕著に少ない。

そして、供試したＤＯＮ耐性菌株の中、ブレビバクテリ
ウム　フラバムＤＩ　１８の場合、Ｌ−グルタミンの生
成量は特に顕著で、Ｌ−グルタミン酸の生成は極めて少
ないことが判った。該ブレビバクテリウム　フラバムＤ
Ｈ１８を代表株として通商産業省工業技術院微生物工業
研究所に平成元年１１月１６日付けで微工研菌寄第１１
１１６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１１１６）として寄託しで
ある。

（以下余白） 第３表 第４表 以下に、上述した２種の菌株の菌学的性質について説明
する。

（１）顕微鏡による所見 通章（０，５−１，０）　Ｘ　（０，８−２，０ｊミク
ロンの桿菌で、大小不同のものを含む。スナツピングデ
イビジョンによるｖ字状配列と多形性を示す。ダラム染
色陽性、非運動性で胞子をつくらない。

（２）培養による所見 ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはっきりした正円
形で、不透明で光沢があり、色は黄色である。寒天斜面
上では接種線に沿って線上に旺盛な生育を示し、臭気や
培地の着色はない。寒天穿刺培養では、最上部で旺盛な
生育を示す。液体ブイヨン培地では均質に濁り、表面に
リングを形成する。

（３）生理的性質 ａ、温度：２５℃−３７℃で生育する。

Ｂ、　ｐＨ：　ｐＨ６−ｐＨ９で生育可能である。

Ｃ 耐熱性：１０％スキムミルク中で５５℃前後で１５分程
度の耐熱性を有する。

好気性である。

ゼラチンを液化しない。

リドマスミルクを変化させない。

インドールを生産しない。

フォーゲス・プロスカラエル試験 （Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓ　Ｘａｕｅｒ　ｔｅｓｔｌ　：
　ｌ［ｊｉ性・硫化水素を生成しない。

、メチルレッド試験：陽性。

硝酸塩還元性：陰性。

クエン酸を利用しない。

デンプンを液化しない。

ウレアーゼ生成：陽性。

カタラーゼ生成：ｌ１ｊｌ性。

各種炭水化物からの酸の生成ニゲルコース、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノースより酸を
生成するが、マンニトール、キシロース、アラビノース
、ラフィノース、ラクトースからは酸を生成しない。

ｒ。

ビオチンを要求する。

ビオチン制限培地で、または高濃度ビオチン含有培地で
は界面活性剤の添加により、培地中にＬ−グルタミンを
著量蓄積する。

６−ジアゾ−５−オキソーノルロイシンに耐性を有する
。

（１）顕微鏡による所見 通常０．５　Ｘ　（０，６〜２．０）ミクロンの短桿菌
で、学園もしくは二連園であるダラム染色陽性、非運動
性で胞子をつ（らない。

（２）培養による所見 ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはっきりした正円
形で、表蘭が滑らかで乾燥しており、色は黄色である。

寒天斜面上では接種線に沿って線状に生育し、表面は乾
燥していて、鈍い光沢があり、色は黄色である。寒天穿
刺培養では、最上部、表面上で生育を示し、空気の通わ
ない部分では生育しない。

生理的性質 温度：２０〜３７℃で生育する。

ｐＨ：ｐＨ６−ｐＨ８で生育可能である。

好気性である ゼラチンを液化しない。

リドマスミルクを変化させない。

インドールを生産しない。

フォーゲス・プロスカラエル試験 （Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓ　Ｋａｕｅｒ　ｔｅｓｔｌ　：
陰性◇硫化水素を生成しない。

メチルレッド試験：陰性。

硝酸塩還元性：陽性。

デンプンを液化しない。

ウレアーゼ生成：陽性。

カタラーゼ生成：陽性。

アンモニア生成：陽性。

各炭水化物からの酸の生成ニゲルコース、フラクトース
、マンノース、シュークロース、マルトースより酸を生
成するが、マンニトール、キシロース、アラビノース、
ラフィノース、ラクトースからは酸を生成しない。

ｐ、各炭水化物からの気体の生成：メリビオースより気
体を生成する。

ｑ、６−ジアゾ−５−オキソーノルロイシンに耐性を有
する。

本発明による上述した菌株を用いて本発明の方法により
Ｌ−グルタミンを生成せしめるについては特に困難はな
い。即ち、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及び使
用する微生物が栄養要求性を有する場合はその要求する
栄養物質を含有する通常の栄養培地を用いて常法により
行うことができる。使用する炭素源としては、グルコー
ス、糖蜜、デンプン加水分解液などの糖類、酢酸などの
有機酸類、エタノールあるいはメタノールなどのアルコ
ール類等が使用可能である。窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸ア
ンモニウム、尿素、アンモニア等を適宜選択して使用で
きる。本発酵は振どう培養あるいは通気攪はん培養等の
好気的条件で行うことが望ましく、培養温度は２４〜３
７℃、培養日数は２〜５日である。高収率を得るために
は、培養開始時または培養期間中に適当な中和剤を用い
て培地をｐ＋＋５．５〜８．５の範囲に調整することが
好ましい。

培養終了後のＬ−グルタミンの採取は、常法により、濃
縮法、イオン交換法等により行うことができる。

〔実施例］ 以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明
はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

グルコース ペプトン 尿素 肉エキス ＫＨ，ＰＯ４ に、ＨＰＯ。

Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈａ ３．０　　％ １．０　　％ １．０　％ ０５　％ ０．０５　％ ０．０５　％ ０　　　　　　　　　　　０．０５　　％Ｆｅ５Ｏ＝　
　・　７Ｈａ　　ＯＯ，００１％Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・　
４　Ｈ２００，００１％チアミン　　　　　　　　　　
　　０．０００２％ビオチン　　　　　　　　　　　　
　２０μｇ／β１ｐＨ７，３〜７．４） メ　イ　ンを立　　上室　　　。

グルコース　　　　　　　　　　　　１０．０％硫酸ア
ンモニウム　　　　　　　　　５．０％ＫＨ２Ｐ○４０
．２５％ Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，ＯＯ，０５％ Ｍｎ５Ｏ−・４〜６Ｈｉ　ＯＯ，００１％Ｃｕ５Ｏ，’
　５Ｈ，ＯＯ，０００１％ＣａＣ０，３，０％ チアミン　　　　　　　　　　　　０．０００１％ビオ
チン　　　　　　　　　　　　２．５ＬＬｇ＃２（ｐＨ
６，５） あらかじめ３２℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育
させたコリネバクテリウム　メラセコラＤＨ３４４株（
徹工研菌寄第１１１１７号）を、上述の組成からなるシ
ード培養培地に１白金耳摺種し、３２℃で１５時時間上
う培養を行った。このシード培養液４　ｍＡを上記メイ
ン培養培地５０　ｍｆ２含む５０Ｃ４ｙａ　１２容坂ロ
フラスコに移植し、常法により３２℃にて７２時時間上
う培養した。

発酵終了液中に生成蓄積されたＬ−グルタミンは３．５
ｇ／ｄｆ２であった。また、グルタミン酸の副生は０．
７ｇ／ｄ、ｅであった。一方、上記と同様の培地、培養
条件でコリネバクテリウム　メラセコラ（微工研薗寄第
５５８号）を培養したところ発酵終了液中に０．４ｇ／
ｄｇのＬ−グルタミンが生成蓄積した。またグルタミン
酸の副生は２．９ｇ／ｄｆｆであった。

グルコース 硫酸アンモニウム コーンスチーブリカー ＫＨ，ＰＯ。

Ｋ、ＨＰＯ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈａ　０ ５％ １％ １％ ０．１　％ ０．１　　％ ０．０５　％ ＦｅＳＯ４・　７Ｈａ　　Ｏ０，０［１０１％Ｍｎ５Ｏ
，・　４〜５Ｈ−００，０ＣＩ０１　　％Ｚ　ｎ　Ｓ　
Ｏ−・　７　Ｈｘ　　ＯＯ，０００１％Ｃｕ５Ｏ−・　
５Ｈｚ　　ＯＯ，０００Ｌ　　％チアミン　　　　　　
　　　　　　０．０００２％ビオチン　　　　　　　　
　　　　３０μｇ＃２（ｐＨ７，４１ 乙と２１ＪｌＬｌ亙威 グルコース　　　　　　　　　　　　　　５％硫酸アン
モニウム　　　　　　　　　５．５％酵母エキス　　　
　　　　　　　　０．２％ＫＨ２１０４０，２５％ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，０４％ＺｎＳＯ４’　
７Ｈｚ○　　　　　０．０００１％ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ
Ｏロ０００１％ Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４・５　Ｈ２００，０００１％Ｍｎ　Ｓ　
Ｏ−・４〜５　Ｈａ　ＯＯ，００１％ビオチン　　　　
　　　　　　　　５μｓ／ｇ（ｐＨ７，４） あらかじめ３２℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育
させたコリネバクテリウム　メラセコラＤＨ３４４株（
黴工研菌寄第１１１１７号）を、上述の組成からなるシ
ード培養培地に１白金耳摺種し、３２℃で１５時時間上
う培養を行った。このシード培養液ＩＬを上記メイン培
養培地１０Ｉ２を含む２０β容ジャーファーメンタ−に
移植し３２℃、４５０ｒｐｍ、通気毎分１０ｉにて培養
を行った。培養中のｐＨはアンモニア水により常時６〜
７に維持し、糖の不足はグルコース（５０ｇ／　ｍｌの
補糖溶液を添加し、７２時間培養を行った。

発酵終了に生成蓄積されたＬ−グルタミンは８．４ｇ／
ｄｆｆであった。また、グルタミン酸の副生は０．５ｇ
／ｄβであった。

この発酵終了液１０Ｌから遠心分離によって菌体を除去
して上清液を得、これからイオン交換樹脂を用いる常法
に従ってＬ−グルタミンを分離、精製を行ったところＬ
−グルタミンの結晶６９０ｇを得た。一方、上記と同様
の培地、培養条件でコリネバクテリウム　メラセコラ（
黴工研薗寄第５５８号）を培養したところ発酵終了液中
に４．５ｇ／ｄβのＬ−グルタミンが生成蓄積した。ま
たグルタミン酸の副生は２．１ｇ／ｄｆｆであった。

１１！ユ ブレビバクテリウム　フラバム　ＤＨ１８株（徹工研菌
寄第１１１１６号）を実施例２と同様の培地組成、培養
条件で７２時間培養を行った。

発酵終了液中に生成蓄積されたＬ−グルタミンは３．２
ｇ／ｄＩ２であった。また、グルタミン酸の副生は０．
４ｇ／ｄＩ２であった。一方、ブ１／ビバクテリウム　
フラバム　ＡＴＣＣ１３８２６を同様に培養したところ
発酵終了液中に１．０ｇ／ｄｆｆのＬ−グルタミンが生
成蓄積した。また、Ｌ−グルタミン酸の副生は０．８ｇ
／ｄ１２であった。

［発明の効果の概要］ 本発明によればコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属し、かつＤＯＮに耐性を有し、Ｌ−グル
タミン生産能を有する微生物を培養することによって、
特殊な薬剤の添加や特殊な培養方法を行わなくてもＬ−
グルタミンの生成蓄積量が著しく向上し、さらに副生ず
るＬ−グルタミン酸の量が低下することから培養終了液
から容易にＬ−グルタミンを高収率で得ることができる
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはプレビバクテリウム属に属
   し、６−ジアゾ−５−オキソーノルロイシンに対して耐
   性を有し、且つＬ−グルタミン生酸能を有する菌株を培
   養してＬ−グルタミンを培養物中に生成蓄積させ、該培
   養物からＬ−グルタミンを採取することを特徴とするＬ
   −グルタミンの製造方法