JPH032565A

JPH032565A - 免疫学的分析方法

Info

Publication number: JPH032565A
Application number: JP13675989A
Authority: JP
Inventors: Yasunobu Kaneko; 金子　恭庸; Makoto Nakamura; 誠中村
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1989-05-30
Filing date: 1989-05-30
Publication date: 1991-01-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、免疫学的反応により試料中に存在する抗原、
抗体を検出するための免疫学的分析方法に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

感染症の疾患においては、患者の血液中に抗原としての
病原体すなわちウィルス、細菌などが存在したり、その
抗原に対する抗体が存在する。例えばＢ型肝炎疾患にお
いては、感染時期によってＨＢｓ抗原、ＨＢＳ抗体、Ｉ
ＩＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢ。

抗体上いった抗原、抗体が種々の割合で存在する。

このＢ型肝炎の検査方法の一つとして１（ＢＳ抗体を固
相した赤血球と試料とを反応させることにより赤血球の
凝集反応を生じさせて試料中の１（ＢＳ抗原の有無を判
定するものがある。しかし、こうして判定した結果ＨＢ
、抗原陰性、ＨＢｓ抗体陰性でありながらＨＢｃ抗体陽
性という場合がある。したがって、■ＢＳ抗原の測定だ
けでなく、ＨＢＣ抗体の測定をもする必要がある。この
ＩＩＢｃ抗体の測定方法としでは、ＨＢｃ抗原を固相し
た赤血球と試料とを反応させることによって、赤血球の
凝集反応により試料中のＨＢｃ抗体の有無を判定するの
である。

〔発明が解決しようとする課題〕

こうした従来の測定方法は、１種類の抗原、抗体を固相
した固相粒子を用いて血液中に存在する抗原、抗体の検
出を行うというものであり、この場合は所望の検出対象
抗原、抗体は１種類だけである。したがって、所望の検
出対象抗原、抗体が数種である場合は、数種の項目を個
別に測定していくことが必要であり、数種の項目の測定
結果により始めて特定の疾患の有無が判定できるという
場合は限られた測定では適正な疾患判定ができず問題で
ある。

本発明は、上記問題点を解決すべく提案されるもので、
測定工数の削減を図るとともに感度よく疾患等の有無を
判定できる免疫学的分析方法を提供することを目的とし
たものである。

〔課題を解決するための手段および作用〕本発明は、上
記目的を達成するため試料中の分析すべき抗原または抗
体の有無を、所要の固相粒子と反応させ、反応後の固相
粒子の凝集パターンによって判定する免疫学的分析方法
において、抗原または抗体を固相した第１の固相粒子と
、上記抗原または抗体とは異種の抗原または抗体を固相
した第２の固相粒子とを試料と反応させるようにした免
疫学的分析方法、および試料中の分析すべき抗原または抗体の有無を、所
要の固相粒子と反応させ反応後の固相粒子の凝集パター
ンによって判定する免疫学的分析方法において、少なく
とも２種以上の抗原または抗体を固相した固相粒子、あ
るいは抗原およびこの抗原とは異種の抗原に対する抗体
を固相した固相粒子を試料と反応させるようにした免疫
学的分析方法としたものである。

第１の発明によれば試料中に分析すべき抗原または抗体
のいずれかが存在する場合は、混合粒子のうぢのいずれ
か一方の固相粒子が上記抗原または抗体と反応して凝集
し、上記抗原、抗体の両方が存在する場合は混合粒子全
体が抗原、抗体と反応して強く凝集するので、能率よく
かつ適正な疾患の判定ができる。

また第２の発明では固相粒子は試料中の数種の抗原、抗
体を介して凝集するので、これを光学的または肉眼的手
段により観察して抗原、抗体の存在を確認できる。

〔実施例〕

本発明の各実施例において抗原または抗体を固相するの
に用いられる粒子は、人間や動物の赤血球、細菌、カオ
リン、活性炭粉末、ポリスチレン、ポリトルエンラテッ
クス、アガロース、デキストラン、セルロース、ゼラチ
ン、ポリアクリルアミド等の一般の凝集反応に用いる各
種の粒子である。

一方、抗原、抗体は、例えばＨＢ、血液型、ＨＬＡ等で
あるが、本発明では少なくとも２種以上の抗原、抗体を
或いは抗原およびこれとは異種の抗原に対する抗体を用
いるので、型特異性を示すような抗原系、抗体系を有す
るもので互いに反応し合わないものを用いる。

そして、抗原、抗体を粒子に固相する方法としては、物
理的吸着、化学的結合等の公知の方法を用いて行えばよ
い。

凝集パターンの観察方法としては、肉眼による目視観察
や、反応容器底面に形成された凝集パターンに光を照射
し散乱光または透過光をディテクタで検知するといった
方法を用いればよい。

次に本発明の第１実施例として、ＨＢＳ抗体固相粒子と
ＨＢｏ抗原固相粒子におけるＨＢｓ抗原、ＨＢ。

抗体の測定について説明する。先ず、抗ＨＢ、抗体固相
粒子を作成するのであるが、（１）ポリアクリルアミド
性の粒径約４μｍの粒子ＶＣＯ１０５０（日本ゼオン社
製）の１％濃度粒子４００μβに、０，０１％Ａｉｚｅ
ｎ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ　Ｐｕｒｅ　ＢＬＵＢ　Ｂｏｉｌ
　（保土谷化学工業社製）を含む０．０１％ポリビニル
アルコール（和光純薬社製）水溶液２００μｍを添加し
混合する。（２）次に前記（１）の混合液を０．１５Ｍ
Ｎａｃｌ　と０．旧％ザンコシネー）ＬＮ（日光ケミカ
ルズ社製）を含む０．０１ＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ　ｐＨ７
，５（以下Ｔｒｉｓ−２Ｓと称す）１顎で２、５００ｒ
ｐｍ　ｘ３ｍｉｎの遠心で３回洗浄し、’ｌ”ｒｉｓ−
２ｓを４００μβ添加する。（３）次にタンニン酸（牛
丼化学社製）をＴｒＩＳ−２Ｓで５０μｇ／誦の濃度に
調整し、その４００μｌと（２）で調整した粒子懸濁液
４００　μｌを混合し３７℃で１時間インキユーベーシ
ョンする。

（４）次に（３）をＴｒｉｓ−２３１−で２．５００ｒ
ｐｍ　Ｘ３ｍ１ｎの遠心で４回洗浄して液を除去後、Ｔ
ｒｉｓ−２３８００μβを添加する。（５）次に１１８
．抗体をＴｒｉｓ−２３で０．２０　μｇ／彪の濃度に
調整し、その４００　μｌと（４）の４００　μｌを混
合し３７℃で１時間インキュベーションする。

（６）次に（５）を０．１　％ウシ血清アルブミン（Ｂ
　Ｓ　Ａ）（ベーリンガーマンハイム社製）を含むＴｒ
ｉｓ２Ｓ　ｌｙｄで２．５００ｒｐｍ　Ｘ３ｍ１ｎの遠
心分離機で３回洗浄して液を除去後、０．０１％ＢＳＡ
を含むＴｒｉｓ−２３１ｍｌを添加する。

以上が抗ＨＢ、抗体固相粒子の作成工程であり、次にＨ
Ｂｃ抗体固相粒子の作成工程について説明する。先ず前
者の作成工程のうち（１）〜（４）についてと同様の工
程を行う。次にＨＢＣ抗原をＴｒｉｓ−２ｓで２０μｇ
／ｍｊ２の濃度に調整し、その４００　μｌと上記抗１
１Ｂ５抗体固相粒子の作成工程（１）〜（４）で作成し
た４００　μｌの粒子懸濁液を混合し、３７℃で１時間
インキュベーションする。次に０．１　％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）（ベーリンガーマンハイム社製）を含
むＴｒｉｓ−２Ｓ　　１　ｄで２．５００ｒｐｍ　ｘ　
３　ｍｉｎの遠心で３回洗浄して上澄液を除去後、０，
１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−２３１−を添加する。

以上がＨＢｃ抗原固相粒子の作成工程であり、次に２種
の特異性の異なるリガンドをそれぞれ表面に固定化した
固相粒子を混合して得られる混合粒子の作成工程につい
て説明する。先ず上述した（１）〜（４）の工程で得ら
れた未固相粒子５００μｌと抗ＨＢ、抗体固相粒子５０
０μβを混合して抗ＨＢｓ抗体固相粒子（Ｉ）とした。

さらに抗ＨＢｃ抗体の未固相粒子５００μβとＨＢｃ抗
原固相粒子５００μｌを混合する。さらに上記混合した
抗ＨＢｓ抗体固相粒子（Ｉ　”）　５００μβとＨＢｃ
抗原固相粒子（ＩＩ）５００．ｃｌとを混合して混合固
相粒子（ＩＩＩ）とした。

次にＨＢｓ抗原、抗日Ｂｃ抗体の希釈ザンプル系列の作
成工程について説明する。先ずＨＢＳ抗原（１μｇ／−
）を０，１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−２３で１／２〜１
１５１２の希釈系列を作成し１（ＢＳ抗原サンプル溶液
（八）とした。さらに抗ＨＢｃ抗体（１μｇ／ｍｌ）を
０．１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−２Ｓで１／２〜１１５
１２の希釈系列を作成し抗ＨＢ、抗体サンプル溶液（Ｂ
）　　とした。さらに上記＋１ＢＳ抗原の希釈系列と抗
日Ｂｏ抗体の希釈系列とを１７２〜１１５１２のサンプ
ル溶液のそれぞれにつき等量づつ混合して混合サンプル
溶液（Ｃ）　　とした。

次にＨＢｓ抗原、抗ＨＢＣ抗体の検出を行うのであるが
、検出を行うには先ずＨＢｓ抗原のサンプル溶液（Ａ）
、抗ＨＢｃ抗体のサンプル溶液（Ｂ）　、（八）と（Ｂ
）の混合サンプル溶液（Ｃ）の３種のサンプル溶液をそ
れぞれ２５μβづつＶ底マイクロプレート（オリンパス
光学工業社製）へ分注する。次に抗１１Ｂｓ抗体固相粒
子（■）、ＨＢｏ抗原固相粒子（ＩＩ）、（Ｉ）と（Ｉ
Ｉ）の混合固相粒子（ＩＩＩ＞を２５μβづつＶ底マイ
クロプレートへ分注する。６０分後、マイクロプレート
のウェルの底に各種の反応パターンが形成されるが、固
相粒子が一様に広がったパターンを陽性（十）、−様に
底面に貼りついた様に広がったパターンを陽性（＋Ｉ−
）、底面の中心に濃く集まったパターンを陰性（−）、
底面の中心に薄く集まったパターンを牛腸性（±）とし
て凝集の有無を判定するのである。

第１表〜第３表は、それぞれＨＢＳ抗原のサンプル溶液
（Ａ）、抗ＨＢｏ抗体のサンプル溶液（Ｂ）、（Ａ＞と
（Ｂ）の混合サンプル溶液（Ｃ）の凝集の有無を判定し
た結果を示したものである。これによると、第１表、第
２表第２表に明らかなように、ＨＢｓ抗原のみのサンプル溶液（Ａ
）、抗１１Ｂｃ抗体のみのサンプル溶液（Ｂ）に対し混
合固相粒子（ＩＩＩ）はクリーンな陽性（十）パターン
を示し、未反応の固相粒子による陰性（−）パターンは
ほとんどδ忍められなかった。

方、第３表に示すように前記（Ａ）と（Ｂ）の混合サン
プル溶液（Ｃ）に対しては混合固相粒子（ＴＩＩ）は、
特に強い凝集反応による陽性（＋）が８忍められた。

このようにＨＢ、抗原のみのサンプル溶液、抗ＨＢｃ抗
体のみのサンプル溶液かあるいは両者の混合サンプル溶
液かによって反応パターンが明らかに異なるので、これ
を肉眼的または光学的に観察すれば試料中の抗原、抗体
の存在の有無を定性的かつ感度よく測定できる。

次に本発明の第２実施例である抗ＨＢ、抗体ＨＢｃ抗原
固相粒子を用いたｌｌＢ５抗原、ＨＢｃ抗体の測定につ
いて説明する。（１）ポリアクリルアミド性の粒子線４
μｍの粒子ＶＣＯ１，０５０（日本上オン社製）の１％
濃度粒子４００μＡに、００１％Ａｉｚｅｎ　Ｖｉｃｔ
ｏｒｉａ　Ｐｕｒｅ　ＢＬＵＢ　Ｂ［ｌＨ（保土谷化学
工業社製）を含む０．０１％ポリビニルアルコール（和
光純薬社製）水溶液２００μβを添加し混合する。（２
）次に前記（１）の混合液を０．１５ＭＮａｃｌ　と０
．旧％ザンコシネートＬＮ（日光ケミカルズ社製）を含
む０．０１ＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ　ｐＨ７５（以下Ｔｒｉ
ｓ−２３と称す）　　１ｍｆ！で２．５００ｒｐｍ　ｘ
　３ｍ１ｎの遠心で３回洗浄し、Ｔｒｉｓ−２３を４０
０μ！添加する。（３）次にタンニン酸く牛丼化学社製
）をＴｒｉｓ−２３で５０μｇ／ｍｉ！の濃度に調整し
、その４００μｐと（２）の４００　μ矛を混合し３７
℃で１時間インキニーベーションする。（４）次に（３
）をＴｒｉｓ−２Ｓ　　１　ｍｆ２で２、５００ｒｐｍ
　ｘ　３ｍ１ｎの遠心で４回洗浄して液を除去後、Ｔｒ
ｉｓ−２５８００μ（！を添加する。（５）次に抗１１
Ｂ５抗体をＴｒｉｓ−２Ｓて２０μｇ／ｍｆｆの濃度に
調整する。（６）さらにＩＩＢｃ抗原をＴｒｉｓ−２３
で、２０μｇ／ｄ濃度に調整する。（７）次に」二記（
５）、（６）による抗ＨＢ、抗体とＨＢｃ抗原３００μ
βづつを混合し、十分攪拌する。（８）次に上記（１）
〜（４）による工程で作成した粒子懸濁液４００μβと
上記（７）の工程で作成した液４００μβを混合し、３
７℃で１時間インキュベートした。（９）次に上記（８
）で調整した粒子懸濁液を０．１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）　　（ベーリンガーマンハイム社製）を含む
Ｔｒｉｓ−２Ｓ　　１　ｍｆ！で２．５００ｒｐｍ　ｘ
３　ｍｉｎの遠心で３回洗浄して液を除去後、０、Ｉ　
ＢＳＡを含むＴｒｉｓ２Ｓ１ｍｌを添加し、抗１１Ｂ、
抗体　１（Ｂ、抗原固相粒子を調整した。

＋１ＢＳ抗原、抗ｌｌ５ｏ抗体の各希釈ザンプル系列の
作成は第１実施例と同様に行った。

次にＨＢｓ抗原、抗ＨＢｃ抗体の検出を行った。先ずＨ
Ｂ、、抗原のサンプル溶液、抗ＨＢｃ抗体のサンプル溶
液、両者の混合サンプル溶液を２５μβづつＶ底マイク
ロプレー■へ分注した。次に上記（９）の工程で作成し
た抗ＨＢＳ抗体ＨＢＣ抗原固相粒子を２５μβづつ、■
底マイクロプレートへ分注した。６０分後、マイクロプ
レートのウェルの底に形成された各種の凝集パターンを
第１実施例と同様の方法で観察をした。

本実施例の場合は、ＨＢＳ抗原、抗ＨＢ、抗体のいずれ
か一方または両方を含む１２８倍希釈までのサンプル溶
液の全てに、陰性の凝集パターンを生じた。本実施例に
よれば固相粒子が感度よく反応して各種パターンの凝集
を生じさせるので、試料中のＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗体の
存在を測定できる。

本発明は以上の実施例に限定されるものではなく、幾多
の変更、変形が可能である。例えば、第１実施例におい
て混合する固相粒子の割合を１対１としたが、必要に応
じてその割合を変えてもよい。また、粒径、材質等が同
一の固相粒子により混合固相粒子を作成しているが、固
相する抗原または抗体の種類に応じて混合する固相粒子
の粒径、材質、色調を異ならせてもよい。こうすること
によって凝集した固相粒子によるパターンのサイズ、形
状、色調等により、試料中の抗原、抗体の種類の識別が
可能となる。

また、第１実施例、第２実施例では固相する抗原または
抗体の質量割合を１対１としているが、この割合も必要
に応じて変更してもよい。さらに固相するのは２種類の
抗原、抗体に限定されず、３種類以上の抗原、抗体を固
相粒子に別個にあるいはいっしょに固相してもよい。

〔発明の効果〕

以−ヒの如く本発明によれば抗原または抗体を固相した
第１の固相粒子と、上記抗原または抗体とは異種の抗原
または抗体を固相した第２の固相粒子を所要の試料と反
応させるようにしたので、少ない工数で試料中の異種の
抗原または抗体のいずれか１種を含むか、複数種を含む
かを凝集の有無により判定できる。

また、２種以上の抗原または抗体を固相した固相粒子あ
るいは抗原およびこの抗原とは異種の抗原に対する抗体
を固相した固相粒子を所要の試料と反応させるようにし
たので、試料中の複数種の抗原、抗体のいずれかを含ん
でいれば凝集反応が生じ、分析すべき抗原、抗体の有無
を判定できる。

Claims

【特許請求の範囲】１、試料中の分析すべき抗原または抗体の有無を、所要
の固相粒子と反応させ、反応後の固相粒子の凝集パター
ンによって判定する免疫学的分析方法において、抗原または抗体を固相した第１の固相粒子と、上記抗原
または抗体とは異種の抗原または抗体を固相した第２の
固相粒子とを試料と反応させるようにした免疫学的分析
方法。２、試料中の分析すべき抗原または抗体の有無を、所要
の固相粒子と反応させ反応後の固相粒子の凝集パターン
によって判定する免疫学的分析方法において、少なくとも２種以上の抗原または抗体を固相した固相粒
子、あるいは抗原およびこの抗原とは異種の抗原に対す
る抗体を固相した固相粒子を試料と反応させるようにし
た免疫学的分析方法。