JPH02276969A - 肝炎の異なるマーカーの同時検出用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明１．を肝炎の抗原および抗体（目しろし、即ちマ
ーカー）の検出および測定に用いる固相免疫試験改良法
に関する。

ビールス性肝炎に少なくもはっきりした２種の型がある
。

肝炎Ａは肝炎Ａ抗Ｊｉ（ＨＡＶＡｇ）によって起こると
されており一般に２乃至６週間の培養期間、軽い前徴お
よび比較的軽い臨床病を特徴としている。この病気は一
般に汚染された食物又は液体によって感染するが、また
全身的接種によっても感染するといわれている。肝炎Ａ
はしばしば“伝染性肝炎”と呼ばれ、米国においては年
間５０．０００以上の報告例がある。

肝炎Ｂビールスはおそらり°゛血清肝炎″の病原体であ
ると信じられている。肝炎Ｂ伝染病は一般に血液生成物
又は針の様な汚染された器具によって感染するが、他の
方法によっても感染するだろう・。従来肝炎Ｂ伝染病は
６週間から６ケ月にわたる培養期間を要した。しかし２
週間の様な短期培養が実証された。この病気は軽く又は
徴候がないが、もし徴候があれば、病状は特に重いだろ
う。前徴には関節痛、関節炎、発疹、発熱、食欲不振、
疲労症および掻痒症があり黄だんを伴ったり伴わなかっ
たりする。

少なくとも３種の異なる抗原−抗体系：表面（ＨＢｓＡ
ｇ：抗−ＨＢｓ）、”芯（ｃｏｒｅ）　”　　（ＨＢ　
ｃＡ　ｇ：抗−ＨＢｃ）、およびｅ−抗原（ＨＢｅＡｇ
：抗−ＨＢｅ）が肝炎ビールスＢと連合できろ。肝炎８
表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は血液中に２２ｎｍ球および直
径２２ｎｍで長さは種々の細管として発見され、肝炎Ｂ
ビールスの蛋白質膜を表わすと信じられろ。

ＤＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼをもっ４２ｎａ＋粒子
は伝染性ビールス（デイン粒子）を表わすと思われろ。

デイン粒子表面はＨＢｓＡｇと似ている又は同じである
。界面活性剤中デイン粒子は２７ｒ＋＋ａの電子密度の
芯、ＨＢｃＡｇに解離せられる。

後者は真の感染段階中血清肝炎をもつ患者の肝細胞植生
に見られる。

したがってＢ型ビールス性肝炎の患者は表面抗原に対す
る抗体（抗−ＨＢｓ）、また蛋白質芯に対する抗体（抗
−ＨＢｃ）を生成すると期待される。血清中のＨＢｓＡ
ｇは肝炎Ｂビールスの存在の一貫したマーカーであり、
また抗−ＨＢｃは普通早期ビールス血症中ひどい肝不調
においてまた抗−ＨＢｓ出現前にしばしば抗原布（ＨＢ
ｓＡｇ）を伴って現われる。抗−ＨＢｅは一般にＨＢｓ
Ａｇの長時間循環を伴い、抗−ＨＢｃがビールスの活性
反応に応じて生成されろことを示唆している。

１９７２年肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）が検出され特徴づ
けられた。ｅマーカーはＨＢｓＡｇ−陽性血清中に発見
されており、普通健康体よりも活性肺病をもつ慢性ＨＢ
ｓＡｇ患者の血清中により普通におこると思われろ。肝
炎Ｂの培養期間中患者のｅ抗原はＨＢｓＡｇの出現直後
また臨床的に明らかな肝障害の現われる前に現われると
わかった。この様な血清中のその存在は理論上不十分な
予後および肝障害進行を示すものであろう。逆にｅ抗体
（抗−ＨＢｅ）の存在はよい予後の表示であろう。これ
らの関係は絶対的なものでないが、臨床的ガイドには有
用であろう。

肝炎の血清学的マーカーが感染、発病および回復の経過
中−貫して連続した順序で現われるので２又は３以上の
マーカの分析が病気の時間経過を調べるに価値あるであ
ろう。

１より多いマーカーの試験はまたＢ型肝炎の影響減少の
努力におけろ給血者又は患者中のＨＢｓＡｇの重要な２
重チエツクを可能とする。この必要はゴールドフィール
ドらのＡＩ！ＩＪＭｅｄ、　Ｓｃｉ、、　２７０：　３
３５−３４２　（１９７５）に発表されており、著者ら
はＨＢｓＡｇに陰性の血液の受血者を注意して調査し、
４６５患者中７人が肝炎抗原に暴露された証拠を発見し
た。明らかに肝炎Ｂビールスに対する１より多くのマー
カーの検査法が偽陰性の発生を減少又は防止するにちが
いない。同様に多（の場合２試験に対する陽性応答は１
試験において発見された偽陽性の可能性を最小とする。

本発明の試薬（複数）および方法は（複数）ビールス性
肝炎に対する種々のマーカー検査用の既知市販製品およ
び方法と同様であるが、従来上記マーカーを同時に検査
する方法については発表又は示唆されていないのである
。

したがって本明細書は試料中の肝炎ビールスにさらされ
たことを立証する少なくも２種の異なるマーカーを同時
に検出する試薬と方法を詳細に記述するものである。

その方法は未知マーカーにコンプリメンタリ−（ｃｏｍ
ｐｌ＋＠−ｅｎｔａｒｙ）な少なくも２［の異なるノン
コンプリメンタリ−な免疫反応体で被覆されている固体
支持体と試料を接触させ、試料をその固体支持体と共に
２４時間までの時間培養し、試料から被覆固体支持体を
分離し、上記支持体を洗い、各々未知肝炎マーカーの一
種と反応又は競合のいずれかする様選ばれ、かつ検出で
きる異なるラベルをつけられた少なくも２種の異なる肝
炎マーカー又は免疫反応体より成る液体試薬と上記洗っ
た支持体を接触させ、試薬液から固相を分離し、かつ固
体支持体上のラベルされたマーカーの存在を各々異なる
ラベル検出によって測定することより成る。

上記においてコンプリメンタリ−とはお互いの存在下に
反応する抗原及び抗体を意味し、肝炎Ｂ芯抗原は肝炎Ｂ
芯抗体にコンプリメンタリ−である。ノンコンプリメン
タリ−は上記の逆であり、肝炎８表面抗原は肝炎Ｂ芯抗
体にノンコンプリメンタリ−である。

次の実施例は本発明の範囲内の代表的試薬の製法および
用法を示すものである。実施例■は肝炎にさらされたこ
とを立証するマーカーにコンプリメンクリ−な２種の異
なるノンコンプリメンタリ−な免疫反応体で被覆した固
体支持体の製法を記述している。

詳述すれば、固体支持体（小粒）はその反応性を保持し
、かつ未知試料中のコンプリメンタリ−なマーカーと結
合できろ様に２種の異なるノンコンプリメンタリ−な免
疫反応体で被覆されている。

実施例Ｉにおいてポリスチレン小粒はＨＢｓＡｇに対す
る抗体および芯抗原、ＨＢｃＡｇで被覆されている。抗
体はその反応性を保持し未知試料中のどんなＨＢｓＡｇ
とも反応しまた添付した芯抗原はアンチゲニシティを保
持し未知試料中の芯（抗−ＨＢｅ）に対するどんな抗体
とも反応する。本発明の要点は両免疫反応が単一固相試
薬と同時におこる点である。

トリス−ＥＤＴＡ−塩溶液（ＴＳＥ）緩衝液中に２％２
−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）および５％トウィ
ーン８０の溶液にゲイン粒子を３７℃で２時間さらして
ＨＢｃＡｇ生成を行った。この溶液を５％２ＭＥ−ＴＳ
Ｅで１０倍に稀釈し−夜装置した後ＴＳＥ中に１：８０
００の最終濃度に稀釈した。別にポリスチレン小粒（１
／４’）をりん酸塩で緩（資）した塩溶液（ＰＢＳＪ中
抗−ＨＢｓ血清（モＡ　モット）の１：２０００稀釈液
中に２時間浸漬してそれを被覆した。小粒をとり出し水
洗乾燥した。次いで芯調合液を被覆粒上に注入し室温で
２日問おいて芯抗原を小球に付着させた。小粒を緩衝液
から取り出し、水洗し、付着物を安定化するため１０％
蔗糖溶液で被覆し風乾した。

ポリスチレン小粒が被覆し易くまた取り扱い易いので好
ましいが、種々のプラスチックス、金属およびガラスか
ら成る大きなもの又は小さなものいずれのどんな固体支
持体も容易に被覆できまた本発明の証明に使用できる。

小球を先ず芯抗原で被覆した後抗−ＨＢｓで被覆できる
が、小球を最初にモルモット抗−ＨＢｓ血清で被覆する
と芯抗原の付着が著しく増加することが認められた。

また重要なことは肝炎ビールスに関するノンコンプリメ
ンクリ−な免疫反応体の他の組合せも使用できることで
ある。

コンプリメンタリ−な親和力は試薬のアンチゲニシティ
（ｉｎ−ｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）および反応性を減少す
るであろうから免疫反応体はもちろんノンコンプリメン
タリ−でなければならない。

次の実施例は免疫反応体、放射性ラベル（ｔ２ｓ　ｒ）
された抗−ＨＢｓおよびマーカー、反応性酵素ラベル（
山葵ペルオキシダーゼ）された抗−ＨＢｃを含む液相試
薬の製法を示すものである。

パマーカー“と“免疫反応体”は相互交換的に使用でき
るが、“マーカー“とは未知試料中の検査しようとする
抗原又は抗体およびそれと同等のものをいう時に使うの
がよい。

“免疫反応体″とは検査されるマーカーにコンプリメン
タリ−な抗原又は抗体いずれかを説明するに使われろ。

したがって次の実施例では固体支持体上に使われろ抗原
および抗体は常に未知マーカーの一つに対し相補的であ
り、したがって免疫反応体といわれろ。

液相試薬中のラベルされた表面抗原抗体は未知マーカー
（ＨＢｓＡｇ）に対しコンプリメンタリ−であり、した
がってラベルされた免疫反応体という。しかしラベルさ
れた芯抗体は検査されるマーカーと同一であり、したが
ってラベルされたマーカーという。

１７８オンスびんに０．５Ｍりん酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７
，５）約０．１ｍｔ’　。

少量の５−６ｍｃｉのＮａ１２５Ｉおよび精製した抗−
ＨＢｓｌ　ＯＯ呵を加え、全成分を混合しｐＨ７，５−
８，０としてＨＢｓＡｇに対する抗体（抗−ＨＢｓ）の
よう素化（”２５Ｉ）を行った。この混合物に新しく生
成したクロラミンＴ（ｐＨ７，５の０．０５Ｍりん酸塩
緩ｌ！ｊｉ液１０ｍｊ’中に３５ｍｇ）の溶液５０μｅ
を加えた。

添加混合後室温で６０秒間反応させた。新しく生成しｔ
コメタ亜硫酸ナトリウム溶液（ｐＨ７，５の０．０５Ｍ
　ｌ）ん酸塩緩衝液１０ｍ１中に３５ｍｇ）５０μＩＶ
を反応混合物に加えてクロラミンＴを迅元してここて反
応を停止させた。

反応混合物を５μｌをホワソトマンＮｏ、　１紙片上に
おき７０％メタノール中で混合物をクロマトグラフ法に
かけ反応効率を検査した。よう素化蛋白質は元にそのま
ま残ったが、遊離１２５Ｉは溶媒に移った。蛋白質中の
１２５１のパーセントは反応効率パーセントと判断され
ろ。

セファデックスＧ−５０ゲルカラムを用いて粗よう素化
抗体を０９％塩化ナトリウムを含むｐＨ７，８の０１Ｍ
トリス緩衝液で精製した。カラムを予め牛血清アルブミ
ンの３０％水溶液少量で処理した後０９％塩化ナトリウ
ムを含むｐＨ７，０の０．１ＭトＩＪス緩衝液の追加等
量で処理した。カラムの上からよう素化抗体を入れ塩溶
液で緩衝したトリス溶液を使って洗い出した。カラムか
ら先ずラベルされた抗体が溶離液として得られた。

メタ過よう化ナトリウムを使ってペルオキシダーゼを活
性化して肝炎Ｂ芯に対する抗体と山葵ペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）の結合がなされた。過剰の過よう化物と副成
物はゲル濾過（セファデックスＧ−２５）カラムによっ
て活性ペルオキシダーゼから分離された。次いで活性ペ
ルオキシダーゼは抗体（抗−ＨＢｅ）と反応させ自然に
反応した。ベルオキシダセと抗体の結合を安定化するな
め水素化ホウ素ナトリウムを加えた後残留水素化ホウ素
ナトリウムを分解するためアセトシを加えた。

本発明の方法によりラベルされた２抗体を使用する場合
、それらを次の組成：胎生血清５０％、通常人の血清１
５％、０．００５Ｍ　ＥＤＴＡ、　　トゥイーン−２０
０１％、ＰＢＳ中のチオメルサル０．０１％を含む稀釈
液に入れ稀釈する。

検出できる種々のラベルが使用できろことは明白である
。

当然ながら唯一の必要事項はこれらが別個に検出できる
点である。

＋２５．が容易であるとおり種々のアイソトープが使用
できる。異種アイソトープそれ自体別個に検出できるの
で１マカー又は免疫反応体が放射性ラベルされまた他が
酵素又は螢光体でラベルされる必要ばない。同様に試薬
のラベルされた成分はすべて異なる基質を必要とする異
なる酵素を同様に容易に使用できて別個に検出できる反
応生成物を生ずる。

重要なことは肝炎ＡとＢの抗体と抗原はいずれも本発明
によってラベルできろことである。免疫化学的に必要な
唯一のことはラベルされた成分が互いに又は測定するマ
ーカーにコンプリメンクリ−でないことである。

実施例■ ＨＢｓＡｇおよび抗−ＨＢｅの同時検出゛未知”肝炎マ
ーカーを含む血清試料を反応トレイの個々のウェルに加
えまた実施例■により被覆したポリスチレン小球を各試
料に加又て４５℃で２時間培養した。小球を反応ウェル
からとり出し水洗して過剰の試薬を全部除き実施例■に
よって製造した液相試薬０．２１１１’に加えた。固相
と液相を４５℃で１時間培養した。次いで固相を抗体試
薬から分離し４回水洗して過剰の試薬を除去した。０−
フェニレンジアミン（ｐＨ５，５の０１Ｍくえん酸塩４
２１街液１ｏｒｎｔｔ中３０■）を含む試験管に洗った
小球を入れ３０分間培養した。次いでＩＭＨＣ１１ｍｊ
’を加えて酵素反応を停止し、試験管を見てラベルされ
た酵素と基質の反応から生ずる色の有無を調べた。色が
ないか又はうすげれば抗−ＨＢｃが未知試料中に存在し
かつ被覆した支持体上の反応位置のラベルされたマーカ
ーと競合したことを示しｔこのである。次に小粒上の放
射能をガンマ−計数管でしらべＣＰＭを記録した。小粒
上の放射能は添付した抗体に付着しまた放射性ラベルさ
れた抗体の結合位置を与えた未知試料中にＨＢｓＡｇが
あることを示した。

本発明は今や前記のとおり詳細に示した種々の方法に実
施できろし、またこれらの方法１よすべて特許請求の範
囲に説明されている。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）肝炎Ｂ芯抗原に対する抗体および肝炎Ｂ表面抗原
   に対する抗体が別個のラベルをつけている同時検出用免
   疫試薬。
2. （２）肝炎Ｂ表面抗原に対する抗体が放射性ラベルを付
   けられている特許請求の範囲第１項に記載の試薬。
3. （３）放射性ラベルが＾１＾２＾５Ｉである特許請求の
   範囲第２項に記載の試薬。
4. （４）肝炎Ｂ芯抗原に対する抗体が酵素でラベルされて
   いる特許請求の範囲第１項に記載の試薬。
5. （５）酵素ラベルが山葵ペルオキシダーゼである特許請
   求の範囲第４項に記載の試薬。