JPH03255959A - ポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は特定な結合対である被分析物の検定に特に好適
な新規ポリマーを提供するものである。

この種の検定はよく知られている上に、広く適用されて
いる。上記結合対の例には抗原（ハブテン）／抗体、糖
／レクチン、ビオチン／アジピン（ストレプトアジピン
）　、ＤＮＡ　（ＲＮＡ）鎖／相補ＤＮＡ　（ＲＮＡ）
鎖や酵素／基質がある。

［従来技術の説明及びその課題］ これら検定では、例えば標識試薬を使用するが、この試
薬は特定結合対である。試薬は放射線により標識化して
もよく、あるいは標識化は抗原性か、あるいは蛍光、化
学ルミネッセンス、色素原、又は酵素信号システム部分
を形成することがきる被検出性単位に結合することによ
り行ってもよい。通常、試薬は反応位置をひとつ以上も
ち、各反応位置に被検出性モノマー単位を結合する。

試薬分子の各反応位置に多くの被検出性単位を結合でき
なら、検定の感度を向上できると考えられる。従って、
本発明の目的はこの考えにより検定感度を改善すること
にある。

［課題を解決する手段］ すなわち、本発明は結合アームにより結合した被検出性
単位の鎖からなるポリマーを提供するものである。好ま
しくは、本ポリマーは鎖ａｂａｂａｂ・・・　（ａは被
検出性単位、そしてｂは結合アームである）からなる。

ポリマーの単位数に臨界的意味はない。原理的には、被
検出性単位を２つだけ含むポリマーを使用すれば、検定
感度を倍増できる。従って、本発明で使用する用語“ポ
リマー”には、オリゴマーと考えてもよいポリマーも含
まれる。

［発明の好適な実施態様の説明］ 十分な注意を払えば、はぼすべての単位を検出できる。

簡単に検出できる単位、例えば上記の検定等に標識とし
て通常使用されている単位は本発明で使用することがで
きる。好適なのは、抗原性か、または蛍光、化学ルミネ
ッセンス、色素原又は酵素信号システム部分を形成する
被検出性単位である。特に好適なのはフルオレセインや
クマリン系の蛍光単位である。被検出性単位をポリマー
鎖に組込むには、ある化学的変性が必要である。

いうまでもないことだが、重要なことは、この化学的変
性が単位を検出できる性質を妨害しないことである。例
えば、被検出性単位が蛍光種の場合に重要なことは、こ
れがポリマーに組込んだ後に蛍光を発生できることであ
る。各種の被検出性単位をその被検出性を阻害せずに化
学的に変性できる方法については、よく知られているの
で、ここでは説明しない。

上記結合アームが被検出性単位を結合する。芳香族基や
環式基、あるいはエチレン系不飽和基があると結合がさ
らに強くなるので好ましい。好適なのは長鎖、例えば少
なくとも３個以上の炭素原子を含むものである。これは
離れた立体配置形の被検出性単位についても５嵌まるの
で、鎖中のひとつの単位の反応が（検出過程で）隣接単
位に妨害されることはない。結合アームについては、よ
く知られている。

特に、被検出性単位が疎水性の場合には、ポリマーを水
溶性化するのに必要は範囲まで結合アームを親水性にす
るのが好適である。水溶性ポリマーは一部の目的には有
用であるが、大半の検定系については不適なものである
。好適な結合単位は１．４−ジ（アミノアルキル）ピペ
ラジン系のものであり、ここでアルキル基の炭素原子数
は例えば２〜１２である。例えば炭素原子数が２〜１２
のアルキル鎖の両末端にアミ７基が結合したジ（アミノ
アルカン）系の結合アームはそれ程好ましくない。

本ポリマーは標準的な方法によって調製すればよい。例
えば、２つのカルボン酸基又は１つのカルボン酸基、あ
るいは１つのアミノ又はチオシアネート基を与えるよう
に被検出性単位を変性する場合には、公知な複合方法、
例えばペプチド綜合試薬やジアルデヒドによって、ある
いはアミノ酸からポリペプチドを調製するために蛋白質
化学で使用されている標準的な方法によって重合を行え
ばよい。非線形ポリマーを除外しつつ線形ポリマーを確
実に形成するためには、鎖の一端を固体支持体に結合す
ればよい。

また、本発明は標識試薬において、試薬が特定な結合対
で、標識が上記ポリマーである標識試薬を提供するもの
でもある。試薬をポリマーで標識化するさいの化学作用
はモノマー標識化におけるそれと本質的に同じである。

この標識試薬は従来方法で特定結合対の検定に使用する
ことができる。また本発明には、この検定を行う、標識
試薬を含むを検定キットも含まれる。

なお、本発明によれば、被検出性単位はポリマ−鎖部分
（すなわち、ポリマー鎖のパックホーン部分を構成する
。

これは、被検出性単位がポリマー鎖に単に結合している
ポリマーとは対照的である。

被検出性単位がポリマー“バックボーン”部分を形成す
るポリマーには幾つかの長所がある。

例えば、被検出性単位の間隔を調節できる。また、例え
ば、ポリマー鎖の長さも調節できる。更に、例示として
だけであるが、ポリマー溶解度も調節できる（例えば、
程度に差はあるが、ポリマーを不溶性に、あるいは可溶
性にできる。例えば、このためには、極性導入を調節す
ればよい）。

なお、被検出性単位の間隔を調節しないと、例えば“自
己冷却（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）”及び／又は
被検出性単位の疎水性“ポケット”への入り込みにより
問題が生じることがある。このような問題が生じると、
検定レスポンスは予測できず、また再現不可能である。

また、例えばポリマー鎖長を調節しないと、検定レスポ
ンスの再現性が悪くなる。

さらに、例えば溶解度を調節すると、（例えば水又は水
性媒体に対して）依然として有効な溶解度もつ相当な鎖
長のポリマーの調製が容易になる。

以下、本発明を添付図面について説明する。

第１図は本発明による７−ヒドロキシクマリン系ポリマ
ーの構造を示す図であり、 第２図は第１図ポリマーの調製工程を示す図であり、 第３図はポリマー調製に使用することができるクマリン
構造の別な例を示す図であり、そして第４図はポリマー
調製に使用することができるフロオレセイン構造の別な
例を示す図である。

第１図に本発明による標識試薬を示す。この試薬は抗原
である。標識は、４つの結合アームにより結合した（及
び抗原に結合した）４つの被検出性単位からなるポリマ
ーである。被検出性単位Ａは７−ヒドロキシ−８−カル
ボキシ−４−メチルクマリン−３＝酢酸から誘導した。

また、結合アームＢは１，４−ビス（３−アミノプロピ
ル）ピペラジンから誘導した。

第２図にこの試薬の調製工程を示す。濃硫酸を存在させ
た状態で、２−６−ジヒドロキシ安息香酸Ｃとジエチル
アセチルスクシネートＤとを反応させて、エチルエステ
ルを生成してから、これをＫＯＨにより７−ヒドロキシ
−８−カルボキシ４−メチルクマリン−３−酢酸Ｆに転
化する。工程２では、ＦのエチルエステルＧを生成する
。工程３では、ｐＨ８，６でＧと１，４−ビス（３アミ
ノプロピル）ピペラジンＨとを重合して、線形ポリマー
■を得る。工程４では、この線形ポリマーと抗原を反応
させて、第１図に示す試薬を得る。

第３図に６種類のクマリン構造Ｆ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ
を示す。すべて２つのカルボン酸基をもつ。化合物Ｍ及
びＮのカルボン酸基は６位又は８位に存在することがで
きる。これは矢印で示しである。別なりマリン構造も可
能である。

第４図に各種のフルオレセン系被検出性単位の調製法を
示す。２，６−ジヒドロキシ安息香酸Ｐと、芳香族環に
置換基Ｒがあるフタル酸誘導体Ｑとを反応させる。Ｒの
性質に応じて、各種の反応生成物が生成する。Ｎｏ、基
の場合には、ＮＨ，、従ってＮＳＣに還元でき、ポリマ
ーへのフルオレセン誘導体の結合を容易にできる。

寒塵旦ユ それぞれ等モル量の２．６−ジヒドロキシ安息香酸（第
２図のＣ）とジエチルスクン不一ト（第２図のＤ）を混
合し、濃硫酸を加え、混合物を一夜放置して、エチルエ
ステルを生成した。

混合物を低温の蒸留水に加えることにより混合物からエ
チルエステルを析出させた。析出したエチルエステルを
フィルターにより分離・洗浄シてから、精製した。（精
製は、例えば結晶化やシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーにより行えばよい）。

はぼ５■のエチルエステルを５％メタノール系ＫＯＨと
混合し、５０℃で一夜放置した。次に、回転蒸発器によ
りメタノールを真空除去し、ＩＭＨＣＣを加えて析出し
、濾過し、洗浄して、化合物Ｆ（第２図参照）を得た。

実施例２ 化合物Ｆを処理して、ＦのＮ−ヒドロキシスクシニミジ
ルエステル（則ち、第２図の化合物Ｇ）を得た。

テトラホウ酸ナトリウムの存在下ｐＨ８，６で、化合物
Ｇを２時間かけて化合物Ｈに少しづつ加えて、重合を行
い、線形ポリマー（オリゴマー）を得た。

実施例３ 実施例１における化合物Ｆの調製方法と同様にして化合
物Ｊ　（第３図）を調製した。

実施例４ 実施例２の化合物Ｆの処理と同様にして化合物Ｊを処理
して、線形ポリマーを生成した。

実施例５ 実施例２及び４のポリマー反応混合物を高分子量ポリマ
ーの存在について分析した。

２つの方法を用いた。

（ａ）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムによるゲル・フィ
ルトレージョン・クロマトグラフィーこの方法では、テ
トラホウ酸ナトリウムバッファー　（ｐＨ９，０）で平
衡化した５０×１゜５ｃｍカラムを用いて、４５−７時
間の流量で１．５−の反応混合物をクロマトグラフィー
して、１．８ｄの画分を得た。

（ｂ）反応混合物を濃縮し、不溶物を除去し、５ｇの重
炭酸／炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８，５）により
（ビイスキング・チューブを使用して）３〜７日間（透
析バッファーは毎日変更）透析した。得られたものを（
ａ）に記載したようにクロマトグラフィーした。

カラム画分の３６０ｎｍ吸収及び蛍光（３７０ｎｍ〜４
７０ｎｍ）を測定した。試験例すべてにおいて、カラム
・ボイド・ボリュームにピークがあり、成分の分子量が
５００００以上であることを示した。

より低い分子量物質は、後の段階でカラムに生じた大き
なピークに溶離した。

なお、透析により低分子量置換基（例えば、１００００
〜１２０００未満）を除去でき、透析膜には高分子量物
質が残り、これを回収する。

数回のカラム操作により得た高分子量ピークをプールし
、２２０〜７００ｎｍにおける走査により分析し、蛍光
レベルについて測定した（定量測定）。

これら物質は出発蛍光色素単位（３６０ｎｍにピーク）
と同様な吸収プロフィルを示した。また、高レベルの特
徴的な明るい青色蛍光を呈した。

吸収レベル及び蛍光レベルはいずれもｐＨ依存性で、ｐ
Ｈ９，８〜１０．３で最大吸収及び蛍光を示した。

実施例６ ステロイドハプテンに複合するために、実施例２で調製
したポリマー（則ち、化合物Ｉ）を使用した。

すなわち、ステロイド誘導体１７−ｔ−ヒドロキシプロ
ゲストロン−３−カルボキシメチルオキシムをそのＮ−
ヒドロキシスフシミジル誘導体（活性エステル）に誘導
することにより活性化した。この誘導体（５００μｇ）
を（１００μｅジオキサン中において）ポリマー■の溶
液（２−の重炭酸ナトリウムバッファー中２０■、ｐＨ
８，６）に加え、周囲温度で２時間反応させた。

生成反応混合物を５ｅｐｈａｄｅｘＧ６２５カラムによ
りクロマトグラフィーした。高分子量物質を含むクロマ
トグラフィー操作からの初期ピークを集めた。

実施例７ 実施例６を繰り返したが、使用したステロイド誘導体は
１７−β−エストラジオール−３−カルボキシメチルエ
ーテルであった。

実施例８ １７−ｆｆ−ヒドロキシプロゲステロンに対する抗原（
Ｉ　ｇＧ製剤）を羊の抗血清から単離し、文献に記載さ
れている実験記録に従い臭化シアノゲン活性化により市
販の磁化性ミクロセルロース粒子に結合した。

実施例９ 実施例８を反復したが、１７−β−エスラジオールに対
する抗原（Ｉ　ｇＧ製剤）を羊の抗血清から単離し、市
販の磁化性ミクロセルロース粒子に結合した。

実施例１０ 実施例８で調製した抗原結合粒子のアリコツト（１０ｍ
Ｍの燐酸バッファーに懸濁したほぼ２０μ９粒子を含む
５０μｇ；ｐＨは０．１ＭＮａ（１！、０．２％ゼラチ
ンで７．２に調整）を実施例６で調製したポリマーハブ
テンのアリコツト（１００μｇ）と３０分間振とう混合
し、粒子をバッファーで３回洗浄し、２０％アセトニト
リルを含む０゜１Ｍグリシン−ＮａＯＨバッフｙ−（ｐ
Ｈ１０゜４）５００μｇと共に１５分間放置した。なお
、アセトニトリル含有高ｐＨバッファーも抗原結合ハブ
テンを溶離することか知られている。

（磁気プレートを使用して、粒子を沈降させた後、溶離
した上澄みの蛍光を測定した。対照実験と比較した場合
、相当な蛍光レベルが認められた。

これにより、ポリマー／）＼ブテン製剤が共有結合した
、免疫学的に活性なノ・ブテンを含むことが判った。

実施例１１ 抗原結合粒子として実施例９で調製したものを、そして
ポリマー／ハブテン製剤として実施例７で調製したもの
を使用した以外は、実施例１０に従った。

蛍光測定により、ポリマー／ノ・ブテン製剤が共有結合
した、免疫学的に活性なノ＼ブテンを含んでいることが
判った。

実施例１２ 検定における固相抗体として、抗原結合磁化性粒子を使
用した。検定は、蛍光トレーサーとして（実施例６で調
製した）ポリマー／ハブテン製剤を使用して蛍光免疫検
定法で実施した。

抗原及びポリマー／ノ・ブテン製剤を適当に希釈したと
ころ、拮抗ハブテン（１７−σ−ヒドロキシプロゲスト
ロン）が１０ｎｇ存在すると、トレーサーの８０％以上
の結合を阻害することが判つた。

拮抗ハプテンのレベルをＯから１０ｎｇ／検定試験管に
漸増させた実験から標準曲線を求めた。

実施例１３ ポリマー／ハブテン製剤として実施例７で調製したもの
を、そして拮抗ハプテンとして１７−βエストラジオー
ルを使用した以外は、実施例１２に従った。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による７−ヒドロキシクマリン系ポリマ
ーの構造を示す図であり、 第２図は第１図ポリマーの調製工程を示す図であり、 第３図はポリマー調製に使用することができるクマリン
構造の別な例を示す図であり、そして第４図はポリマー
調製に使用することができるフロオレセイン構造の別な
例を示す図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）結合アームにより結合した被検出性単位の鎖から
   なるポリマー。
2. （２）結合アームを親水性にすることにより水溶性にじ
   た請求項第１項に記載のポリマー。
3. （３）結合アームが１，４−ジ（アミノアルキル）ピペ
   ラジンからなる請求項第１項又は第２項に記載のポリマ
   ー。
4. （４）被検出性単位が抗原性か、あるいは蛍光、化学ル
   ミネッセンス、色素原又は酵素信号システム部分を構成
   する請求項第１〜３項のいずれか１項に記載のポリマー
   。
5. （５）被検出性単位が蛍光発光性である請求項第４項に
   記載のポリマー。
6. （６）被検出性単位がフルオレセイン又はクマリン系で
   ある請求項第５項に記載のポリマー。
7. （７）標識試薬において、試薬が特定な結合対で、標識
   が請求項第１〜６項のいずれ１項に記載のポリマーであ
   る標識試薬。
8. （８）試薬が特定な結合対である標識試薬を使用する特
   定な結合対を検定する方法において、標識試薬として請
   求項第７項に記載の標識試薬を使用する検定方法。
9. （９）請求項第７項に記載の標識試薬を含む、請求項第
   ８項に記載の検定方法を行うため検定キット。