JPH044887A - Ｌ―リジンの発酵的製造法 - Google Patents

Ｌ―リジンの発酵的製造法

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JPH044887A
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豊 村上
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三輪　治文
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茂 中森
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、コリネバクテリウム属に属し、４０℃以上で
も生育しつる、かつ５−（２−アミノエチル）Ｌ−−シ
ステイン（ＡＥＣ＞に耐性を有するＬリジン生産性変異
株を培地に培養して培養液中にＬ−リジンを生成・蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの
発酵的製造法及びこのようなし−リジンの発酵的製造法
に好適に使用することができる新規なＬ−リジン生産性
変異株そのものに関する。
（従来の技術） 家畜飼料の添加物等として重要な用途を有するＬ−リジ
ンは主として発酵法により製造されている。
しかして、Ｌ−リジンの発酵的工業生産において経流性
を高める技術的な要因はいくつかある。
例えば、対糖収率の向上、Ｌ−リジンの蓄積濃度の向上
、培養時間の短縮化等々である。
其の他に要因として重要なものに培養温度の高温化があ
る。培Ｉｆｉ度はＬ−リジンの発酵至適温度で行れるが
従来のＬ−リジン生産菌を使用する場合、この温度は通
常２８〜３５℃である。培養が開始されると発酵熱が発
生するためにそのまま放置すれば培養液の温度は上昇し
、Ｌ−リジンの生成は著じるしく低下する。培養液の温
度を至適に維持するためには、発酵槽内に熱交換機を設
置し、これに冷水を循環させることが必要となる。冷水
を得るためには冷凍機を使用しなければならないが発生
する光酵熱が英大であるため冷凍機で消費する電気エネ
ルギーも大きなものとなっている。
従って１−−リジン発酵の培養温度を従来より上昇させ
ることが出来れば冷却負担が減少し、もってＬ−リジン
の工業生産の経済性が高められるものである。
Ｌ−リジン発酵において培ｉ温度の高温化を図ったもの
としては、韓国特許出願公告８５−１２３１号公告特許
公報（１９８５，８，２３公告）に記載の方法がある。
すなわち、この方法は、コリネバクテリウムに属し、リ
ジンアナログ耐性及び温度耐性を有し、ホモセリン、ロ
イシン及びバリンを複合要求するＬ−リジン生産性変異
株Ｔ　Ｒ−３５７９（ＫＦＣＣ１００６５）を使用し、
これを培地で高温培養（３７〜４５”ＣＡして培養液中
にＬ−リジンを生成・蓄積せしめるものである。
しかして、この方法で使用されるＬ−リジン生産性変異
株は、通常のＬ−リジン生産菌（３０〜３５℃で生育）
を変異処理によりより高温（３７〜４５℃）でＬ−リジ
ンを生産できるように改良して得たものであるところ、
数段階の変異処理のため、前記のように、ホモセリン、
ロイシン及びバリンのアミノ酸の複合要求性となってお
り、実用性に欠ける。
特開昭５８−１７０４８７号公開特許公報には、ブレビ
バクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活性が低下
し、かつＬ−リジン生産能を有し、５（２−アミンエチ
ル）−し−−システイン（ＡＥＣ＞耐性を任意的に併有
する変異株を培養して培養液中にＬ−リジンを生成パ蓄
積せしめ、これを採取する発酵法によるＬ−リジンの製
造法が記載されている。
しかして、この方法における発酵温度は２０〜４０℃と
されているが、唯一の実施例（実施例１）で採用されて
いる温度が３０℃であることから推定されるように、ま
た本発明者の追試実験によっても確認されたように、発
酵温度範囲の上限４０℃近辺では使用菌の生育は顕著で
なく、顕著なＬ−リジンの生成・蓄積は見られない。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、実用に耐えつるＬ〜リジンの高温発酵菌、惹
いては実用に耐えうるＬ−リジンの高温発酵法を提供す
ることを目的とする。
（ｉ！ｉ！題を解決するための手段） 本光明者は前者の課題を解決すべく鋭意研究の結果、４
０℃以上でも生育可能な高温性のコリネバクテリウム属
の細菌にＡＥＣ耐性を付与して［リジン生産菌に改良し
た変異株を使用すれば前記の目的を達成し得ることを見
出し、このような知見に基いて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、コリネバクテリウム属に属し、４
０°Ｃ以上でも生育しつる、かつＡＥＣに耐性を有する
Ｌ−リジン生産性変異株を培地に培養して培養液中にＬ
−リジンを生成・蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とするし−リジンの発酊的製造法及びこのようなＬ−
リジンの梵酊的製造法に好適に使用することができる新
規なＬ−リジン生産性変異株そのものに関する。
以下、本弁明について詳述する。
本発明で使用できるコリネバクテリウム属に属し、４０
℃以上でも生育し得、かつＡＥＣ耐性のしリジン生産性
変異株は、例えば、コリネバクテリウム属に属し４０℃
以上でも生育可能な細菌、例えばＬ−グルタミン酸生産
菌、を親株とし、これを変異処理して冑ることができる
。
このような親株としては、例えば特開昭６３２４０７７
９号公開特許公報に記載の天然界より分離したコリネバ
クテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｎ　ｔｈｅｒｎｏａｎｉｎｏｇｅｎｅｓ）に
属する細菌を挙げることができる。
親株を変異処理に付してＬ−リジン生産性変異株を採取
するには格別のＩ！ｌ難はなく、従来公知の薬剤耐性変
異株採取方法によることができ、例えば、親株が生育出
来ない、ＡＥＣを１〜２ｇ／瀬含有する普通寒天平板培
地に、Ｎ−メチル−Ｎ”ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン等で変異処理（２５０埒／ｄ、３０℃で３０分）した
親株を塗布し、４０℃以上で例えば４３℃で培養した結
果生成したコ〇−を採取し、目的の変異株を得ることが
できる。
このようにして採取されたＬ−リジン生産性変異株とし
ては、例えば、次のものを挙げることができる： コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕＩｌｔｈｅｒｌｌｏａｉｉｎｏｇｅ
ｎｅｓ）Ａ　Ｊ　１２５２１　：コリネバクテリウム・
サーモアミノゲネスＡ　Ｊ　　１２５２２　：コリネバ
クテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ　　１２５２３．
及びコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ　　
１２５２４゜これらの変異株の菌学的性質は第１表の１
〜６の通りである。
因みに、親株コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
ＡＪ　　１２３０８及びＡＪ　　１２３０９はいずれも
工業技術院微生物工業技術研究所に国際寄託され、受託
番号ＦＥＲＮ　ＢＰ−１５４０及びＦＥＲＮ　ＢＰ−１
５４１をそれぞれ付与されている。また、変異株コリネ
バクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ　　１２５２１
、ＡＪ１２５２２、Ａ　Ｊ　　１２５２３及びＡＪ　　
１２５２４もいずれも上記研究所に寄託され、受託番号
ＦＥＲＮ　Ｐ−１１４０９、ＦＥＲＮ　Ｐ−１１４１０
、ＦＥＲＮ　Ｐ−１１４１１及びＦＥＢｔ４　Ｐ−１１
４１２をそれぞれ付与されている。
本光明のＬ−リジン生産性変異株を使用してしリジンを
生成・蓄積せしめる培地、すなわち、本発明で使用する
培地は、従来公知のＬ−リジン生産培地と同じでよく、
炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じて使用す
る微生物が要求する有機微量栄養素を含有する通常の栄
養培地が使用できる。炭素源としては使用する変異株の
利用可能なものであれば良く、例えばグルコース、シュ
ークロース、マルトース、これらを含む澱粉氷解物、糖
蜜等の糖類、エタノール、プロパツール等のアルコール
類、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、更に菌株によって
はノルマルパラフィン等も単独又は他の炭素源と併用し
て用いられる。窒素源としては酢酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩
、硝酸塩類、尿素、アンモニア、更には肉エキス等、無
機又は有機の窒素源が使用される。無ＩＮ塩類とじては
、ＫＨＰＯ、ＭＣ］ＳＯ、ＦｅＳＯ４゜Ｍｎ５０４等通
常使用されるもので良い。有機微量栄養素としてはビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にはこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白加水分解物が使
用される。
培養は好気的条件下で行うことが望ましく、培養期間中
ｐＨを５〜９好ましくは７〜８．５、温度を使用菌の生
育温度すなわち約２５〜５０℃、好ましくは高い１−リ
ジン生産活性維持の理由から約３５〜約４５℃の範囲内
となるように制卸しつつ２〜４日間振掃培養又は通気撹
拌培養づることによりＬリジンが＠吊培養液中に生成蓄
積される。
培養液からＬ−リジンを回収する方法は公知の方法に従
って行なえば良く、通常のイオン交換樹脂法、晶析法等
を適宜組合せて回収される。
本発明によるＬ−リジンの発酵温度は、前記のように、
使用菌の生育温度、すなわち約２５〜５０℃が使用し得
るが、好ましくはＬ−リジン生産活性の高い３５〜４５
℃である。後記実施例２及び３は実験室スケールにおい
て発酵温度を４３℃に制御しつつＬ−リジンの著量生成
・蓄積を実証している。
これより商業的スケールでの発酵熱除去のための冷却負
担を試算してみると、例えば容ｆｆ１２００ｋｇの発酵
タンクを使用してＬ−リジン発酵を行なった場合、従来
公知のＬ−リジン生産菌の至適発酵温度例えば３０℃を
維持するための冷却負担は１バッチ当り１０千冷凍トン
（ＪＲＴ）であったのに 対し、本発明のＬ−リジン生産性変異株を使用して発酵
温度を４３℃を超えないようにするための冷却負担は１
バッチ当り１千冷凍トン（ＪＲＴ）となる。このように
、本発明によれば冷却負担を９割削減することが可能と
なる。
（実施例） 以下、本発明を実施例により更に説明する。
実施例１　（変異株の採取） コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３０
８を常法により、Ｎ−メチル−Ｎ−−ニトロＮ−二トロ
ソグアニジンにて処理（２５０埒／ｄ。
３０℃で３０分）した後、下に示す最少培地に、ＡＥＣ
を１．５ｇ／瀬添加した培地で４３℃で生育したコロニ
ーを採取した。
最少培地組成ニ ゲルコース 尿　　　　　素 硫酸アンモニウム Ｈ２ＰＯ４ Ｍｇ５０　・７日２０ Ｆｅ５０　・７Ｈ２０ Ｌ−アラニン ニコチン酸アミド ２．０　　　ｇ／ｄρ ０．２５ｙ／、Ｊｊ！ １．０　　　ｇ／瀬 ０．１　　　ｇ／ｄｆ！ ０．０４ｇ／ＪＲ １、０１１ｇ／　ｃｌｆｆｉ ５０ＩＲｇ／ｄｆ！ ０．５　　／１ｇ／ｃｌｊ！ Ｍ　ｎ　Ｓ　０　　・４Ｈ２０１，０層Ｓ／瀬ビ　　Ａ
　　ブ　　ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５．０　　１１９／ｃＪ（！４ノイアミン塩酸堪　　　
　　　　１０　　１ｔｓ／、ＪＰ。
Ｎ　ａ　ｃρ　　　　　　　　　　　　　　　　−５■
／ｄｐ。
ｐ　Ｈ７，２ この様にして得られた変異株の内、Ｌ−リジン生産能の
すぐれた変異株としてＡ、、Ｊ　　１２５２１及びＡ、
）　−２５２２を採取した。
又、同様の方法により、コリネバクテリウム・＋ｊ−−
モアミノグネスＡＪ　　１２３０９を親株として、ＡＪ
　　１２５２３及びＡ　Ｊ　　１２５２４を採取した。
このようにして得られた変異株４株を、あらかじめグル
コース・ブイヨン寒天培地十に４３℃で生育させ、それ
ぞれ１白金耳づつ、５００ｄ容の振どうフラスコに分注
し、殺菌した下記組成の培地２０献に接種した。
培地組成： ビート糖蜜（グルｌ−ス換口） 硫酸アン［ニウム Ｈ２ＰＯ４ ＭｑＳＯ・　７　ト４゜　Ｏ ビ　　オ　　チ　　ン 炭酸カルシウム ｐＨ７，０ （別殺菌添加） ｇ／瀬 ａ／ｄｆ！ ｇ／、Ｊ（！ ｆｆ１ｇ／　、１ｆｆ ｎ／瀬 ９／′瀬 これらを４３℃で７２時間培養をおこなったところ第２
表のごとくリジンを蓄積した。
第　　２　　表 実施例２ 下記の組成の水性培地を２０ｄ　、　　５００ｄ容振と
うフラスコ分注し、１１０℃にて１０分間蒸気殺菌した
。
培地組成ニ ゲルコース ｇ／ｄ、ｅ ９／瀬 ｇ／ｃｌｊ’ ｇ／ｃｌρ ■／　、Ｊｆ！ ｍｓ　／　ｃＵＲ ＩＪ！Ｉ／　ｄｉ！ ＃　／　ｄｉ！ ４．５ ０．１ ０．０４ １．０ １．０ ５．０ ｒａＭ、アンモニウム Ｈ２ＰＯ４ Ｍｏ５Ｏ・７日２０ Ｆ　ｅｓｏ　　・７　Ｈ２０ Ｍ　ｎ　Ｓ　０　　・４　Ｈ２０ ビＡヂン シイアミン堪酸塩 大豆タンパク塩酸加水分解液 ＩＩ縮物（総窒素７％） １．５ ｒ９１酸カルシウム（別殺菌添加） ｐＨ７，０ ｄ　／　ｄｊ ｇ／瀬 上記の如く調製したフラスコ中の培地に、あら かじめグル」−ス・ブイコンスラン１〜上で生育せしめ
たコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ　　１
２５２１を１白金耳接種し、ぞれらを４３゛Ｃにで７２
時間振どう培養した。
７２時間培Ｍ後の培地中のＬ−リジン生成量を、酸性−
銅二ンヒドリン反応を用いる比色法によって測定した結
束、１−−リジンが３．０！７／ａ）であった。
さらに、同様にして培養したフラスコ５０本分のｊ８ｉ
終了液を集め、遠心分離によって、菌体おＪ、びカルシ
ウム塩を除いた上清成約１２を強酸性イオン交換樹脂（
［アンバーライ１〜Ｊ　ＩＲ−１２０（ＯＨ型））に通
過させ、Ｌ−リジンを吸乞させた。ついで、３％アンモ
ニア水で吸看した１−−リジンを溶出し、溶出液を減圧
ａ！縮した。′Ｉａ４１ｉ′ｉ液に塩酸を添加した後冷
却し、Ｌ−リジンをし−リジン塩酸塩２水加物として析
出させ、結晶２６．５９を得た。
実施例３ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２５２
３およびその親株ＡＪ　　１２３０９をイれぞれスラン
ト上より１白金耳かきとり、下記種培養水性培地５０ｄ
に接種し、１８時間、４３℃にて通気撹拌培養をおこな
って種培養液を調製した。
種培養培地組成ニ ゲルコース　　　　　　　　　　　１．５　９／ｃｌｊ
！酢酸アンモニウム　　　　　　　　（１，３ｇ／Ｊ尿
　　　　　　　素　　　　　　　　　　　　　　　　０
．１　　　ｇ／ＪＫＨ２ＰＯ４ｏ、１　ｇ／Ｊｊ！ ＭＣｌ５０　　・７　Ｈ２Ｏ０，０４ｇ／舐Ｆｅ５０　
−７Ｈ２０１，Ｏｒａｙ／ｄｅＭｎ５Ｏ−４Ｈ２０１，
Ｏｍｇ／ｃＪＲビ　　オ　　チ　　ン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　５．ＯＩ１９／瀬サイアミン塩
酸塩　　　　　　　２０　　〜／瀬大豆タンパク塩酸加
水分解液 濃縮物（総窒素７％）　　　　　　２．０　　ｄ／、１
ρｐＨ７，５ 方、１ｐ容小型ガラス製ジヤー・ファーメンタ−に下記
の組成より成る主発酵水性培地を３００ｄ宛分注し、常
法により殺菌した。
これらに上記の種培養液をそれぞれ１５ｍ１宛接種し、
４３℃にて通気撹拌培養を開始した。
主発酵培地組成ニ ゲルコース 酢酸アンモニウム 尿　　　　　　　素 Ｈ２ＰＯ２ Ｍｏｎｏ　　・７Ｈ２０ Ｆｅ５０　・７日２゜ Ｍｎ５Ｏ−４Ｈ２０ ビ　　オ　　チ　　ン サイアミン塩酸塩 ２．０ ０．５ ０．２ ０．１ １．０ ５．０ ９／、Ｉρ ｇ／Ｆｊ ｇ／ｄρ ｇ／、１７！ ｇ／ｄｆｆｉ 贋ｇ／　ｄｆｆｉ １１ｇ／　ｃｌで １１９／Ｒ １１！ｉ／ｆｌ ニコチン酸アミド　　　　　　　　１．０　１Ｍ’Ｊ／
ｆｌ大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素７％）　　　　　　３．Ｏｒｄ／ｄｊ！
ｐＨ７，２ 培養液中に、酢酸と酢酸アンモニウムとの混合液（酢酸
：酢酸アンモニウムとの混合液のモル比は１：ｏ、２５
、混合液の酢！！濃度は６０％）を培地のｐＨを７．２
〜８．０の間に保持するように添加して４３℃で、５５
時間培養を行った。
結果を、第３表に示す。
第　　　　３　　　　表 Ｃ’ｊ／ｄρ） （親株）　Ａ　Ｊ　　１２３０９ ０．０３ ＡＪ　　１２３２３の発酵終了液３００ｄから実施例２
と同様の方法により、１．０ｇのＬ−リジン塩酸塩２水
加物結晶を得た。
実施例４ 実施例２で用いた培地と同じ組成の培地２（７！を５０
０ｒｄ容振とうフラスコに入れ、１１０℃で１０分間蒸
気殺菌した。これに、あらかじめグルコース・ブイヨン
スラント上で生育させたコリネバクテリウム・サーモア
ミノゲネスＡＪ　　１２５２４を１白金耳接種し、４３
℃にて５０時間振どう培養した。
この培養液０．２ｄをガラス￥Ｊ遠心チューブにとり、
冷生理用食塩水５献を添加し、撹拌の後、４５００　「
ｐｌ、　１０分の遠心分離に付し、上清をすてた。
０．２Ｍ　ＩＪ　ン酸ハ’／　７７’　（１）８　７．
５）　　１．５ｆｆｉｅと下記反応液１．５−とを加え
、撹拌し、菌体をけん濁し、４３℃で振とう反応（１２
０ｒｐｎ＞を２時間行った。
反応液ニ ゲル」−ス　　　　　　　　　　１　　　ｇ／、３（！
（Ｎ　ト１４　）２　　Ｓｏ　４　　　　　　　　　　
　　　０．４　　　’；ｉ／ｄｆｉＭ　＜Ｊ　Ｓ　０　
　・７Ｈ２００，０４ｇ／瀬ビ　　オ　　チ　　ン　　
　　　　　　　　　　　　　　　５００　　　　１１ｊ
ｌ／瀬ｐ目　　　　７．５ その後遠心弁Ｍ　（４５００ｒｐｌ、　１０分）し、そ
の−Ｌ澄液の１−〜リジン濃度を液体り［コマ］・グラ
フィーで分析した３、その結果、０−２９／ｃｌ！のＩ
−−リジンが蓄積していたことがわかった。
（賽も明の効果） 本梵明により、ブを耐熱除去のための冷却負担が削減さ
れたしかもアミノ酸を必要としない実用に耐え得る１−
リジンのＴ業的生産方法が提供された。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）コリネバクテリウム属に属し、４０℃以上でも生
    育しうる、かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システ
    インに耐性を有するＬ−リジン生産性変異株を培地に培
    養して培養液中にＬ−リジンを生成・蓄積せしめ、これ
    を採取することを特徴とするＬ−リジンの発酵的製造法
    。
  2. （２）コリネバクテリウム属に属し、４０℃以上でも生
    育しうる、かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システ
    インに耐性を有する下記いずれかのＬ−リジン生産性変
    異株。 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２５２１、ＦＥＲＭＰ−１１４０９、コリネバク
    テリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２５２２、ＦＥＲＭＰ−１１４１０、コリネバク
    テリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２５２３、ＦＥＲＭＰ−１１４１１、コリネバク
    テリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２５２４、ＦＥＲＭＰ−１１４１２。
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