JPH032516B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、ストレプトコツクス属に属し、ベン
ゾイルギ酸還元酵素Ａ生産能を有する微生物を培
養して該酵素を菌体内に生産させるに際し、該酵
素の生産量を増収させる方法に関するものであ
る。

〔従来技術〕

左旋性のマンデル酸（（−）−マンデル酸）はエ
フエドリンやセフアロスポリン系の抗生物質各種
の医薬品の製造原料として知られている。このよ
うな左旋性のマンデル酸の製造方法としては、ラ
セミ体の分別結晶による光学分割法、クロマトグ
ラフイーによる光学分割法、有機化学的な不斉合
成法等が知られているが、これらの方法は、操作
が煩雑であるとか、収率が低い、生成物の光学純
度が低い等の欠点を有している。

一方、左旋性のマンデル酸を得るために、ベン
ゾイルギ酸を微生物菌体を用いて不斉還元する方
法（特開昭57−198096号公報）も知られている。
この方法によれば、前記の公知方法の欠点は除去
されるものの、微生物のプロテアーゼによる自己
消化のための活性低下が避けられず、また菌体内
成分や培地成分による製品の汚染・純度低下の問
題等が残る。

本発明者らは、微生物菌体を用いずに、微生物
から産出される酵素を用いて前記微生物菌体を用
いる場合の問題点を解消すべく種々研究を行つた
結果、ストレプトコツクス属細菌から取出された
酵素Ａが、ベンゾイルギ酸還元能を有することを
見出した。この酵素Ａは、還元剤としての還元型
のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（NADH）と組合せて、ベンゾイルギ酸の還元反
応に用いる時には、光学純度100％の左旋性マン
デル酸を高収率で与える。

ところで、このストレプトコツクス属の細菌を
培養して酵素Ａをその菌体内に生産する場合、従
来から慣用されてきた培地では酵素Ａの収量が低
いという問題があつた。例えば、この細菌のため
の最も標準的な培地の１つであるMRS培地（「微
生物学実験法」、p435、講談社、1975年）を用い
た場合の菌体を含む培養物全体としての単位体積
当りの酵素Ａ活性は0.2〜0.5U／mlにすぎなかつ
た。また、ストレプトコツクス属細菌の菌体を用
いてベンゾイルギ酸を還元する公知の方法（特開
昭57−198096号公報）において用いられている培
地について試験した場合にも、酵素Ａの生産量は
0.4〜0.9U／mlと２倍程度に増加したにすぎなか
つた。

〔目的〕

本発明は、前記ストレプトコツクス属細菌菌体
内に産生されるベンゾイツギ酸還元能を有する酵
素Ａを増収させる方法を提供するすることを目的
とする。

〔構成〕

本発明者らは、前記目的を達成すべく種々研究
を重ねた結果、トマト果実から得られるジユース
（以下、単にトマトジユースという）を基体とす
る特別の培地を用いて培養を行うことによつて、
その目的を達成し得ることを見出し、本発明を完
成するに到つた。

即ち、本発明によれば、ストレプトコツクス属
に属し、ベンゾイルギ酸還元酵素Ａ生産能を有す
る微生物を培養して該酵素を菌体内に生産させる
に際し、該微生物を、トマト果実から得られるジ
ユースと、ペプトンと、麦芽エキスと、２価コバ
ルトイオンを含む液体培地で培養することを特徴
とするベンゾイルギ酸還元酵素Ａの増収方法が提
供される。

本発明で用いる培地は、トマトジユースをベー
スとする。

この時に使用されるトマトジユースの量を元の
トマト果実の重量に換算すると培地１作るのに
100〜1000ｇの果実を必要とすることになる。本
発明では、このトマトジユースに対し、ペプト
ン、麦芽エキス、２価コバルトイオンを添加する
ことを必須要件とするが、この場合、培地１当
り、ペプトンの添加量は３〜30ｇ、麦芽エキスの
添加量は１〜30ｇ及びコバルトイオンの添加量
は、硫酸コバルト７水和物として100〜200mg、コ
バルト金属としては20〜40mgである。ペプトンと
しては、トリプトン、バクトペプトン、ポリペプ
トン等の各種のものが用いられる。また、本発明
で用いる培地には、グルコースを１〜30ｇ程度加
えることが好ましい。培地のPHは、6.5〜7.5の範
囲に調節するのがよい。

本発明で用いる好ましい培地の調整例を示す
と、市販の缶入りトマトジユース約200mlの不溶
分を遠心分離にて除いた上清又はこれに相当する
新鮮トマト（完熟、約300ｇ）の圧さく汁を蒸溜
水にて１に希釈する。これにグルコース10ｇ、
麦芽エキス10ｇ、硫酸コバルト（７水和物）0.1
ｇを加え、よく溶かし、水酸化ナトリウムにてPH
7.2に調節する。

本発明による培地を使用してストレプトコツク
ス属細菌を培養する場合、静置培養よりも振とう
培養によることが望ましい。培養温度は25℃〜35
℃付近、最も好ましくは30℃とする。培養時間は
増殖が静止期に入るまでとすることが好ましく、
通常15〜25時間を要する。集菌は遠心分離などの
通常の方法を用いて行えばよく、菌体を破壊して
目的酵素を抽出するためには超音波処理など通常
の方法を用いればよい。

なお、本発明で生産される酵素Ａはベンゾイル
ギ酸還元能の他、Ｄ−２−ピドロキシイソカプロ
ン酸脱水素能も有するものである。

ベンゾイルギ酸還元酵素Ａの理化学性質は次の
ようであつた。

(1) 活性測定法：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）2.5
ml、83ｍＭベンゾイルギ酸（ナトリウム塩）水
容液0.2ml、及び10mg／mlNADH水溶液0.05ml
を混合して基質液を調整し、30℃保温する。酵
素Ａ溶液20μを添加・混合し、340nｍにおけ
る吸光度の時間変化を測定して初速度を求め
る。ブランクとしてはベンゾイルギ酸水溶液の
代りに水を用いて測定を行い、その時の吸光度
の変化速度を先の値か差らし引く。初速度とし
てNADHの1μmolを１分間に変化させる酵素
量を１単位（Ｕ）とする。

(2) 精製酵素の比活性：911U／mg・蛋白質 (3) 分子量：ゲル濾過法を用いて測定して72000
±2000。SDS・ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて測定した場合には34000±2000で
あつた。従つて本酵素Ａは分子量34000付近の
サブユニツト２個からなる二量体蛋白であると
考えられる。

(4) 等電点：4.9〜5.0。

(5) 至適PH：ベンゾイルギ酸を基質とした場合は
PH4.5。逆反応として（−）−マンデル酸を基質
としてNAD⁺を補酵素として用いた場合はPH
9.2。

(6) 安定性に及ぼすPHの影響・種々の緩衝液を用
いて55℃で１時間加熱した時の残存活性が70％
を越えるPH領域は6.2〜5.5。同条件でPH7.2以上
及びPH４以下では完全に失格する。故に本酵素
ＡはPH6.5〜5.0の微酸性条件において安定であ
る。

(7) 加熱に対する安定性：２ｍＭのメルカプトエ
タノールを含む0.1Mのリン酸緩衝液（PH6.0）
の中で１時間加熱した時の残存活性は、55℃で
35％、50℃で50％、45℃で80％であつた。次に
１％の牛血清アルブミンを安定化剤として共存
させた時の結果（残存活性）は55℃で70％、50
℃で87％、45℃で96％あつた。

(8) （−）−マンデル酸を製造するための実際の
条件を模した条件における安定性：ベンゾイル
ギ酸0.1M、NAD1ｍＭ、２−メルカプトエタ
ノール２ｍＭ、血清アルブミン１％、ソルビン
酸カリウム（防腐剤）0.02％を含む15ｍＭリン
酸緩衝液（PH6.3）に溶かした状態で30℃に保
温した時の酵素Ａの残存活性は、５日目に73
％、10日目に52％、19日目に42％であつた。

(9) 冷蔵保存時における安定性：２ｍＭのメルカ
プトエタノールと3.2Mの硫安を含む15ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH6.3）の中で４℃において、１
ケ月の間ほとんど失格しなかつた。

(10) ミカエリス定数：0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）を用いて30℃で測つた場合、ベンゾイル
ギ酸については3.3ｍＭ、NADHについては
35μMであつた。

(11) 基質特異性：補酵素としてNADPHは
NADHの代用にならない。本酵素Ａはベンゾ
イルギ酸以外にも各種のα−ケト酸を還元す
る。代表的なものは次の通りである。（括弧の
内の数値は、10ｍＭの濃度で使用した時の反応
速度をベンゾイルギ酸による値を100としての
％である。）：α−ケト酪酸(3)、α−ケトバレリ
アン酸（23）、α−ケトカプロン酸（24）、α−
ケトイソバレリアン酸（67）、α−ケトイソカ
プロン酸（132）、α−ケト−β−メチルバレリ
アン酸（63）、フエニルピルビン酸（60）、３−
ブロムピルビン酸（152）、及び３−クロロピル
ビン酸（17）。α−ケト酸の中でもピルピン酸、
オキザロ酢酸、α−ケトグルタル酸などには全
く活性を示さなかつた。

(12) 反応の立体選択性：ベンゾイルギ酸と
NADHを基質にして生成するマンデル酸を抽
出して旋光度を測定し、またジアステレオメリ
ツク誘導体としてガスクロマトグラフイー法で
光学純度を測定したところ、（Ｒ）−（−）−マン
デル酸が100％の光学純度で生成していること
が確認された。一方逆反応としてNAD⁺と
（−）−マンデル酸又は（＋）−マンデル酸（ア
ルドリツチ社製）を用いて活性を測定したとこ
ろ、（−）−マンデル酸は完全に酸化されたが、
（＋）−マンデル酸はごくわずかしか反応しなか
つた。

(13) 阻害剤：本発酵Ａはいくつかの重金属イオ
ンによつて活性を阻害される。代表的なものを
次にかかげる（括弧内は0.1Mトリス／HC緩
衝液PH7.5を用いて測定した時の残存活性を金
属イオン無添加時の値を100として％で示した
ものと、その時の金属イオン濃度である）：
Cu²⁺（９％、１ｍＭ）、zn²⁺（０％、１ｍＭ）、
Ni²⁺（55％、１ｍＭ）、Ｈｇ⁺（６％、0.1ｍＭ）、
Ｈｇ²⁺（31％、0.1ｍＭ）、Cd²⁺（２％、１ｍＭ）。
また本酵素Ａは0.5ｍＭのｐ−クロロマーキユ
リーベンゾエートによつて完全に阻害され、１
ｍＭのＮ−エチルマレイミドによつても60％阻
害される。

〔実施例〕

次に、実施例によつて本発明をさらに詳細に説
明するが、本明細書における酵素Ａの活性測定は
次の方法によつて行つた。

（活性測定法）：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）2.5
ml、83ｍＭベンゾイルギ酸（ナトリウム塩）水
溶液0.2ml及び10mg／mlNADH水溶液0.05mlを
混合して基質液を調整し、30℃に保温する。酵
素Ａ溶液20μを添加混合し、340nｍにおける
吸光度の時間変化を測定して初速度を求める。
ブランクとしてはベンゾイルギ酸水溶液を代り
に水を用いて測定を行い、その時の吸光度の変
化速度を先の値からさし引く。NADHの
1μmolを１分間に変化させる酵素Ａ量を１ユニ
ツト（Ｕ）とする。

実施例 １ 市販の缶入りトマトジユース（キツコー食品工
業株式会社製、デルモンテ印）195ｇを遠心分離
にかけ（7000rpm）上清を更に濾過にて濾過して
清澄化した。これを水で１に希釈した。この希
釈ジユース液の200mlにグルコースを２ｇ、トリ
プトンを２ｇ、麦芽エキス２ｇ、及び硫酸コバル
ト（７水和物）を20mg加えて溶かし、次で
2NNaOHでPHを7.2に調節した。この培地の100
mlづつを２個の500ml容バツフル付三角フラスコ
に分注し、シリコンスポンジキヤツプにて栓を
し、120℃で20分間滅菌した。ストレプトコツク
ス フアエカリス（Streptococcus faecalis）
IFO12964菌を同上の培地の８mlを用いて12時間
振とうにより前培養した培養物の４mlを上記の
100mlの培地の各々に無菌的に移植した。これら
を30℃にてロータリー振とう機（170rpm）上で
24時間振とう培養した。２本の培養物（100ml×
２）を合せ、遠心分離（7500rpm）にて集菌し、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で十分に洗浄した。
得られた菌体の湿潤重量は1.13ｇであつた。これ
を２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）の40mlに縣濁し、氷
冷下180Wにて15分間超音波処理を行い菌体を破
壊した。遠心分離（9500rpm）にかけて不溶分を
除いた上清中のベンゾイルギ酸還元酵素Ａ活性を
測定したところ、全体で924Uあつた（非活性：
8.9U／mg・蛋白質）。

一方、比較のために、MRS培地（「微生物学実
験法」、p435、講談社、1975年）、栄養培地（特
開昭57−198096号広報）、トマトジユース・酵母
エキス培地（「微生物学実験法」、p435、講談社、
1975年）及び上記のトマトジユース／麦芽エキ
ス／硫酸コバルト培地から、硫酸コバルトのみを
除去した培地の200mlづつを用いて上記と同様に
して実験を行つたところ、生産された酵素Ａ量
は、それぞれ、99U、190U、205U、及び616Uで
あつた。

実施例 ２ 完熟したトマト果実の60ｇを蒸溜水約100mlと
混ぜ、ワーリングブレンダーにて完全に粉砕し
た。瀘紙を用いて吸引濾過した瀘液を水で200ml
に希釈した。この希釈ジユース液を用いて実施例
１と同様にして１％グルコース、１％のトリプト
ン、１％の麦芽エキス及び0.1mg／mlのCoSO₄・
7H₂O含む培地（PH7.2）を調整し、実施例１と同
様にしてストレプトコツクス フアエカリス
IFO12964菌の培養を行い、酵素Ａを抽出した。
その結果、生産された酵素Ａの総量は467Uであ
り、比活性は5.2U／mg・蛋白質であつた。

実施例 ３ 実施例２において用いたトマト果実の重量を20
ｇ、40ｇ、100ｇ及び150ｇとした以外は実施例２
と同様にして実験を行つたところ、生産された酵
素Ａの総量はそれぞれ278U、326U、434U及び
358Uであつた。

実施例 ４ 実施例２において用いた麦芽エキス濃度（１
％）を0.1％に変更した以外は実施例２と同様の
実験を行つたところ、100ml×２の培地を用いて
生産された酵素Ａの総量は425Uであり、比活性
は5.6U／mg・蛋白質であつた。

実施例 ５ 実施例２において用いたトリプトンの濃度（１
％）を0.3％に変更した以外は実施例２と同様の
実験を行つたところ、100ml×２の培地を用いて
生産された酵素Ａの総量は470Uであり、比活性
は5.4U／mg・蛋白質であつた。

実施例 ６ 実施例１で述べた缶入りトマトジユースを利用
するトマトジユース・麦芽エキス・CoSO₄培地に
ついて、CoSO₄・7H₂Oの濃度を０、0.01、0.03、
0.1、0.2、0.4及び１mg／mlとした７種類の培地を
100mlづつ調整し、実施例１と同様にしてストレ
プトコツクス フアエカリスIFO12964菌の培養
を行つた。24時間振とう後、培養物のそれぞれか
ら８mlづつをぬきとり、菌体を集菌・洗浄後、３
mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0、２ｍＭメルカプ
トエタノール含有）に縣濁した状態で超音波処理
を行つた（４℃、200W、１分間）。不溶物を遠心
分離で除去した上清中の酵素Ａ活性を測定したと
ころ、次のような結果を得た（かつこ内は培地に
用いたCoSO₄・7H₂O濃度、mg／ml）：4.2U／ml
（０）、5.4U／ml（0.01）、5.3U／ml（0.03）、
6.8U／ml（0.1）、7.2U／ml（0.2）、・5.0U／ml
（0.4）及び5.0U／ml（１）。従つて、CoSO₄・
7H₂Oの添加の最適濃度は0.1〜0.2mg／mlと結論
された。

〔効果〕

以上のような、本発明によれば、特定組成の培
地を用いることにより、ベンゾイルギ酸還元能を
有する酵素Ａ生産量を著しく向上させることがで
きる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトコツクス属に属し、ベンゾイルギ
   酸還元酵素Ａ生産能を有する微生物を培養して該
   酵素を菌体内に生産させるに際し、該微生物を、
   トマト果実から得られるジユースと、ペプトン
   と、麦芽エキスと、２価コバルトイオンを含む液
   体培地で培養することを特徴とするベンゾイルギ
   酸還元酵素Ａの増収方法。