JPH03236781A - ランダムプライマーキット及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料中の核酸の増幅のためのキットに関し、
更に詳細には、ランダムプライマー及び修飾酵素より成
るキットに関する。本発明はまた、該キットを用いる、
核酸のクローニング方法、及び試料中の核酸の検出方法
に関する。

〔従来の技術〕

近年の組換えＤＮＡ技術の急速な進歩によって、生体内
の種々の遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子を大
腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、カビ、動
物細胞などの真核細胞において発現させることが可能に
なった。

遺伝子クローニングにおける最も重要なポイントは、組
換え体ＤＮＡの集団から目的の遺伝子を含むクローンを
選択することにある。組換え体ＤＮＡの集団としてはゲ
ノムＤＮＡを制限酵素等で断片化し、適当なベクターに
つないだゲノムＤＮＡライブラリーや、細胞や組織から
ｍＲＮＡを調製し、二本鎖ｃＤＮＡを合成してベクター
につないだｃＤＮＡライブラリーがある。ライブラリー
から目的のクローンを選択するのに従来用いられてきた
方法には次のようなものが挙げられる。例えば遺伝子産
物のアミノ酸配列の一部が既知の場合、そこから可能な
りＮＡ配列を推定しこれを化学合成してプローブとして
用いる。合成してＤＮＡプローブをアイソトープやビオ
チン、蛍光色素等で標識しゲノムライブラリーあるいは
ｃＤＮＡライブラリーからコロニー又はプラークハイブ
リダイゼーション法により目的とするクローンを選択す
る。

化学合成したＤＮＡをｃＤＮＡｌｓｔストランド合或の
プライマーとして用い、その際に標識された基質を取込
ませて目的とする遺伝子に特異的なプローブを作製する
方法もある。相同性の高い塩基配列を持つ遺伝子が既に
クローニングされている場合は、その一部をプローブと
してスクリーニングを行うこともできる。

そして、各種の組換えＤＮＡ技術による生産物や株化細
胞の産物に、タンパク質やペプチドの精製技術を適用す
ることによって、今まで得られなかった有用タンパク質
やペプチドを高純度に量産することが可能になった。

このようにして得られた精製標品を医薬品としてヒトに
投与する前に、最＃標品中に微量に存在する核酸を正確
に把握し、それらに起因する副作用を最小限に押える方
法を確立し、安全性を完全に確立しておくことが重要で
ある。

従来のりコンビナンドタンパク質中のＤＮＡの測定はま
ず試料よりＤＮＡを抽出後、ニックトランスレーション
やランダムプライムラベリングを利用したサザンハイプ
リダイゼーション法、ドットパイプリダイゼーション法
などにより行われていた。

また、最近ビオチン標識した一本鎖ＤＮＡ結合性タンパ
ク質、ストレプトアビジンを介してビオチン化メンプラ
ン上に一本鎖ＤＮＡを固定する一方、ウレアーゼ標識抗
ＤＮＡモノクローナル抗体で一本鎖ＤＮＡを識別、抗体
に結合しているウレアーゼでＤＮＡ・結合性タンパク質
複合体を検出するという方法も開発されていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのクローニング方
法として従来用いられてきた、ファージベクターあるい
はコスミドベクターで上述したようにゲノムＤＮＡ又は
ＣＤＮＡライブラリーを作製後プローブによりスクリー
ニングする方法では、ライブラリーの作製が煩雑でかつ
技術を要すること、またコロニーパイプリダイゼーショ
ン、プラークハイブリダイゼーションは時間がかかり過
ぎ、アイソトープを使用する場合が多いことなどの問題
があった。

更にｃＤＮＡの場合、より大きなフラグメントを得よう
とする時（ｃＤＮＡ歩行）、新たにライブラリーを作り
直す必要が出てくる。

また、上述の試料中の核酸の検出方法はいずれも試料の
ＤＮＡ抽出という操作が必要であり、煩雑なばかりでな
く、この操作の段階は測定ＤＮＡ量に誤差が生じる原因
となっていた。

近年、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　
Ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ　）が目的とする遺伝子のみを酵素
的に短時間に増幅する方法として開発された〔サイキＳ
。

（５ａｉｋｉ　Ｓ、　）、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ
　）第２３０巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８５）
）。

ＰＣＲ法によれば酵素として、例えば耐熱性タックポリ
メラーゼ、プライマーとして、一対の目的遺伝子に特異
的なプライマーを用い、ＤＮＡの変成の工程、特異的プ
ライマーＤＮＡのアニーリングの工程、ＤＮＡの相補鎖
の酵素的合成の工程より戒る温度サイクルを任意の回数
繰返すことで目的遺伝子のみを指数的に増幅することが
できる。一方、ランダムプライマーはランダムな塩基配
列のオリゴヌクレオチドの混合物であり、例えばデカマ
ーのランダムブライマーは約４　＋ａ種類のオリゴヌク
レオチドである。

この様に多様なランダムブライマーを用い、核酸の増幅
を効率よく行うことができれば、特異配列プライマーと
、ランダムブライマーの組合せにおいて、特定のＤＮＡ
のクローニング方法が、またランダムブライマーの使用
で、試料中の核酸の検出方法が提供できる。

すなわち、本発明の目的は、試料中の核酸を効率よく増
幅させるキット、及び該キットと特異的ブライマーを用
いる効率のよい核酸のクローリング方法、また、該キッ
トを用いた簡便、正確かつ高感度な試料中の核酸の検出
方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、試料中の
核酸を増幅させるための核酸の増幅キットに関し、ラン
ダムな塩基配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるラ
ンダムブライマー及び修飾酵素を含有していることを特
徴とする。

また、本発明の第２の発明は、核酸のクローニング方法
に関し、本発明の第１の発明のキット及び目的核酸に対
する特異配列ブライマーを用い、目的とする核酸を増幅
させることを特徴とする。更に、本発明の第３の発明は
、試料中の核酸の検出方法に関し、本発明の第１の発明
のキットを用い、試料中の核酸を増幅させ、その増幅核
酸を検出することを特徴とする。

本発明における核酸とは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は
ｍＲＮＡをいう。

また、本発明におけるランダムブライマーとは、ランダ
ムな塩基配列のオリゴヌクレオチドの混合物をいい、例
えばデカマーの場合は約４１０種類のオリゴヌクレオチ
ドの混合物である。

また特異配列ブライマーとは、目的核酸の一部分に完全
にアニールするブライマー等である。

更に本発明における増幅とは、核酸のコピー数を増やす
ことである。

本発明者らは、鋭意研究を重ね、特定の鎖長のランダム
ブライマーを合成し、該ブライマーを用いることにより
、目的ＤＮＡのクローニングが効率よく行えること、及
び試料中の核酸の検出が簡便に行えることを見出し、本
発明を完成させた。

以下、順を追って本発明を具体的に説明する。

遺伝子工学の分野では、例えばｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮ
Ａを合成する際や、ニックトランスレーションに代るＤ
ＮＡラベル法にランダムブライマーが用いられている。

ランダムプライマーとしては、例えばヘキサマーのラン
ダムブライマー宝酒造社）があり、この場合４６種類の
塩基配列に対応するブライマーの混合物である。

このようなランダムブライマーを用いれば、目的とする
核酸の配列が何であれ、それらとアニーリングし、ブラ
イマーとして作用すると考えられる。一般にランダムブ
ライマーとしてはヘキサマーがよく用いられ、それまり
長鎖のものは通常ランダムブライマーとして用いられて
いない。しかし、長鎖になれば、ランダムプライマーの
種類は指数的に増加し、例えばデカマーでは４１０種類
の組合せが可能であり、長鎖ランダムブライマーが求め
られる。各鎖長のランダムプライマーはＤＮＡ合成機を
用い合成でき、ＨＰＬＣにて精製できる。

核酸を増幅させる方法としては前述のＰＣＲ法を利用す
るのが現在、最も簡便で迅速である。

そこで、以下、合成ランダムブライマーを用い、ＰＣＲ
法に従って説明するが、本発明はＰＣＲ法に限定される
ものではない。

ランダムプライマーを用い、核酸をクローニングする方
法について述べる。

核酸の調処方法は、公知の方法なら何でも良いが、例え
ば特異配列ブライマーを用い、公知の方法で抽出したＤ
ＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型にして、目的ＤＮＡ近辺の
領域のみを酵素的に合成しておくほうが望ましい。

ＰＣＲ法については、タックポリメラーゼを含む遺伝子
増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が宝酒造より市販さ
れており、これを用い、本発明の方法に従い、目的の核
酸領域の増幅及びクローニングを行えばよい。

すなわち、目的の核酸に対する特異配列ブライマーと、
ランダムブライマーを用い、ＰＣＲ法を行うことにより
、特異配列ブライマ一部位を含む目的核酸を増幅させる
。

増幅後の目的ＤＮＡの確認は、例えばアガロースゲル電
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて行う
ことができる。

ランダムプライマーは鋳型ＤＮＡのさまざまな箇所にア
ニールするので、増幅産物は、いろいろな長さのＤＮＡ
断片の混合物となる。これをベクターにサブクローニン
グし適当なプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ションを行うことによって目的のクローンを選ぶことが
できる。

また特異配列プライマーを変えることにより、自由にｃ
ＤＮＡの異なった部分のクローニングができるため、ｃ
ＤＮＡ歩行も容易に行える。

ランダムブライマーとして、ヘキサマーを用いた時は、
ヘキサマー同志での増幅が認められ、より長鎖のランダ
ムブライマーではこの増幅は減少した。ランダムブライ
マーとしてはＰＣＲ法の増幅効率と経済性より、ヘキサ
マーからドデカマーが使用し易く、更に最適にはデカマ
ーであった。

以上述べた様に、一対の特異配列プライマーを用いるこ
となく、一種の特異配列プライマー及びランダムブライ
マーを用い、核酸のクローニングが可能となり、その結
果これまでのクロニングシステムに比べて、格段のスピ
ードアップを計れるようになった。

次にランダムブライマーを用い、試料中の核酸を検出す
る方法について述べる。

検出する核酸を含む試料としては、種々の試料があり、
例えば、前述の組換えＤＮＡ技術による生産物や、食品
等の微生物由来核酸の混入物等である。

核酸の増幅方法は、前述ＰＣＲ法を用い、本発明のラン
ダムブライマーで試料中の核酸の増幅を行えばよい。

ランダムブライマーとしては、前述と同様な理由でヘキ
サマーからドデカマーが使用し易く、更に最適なものは
デカマーである。

増幅後の核酸の検出は、例えばアガロースゲル電気泳動
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スポット法、及び
サザンプロット法を用いて行うことができる。スポット
法、サザンブロット法の際は、増幅が予測される核酸を
プローブＤＮＡとすればよい。プローブＤＮＡは前記ラ
ンダムブライマーと同様の方法で合成、精製しても良く
、微生物等から調製しても良い。プローブＤＮＡは、標
識化することにより、高感度な検出が可能となる。

標識化の方法は放射性同位元素標識法に限らず、酵素標
識、蛍光標識、ビオチン・アビジン系標識、ケミプロー
ブ標識法等公知の方法なら何でも良い。

実際選定されたランダムブライマーを用い、試料中の核
酸を増幅、高感度に検出することができた。

核酸のクローニング、又は試料中の核酸の増幅等に用い
るランダムブライマー及び逆転写酵素、ＤＮＡポリメラ
ーゼ等の修飾酵素をそろえてキットとしておくことで、
目的核酸のクローニング、又は医薬品、食品等の試料中
の核酸の検出等を簡便に行うことができる。なおキット
に用いる試薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥品でも良い
。

〔実施例〕

以下に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１　ランダムブライマーＤＮＡの合成及び精製 ＰＣＲ法により、試料中の核酸を増幅させるために、ラ
ンダムブライマーとして、ヘキサマ、オクタマー、デカ
マー　ドデカマーＤＮＡを、アブライドバイオシステム
ズ社のＤＮＡ合戊機を用いて合成し、脱保護の後、イオ
ン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ロＢＡＢ−２ＳＷカラム
）で精製し、セブーパク　（ＳＢＰ−ＰＡに）Ｃ１８（
ウォーターズ社製）で脱塩し、各ＤＮＡ約１００μｇを
得た。

実施例２ アシルアミノ酸遊離酵素（ＡＡＲＥ）のＰＣＲ法による
ｃＤＮＡのクローニング ＡＡＲＥのｃＤＮＡの約２．３　ｋｂ　［ジャーナルオ
ブ　バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ）　、
第１０６巻、第５４８〜５５１頁（１９８９））のフラ
グメントを挿入したＰＴＶ１１９プラスミドを用いてモ
デル実験を行った。

上記プラスミド１　ｎｇを０．５　ｍｌ用チューブに取
り、シーンアンプ７Ｍキット（宝酒造社）中のｌＯμｌ
の１０倍濃縮増幅用緩衝液［１００ｍＭ）リ　ス　−Ｈ
ＣＩ　　Ｓ　ｐＨ８Ｊ　、　５　０　０＋ｎＭ　　ＫＣ
Ｉ　、　　１５ｍＭＭｇＣＬ２．０．１　％（Ｗ／Ｖ）
ゼラチン〕、１６μｌの１．２５ｍＭ　　ｄＮＴＰ混合
液（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ。

ＴＴＰ）、０．１ｐｇの特異的配列プライマーＰ５（５
’−ＡＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣ−３’　）　
、０．２μｇ又は１ｐｇ又は５μｇのランダムブライマ
ー（デカマー）、０．５μｌの５ユニツト／μｌアンブ
リタツクＴｋｌ　（宝酒造社）を加え、滅菌水を加えて
１００μｌの溶液にした。この反応液に１００μｌのミ
ネラルオイル（シグマ社）を重層した後、自動遺伝子増
幅装置サーマル・サイクラ−（宝酒造社）により増幅を
行った。

反応条件（１）　９４℃で３０秒間（熱変性）−３７℃
で２分間（アニーリング）０７２℃で１分間（合成反応
）のサイクルを４０サイクル、（２）９４℃で３０秒間
→５５℃で２分間→７２℃で１分間のサイクルを４０サ
イクル、（３）　９４℃で３０秒間→５０℃で２分間→
６０℃で３分間のサイクルを４０サイクル、以上の３通
りで行った。

反応後反応液の１０μｌを取り、１％タカラＬＯ３アガ
ロースゲルにて電気泳動を行い、ナイロンメンブラン　
ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）　−Ｎ（アマジャム社）を
用いてサザンハイプリタイゼーションを行った。プロー
ブはＰ５ブライマーから８４　ｂａｓｅ上流側のオリゴ
ヌクレオチドＰ４　（５’−ＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴ
ＧＡＴＧＧ−３’　）をＣｒ−”ＰＩＡＴＰで末端標識
したものを用いた。このサザンハイプリダイゼーション
の結果、反応条件（３）の場合、ＡＡＲＥの塩基配列が
増幅されていることが確認できた。このフラグメントを
ゲルから切出して精製し、ＤＮＡプランティングキット
（宝酒造社）を用いて末端を平滑化し、ｐ［ＩＣｌ３ベ
クターの旧ｎｃＩＩサイトにサブクローニングし、上記
オリゴヌクレオチドＰ４をプローブとして、コロニーハ
イブリダイゼーションを行って得たポジティブ・クロー
ンをジデオキシ法によりシーフェンシングし、ＡＡＲＥ
のｃＤＮＡの２５０ｂｐ（７３９〜９８８）の塩基配列
を確認した。

実施例３ 牛血清アルブミン溶液中に混在するλフアージＤＮＡ断
片の検出 （３−１）試料ＤＮＡ溶液の調製 まず、牛血清アルブミン（シグマ社製）を滅菌水に溶か
して１ｍｇ／−とした。この溶液１００μｌに、λ−Ｂ
。ｏＴ１４　Ｉ消化断片（宝酒造社製）を１　ｎｇ、　
１００ｐｇ、　１０ｐｇ溶かし、これを試料ＤＮＡ溶液
とした。

（３−２）　λフアージＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増
幅 上記試料ＤＮＡ溶液それぞれを１０μｌずつ０．５−用
チューブにとり、９４℃で５分間加熱した後、水中で急
冷した。ここに、シー７７７１１Ｍキット（宝酒造社）
中の１０μｌの１０倍濃縮増幅用緩衝液［１００ｍＭ）
リス−）ＩＣＩ、ＰＨ８，３，５００ｍＭ　ＫＣＩ、１
５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１％（Ｗ／　Ｖ）ゼラチン
〕、１６μｊ２の１．２５ｍＭ　　ｄＮＴＰ混合液（ｄ
ＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ＴＴＰ　）　　　
２０ｐｇの各々のランダムブライマー（ヘキサマーオク
タマー、デカマー及びドデカマー）、０．５μｌの５ユ
ニツト／μｌアンブリタツク７０を加え、滅菌水を加え
て１００μｌの溶液にした。

この反応液に１００μｌのミネラルオイル（シグマ社〉
を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラ
−により増幅を行った。増幅反応は、９４℃１分間（熱
変性）→５０℃２分間（アニーリング）→６０℃５分間
（合成反応）のサイクルを５０サイクル行った。

（３−３）　　ドツトハイブリダイゼーションによるλ
フアージＤＮＡ断片の検出 ＰＣＲ反応後のそれぞれの反応液を９４℃で５分間加熱
した後、水中で急冷し、その１μｌをとってナイロンメ
ンブラン　ハイボンド−Ｎにスポットした。同時にコン
トロールとしてλフアージＤＮＡ断片を５ｎｇ、１　ｐ
ｇ、　１０−’ｐｇ及び１００−２ｐスポツトした。こ
のナイロンメンブランを風乾した後、紫外線を５分間照
射してＤＮＡをナイロンメンプランに固定した。

プレハイブリダイゼーションは、５ｘＳＳＣ。

０、１　％（Ｗ／Ｖ）ボｊＪ　ｔ＝−＝　ＪＬ／　ヒｏ
リドン、０．１％（ｌｌｌ／ｖ）フィコール４００．０
．１％（１１／Ｖ）牛血清アルブミン、０．１％（Ｗ／
Ｖ）Ｓ　Ｄ　Ｓ、　１００　μｇ／ｒｎ１．熱変性ニシ
ン精子ＤＮＡの混合液中で５０℃３時間行った。

プローブは、λ−Ｅ！ｃ、Ｔ　１４Ｉ消化断片５０ｎｇ
をランダムブライマーＤＮＡラベリングキット（Ｒａｎ
ｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋ
ｉｔ　）　（宝酒造社）と［α−”Ｐ　］　ｄＣＴＰ（
３０００Ｃｉ／　ｍ　ｍｏｌ）　（アマージャム社）５
０μＣｉを用いて３２ｐ［識を行い、作製した。

ハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーショ
ンに用いた混合液に、上記のプローブを２５　ｎｇ／ｍ
ｉ’　（４Ｘ　１０　’ｃｐｍ／ｍｉ’）の濃度で加え
て５０℃１６時間行った。

洗浄は２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにて、５０℃で３０
分間行った後、０．５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにて５
０℃で３０分間行った。

風乾後、Ｘ線フィルム（富士フィルム）、増感紙（富士
フィルム）２枚を使用して、−８０℃にてオートラジオ
グラムをとった（Ｎ光時間１６時間〉。その結果、ＰＣ
Ｒ法においてデカマーのランダムブライマーを用いた場
合が最も感度よく検出され、ＰＣＲ反応系当り、ｔｐｇ
のＤＮＡを添加したところまで、オートラジオグラムの
スポットが肉眼で確認できた（表１）。

増幅前のコントロールとしてメンプランにスポットした
１　ｐｇ、　　１０−’ｐｇ、　　１００−２ｐのＤＮ
Ａは、オートラジオグラムでスポットが現われなかった
ので、ＰＣＲを用いて増幅することにより微量ＤＮＡの
検出感度が高くなったといえる。

表１　　増幅ＤＮＡ検出感度 表２　核酸検出キット（１００回分） ヘキサマー　　　　十　　　　＋ オクタマー　　　　十　　　　＋ デカマー　　　　　＋＋＋ ドデカマー　　　　　＋　　　　　＋ 戒 試料中の核酸を増幅・検出するためのキットを作成した
。

ＤＮＡ増幅用ブライマーとして、デカマーＤＮＡポリメ
ラーゼとしてタックポリメラーゼを用い核酸検出キット
を作成した。

〔発明の効果〕

以上、詳細に説明したように、本発明により、一対の特
異配列ブライマーを使用することなく核酸の増幅が可能
となり、核酸増幅用キット、及び該キットを用いる簡便
な核酸のクローニング方法、及び試料中の微量核酸の高
感度検出方法が提供された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の核酸を増幅させるためのキットであって、
   ランダムな塩基配列のオリゴヌクレオチドの混合物であ
   るランダムプライマー、及び修飾酵素を含有しているこ
   とを特徴とする試料中の核酸の増幅キット。 ２、試料中の核酸を請求項１記載のキット及び目的核酸
   に対する特異配列プライマーを用い、目的とする核酸を
   増幅させることを特徴とする核酸のクローニング方法。 ３、試料中の核酸を請求項１記載のキットを用い増幅さ
   せ、その増幅核酸を検出することを特徴とする試料中の
   核酸の検出方法。