JPH03244392A - ホスホペプタイドの分離濃縮法 - Google Patents
ホスホペプタイドの分離濃縮法Info
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- JPH03244392A JPH03244392A JP2039721A JP3972190A JPH03244392A JP H03244392 A JPH03244392 A JP H03244392A JP 2039721 A JP2039721 A JP 2039721A JP 3972190 A JP3972190 A JP 3972190A JP H03244392 A JPH03244392 A JP H03244392A
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- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、カゼインをプロテアーゼで分解したときに生
じるペプタイド混合物の中から、酸性ペプタイド、特に
ホスホセリン残基を有するホスホペプタイドを分離濃縮
する方法に関する。
じるペプタイド混合物の中から、酸性ペプタイド、特に
ホスホセリン残基を有するホスホペプタイドを分離濃縮
する方法に関する。
更に詳細には、本発明は、エチルアルコールやピリジン
等の有機溶媒を用いることなく、そしてまたカルシウム
や鉄等を添加することなく、これらのベプタイドを分離
濃縮する方法に関するものであり、しかも、カゼインの
トリプシン加水分解物であってホスホセリン残基を含有
する複数種のベプタイドと通常定義されるカゼインホス
ホペプタイド（以後、ｃｐｐと称す）のみに限定される
ことなく、トリプシン以外のプロテアーゼ加水分解物に
も広く本発明は適用できるものである。
等の有機溶媒を用いることなく、そしてまたカルシウム
や鉄等を添加することなく、これらのベプタイドを分離
濃縮する方法に関するものであり、しかも、カゼインの
トリプシン加水分解物であってホスホセリン残基を含有
する複数種のベプタイドと通常定義されるカゼインホス
ホペプタイド（以後、ｃｐｐと称す）のみに限定される
ことなく、トリプシン以外のプロテアーゼ加水分解物に
も広く本発明は適用できるものである。
（従来の技術）
□実験室規模でカゼイン由来のホスホペプタイドを調製
する方法については、１９７０年前後にいくつかの方法
が確立された。
する方法については、１９７０年前後にいくつかの方法
が確立された。
例えば、Ｌ Ｍａ＾ｓｏｎ及び’ＩＪ、 Ｄ、 Ａｎｎ
ａｎは、β−カゼインをｐｌ（８，２０℃でトリプシン
によって分解した液中のｐＨ４，６可溶画分に、塩化バ
リウムとエチルアルコールを加えてホスホペプタイドを
沈殿、分取している（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｄ、
１４５．１５−２６（１９７１））。
ａｎは、β−カゼインをｐｌ（８，２０℃でトリプシン
によって分解した液中のｐＨ４，６可溶画分に、塩化バ
リウムとエチルアルコールを加えてホスホペプタイドを
沈殿、分取している（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｄ、
１４５．１５−２６（１９７１））。
一方、内藤と鈴木は、β−カゼインのトリプシン分解物
溶液をゲル濾過によって粗分側した後。
溶液をゲル濾過によって粗分側した後。
イオン交換体（ＤＯＷＥＸ ５Ｏ−Ｘ２）カラムに通し
、ピリジン−酢酸緩衝液（ｐＨ２，５，０，２Ｎピリジ
ン）で溶出することによりホスホペプタイド等を分離し
ている（Ａｒｇ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ３８
（８） １５４３−１５４５（１９７４））−またＷｅ
ｓｔは、トリプシン処理したα−カゼイン溶液のｐＨを
２に調整して沈殿を除いた後、濾液をゲル濾過（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍ）にかけ、Ｖｏｉｄ Ｖｏｌｕ
ｍｅに溶出した大分子量画分を次に陰イオン交換体（Ｄ
ＥＡＥ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ Ａ３０）に通してホスホ
ペプタイドを吸着させている。
、ピリジン−酢酸緩衝液（ｐＨ２，５，０，２Ｎピリジ
ン）で溶出することによりホスホペプタイド等を分離し
ている（Ａｒｇ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ３８
（８） １５４３−１５４５（１９７４））−またＷｅ
ｓｔは、トリプシン処理したα−カゼイン溶液のｐＨを
２に調整して沈殿を除いた後、濾液をゲル濾過（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍ）にかけ、Ｖｏｉｄ Ｖｏｌｕ
ｍｅに溶出した大分子量画分を次に陰イオン交換体（Ｄ
ＥＡＥ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ Ａ３０）に通してホスホ
ペプタイドを吸着させている。
しかしながら、これらの方性は、あくまでも研究目的の
ためのＣＰＰを調製したり、ＣＰＰの存在あるいは純度
を確認したりするための方法であって、食品用素材の製
造法として工業化するには塩化バリウムやピリジン等不
適当な試薬が使用されていたり、スケールアップして工
業化するには困難な操作を含んでいる。
ためのＣＰＰを調製したり、ＣＰＰの存在あるいは純度
を確認したりするための方法であって、食品用素材の製
造法として工業化するには塩化バリウムやピリジン等不
適当な試薬が使用されていたり、スケールアップして工
業化するには困難な操作を含んでいる。
一方、大規模生産を目的とした方法については、カゼイ
ンのプロテアーゼ分解によって生成したペプタイドの内
、ホスホペプタイドがカルシウム等ミネラルの添加によ
り沈殿はしないものの大きな会合体を形成することを利
用して、他のベプタイドから限外濾過膜で分離すること
が提案されている（特開昭５６−１２３９２１号）。
ンのプロテアーゼ分解によって生成したペプタイドの内
、ホスホペプタイドがカルシウム等ミネラルの添加によ
り沈殿はしないものの大きな会合体を形成することを利
用して、他のベプタイドから限外濾過膜で分離すること
が提案されている（特開昭５６−１２３９２１号）。
また、カゼインのトリプシン分解物にカルシウムとエチ
ルアルコールを加えて又は塩化第２鉄を加えてホスホペ
プタイドを沈殿、分離することが知られているにすぎな
い（特開昭５８−１７０４４０号、特開昭５９−１５９
７９３号）。
ルアルコールを加えて又は塩化第２鉄を加えてホスホペ
プタイドを沈殿、分離することが知られているにすぎな
い（特開昭５８−１７０４４０号、特開昭５９−１５９
７９３号）。
（発明が解決しようとする課題）
ホスホペプタイドを食品用素材ないし医薬用素材として
使用するには、バリウム塩が含有されることは避けなけ
ればならないから、上記した従来技術において、塩化バ
リウムを使用するＭａｎｓｏｎとＡｎｎａｎの方法は不
適当である。
使用するには、バリウム塩が含有されることは避けなけ
ればならないから、上記した従来技術において、塩化バ
リウムを使用するＭａｎｓｏｎとＡｎｎａｎの方法は不
適当である。
また、エチルアルコールを使用する方法は高価なエチル
アルコールを多量に使用する必要があるため、大規模処
理の場合、特に経済性及び安全性の点で問題がある。更
に、ｃＰＰはカルシウム吸収促進因子としても知られて
いるので（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ。
アルコールを多量に使用する必要があるため、大規模処
理の場合、特に経済性及び安全性の点で問題がある。更
に、ｃＰＰはカルシウム吸収促進因子としても知られて
いるので（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ。
ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、 ４３．４５７−４６７（
１９８０））、ホスホペプタイドをカルシウム吸収促進
因子として食品素材等において使用する場合には、カル
シウム等ミネラルは別途併用することが多いため、ホス
ホペプタイド中にカルシウム等ミネラルが含有されてい
ない方が好都合であり、したがってこのような場合には
カルシウムフリーないし鉄フリーの状態でホスホペプタ
イドを市場に供給した方が適用範囲が広くなり、商品価
値が高まる。
１９８０））、ホスホペプタイドをカルシウム吸収促進
因子として食品素材等において使用する場合には、カル
シウム等ミネラルは別途併用することが多いため、ホス
ホペプタイド中にカルシウム等ミネラルが含有されてい
ない方が好都合であり、したがってこのような場合には
カルシウムフリーないし鉄フリーの状態でホスホペプタ
イドを市場に供給した方が適用範囲が広くなり、商品価
値が高まる。
他方、前述した実験室スケールでの各調製法も様々の問
題を含んでいる。先ず、バリウム塩を用いる方法は食品
素材には適用し得ない。次に、ゲル濾過とイオン交換カ
ラム法を組み合わせた方法については、現時点ではゲル
濾過法は大スケールの生産には使用できない。
題を含んでいる。先ず、バリウム塩を用いる方法は食品
素材には適用し得ない。次に、ゲル濾過とイオン交換カ
ラム法を組み合わせた方法については、現時点ではゲル
濾過法は大スケールの生産には使用できない。
また、後者の方法において、先ず陰イオン交換樹脂は、
原理的にはホスホセリン残基を持つホスホペプタイドと
親和性を有する。しかしカゼイン自体が酸性タンパクで
あり、プロテアーゼ分解物も全体として陰イオン交換体
と親和性を保つため全ペグタイドからホスホペプタイド
を分離するには厳しい選択性が求められる。実際大部分
の陰イオン交換樹脂を単独で使用すると、ホスホペプタ
イド吸着が極めて弱い。たとえホスホペプタイドのよう
な大分子量の物質と親和性を持つ陰イオン交換樹脂を使
っても吸着の選択性が弱く、また比較的強い選択性を与
える狭いｐＨ範囲では吸着能が弱い。従って極めて稀薄
なペプタイド混合溶液から、収率や製造効率を犠牲にし
てホスホペプタイドを調製する目的以外には使えない。
原理的にはホスホセリン残基を持つホスホペプタイドと
親和性を有する。しかしカゼイン自体が酸性タンパクで
あり、プロテアーゼ分解物も全体として陰イオン交換体
と親和性を保つため全ペグタイドからホスホペプタイド
を分離するには厳しい選択性が求められる。実際大部分
の陰イオン交換樹脂を単独で使用すると、ホスホペプタ
イド吸着が極めて弱い。たとえホスホペプタイドのよう
な大分子量の物質と親和性を持つ陰イオン交換樹脂を使
っても吸着の選択性が弱く、また比較的強い選択性を与
える狭いｐＨ範囲では吸着能が弱い。従って極めて稀薄
なペプタイド混合溶液から、収率や製造効率を犠牲にし
てホスホペプタイドを調製する目的以外には使えない。
しかも通常の陰イオン交換樹脂とベプタイドの結合はイ
オン的相互作用だけではなく、疎水結合等も強く関与し
、−度吸着したものを十分溶出回収する為には、ピリジ
ンのような溶媒系の溶出液を使ったり、非常に高濃度の
塩類を添加する必要がある等、実生産への応用を不可能
にする手段によらなければならない。
オン的相互作用だけではなく、疎水結合等も強く関与し
、−度吸着したものを十分溶出回収する為には、ピリジ
ンのような溶媒系の溶出液を使ったり、非常に高濃度の
塩類を添加する必要がある等、実生産への応用を不可能
にする手段によらなければならない。
（課題を解決するための手段）
本発明は、カゼインからなる及び／又はカゼインをベー
スとした原料にプロテアーゼを作用せしめ、得られた蛋
白分解物を、架橋化キトサン成形物に吸着せしめ、次い
で脱着させるホスホペプタイドの分離濃縮する方法に関
し又、吸着させるときｐＨが１．５〜５．０の範囲で処
理する方法に関するものである。
スとした原料にプロテアーゼを作用せしめ、得られた蛋
白分解物を、架橋化キトサン成形物に吸着せしめ、次い
で脱着させるホスホペプタイドの分離濃縮する方法に関
し又、吸着させるときｐＨが１．５〜５．０の範囲で処
理する方法に関するものである。
本発明は、前述の欠点を解決するためになされたもので
あって、Ｂａ、 Ｃａ、 Ｆｅ等有害ないし不要ミネラ
ル類を含まずまたエチルアルコール等高価な原料も使用
することなく、ホスホペプタイドを効率よく分離回収で
きる大規模な方法を開発する目的でなされたものである
。
あって、Ｂａ、 Ｃａ、 Ｆｅ等有害ないし不要ミネラ
ル類を含まずまたエチルアルコール等高価な原料も使用
することなく、ホスホペプタイドを効率よく分離回収で
きる大規模な方法を開発する目的でなされたものである
。
本発明は、更に、単に大規模な工業的製法を開発するの
ではなく、新しい装置を新規に設備することなく乳業や
食品産業に既に設備されている装置をそのまま使用する
ことのできる大規模な方法を開発する目的でなされたも
のである。
ではなく、新しい装置を新規に設備することなく乳業や
食品産業に既に設備されている装置をそのまま使用する
ことのできる大規模な方法を開発する目的でなされたも
のである。
そこで本発明者らは、通常、乳業・食品産業に設備され
ている装置を使い、工業的規模で、食品衛生上不適切な
試薬等を使用せずにカゼインのプロテアーゼ分解物から
ホスホペプタイドを濃縮分離する経済的な方法を種々検
討した。その結果キトサン（２−アミノ−２−デオキシ
−Ｄ−グルコースを主成分とする多糖）を成型し、かつ
架橋処理を行なって調製した分離剤（以後、架橋化キト
サン成形物と称す）を使用することにより、目的を達成
することを発見し、本発明を完成させた。
ている装置を使い、工業的規模で、食品衛生上不適切な
試薬等を使用せずにカゼインのプロテアーゼ分解物から
ホスホペプタイドを濃縮分離する経済的な方法を種々検
討した。その結果キトサン（２−アミノ−２−デオキシ
−Ｄ−グルコースを主成分とする多糖）を成型し、かつ
架橋処理を行なって調製した分離剤（以後、架橋化キト
サン成形物と称す）を使用することにより、目的を達成
することを発見し、本発明を完成させた。
本発明に用いられるキトサンをベースとした架橋化キト
サン成形分は、キトサンを成形した後に架橋処理を施し
、耐酸性を付与したものが用いられる。
サン成形分は、キトサンを成形した後に架橋処理を施し
、耐酸性を付与したものが用いられる。
キトサンの成形物としては、粒状体、膜、繊維等がある
が、表面積や使用時の操作性の面から多孔質粒状体が好
ましい。
が、表面積や使用時の操作性の面から多孔質粒状体が好
ましい。
キトサンの多孔質粒状体は、特公平１−１６４２０号で
開示されている方法によって得ることができる。
開示されている方法によって得ることができる。
即ち、平均分子量１０，０００〜２３０，０００の低分
子量キトサンを酢酸等の酸性溶液に溶解し、２〜２０％
濃度のキトサン酸性溶液を得、これを水酸化ナトリウム
等の塩基性溶液中に滴下し、再生凝固させた後、十分水
洗することによって得られる。
子量キトサンを酢酸等の酸性溶液に溶解し、２〜２０％
濃度のキトサン酸性溶液を得、これを水酸化ナトリウム
等の塩基性溶液中に滴下し、再生凝固させた後、十分水
洗することによって得られる。
このときの多孔質粒状体の粒子径は、キトサン酸性溶液
の滴下ノズルのノズル径と、吐出圧等で制御可能である
。
の滴下ノズルのノズル径と、吐出圧等で制御可能である
。
キトサンの多孔質粒状体の粒子径は、特に限定されてい
ないが、本発明においては、操作性や吸着量の点から０
．１＝１．Ｏｍｍφが好ましい。
ないが、本発明においては、操作性や吸着量の点から０
．１＝１．Ｏｍｍφが好ましい。
上述の如く得られたキトサンの成形物に、耐酸性の付与
を目的として用いられる架橋剤は、キトサンのアミノ基
と反応するもの、例えばジイソシアネート、ジアルデヒ
ド５、ジカルボン酸誘導体、ジェポキシ等が挙げられる
が、イオン交換容量や反応性の面から、下記式で示され
るジェポキシを用いることが好ましい。
を目的として用いられる架橋剤は、キトサンのアミノ基
と反応するもの、例えばジイソシアネート、ジアルデヒ
ド５、ジカルボン酸誘導体、ジェポキシ等が挙げられる
が、イオン交換容量や反応性の面から、下記式で示され
るジェポキシを用いることが好ましい。
（但し、ｎ＝１−１０． ｍ＝３〜１０ ）上式
において一例を挙げると、〔１〕としては。
において一例を挙げると、〔１〕としては。
エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレン
グリコールジグリシジルエーテル、トリエチレングリコ
ールジグリシジルエーテル等、〔２〕としては、トリメ
チレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレ
ングリコールジグリシジルエーテル、ヘキサメチレング
リコールジグリシジルエーテル等がある。
グリコールジグリシジルエーテル、トリエチレングリコ
ールジグリシジルエーテル等、〔２〕としては、トリメ
チレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレ
ングリコールジグリシジルエーテル、ヘキサメチレング
リコールジグリシジルエーテル等がある。
この際の架橋度は高過ぎると細孔径が小さくなり、ＣＰ
Ｐの粒内拡散速度が低下し、低過ぎると強度と耐酸性が
低下することからキトサン残基当り５〜３０モル％の範
囲の架橋剤で処理することが好ましい。
Ｐの粒内拡散速度が低下し、低過ぎると強度と耐酸性が
低下することからキトサン残基当り５〜３０モル％の範
囲の架橋剤で処理することが好ましい。
本発明において使用する原料であるカゼインとしては、
各種酸カゼイン、カゼインナトリウム、カゼインカルシ
ウム等のカゼインが最も良いが、牛乳、スキムミルク等
の未精製のものも使用することができる６またそれらの
限外濾過残留物等濃縮物ないし処理物も有利に使用でき
るし、未精製のホスホペプタイドあるいは各種のホスホ
カゼイネート等も使用することができ、カゼインを含有
ないしベースとする各種原料が広く使用できる。
各種酸カゼイン、カゼインナトリウム、カゼインカルシ
ウム等のカゼインが最も良いが、牛乳、スキムミルク等
の未精製のものも使用することができる６またそれらの
限外濾過残留物等濃縮物ないし処理物も有利に使用でき
るし、未精製のホスホペプタイドあるいは各種のホスホ
カゼイネート等も使用することができ、カゼインを含有
ないしベースとする各種原料が広く使用できる。
本発明においては、このような原料をプロテアーゼ処理
して蛋白分解物を生成せしめるのであるが、この工程は
プロテアーゼとしてトリプシンを用いるＣＰＰの製造工
程に準して行えばよい。例えば、酸カゼインを中和した
後、またはナトリウムカゼイネートを溶解して１〜１０
％程度の溶液とし、これにプロテアーゼを添加し、ｐＨ
８，０、温度３０〜４５°Ｃで３〜２４時間静置すれば
よい。なお、酵素反応終了後のｐＨを４．６．可溶性Ｎ
／全Ｎ比が０．８以上となるようにするのが経済上好適
である。
して蛋白分解物を生成せしめるのであるが、この工程は
プロテアーゼとしてトリプシンを用いるＣＰＰの製造工
程に準して行えばよい。例えば、酸カゼインを中和した
後、またはナトリウムカゼイネートを溶解して１〜１０
％程度の溶液とし、これにプロテアーゼを添加し、ｐＨ
８，０、温度３０〜４５°Ｃで３〜２４時間静置すれば
よい。なお、酵素反応終了後のｐＨを４．６．可溶性Ｎ
／全Ｎ比が０．８以上となるようにするのが経済上好適
である。
プロテアーゼとしては、本発明においては、ＣＰＰの場
合のように精製トリプシンのみに限定されることなく、
例えば、パンクレアチン、ペプシン、キモトリプシン等
動物起源の酵素；パパイン、プロメレイン、フィシン等
植物起源の酵素；糸状菌、酵母、細菌プロテアーゼ等微
生物起源の酵素のようなプロテアーゼが用いられる。
合のように精製トリプシンのみに限定されることなく、
例えば、パンクレアチン、ペプシン、キモトリプシン等
動物起源の酵素；パパイン、プロメレイン、フィシン等
植物起源の酵素；糸状菌、酵母、細菌プロテアーゼ等微
生物起源の酵素のようなプロテアーゼが用いられる。
このようにしてプロテアーゼ処理することによって得た
酸性ペプタイト（ホスホペブタイド含有）は、前記した
ところにより調製した架橋化キトサン成形物を分離剤と
して使用することにより、カゼインあるいはそれを主体
とする原料をプロテアーゼで分解して生成した各種ペプ
タイトの混合溶液の中から、ホスホペプタイドを非常に
高い選択性と吸着率で吸着させることが出来る。また、
ホスホペプタイドの溶出はｐＨを変化させるだけで容易
に約８０％以上の溶出率を達成する。溶出率を一度に１
００％に近づける必要がある場合、少量の食塩添加によ
り達成できる。
酸性ペプタイト（ホスホペブタイド含有）は、前記した
ところにより調製した架橋化キトサン成形物を分離剤と
して使用することにより、カゼインあるいはそれを主体
とする原料をプロテアーゼで分解して生成した各種ペプ
タイトの混合溶液の中から、ホスホペプタイドを非常に
高い選択性と吸着率で吸着させることが出来る。また、
ホスホペプタイドの溶出はｐＨを変化させるだけで容易
に約８０％以上の溶出率を達成する。溶出率を一度に１
００％に近づける必要がある場合、少量の食塩添加によ
り達成できる。
何故、架橋化キトサン成形物がホスホペプタイド用とし
てこのように優れているかについてはまだ十分解明され
ていないが、プラス荷電を持つアミノ基を均一に適切な
間隔で分散していること、プラス荷電部を除く骨格部の
親水性が強いこと、などが作用していると考えられる。
てこのように優れているかについてはまだ十分解明され
ていないが、プラス荷電を持つアミノ基を均一に適切な
間隔で分散していること、プラス荷電部を除く骨格部の
親水性が強いこと、などが作用していると考えられる。
混合ペプタイト溶液の濃度については、格別の制限はな
いが、一応の濃度の基準としては、酵素反応終了時の濃
度そのままでもよいし、必要ある場合には若干これを稀
釈して固形分率０，１〜５％程度とするのも好適である
。
いが、一応の濃度の基準としては、酵素反応終了時の濃
度そのままでもよいし、必要ある場合には若干これを稀
釈して固形分率０，１〜５％程度とするのも好適である
。
カゼインと酵素分解物溶液の中からホスホペプタイドを
選択的に吸着させる条件としてはｐＨのコントロールが
最も重要であり、１．５以上５．０以下とすべきである
。より望ましくは２．５以上、４．５以下とするのが良
い。
選択的に吸着させる条件としてはｐＨのコントロールが
最も重要であり、１．５以上５．０以下とすべきである
。より望ましくは２．５以上、４．５以下とするのが良
い。
ｐＨ５，０以上では架橋化キトサン成形物の１級アミン
、２級アミンとも解離度が極めて小さいため、ホスホペ
プタイドとのイオン的相互作用が弱いために、吸着能力
が低い。さらにこのように高いｐＨ領域ではカゼイン酵
素分解液中のホスホペンタイ１〜以外の多くのペプタイ
トが負の電荷を持つため、咬着の選択性が低くなる。逆
にｐＨ１，５以下では大部分のホスホベプタイドの荷電
状況が極めて低いか架橋化キトサン成形物と同符号の電
荷を持つために吸着は起こらない。
、２級アミンとも解離度が極めて小さいため、ホスホペ
プタイドとのイオン的相互作用が弱いために、吸着能力
が低い。さらにこのように高いｐＨ領域ではカゼイン酵
素分解液中のホスホペンタイ１〜以外の多くのペプタイ
トが負の電荷を持つため、咬着の選択性が低くなる。逆
にｐＨ１，５以下では大部分のホスホベプタイドの荷電
状況が極めて低いか架橋化キトサン成形物と同符号の電
荷を持つために吸着は起こらない。
吸着温度は室温で良く、通常範囲の温度のふれがあって
も吸着率に大きな変化は見られない。
も吸着率に大きな変化は見られない。
ホスホベプタイトの吸着は、カゼインの酵素分解液と架
橋化キトサン成形物が接触した瞬間から起こるが、吸着
量を最大限とする為にｐＨ調整後、１０分〜３０分は反
応時間を与えた方が良い。
橋化キトサン成形物が接触した瞬間から起こるが、吸着
量を最大限とする為にｐＨ調整後、１０分〜３０分は反
応時間を与えた方が良い。
このようにして生成したホスホペプタイド吸着体は、通
常の固液分離法によって容易に分離、回収することがで
きる。固液分離法としては、遠心分離法、デカンテーシ
ョン、濾過法、膜濾過法等が例挙されるがこれらのみに
限定されるものではない。
常の固液分離法によって容易に分離、回収することがで
きる。固液分離法としては、遠心分離法、デカンテーシ
ョン、濾過法、膜濾過法等が例挙されるがこれらのみに
限定されるものではない。
前記により生成した酸性ペプタイトを吸着した架橋化キ
トサン成形物は、反応容器に設けたスクリーンを通して
非吸着ペプタイトを含む溶液を排出した後に、必要があ
れば架橋化キトサン成形物ヲ水洗し、ついでホスホペブ
タイドの溶出工程に入る。
トサン成形物は、反応容器に設けたスクリーンを通して
非吸着ペプタイトを含む溶液を排出した後に、必要があ
れば架橋化キトサン成形物ヲ水洗し、ついでホスホペブ
タイドの溶出工程に入る。
架橋化キトサン成形物を使用する特徴として、はとんど
のホスホペプタイドの脱着をｐＨの調整だけで行なうこ
とができる。具体的には、非吸着画分を排出した後の架
橋化キトサン成形物を水に分散し、酸またはアルカリで
、Ｐ）Ｉを１．５以下、もしくは５以上とする。
のホスホペプタイドの脱着をｐＨの調整だけで行なうこ
とができる。具体的には、非吸着画分を排出した後の架
橋化キトサン成形物を水に分散し、酸またはアルカリで
、Ｐ）Ｉを１．５以下、もしくは５以上とする。
ｐＨ調整だけでは吸着したホスホペプタイドの１０〜２
０％程度が残留することがあり、繰り返し使用によって
残留ペプタイドが増える。このような場合０．２〜１
ｍｏｌ／Ｒ位の食塩水によって、残留ペプタイドを溶出
回収することができる。
０％程度が残留することがあり、繰り返し使用によって
残留ペプタイドが増える。このような場合０．２〜１
ｍｏｌ／Ｒ位の食塩水によって、残留ペプタイドを溶出
回収することができる。
この架橋化キトサン成形物を使用したホスホペプタイド
の吸着、および脱着（溶出）を行なう装置としては、ス
テンレスあるいは合成ポリマー製のカラムに架橋化キト
サン成形物を充填したものを使っても良いが、乳業で一
般的に使用されるタンクやファーメンタ−にカゼインの
酵素分解液を導き、そこに所定量の架橋化キトサン成形
物を投入するような簡便なもので十分であ−る。
の吸着、および脱着（溶出）を行なう装置としては、ス
テンレスあるいは合成ポリマー製のカラムに架橋化キト
サン成形物を充填したものを使っても良いが、乳業で一
般的に使用されるタンクやファーメンタ−にカゼインの
酵素分解液を導き、そこに所定量の架橋化キトサン成形
物を投入するような簡便なもので十分であ−る。
溶出したホスホペプタイドを含む溶液は濃縮した後殺菌
し、濃縮液として充填しても良いし、さらにこれを噴震
乾燥し、粉体とすることもできる。
し、濃縮液として充填しても良いし、さらにこれを噴震
乾燥し、粉体とすることもできる。
溶出過程で多量の塩を使用した場合は、イオン交換や電
気透析等で脱塩を行なった後、濃縮・乾燥しても良い。
気透析等で脱塩を行なった後、濃縮・乾燥しても良い。
次に、本発明において使用する架橋化キトサン成形物の
調製例及びホスホペプタイドの分離濃縮例を、実施例と
して詳述し、更に実験例について述べる。
調製例及びホスホペプタイドの分離濃縮例を、実施例と
して詳述し、更に実験例について述べる。
実施例１
脱アセチル化度８２％、平均分子量４２，０００の低分
子量キトサン１．８ｋｇを、３％酢酸溶液２７．９ｋｇ
に溶解し、線溶液を水酸化ナトリウム：エタノール：水
＝６．５ ： ２０ ： ７３．５からなる混合溶液中
に０．１５■ｍφ孔径ノズルから落下させ、凝固再生さ
せた後、中性になるまで水洗し、平均粒子径０．３ｍｍ
φのキトサン成形物３０Ｑ（湿潤状態）を得た。
子量キトサン１．８ｋｇを、３％酢酸溶液２７．９ｋｇ
に溶解し、線溶液を水酸化ナトリウム：エタノール：水
＝６．５ ： ２０ ： ７３．５からなる混合溶液中
に０．１５■ｍφ孔径ノズルから落下させ、凝固再生さ
せた後、中性になるまで水洗し、平均粒子径０．３ｍｍ
φのキトサン成形物３０Ｑ（湿潤状態）を得た。
得られたキトサン成形物３０Ｑ（湿潤状態）にイソプロ
ピルアルコ−Ｊし１５ｆｌとエチレングリコールジグリ
シジルエーテル３００ｇを加え、７０℃で２時間反応さ
せた後水洗して、比表面積８５．２ｍ／ｇ、イオン交換
容量０．４５ｍｅｑ／ｌＲの架橋化キトサン成形物３０
悲を得た。
ピルアルコ−Ｊし１５ｆｌとエチレングリコールジグリ
シジルエーテル３００ｇを加え、７０℃で２時間反応さ
せた後水洗して、比表面積８５．２ｍ／ｇ、イオン交換
容量０．４５ｍｅｑ／ｌＲの架橋化キトサン成形物３０
悲を得た。
これとは別に、酸カゼインから調製した５％カゼイン溶
液１００ｋｇのｐｌ（を８として豚トリプシン（Ｎｏｖ
ｏ社トリブトリプシン）を使用し、ｐＨ４，６で不溶と
なる窒素成分が１０％以下となるまでカゼインを分解し
た。ｐＨ４，６で発生した沈殿を遠心分離で除いたとこ
ろ５溶解液中では、ホスホペプタイド約４５０ｇを含む
ペプタイド約３，９６０ｇが認められた。これを下部に
スクリーンのついた反応タンクに秒した。
液１００ｋｇのｐｌ（を８として豚トリプシン（Ｎｏｖ
ｏ社トリブトリプシン）を使用し、ｐＨ４，６で不溶と
なる窒素成分が１０％以下となるまでカゼインを分解し
た。ｐＨ４，６で発生した沈殿を遠心分離で除いたとこ
ろ５溶解液中では、ホスホペプタイド約４５０ｇを含む
ペプタイド約３，９６０ｇが認められた。これを下部に
スクリーンのついた反応タンクに秒した。
この溶液に上述の如く調製した架橋化キトサン成形物３
０Ｑ（湿潤状態）を投入した後、塩酸にてｐＨを３．５
に調整し、さらに３０分間静置した。３０分後、スクリ
ーンを通して架橋化キトサン成形物だけを残して排液し
た。水５０ｋｇで架橋化キトサン成形物を洗浄した後、
タンクに水１００ｋｇを投入、ゆっくり架橋化キトサン
成形物とともに攪拌しながら、ｐＨを１．５とし、２０
分静置して、ホスホペプタイドを中心とした酸性ペプタ
イドを架橋化キトサン成形物から溶出した。溶出液中に
はペプタイドを主として約５２０ｇの固形分が含まれ、
うちホスホペプタイドは約３２０ｇであった。
０Ｑ（湿潤状態）を投入した後、塩酸にてｐＨを３．５
に調整し、さらに３０分間静置した。３０分後、スクリ
ーンを通して架橋化キトサン成形物だけを残して排液し
た。水５０ｋｇで架橋化キトサン成形物を洗浄した後、
タンクに水１００ｋｇを投入、ゆっくり架橋化キトサン
成形物とともに攪拌しながら、ｐＨを１．５とし、２０
分静置して、ホスホペプタイドを中心とした酸性ペプタ
イドを架橋化キトサン成形物から溶出した。溶出液中に
はペプタイドを主として約５２０ｇの固形分が含まれ、
うちホスホペプタイドは約３２０ｇであった。
実施例２
実施例１と同様の操作で得られた平均粒子径０．３ｍｍ
φのキトサン成形物３０Ｑ（湿潤状態）に、イソプロピ
ルアルコール１５Ｑとトリメチレングリコールグリシジ
ルエーテル３２５ｇを加え、７０℃で２時間反応させた
後水洗して、比表面積８５．５ｍ２７ｇ、イオン交換容
量０．４８ｍｅｑ／−の架橋化キトサン成形物３０Ｑを
得た。
φのキトサン成形物３０Ｑ（湿潤状態）に、イソプロピ
ルアルコール１５Ｑとトリメチレングリコールグリシジ
ルエーテル３２５ｇを加え、７０℃で２時間反応させた
後水洗して、比表面積８５．５ｍ２７ｇ、イオン交換容
量０．４８ｍｅｑ／−の架橋化キトサン成形物３０Ｑを
得た。
実施例１と同一の条件でカゼインのトリプシン分解物溶
液をつくり、同じ反応タンクに移した。
液をつくり、同じ反応タンクに移した。
この溶液に上述のごとく調製された架橋化キトサン成形
物３０Ｑを投入した後塩酸にてｐＨを３．５に調整し、
やはり３０分間静置した。３０分スクリーンを通じて架
橋化キトサン成形物を残して排液した。
物３０Ｑを投入した後塩酸にてｐＨを３．５に調整し、
やはり３０分間静置した。３０分スクリーンを通じて架
橋化キトサン成形物を残して排液した。
水５０ｋｇで架橋化キトサン成形物を洗浄した後、タン
クに水１００ｋｇを投入、ゆっくり分離剤とともに撹拌
しながらｐＨを７．３とし、１時間静置して、ホスホペ
プタイドを中心とした酸性ペプタイドを架橋化キトサン
成形物から溶出した。溶出液中にはペプタイドを主とし
て約５９０ｇの固形分が含まれ、そのうちホスホペプタ
イドは約３６０ｇであった。
クに水１００ｋｇを投入、ゆっくり分離剤とともに撹拌
しながらｐＨを７．３とし、１時間静置して、ホスホペ
プタイドを中心とした酸性ペプタイドを架橋化キトサン
成形物から溶出した。溶出液中にはペプタイドを主とし
て約５９０ｇの固形分が含まれ、そのうちホスホペプタ
イドは約３６０ｇであった。
実験例
架橋化キトサン成形物と既存のイオン交換樹脂とのホス
ホペプタイド吸着能および、溶出挙動を比較した実験例
を示す。
ホペプタイド吸着能および、溶出挙動を比較した実験例
を示す。
ホスホペプタイド０．４５％を含むカゼインのトリプシ
ン分解液を５個の１００ｍ１２ビーカーに夫々８０ｍＵ
とり、夫々に示す実施例１で調製した架橋化キトサン成
形物と既存のイオン交換樹脂４種を５ｇ投入し、塩酸に
てｐＨを３．５に調整した後３０分間静止した。ガラス
ろうとをフィルターとして樹脂と非吸着画分を含む排出
液（Ａ）に分離し、Ａの体積とＡ中のホスホペプタイド
含量を測定した。ホスホペプタイドの吸着率は次の式で
計算した。
ン分解液を５個の１００ｍ１２ビーカーに夫々８０ｍＵ
とり、夫々に示す実施例１で調製した架橋化キトサン成
形物と既存のイオン交換樹脂４種を５ｇ投入し、塩酸に
てｐＨを３．５に調整した後３０分間静止した。ガラス
ろうとをフィルターとして樹脂と非吸着画分を含む排出
液（Ａ）に分離し、Ａの体積とＡ中のホスホペプタイド
含量を測定した。ホスホペプタイドの吸着率は次の式で
計算した。
の式により計算した。
結果を次の表にまとめる。
この結果により、架橋化キトサン成形物が性能的に極め
て優れていることが明かであるつぎに、ガラスフィルタ
ー上に残った夫々の架橋化キトサン成形物、イオン交換
樹脂をｌｏＯ＋ｏＱビーカーに戻し、水５０ｍＱを加え
、塩酸でｐＨを１．５に調整し、その状態で３０分間保
持し、吸着されたホスホペプタイドの溶出を図った。や
はりガラスろうとて樹脂と溶出液（Ｂ）を分離し、溶出
液（Ｂ）中のホスホペプタイド含量を測定した。溶出率
は次（発明の効果） 本発明により、エタノール、ピリジン等の有機溶剤を使
用せずに、カゼイン由来のホスホペプタイドを当ペプタ
イドが生体でその吸収を促進することが期待されるとこ
ろのカルシウムや鉄を含まないかたちで、既存の設備を
利用して非常に経済的に工業的スケールで生産すること
ができる。
て優れていることが明かであるつぎに、ガラスフィルタ
ー上に残った夫々の架橋化キトサン成形物、イオン交換
樹脂をｌｏＯ＋ｏＱビーカーに戻し、水５０ｍＱを加え
、塩酸でｐＨを１．５に調整し、その状態で３０分間保
持し、吸着されたホスホペプタイドの溶出を図った。や
はりガラスろうとて樹脂と溶出液（Ｂ）を分離し、溶出
液（Ｂ）中のホスホペプタイド含量を測定した。溶出率
は次（発明の効果） 本発明により、エタノール、ピリジン等の有機溶剤を使
用せずに、カゼイン由来のホスホペプタイドを当ペプタ
イドが生体でその吸収を促進することが期待されるとこ
ろのカルシウムや鉄を含まないかたちで、既存の設備を
利用して非常に経済的に工業的スケールで生産すること
ができる。
このようにして得られたホスホペプタイドは、食品用素
材、機能性食品、栄養剤等に広範に利用することができ
る。
材、機能性食品、栄養剤等に広範に利用することができ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、カゼインからなる及び／又はカゼインをベースとし
た原料にプロテアーゼを作用せしめ、得られた蛋白分解
物を、架橋化キトサン成形物に吸着せしめ、次いで脱着
せしめることを特徴とするホスホペプタイドの分離濃縮
法。 ２、架橋化キトサン成形物に蛋白分解物を吸着させると
きｐＨ１．５〜５．０の条件下で行うことを特徴とする
請求項１に記載のホスホペプタイドの分離濃縮法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2039721A JPH0724597B2 (ja) | 1990-02-22 | 1990-02-22 | ホスホペプタイドの分離濃縮法 |
| EP19910300405 EP0443718B1 (en) | 1990-02-22 | 1991-01-18 | Method for separation and concentration of phosphopeptides |
| DE69111637T DE69111637T2 (de) | 1990-02-22 | 1991-01-18 | Verfahren zur Trennung und Konzentration von Phosphopeptiden. |
| DK91300405T DK0443718T3 (da) | 1990-02-22 | 1991-01-18 | Fremgangsmåde til separering og koncentrering af phosphopeptider |
| NZ23685791A NZ236857A (en) | 1990-02-22 | 1991-01-22 | Method for separating and concentrating acid phosphopeptides |
| US08/053,808 US5290685A (en) | 1990-02-22 | 1993-04-29 | Method for separation and concentration of phosphopeptides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2039721A JPH0724597B2 (ja) | 1990-02-22 | 1990-02-22 | ホスホペプタイドの分離濃縮法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03244392A true JPH03244392A (ja) | 1991-10-31 |
| JPH0724597B2 JPH0724597B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=12560850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2039721A Expired - Fee Related JPH0724597B2 (ja) | 1990-02-22 | 1990-02-22 | ホスホペプタイドの分離濃縮法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0443718B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0724597B2 (ja) |
| DE (1) | DE69111637T2 (ja) |
| DK (1) | DK0443718T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ236857A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007135801A1 (ja) | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | γ－Ｌ－ＰＧＡ生産微生物、該微生物を用いたγ－Ｌ－ＰＧＡ製造方法、架橋体、及び皮膚外用剤 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101838467B (zh) * | 2010-05-21 | 2013-05-29 | 南京农业大学 | 一种新型壳聚糖纳米颗粒及其制备方法 |
| CN117000190B (zh) * | 2022-04-29 | 2025-06-24 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜及其制备与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58170440A (ja) * | 1982-03-30 | 1983-10-07 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 健康飲食品 |
| JPS59159793A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-09-10 | Meiji Seika Kaisha Ltd | カゼインホスホペプチドの精製法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2474829B1 (fr) * | 1980-02-01 | 1983-09-09 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de traitement d'une matiere a base de caseine contenant des phosphocaseinates de cations monovalents ou leurs derives, produits obtenus et applications |
-
1990
- 1990-02-22 JP JP2039721A patent/JPH0724597B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-01-18 DE DE69111637T patent/DE69111637T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-18 EP EP19910300405 patent/EP0443718B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-18 DK DK91300405T patent/DK0443718T3/da active
- 1991-01-22 NZ NZ23685791A patent/NZ236857A/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58170440A (ja) * | 1982-03-30 | 1983-10-07 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 健康飲食品 |
| JPS59159793A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-09-10 | Meiji Seika Kaisha Ltd | カゼインホスホペプチドの精製法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007135801A1 (ja) | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | γ－Ｌ－ＰＧＡ生産微生物、該微生物を用いたγ－Ｌ－ＰＧＡ製造方法、架橋体、及び皮膚外用剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0443718B1 (en) | 1995-08-02 |
| DE69111637T2 (de) | 1996-04-04 |
| DK0443718T3 (da) | 1995-08-21 |
| NZ236857A (en) | 1992-02-25 |
| JPH0724597B2 (ja) | 1995-03-22 |
| EP0443718A3 (en) | 1992-02-26 |
| DE69111637D1 (de) | 1995-09-07 |
| EP0443718A2 (en) | 1991-08-28 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |