JPH09504505A - プテリン誘導体およびその製法と利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 下記一般式Ｉで表されるプテリン誘導体は、ネオプテリンおよびビオプテリンを検出する鋭敏な免疫試験に有用である。一般式Ｉ： ここで、Ｒ₁は-(CHOH)₂-CH₃もしくは-(CHOH)₂-CH₂OH基を表わし、Ｒ₂とＲ₃は同じではなく、水素もしくは-(CH₂)₃CONH(CH₂)₄-NH-R₄基のいずれか一方を表わす。ただし、ここでＲ₄は水素または免疫試験での通常の標識基または固相免疫試験での通常のコーティング／支持体材料もしくは抗体形成での免疫性基である。

Description

【発明の詳細な説明】 プテリン誘導体およびその製法と利用法 ネオプテリンおよびジヒドロネオプテリンは、インターフェロンやリポ多糖類 による活性化によって、主に霊長類（僅かな程度ならより下等なホ乳類でも）の 単核白血球／マクロファージで作られて分泌される。細胞免疫系の活性化が起こ るような病気の患者の体液では、ネオプテリンのレベルが増加しているのを見る ことができる。 ネオプテリンのレベルを決定することは、例えば、移植の際の拒絶反応の予後 徴候を見たり、輸血の安全性を高めるために血液ドナーのＨＩＶ感染や他の未確 認の感染症をふるい分けたりする、といった医療診断に有効であることが明らか にされてきた。ネオプテリンの測定は、蛍光による検知をする高速液体クロマト グラフィー（ＨＰＬＣ）、放射性物質を用いた免疫試験、薄層クロマトグラフィ ーなど様々な方法によって行なうことができる。ジヒドロネオプテリンは、公知 の方法を使って低いｐＨで（ヨウ素もしくは二酸化マンガンを使って）酸化する ことでネオプテリンとして検出することができるし、あるいは電気化学的な検知 をするＨＰＬＣを使えばジヒドロネオプテリンとして検出することができる。 テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ₄）は芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（神 経伝達物質ドーパミンおよびヒドロキシトリプタミンの合成）や五酸化二窒素シ ンテターゼといった重要な酵素の共同因子（コファクター）である。従って、こ れを決定することは価値あることである。ビオプテリンそれ自身は体液中に存在 しないが、上記したネオプテリンのように酸性下での酸化によってＢＨ₄から定 量的に得ることができ、様々な方法によって測定することができる。 放射性物質を使用しない免疫試験については文献に記載されてきた。しかし、 現在までのところ、血清中のプテリンを測定するのに（ＨＰＬＣに比べて）簡単 に出来て、しかも正確な結果を得ることができるような酵素免疫試験はまったく 市場に出されていない。 プテリンを測定するために行われる放射性物質を用いる免疫試験については、 ＤＥ−Ａ−３０２５２２６に記載されている。この試験では、２位のアミノ基と 標識基との間にあるスペサー基は炭素数１から６の直鎖もしくは分岐アルキル基 である。これらの免疫試験は、ネオプテリンやビオプテリンを所定の手順で測定 して信頼できる結果を得るためには不充分な感度である。 ＥＰ−Ａ−０３７０９６０にはカプロン酸基をスペーサー基にした免疫試験が 記載されているが、これも不満足な結果しか得られない。 従って、本発明の目的は、実質的により信頼のおける免疫試験、特に体液中の ネオプテリンのレベルを測定するための放射性物質を使用しない試験、を行うた めの物質を提供することである。研究の結果、プテリン環と標識基との間のスペ サー基を、プロピル基を介してアミノ基とＣ²（”Ｎ²”）で連結するか、もしく はプロピル基を介してネオプテリンまたはビオプテリンのＮ³と連結するω−ア ミノブチル−カルボキシアミドプロピル基［H₂N-(CH₂)₄-NH-CO-(CH₂)₃-］にすれ ば目的のような免疫試験ができることが思いがけなく分った。 従って、第一に、本発明は一般式Ｉで表わされるプテリン誘導体に関するもの である。 ネオプテリンとビオプテリンは、下記のような構造を持っている。 ただし、ここで使用した記号は以下の意味を表わす。 Ｎ³ ：プテリン環の３位にある窒素 Ｎ² ：プテリン環の３位にある炭素に付いている窒素 一般式Ｉ ここで、Ｒ₁は-(CHOH)₂-CH₃または-(CHOH)₂-CH₂OHを表わし、Ｒ₂とＲ₃は同じ ではなく、水素もしくは-(CH₂)₃CONH(CH₂)₄-NH-R₄基のいずれか一方を表わす。 ただし、ここでＲ₄は水素または免疫試験での通常の標識基または固相免疫試験 での通常のコーティング／支持体材料もしくは抗体形成での免疫性基である。 「通常の標識基」の例としては、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光 標識が挙げられる。 固相免疫試験での「支持体材料」の例はマイクロチター・プレートやポリスチ レンのチューブあるいはビーズなどで、そこに「通常のコーティング材料」が共 有結合によってか、あるいは吸着によって付いている。「通常のコーティング材 料」の例には、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリンなどのタン パク質、あるいは、ポリ（フェニルアラニン−リジン）などの合成ペプチドがあ る。しかし、化合物Ｉ（Ｒ₄＝Ｈ）は、また、カルボキシ基を有するプラスチッ ク表面のような適当な支持体材料と共有結合によって結びついていてもよい。 「免疫性基」の例は、特異的カサガイ・ヘモシアニン、チログロブリンあるい はポリアクリルアミドなどの高い免疫性を有するタンパク質やペプチドである。 上記のプテリン誘導体Ｉは、一般式IIで表わされるプテリン誘導体を１、４− ジアミノブタンと反応させることで得られる。所望によって、これにさらに続い て公知の反応によって、末端がフリーのアミノ基で標識やコーティング／支持体 材料あるいは免疫性基と連結させることもできる。 一般式II ここで、Ｒ₁は先に定義した通りで、Ｒ₅とＲ₆は同じではなく、水素もしくは- (CH₂)₃COOOH基のいずれか一方を表わす。 本発明は、ネオプテリンやビオプテリンの測定をするための免疫試験に上記の プテリン誘導体を使用することに関する。 プテリン誘導体Ｉを合成するための出発物質として用いられる一般式IIで表さ れるプテリン誘導体は、以下のようにして得ることができる。 ネオプテリンあるいはビオプテリンは４−ブロモブチル酸エチルエステルと反 応してＮ³−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリンあるいは−ビオプテリ ンを形成する。このエチルエステルは酸によって加水分解されてＮ³−カルボキ シプロピル・プテリン誘導体を生じるが、アルカリ条件下で加水分解すると同時 転位によって２−アミノ基の位置に置換基を有するＮ²−カルボキシプロピル・ プテリン誘導体を生じる。これらのカルボン酸誘導体は、いずれもカルボキシル 基を活性化する通常の反応を用いて１、４−ジアミノブタンとさらに反応させる ことができる。例えば、無水ジメチルホルムアミド中でＮ−ヒドロキシスクシン イミドを用いて、モルホリノエチル・イソニトリルとルチジンを加えるか、ある いは活性化剤としてカルボジイミドを使って上記の３−カルボキシプロピル・プ テリン誘導体のω−アミノブチルイミドを得ることができる。また、Ｎ³−アミ ドをアルカリを使って転位させて対応するＮ²−誘導体にすることもできる。 Ｒ₄が標識基、コーティング／支持体材料あるいは免疫性基になっている物質 は、Ｒ₄が水素である一般式Ｉで表される物質から、適当な標識基、固相免疫試 験でのコーティング／支持体材料あるいは免疫性基と反応させることによって得 られる。 Ｒ₄が水素である一般式Ｉで表される物質は、また、ネオプテリンやビオプテ リンに対する抗体を生成することにも利用できる。このため、この目的のために 一般に用いられている免疫性基が付けられる。そのような免疫性基の例には免疫 性タンパク質があり、特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、チログロブリン、特 異的カサガイ・ヘモシアニン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。ウサギ、 ヒツジ、ニワトリ、マウスなどでは免疫化のために通常用いられる補薬を用いて もよい。補助注射の回数および間隔は個々の動物の種によって変えてもよい。さ らに、他の物質によって生じたネオプテリンやビオプテリンに対する抗体も、対 応する免疫試験を行うのに潜在的に適していることも示されてきている。また、 例えば免疫化したマウスのヒ臓細胞から通常の処理によって得られるモノクロー ル抗体を使用することも可能である。 適当なコーティングあるいは支持体材料、例えば、ＢＳＡ、免疫グロブリン、 トランスフェリン、プラスチック表面などと結び付けられたＩ式で表される誘導 体は、また、ＥＰ−０１３５０７１の方法による免疫試験に使用することができ る。 好適な放射性標識は、例えば、下記のような化学式で表わされる３’−¹²⁵ヨ ードチロシルもしくは４’−ヒドロキシ−３’−¹²⁵ヨードフェニルプロピオン 酸誘導体である。 これらは、ω−アミノネオプテリン誘導体（もしくはω−アミノビオプテリン 誘導体）ＩＡ／Ｂを適当な放射性標識化合物（上記の式を参照）の活性化Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミド・エステルと反応させて、得られた生成物をＨＰＬＣで 分離するという「間接ラベリング」によって得ることができる。あるいは、まず 最初にヨウ素の入っていない類似化合物を合成して、それから、例えば放射性ヨ ウ素を用いた通常のクロラミンＴ法によって標識を付ける「直接放射性ラベリン グ」をすることもできる。 好適な酵素標識は、例えば、アルカリ・ホスファーゼ、ホースラディシュ・ペ ルオキシターゼあるいはβ−ガラクトシダーゼなどを通常の方法（例えば、グル タルアルデヒドやエポキシ誘導体などを用いたり、過ヨウ素酸酸化をしたりする 方法）で活性化したもので、ω−アミノプテリン誘導体の末端のアミノ基につな げられる。精製はゲル・クロマトグラフィーが効果的で、通常はＨＰＬＣによっ て行われる。 好適な蛍光標識は、例えば、フルオレセイン基である。これは、ω−アミノプ テリン誘導体をフルオレセイン・イソチオシアネートと反応させることで容易に 導入することができる。この化合物はＨＰＬＣによって精製する。 好適な化学発光標識は、例えばアクリジニウムエステル、ルミノール誘導体、 ＡＢＥＩ（Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール）などで、こ れらは通常、市販の活性化誘導体によって導入される。生成物はＨＰＬＣによっ て精製する。 以下の実施例によって、出発物質（II式）と本発明による物質（Ｉ式）の合成 およびこれらの用途について詳細に説明するが、これら実施例は必ずしも、すべ ての可能な態様を与えるものではない。 用いた化学薬品は高純度のもので、Ｅ．メルク社（ダルムシュタット）、フル カ社（ノイ−ウルム）、シグマ社（ミュンヘン）あるいはカルバイオケム社（バ ート・ゾーデン）から入手したものである。ネオプテリンとビオプテリンンはド クター・シャルク・ラボラトリー（スイス、ヨナ）から得た。その他の特殊な材 料については個々の実施例のなかで記載した。薄層クロマトグラフィー用のセル ロース・シートはシュライヒャー・アンド・シェール（ダッセル）から得た。 化学式IIの中間体の合成 Ｎ³−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリン・エチルエステル（IIＡ） １２ｍｇのネオプテリンを１．５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸 濁させる。１４μｌの４−ブロモブチル酸エチルエステルと２６ｍｇの無水Ｋ₂ ＣＯ₃を加えてから、混合物を２日間室温で振盪する。反応混合液の一部を薄層 クロマトグラフィー（セルロースシート、ｎ−プロパノール／３％ＮＨ₃水の２ ：１混合溶媒）にかけ、主バンド（Ｒ_f：約０．６５）をメタノール−水で溶離 する。あるいは、生成物をカラム内にデルタパックＣ−１８（ミリポール、エシ ェボーン）を充填したＨＰＬＣで、傾斜溶離法（溶離液Ａ：０．１％トリフロロ 酢酸水溶液、溶離液Ｂ：０．１％トリフロロ酢酸アセトニトリル溶液、３０分間 でＢが０から２５％）によって単離してもよい。保持時間は約２１分。収率は３ ２％。 Ｎ³−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリン（IIＢ） 上記のエチルエステル５ｍｇを、光を遮った状態で５００μｌの１Ｎ塩酸とと もに２ｍｌの水の中で２日間おだやかに振盪する。これでエステルは完全に加水 分解される。混合物をロータリーエバポレーターによって真空乾燥させる。収量 ３．７ｍｇ（収率８０％）。Ｒ_f値は約０．２３（セルロースシート、ｎ−プロ パノール／３％ＮＨ₃水の２：１混合溶媒）。 Ｎ²−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリン（IIＣ） ５ｍｇのＮ³−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリン・エチルエステル を、室温、遮光状態で、２ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で処理し、そ の後、混合液を塩酸で中和する。薄層クロマトグラフィー（セルロースシート、 ｎ−プロパノール／３％ＮＨ₃水の２：１混合溶媒）でＲ_f値０．１５に得られる 。収量は３．２ｍｇ（６９％）。 化学式Ｉの物質の合成 ［実施例１］ Ｎ³−（ω−アミノブチル−３−カルボキシアミド−プロピル）−ネオプテリン （“Ｎ³−ω−アミノネオプテリン”）ＩＡ ３ｍｇのＮ³−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリンIIＢを１．５ｍｌ のＤＭＦ（無水）に溶かし、５０μｌのＤＭＦ（無水）と４μｌのルチジン中で ５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと６μｌのモルホリノエチル・イソニト リルと混合する。室温、遮光状態で３日間おだやかに振盪した後、５０μｌの１ ，４−ジアミノブタンを加え、混合物をさらに２日間振盪し続ける。反応混合液 の一部を薄層クロマトグラフィー（セルロースシート、ｎ−プロパノール／３％ ＮＨ₃水の２．５：１混合溶媒）で精製する。主バンド（Ｒ_f：約０．３）をメタ ノール−水で溶離し、ロータリーエバポレーターで乾燥させる。 同様の生成物は、以下の方法でも得ることができる。 ８．５ｍｇのＮ³−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリン・エチルエス テルIIＡを、６ｍｌの１Ｎ塩酸を使って室温、遮光状態で２日間処理する。混合 物をロータリーエバポレーターによって真空乾燥させる。これを２ｍｌの水で３ 回くり返してから、残渣を２ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶かし、１２ｍgのエチル・カ ルボジイミドを加える。室温、遮光状態で１６時間振盪してから、１５μｌの１ ，４−ジアミノブタンを加え、混合物をさらに１日間振盪し続ける。混合物をロ ータリーエバポレーターによって真空乾燥させ、ＤＭＦでこれをくり返す。精製 は上記と同様に行う。Ｒ_f：０．３２。 ［実施例２］ Ｎ²−（ω−アミノブチル−３−カルボキシアミド−プロピル）−ネオプテリン （“Ｎ²−ω−アミノネオプテリン”）ＩＢ ７ｍｇのＮ²−（３−カルボキシプロピル）−ネオプテリンIIＣを２ｍｌのＤ ＭＦ（無水）と５μｌのルチジン中に溶解させる。一方、６ｍｇのＮ−ヒドロキ シスクシンイミドと７μｌのモルホリノエチル・イソニトリルとを１２０μｌの ＤＭＦ（無水）に溶かし、これを上記の溶液に加える。混合物を室温、遮光状態 で５日間撹拌する。その後、１００μｌの１，４−ジアミノブタンを加え、混合 物を室温、遮光状態でさらに１６時間おだやかに振盪する。ｎ−プロパノール／ ３％ＮＨ₃水の２．５：１混合溶媒を用いたセルロースシートの薄層クロマトグ ラフィーにかけると、Ｒ_f約０．２７に主バンドができる。これをメタノール／ 水／アンモニアで溶離し、ロータリーエバポレーターで乾燥する。収量４．３ｍ ｇ（５３％）。 この物質は、以下の方法でも得ることができる。 １ｍｇのＮ³−ω−アミノネオプテリン誘導体ＩＡ（実施例１で得たもの）を ５００ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に加え、室温、遮光状態で４時間 おだやかに振盪する。得られた混合物を塩酸で中和し、凍結乾燥する。ｎ−プロ パノール／３％ＮＨ₃水の２．５：１混合溶媒を用いたセルロースシートの薄層 クロマトグラフィーでのＲ_f値は約０．２７である。 ［実施例３］ “Ｎ³−ネオプテリン−アルカリ・ホスファターゼ標識” 実施例１で得られたＮ³−ω−アミノネオプテリン誘導体ＩＡ０．２４ｍｇを ２５μｌの炭酸塩緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９）に溶かし、４℃で５５μｌ（０．５ｍ ｇ）の活性化アルカリ・ホスファターゼ（ピアース・ヨーロッパ、オランダ）と 混合した。得られた混合液を４℃で一晩放置してから１５μｌのリシン（２Ｍ） を加えて、さらに２時間後に１７５μｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１％水 溶液）を加える。得られた混合物をゲル・クロマトグラフィー（ＮＡＰ−１０カ ラム；ファーマシア、フライブルク）によって分離する。 ［実施例４］ “Ｎ²−ネオプテリン−アルカリ・ホスファターゼ標識” 実施例３と同様にして、０．２４ｍｇのＮ²−ω−アミノネオプテリン誘導体 ＩＢ（実施例２）をアルカリ・ホスファターゼ（予め活性化しておいたもの、ピ アース・ヨーロッパ）で処理する。生成物は上記のようにゲル・クロマトグラフ ィー（ＮＡＰ−１０）によって分離する。 ［実施例５］ “Ｎ³−ネオプテリン−ＢＳＡ−複合体” ２０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；バイヤー社レーバーキュッセン）を ２ｍｌの水に溶かし、これに４℃で１００μｌのグルタルアルデヒドを加える。 室温で１時間放置した後、０．５ｍｇのＮ³−ω−アミノネオプテリン誘導体Ｉ Ａ（実施例１によるもの）を１ｍｌのメタノール／水に溶かしたものを加える。 過剰のアルデヒド基をリシンによって飽和にする。生成物を水（総量で５リット ル）で透析し、一部を凍結乾燥する。収量１４ｍｇ。 ［実施例６］ “Ｎ³−ネオプテリン−ＫＬＨ−複合体” 実施例５と同様にして、２５ｍｇの特異的カサガイ・ヘモシアニンを２ｍｌの 水に溶かし、Ｎ³−ω−アミノネオプテリン誘導体ＩＡと反応させる。生成物を 総量で６リットルの水で透析（数回くり返す）して、一部を凍結乾燥する。収量 １８ｍｇ。 ［実施例７］ “Ｎ²−ネオプテリン−ＢＳＡ−複合体” 実施例５と同様にして、２０ｍｇのＢＳＡをＮ²−ω−アミノネオプテリン誘 導体ＩＢと反応させ、得られた生成物を透析する。収量１３ｍｇ。 ［実施例８］ “Ｎ³−ネオプテリン−フルオレセイン標識” ０．４ｍｇのω−アミノネオプテリン誘導体ＩＡを１ｍｌの０．０５Ｍホウ酸 塩緩衝液（ｐＨ８．２）に溶かし、そこに４０μｌのフルオレセイン・イソチオ シアネー卜溶液（１０ｍｇ／ｍｌのジメチルスロホキシド溶液）を加える。１４ 時間後、同量を室温、遮光状態で加える。さらに１８時間後、得られた混合物を ＨＰＬＣで分離する（ユーロスファー８０−Ｃ１８、実施例１と同様の傾斜溶離 法を行い、４５分間でＢが０−２５％、１０分間で２５−１００％）。保持時間 は５２分。 ［実施例９］ “Ｎ²−ネオプテリン−アクリジニウムエステル化学発光標識” 実施例２のω−アミノネオプテリン誘導体ＩＡ１０ｍｌ（０．６ｍｇ／ｍｌ） を５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）に加えてから、 ４０μｌのアクリジニウムエステル溶液（ＭＡ７０、１ｍｇ／ｍｌ；ヒュヒスト ・ベーリング、フランクフルト）を加える。得られた混合物を室温、遮光状態で １５分間静置する。こうして標識を付けられたネオプテリンは、Ｃ１８逆相ＨＰ ＬＣで、共にトリフロロ酢酸０．１％を含む溶離液Ａ（水／アセトニトリル、９ ５／５）と溶離液Ｂ（アセトニトリル／水、９０／１０）との傾斜溶離法によっ て精製する。 ［実施例１０］体液中のネオプテリンを測定する酵素免疫試験 標識物質（トレーサー）の作成 １００ｍＭのヘペス（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、８０ｍｇ／ｌの青 色食用色素、１０．７ｇ／ｌのアルカリ・ホスファターゼ（１Ｕ／ｍｇ）、１． ０７ｇ／ｌづづのヒツジおよびウシのＩｇＧ、および１６ｇ／ｌのＢＳＡを含む 緩衝液で、実施例５のネオプテリン−アルカリ・ホスファターゼ複合体を約１８ ００Ｕ／μｌまで希釈し、２．５ｍｌを取り出し凍結乾燥する。 コーティングしたマイクロチター・プレートの作成 １０ｍＭのトリス／塩酸（ｐＨ７．８、１０ｍＭのＮａＣｌ）中に１０ｍｇの ロバ抗ヒツジ抗体を溶かした溶液３００μｌを、マイクロチター・プレート（マ キシソープＦ９６、ヌンク）のそれぞれのウェルに加えた。一晩放置した後、溶 液を吸引除去し、得られたプレートを０．５％ＢＳＡ／２％砂糖溶液で２時間飽 和させた。それぞれのウェルに、１０ｍＭのトリス／塩酸（ｐＨ７．８、１０ｍ ＭのＮａＣｌ）に溶かした抗ネオプテリン抗血清希釈液（２ｍｇ／ｌ）３００μ ｌを加え、１８から２４時間後に溶液を吸引除去し、再度プレートを上記のよう に飽和させてから凍結乾燥する。 標準試料の作成 ネオプテリンを含まないヒト血清を殺菌ロ過し、０．０５％のアジ化ナトリウ ムと所望の量のネオプテリンを加える。 試験手順 １。凍結乾燥した上記の標識物質２．５ｍｌを、１００ｍＭヘペス緩衝液（ｐ Ｈ６．５、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）４０ｍｌで戻す。 ２。５０ｍｌの標準試料または患者の血清（もしくは血漿）と１５０μｌの標 識物質をピペットで、コーティングしていないマイクロチター・プレートのウェ ルに入れ、完全に混合する。 ３。得られた混合物１５０μｌを、抗体でコーティングしたマイクロチター・ プレートに移して、室温、遮光状態で２時間静置する。 ４。３回洗浄する。 ５。それぞれのウェルに１０μｌの４−ニトロフェニル・ホスフェート（４− ＮＰＰ溶液）をピペットで入れ、３０分間静置する。 ６。それぞれのウェルに１０μｌの２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を入れて、反 応を停止させる。 ７。光度計で、４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定する。 結果 ［実施例１１］体液中のネオプテリンを測定する化学発光免疫試験 標識物質（トレーサー）の作成 ５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、２０ｇ／ｌのＢＳＡ、０．８ｇ／ ｌづづのヒツジおよびマウスのＩｇＧ、０．２ｇ／ｌの青色食用色素、および０ ．１ｇ／ｌのカソンＣＧを含む緩衝液で、実施例９の標識を付けられたネオプテ リンを約１８００ＲＬＵ／μｌまで希釈し、１．４ｍｌを分け取って凍結乾燥す る。 標準試料の作成 ネオプテリンを含まないヒト血清を殺菌ロ過し、０．０５％のアジ化ナトリウ ムと所望の量のネオプテリンを加える。 コーティングしたチューブの作成 １０ｍＭのトリス／塩酸（ｐＨ７．８、１０ｍＭのＮａＣｌ）で抗ネオプテリ ン抗血清を６．６ｍｇ／ｌに希釈し、それをピペットで１本について３００μｌ づつの量でスター・チューブ（マキシソープ、ヌンク）に入れ、室温で１８から ２４時間静置する。次に、溶液を吸引除去し、得られたチューブを砂糖／ＢＳＡ （２％／０．３％）溶液で飽和させた。２時間後、室温で再度、溶液を吸引除去 し凍結乾燥する。 試験手順 １。凍結乾燥した上記の標識物質１．４ｍｌを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝 液（ｐＨ６．５）２０ｍｌで戻す。 ２。５０ｍｌの標準試料または患者からの試料と２５０μｌの標識物質をピペ ットで、コーティングしていないチューブに入れる。 ３。得られた混合物を室温、遮光状態で２時間、３０r.p.m.で振盪する。 ４。４回洗浄する。 ５。ルミノメーターで測定する。 結果

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ０７Ｍ 5:00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ， ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １。下記一般式Ｉで表わされるプテリン誘導体。 ここで、Ｒ₁は-(CHOH)₂-CH₃もしくは-(CHOH)₂-CH₂OH基を表わし、Ｒ₂とＲ₃は 同じではなく、水素もしくは-(CH₂)₃CONH(CH₂)₄-NH-R₄基のいずれか一方を表わ す。ただし、ここでＲ₄は水素または免疫試験での通常の標識基または固相免疫 試験での通常のコーティング／支持体材料もしくは抗体形成での免疫性基である 。 ２。前記標識基が、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、および化学発光標識から なる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１に記載のプテリン誘導 体。 ３。下記一般式Ｉで表わされるプテリン誘導体の製造法であって、下記一般式II で表わされるプテリン誘導体を１、４−ジアミノブタンと反応させ、所望によっ ては、これに続いて末端がフリーのアミノ基で標識やコーティング／支持体材料 あるいは免疫性基と連結させることを特徴とするプテリン誘導体の製造法。 ここで、Ｒ₁は-(CHOH)₂-CH₃もしくは-(CHOH)₂-CH₂OH基を表わし、Ｒ₂とＲ₃は 同じではなく、水素もしくは-(CH₂)₃CONH(CH₂)₄-NH-R₄基のいずれか一方を表わ す。ただし、ここでＲ₄は水素または免疫試験での通常の標識基または固相免疫 試験での通常のコーティング／支持体材料もしくは抗体形成での免疫性基 である。 ここで、Ｒ₁は先に定義した通りで、Ｒ₅とＲ₆は同じではなく、水素もしくは- (CH₂)₃COOHのいずれか一方を表わす。 ４。ネオプテリンもしくはビオプテリンを検出するための免疫試験に、請求項１ もしくは２のプテリン誘導体を利用するプテリン誘導体の利用法。