JPH03262486A - ベクターによる糸状菌類の形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、１ｔｒ規ベクター・プラスミド（以下、単に
「プラスミド」という）、および該プラスミドをペニシ
リウム・シトリナムｆＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒ
ｉｎｕＭ１）菌株中に導入し、形質転換を起こさせる、
ペニシリウム・シトリナム菌株の形質転換方法に関する
ものである。

不発明を利用することにより、ペニシリウム・シトリナ
ムを宿主細胞として使用することが可能になり、また、
形質転換体を用いて既知の生理活性物質の収量を上げる
ことや、新規な生理活性物質８よび生理活性物質誘導体
を生産することが期待される。

［従来の技術］ 糸状菌を遺伝子操作の宿主として用いることは、 （１）大腸菌等の非分泌型の宿主と異なり、蛋白質をコ
ードした外来遺伝子を導入することにより、所望の蛋白
質を菌体外に分泌させることが可能になる。

（２）その糸状菌が、元来生産する生理活性物質の収量
の増大が期待できる、 （３）未知の生理活性物質の生産が期待できる、等の利
点がある。

しかし、糸状菌に由来する自律複製型のプラスミドはほ
とんど知られていない。

一方、糸状菌に導入された外来性のプラスミドは染色体
中に取り込まれ、糸状菌中では自律複製機能を失ってし
まう。

さらに、糸状菌を形質転換させ得るようなプラスミドは
種ごとに異なる。

以上より、糸状菌において形質転換能力を有するプラス
ミドを見出すことは、極めて困難である。

プラスミドを用いて糸状菌の形質転換を行なった例とし
ては、ペニシリン生産菌ペニシリウム◆クリソゲナム（
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏ　ｅｎｕｍ：　
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬｏｇｙ、５，４９４．（１９８７
１）　、セファロスポリンＣ生産菌セファロスポリウム
・アクレモニウム（（Ｃｅ　ｈａｌｏｓ　ｏｒｉｕｍ　
ａｃｒｅａ＋ｏｎｉｕｍ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４
６８、　（１９８５））　、アスペルギルス・オリゼ（
加匣址■朋ｏｒｙｚａｅ：　Ａｇｒｉｃ、　ＢｉｏＬ、
Ｃｈｅｍ、、５１．３２３゜ｆ１９８７））等を宿主と
したごく少数の例が知られているだけであり、特にペニ
シリウム属では、上記の１例のばかペニシリウム・ナル
ギオベンゼ（Ｐｅｎ　ｉｃ　ｉ　１１　ｉｕｍ　ｆｉｌ
が知られているのみである。

ペニシリウム・シトリナムは、高脂血症治療薬ブラバス
タチン・ナトリウムの製造中間体であるＭＬ−２３６８
の生産菌として知られている［Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃｓ　２９．１３４６（１９７６１）　、したがって、
この菌株を形質転換させ得るようなベクターは、前述し
たような有用性が期待されるものであるが、現在のとこ
ろまで、該菌種の菌株を形質転換させ得るようなベクタ
ーは見出されていない。

［発明が解決する課題］ 本発明者らは、大腸自由米のベクターを改変したプラス
ミドが、ペニシリウム−シトリナムを形質転換する能力
を有することを見出し、ペニシリウム・シトリナムを宿
主とする形質転換系を確立し、本発明を完成した。

［課題を解決する手段］ 本発明の新規プラスミドは、 ■（イ）プロモーターとして、 （１）ペニシリウム・シトリナムに近縁または同種の菌
株由来であり、 （ｉｉ）発現活性が強力である、 プロモーターを有し、 （ロ）選択マーカーとして、薬剤耐性遺伝子を有し、 （ハ）り〜ミネーターを有し、 ■大腸菌で選択・複製が可能なベクター由来であり該ベ
クター中に存在する、 ｆｉ）大腸菌で複製可能なｏｒｉ領域、および（ｉｉ）
大腸菌で選択可能な薬剤耐性遺伝子、を含み、 ■ペニシリウム・シトリナムの形質転換能を有する、プ
ラスミドに関するものである。

さらに具体的には、■（イ）に関して、ブロモターが、
糸状菌の、３−ホスホグリセレートキナゼ、グリセルア
ルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵
素、エノラーゼ、トリプトファン合成酵素、β−イソプ
ロピルリンゴ酸脱水素酵素、オロチジン−５゛−リン酸
脱水素酵素、チトクロム酸化酵素、クルコアミラーゼ、
グルタミン脱水素酵素、α−アミラーゼ、アセトアミダ
ーゼの遺伝子のプロモーターのいずれか１つであるプラ
スミドに関するものである。

詳しくは、プロモーターが、エメリセラ・ニドランス（
Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ：Ｃ，Ｒ，Ｂ
ｅｎｊａＩｎｉｎ。

Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ　４７［Ｓ）、６６９−６８７．　
（１９５５）によりυ之±Ｌ１１ｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎ
ｓの完全世代であると報告されている、なおかつ、水様
は不完全世代として、鼓且虹址旦朋ｎ１ｄｕｌａｎｓを
つくる）またはペニシリウム−シトリナムの３−ホスホ
グリセレートキナーゼ遺伝子のプロモルタ−である、も
のである。プラスミドに関する別の、さらに具体的な態
様としては、■（ロ）に関して薬剤耐性遺伝子が、大腸
菌由来のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子または、ネオマ
イシン耐性遺伝子である、プラスミドに関するものであ
る。

詳しくは、大腸菌由来のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子
が、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝
子である。プラスミド、あるいは、 大腸菌由来のネオマイシン耐性遺伝子が、ネオマイシン
ホスホトランスフエラーゼエ遺伝子または、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子であるプラスミド
に関するものである。

別の、さらに具体的な態様としては、■（ハ）に関して
、ターミネータ−が、エメンノセラ・ニドランスの３−
ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のターミネータ−で
ある、プラスミドに関するものである。

本発明のもっとも詳細な態様としては、ＤＮＡ鎖長が、
５．４キロ塩基対であり、第１図の制限酵素地図で表わ
される。プラスミド、　ｐＳＡＫ３３３に関するもので
あり、また、 ＤＮＡ鎖長が６．８キロ塩基対であり、第２図の制限酵
素地図で表わされるプラスミド、ｐＳＡＫ３４５に関す
るものである。

本発明は、また、上記のプラスミドを用いて、ペニシリ
ウム・シトリナム菌株を形質転換する方法に関するもの
である。

本発明のプラスミドは、以下に記載する方？去で製造す
ることができる。

糸状菌にプラスミドを形質導入し発現させるためには、
形質転換株のみを識別できる選択マカーを該プラスミド
に組み込もことが必要である。その方法としては、 １　アミノ酸あるいはピリジン要求性の相補性を利用す
る方法、 ２、ポジティブ選択マーカーとして、既存の薬剤耐性遺
伝子（大腸菌で発現するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子
およびネオマイシン耐性遺伝子）を利用する方法、 ３、糸状菌に感受性の高い薬剤（オリゴマイシン、ベノ
ミル等）の耐性株を分離しその耐性遺伝子を利用する方
法、 などが挙げられるが、特に２に記載した方法が好ましい
。

ネオマイシン耐性遺伝子としては、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼＩ遺伝子、ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ■遺伝子等が用いられ、また、ハイグロ
マイシンＢ耐性遺伝子としては、ハイグロマイシンＢホ
スホトランスフェラーゼ（以下ｒＨＰＴ４　とする）遺
伝子が用いられ得るが、特に、ＨＰＴ遺伝子が好ましい
。

選択マーカー遺伝子を、ペニシリウム・シトリナムにお
いて高率よく安定に発現させるためには、その上流に接
続するプロモーターとして、■該画種に近縁または同種
の菌株由来であり、■発現活性が強力である、 プロモーターを接続することが必要である。

このようなプロモーターとして、糸状菌の３ホスホグリ
セレートキナーゼ、クリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素、アルコール脱水素酵素、エノラーゼ、トリプ
トファン合成酵鼾、β−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵
素、オロチジン−５゛−リン酸脱水素酵素、チトクロム
酸化酵素、グルコアミラーゼ、グルタミン脱水素酵素、
α−アミラーゼ、７セトアミターゼの遺伝子のプロモー
ターが用いられ得るが、特にエメリセラ・ニドランスま
たはペニシリウム・シトリナムの３−ホスホグリセレー
トキナーゼ（以下ｒＰＧＪ　という）遺伝子のプロモー
ターが好適に用いられる。

なお、プロモーターを選択マーカー遺伝子に接続する際
には、前段階の操作としてプロモーターをクローニング
しておくことが必要である。

ターミネータ−としては、いずれの６のも用いられ得る
が、特に、エメリセラ・ニドランスのＰＧＫ遺伝子のタ
ーミネータ−が好適に用いられる。

出発材料としてのベクターとしては、大腸菌に右いて選
択・複製が可能なベクターを用いるのが好ましい。

該ベクターとして（土、ｐＢＲ３２２，［）８Ｒ３２：
ｌ、　ｐＢＲ３２９゜ｐＵｃ１８．ｐＵｃ１９．ｐ［Ｊ
ｃ１１８．ｐＵ（：１１９等が用いられ得るが、特にｐ
ＢＲ３２２およびｐＬＩｃ１１９が好適に用いられる。

該ベクターには、大腸菌で複製可能なｏｒｉ領域るよび
大腸菌で選択可能な薬剤耐性遺伝子が必要である。

薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性
遺伝子等が用いられ得るが、特に、アンピシリン耐性遺
伝子が好適に用いられる。

このようなベクターに、前述した各遺伝子を、遺伝子操
作で通常用いられる技術によって組み込もことにより、
本発明のプラスミドを製造することができる。

ＨＰＴ遺伝子はＪ、Ｄａｖｉｅｓらにより、Ｇｅｎｅ、
　２５．１７９−１８！１．　（１９８３）に詳細に報
告され、今回、用いたｐＹ３はに、　Ｂｌｏｃｋｌｉｎ
ｇｅｒらがＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕａ
ｒ　Ｂｉ○ｌｏｇｙ、　４　（１２１、２９２９−２９
３１，（１９８４）に報告しているものを出発材料とす
ることができる。ＨＰＴはハイグロマイシンＢのリン酸
化を触媒するものである。

この酵素反応および、その生成物の詳細は、Ｒａ。

らｆＡｎｔｉｆｆＩｉｃｒｏｂ、Ａｇ、　ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒ、２４．６８９．　（１９ｇ３１１に記載されて
いる。マグネシウムイオンの非存在下におけるハイグロ
マイシンＢはペニシリウム・シトリナムに対して致死的
であるが、ハイグロマイシンＢのリン酸化体は致死的で
はなく、ＨＰ丁遺伝子の遺伝子産掬がペニシリウム属、
例えば、ペニシリウム・シトリナム中で発現さｎた場合
、この細胞はハイグロマイシンＢに対して剛性を有する
様になる。

さらに、プラスミドｐＳＡＫ３３３はエメリセラ・ニド
ランスＰＧＫ遺伝子のプロモーターを有することにより
、特徴付けられる。プラスミドｐＳＡＫ３３３に含まれ
るＰＧＫ遺伝子のプロモーターはｐＳＡＫ３３３のＥｃ
ｏＲＩ・）ＩｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡ断片にある。プラス
ミドｐＳＡＫ３３３のＨＰＴ遺伝子のプロモーター配列
をペニシリウム・シトリナムのプロモーターに置き換え
た別のベクターｐＳＡＫ３４５もまた有用である。

このような配列は、）ＩＰＴＤＮＡ配列の発現を促進さ
せるために配置される。これらのプラスミドは研究用操
作において大きな有用性を持ち、外来性遺伝子、ペニシ
リウム・シトリナム遺伝子およびペニシリウム・シトリ
ナム調節ＤＮＡ配列をクローンする手段となる。特に興
味深いのは、臨床上重要な高脂血症治療薬ブラバスタチ
ン・ナトリウム系物質を製造する際の中間体として役立
つＭＬ−２３６Ｂの醗酵生産に有用なりＮＡ配列である
。

さらに、製造された該プラスミドを用いて、通常の形質
転換方法を用いて、ペニシリウム・シトリナムを形質転
換することができる。ペニシリウム・シトリナムへのこ
れらの自律複製領域を欠くプラスミドによる形質転換は
染色体への組み込みを必要とする。

したがってこのようなプラスミドは、満足すべき形質転
換の結果を産むためには、ただペニシリウム・シトリナ
ム細胞中に取り込まれる必要があるのみである。それぞ
れの事象、即ちペニシリウム・シトリナム細胞への取込
みおよびペニシリウム・シトリナムゲノムへの組込みは
、細胞当り約１０””〜１０−４または時には１０−５
という低い確立で起こる。

また、本発明において製造されたプラスミドは、Ｅ、ｃ
ｏｌｉにおいて複製および選択が可能である。

例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＲＲ１，Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｋ１２ＪＡ２２１゜Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００，Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００Ｒ１Ｍ１．　Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＨＢ１０１　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＲＶ３０８
等の菌株のごときＥｃｏｌｉにも有用であり、かつ導入
することかできる。

ペニシリウム属菌株は本来非制限的であると信じられて
いる。

非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質転換
の際にプラスミドＤＮＡを切断または分割することがな
い。本発明においては、不発明に係るベクターのいかな
る制限サイトをも切断しない制限酵素を含も宿主細胞も
、やはり非制限的とみなすこととする。

ハイグロマイシンＢの非常に広い抗菌スペクトル、殆ん
どの真菌中にＰＧＫ遺伝子が共通して存在すること、そ
して、下等真核生物のホスホグリセラードキナーゼ遺伝
子の転写および翻訳活性化配列中にわずかに保持される
だけで発現されるＨＰ丁暗号化配列の基本的レベルによ
り１本発明は、ペニシリウム・シトリナムに対して適用
可能となっている。

本発明は、栄養要求性変異株および栄養要求性欠損を相
補する遺伝子を前もって分離する必要がないため、遺伝
的および生化学的な性格付けが完全にはなされていない
微生物に対して特に有用である。さらに、下等真核生物
はハイグロマイシンＢによって非常に効果的に死滅し、
かつその殆んどは、とりわけ真菌は、自然突然変異によ
りハイグロマイシンＢに対する耐性を自然に獲得すると
いう有意な能力を示さない。ペニシリウム・シトリナム
は、マグネシウムおよびその他の毒性に拮抗するイオン
の非存在下では、ハイグロマイシンＢの約２００μｇ／
ｍｌによって死滅する。この範囲内または好ましい濃度
２００μｇ／ｓ＋１の下では、ハイグロマイシンＢ耐性
に至る自然突然変異は観察されなかった。この、耐性に
至る自然突然変異が無いという事は、本発明の形質転換
系をペニシリウム・シトリナムに適用するに際して、極
めて重要な要素となる。自然突然変異によって生ずる耐
性変異体の高い「バッククラランド」の中に形質転換体
がごく少数しか存在しないこと、この形質転換体の検出
、分割、分析および取扱いが非常に困難となる。遺伝的
８よび生化学的に明確に定義されていない個々の下等真
核生物のための形質転換系を開発するのに必要な時間と
費用は多大なものであるから、本発明は、このような広
範囲の真核生物に対する一般的適用可能性の故に、大き
な有用性を持つ。

なお、不発明により製造されたプラスミド、ｐＳＡＫ３
３３およびｐＳＡＫ３４５は、大腸菌に１２株ＨＢＩＯ
Ｉに封入され、５ＡＮＫ７０２９０株（微工研菌寄第１
１２４１号）、および５ＡＮＫ７０３９０株（微工研菌
寄第１１２４２号）として寄託されている。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが本
発明は、これに限定されない。

実施例■ エメリセラ・ニドランス５ＡＮＫ１０６６９菌株（微工
研菌寄第１１２４０号）をＮＯ培地（５％マルトース７
２％Ｇ、Ｓ、Ｌ、１０．２５％極東ペプトン１０．１％
Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０／１５％クエン酸アンモニウム７
１１．５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール（ｐＨ６，２５））
において、２６℃で７日間振どう培養し、染色体分離の
為の菌体とした。−７０’Ｃで数時間凍結し、そのうち
２〜４ｇを乳鉢中で低温下で迅速に磨砕した。その後、
２０ｎｌの溶菌緩衝液（２％ＳＤＳ　　（ソディウム・
ドデシル・サルフェト）　／６２．５０１Ｍ　ＥＤＴＡ
　（エチレンジ７ミンテトラアセテイツクアシツド）　
７５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐ）１８゜２））に悲濁し
、水冷下で２時間放置した。ＴＥ緩衝液（ＩＯＩＩＩＭ
トリス−塩酸ｆｐＨ８，０）１０．Ｓｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ
）で飽和したフェノール溶液（以下、ｒＴＥ飽和フェノ
ール」とする）を２０ｍ１添加後、５０℃で１時間ゆつ
くりと撹拌し２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心後（トミ
ー精工（株）製Ｒ５−２Ｏｎ遠心機、ローター；Ｎｏ、
３Ｎｌ水層を集め、ｌ／２容量の８Ｍ酢酸アンモニウム
と３．７５容量の冷エタノールを加え、−８０°Ｃで１
０分間インキュベートした。その後、１２．ＯＯＯｒｐ
ｍ　、　１５分間遠心分離後（トミー精工（株）製Ｒ５
−２０［１遠心機、ローター１Ｎ０．４）、沈殿物を（
以下、「エタノール沈殿」とする）、減圧乾燥し、染色
体ＤＮＡ粗抽出液とした。そして、イソプロパツールで
数回洗浄することによりＲＮＡを除き、クローニングの
為の染色体ＤＮＡ国分とした。

エメリセラ・ニドランスの３−ホスホグリセレートキナ
ーゼ（以下ｒＰＧＫＪ　とする）のプロモータのクロー
ニングは、以下に示す方性により行なった。該プロモー
ターは、該菌株の染色体ＢａｍＨＩ断片の一つ６．７　
ｋｉｌｏ−ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ　（以下ｒｋｂＪとす
る）　ＤＮＡ内に存在する（Ｇｅｎｅ、４４，９７．（
１９８６））　、そこで、エメリセラ・ニドランス染色
体ＤＮＡ　阿分約ｌＯμｇを、５０μｌの制限酵素緩衝
液Ｂ　（１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８，０１１５ｍ
Ｍ　ＭｇＣ，Ｌａ／１００ｍＭ　ＮａＣ１／１ｍＭ　２
−メルカプトエタノール）中で、２０単位の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（宝酒造（株）製）の添加により３７℃、２時
間切断反応を行い、その後ＴＥ飽和フェノールを等量添
加して撹拌することにより反応を停止した。１４，５０
０ｒｐｍ　、　１０分間遠心分離後（トミー精工（株）
製微量高速遠心櫟ＭＲＸ−１５０、ローター同社ＴＭＡ
−４１、水層を分取し、（以下、ｒＴＥ飽和フェノール
処理」とする）、その後エタノール沈殿処理を行ないＤ
ＮＡ断片を回収した。クローニングの為のベクターとし
ては、ＢａｍＨＩ処理したｐＵｃ１８（宝酒造（株）製
）５μｇを用い、子牛腸由来のアルカリホスファターゼ
（東洋紡（株）製）２０単位を使い４００μｍの丁Ｅ緩
衝液中で３７℃、３０分間インキュベートすることによ
り脱リン酸化反応を行った（以下、「アルカリホスファ
ターゼ処理」とする）。ＴＥ飽和フェノール処理、エタ
ノール（尤殿処理を行った後、その１／２容をアスペル
ギルスニドランス染色体ＤＮＡ　ＢａｍＨＩ処理画分３
μｇと混合し、５０μｌのＤＮＡリガーゼ緩衝液（６７
ｄ　トリス−塩酸（ｐＨ７，６）／６．７＋ｎＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｔ／１０ｒｎＭジチオスレイトール／　０．５ｍＭ
　ＡＴＰＩ中で３００単位のＴ４ＤＮＡ　リガーゼ（宝
酒造（株）製）を加え、１６°Ｃで終液インキュベート
して、ライゲーション反応を行った（以上「ライゲーシ
ョン操作」とする）。反応終了後、全反応物を用いて（
以下の操作を「プラスミドの大腸菌への形質転換とする
」）大腸菌に一１２株ＨＢＩＯＩコンピテントセル（宝
酒造（株）製）５００μｌと混合し、水冷下２０分間イ
ンキュベーションした。その後、４２°Ｃ１１分間ヒー
ト・ショックを行ない再度水冷下で２〜３分間冷却した
後、３ｍ１のＴ−Ｙ培地（１％バクト・トリプトン（Ｄ
ｉｆｃ○社Ｍ）／Ｑ、ｓ％バクト・イーストエキストラ
クト（Ｃｌｉｆｃｏ社製））を加え、３７℃で１時間静
置培養を行った。その後、培養液１００μｍずつをＴ−
Ｙ培地プレート（寒天ｉ、ｓ％、アンピシリン８０μｇ
／ｍｌ　（シグマ社製））に塗布し、３７°Ｃで終液、
培養したところ、約２３．０００個のアンピシリン耐性
株を得たので、エメリセラ・ニドランス染色体ＤＮＡラ
イプラノ−とした。

プローブとして、ＰＧＫのプロモーターと思われる領域
、−１２０から＋１３　　（転写開始点の塩基を＋１と
して、−例を５°末端側、＋側を３゛末端側とした場合
）の計１３３のオリゴヌクレオチド領域を、アプライド
、バイオシステム社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて
亜リン酸固相ホスフォアミダイト合成法により合成した
。合成終了後、１１Ｉ＋１のアンモニア水（含量２８．
０％］を加え、５５℃で６時間インキュベートした後、
凍結乾燥を行った。このサンプルを３００μｍのＴＥ緩
衝液に懸濁し、クローニングの為のプローブとした。尚
、その配列は、（Ｇｅｎｅ、　４４．９７．　（１９８
６）　）により公知であり、以下に示す通りである。

５’−ＡＧ（：Ｔ（：ＴＧＣ：ＧＡ　　Ｔ丁ＣＴＧＧＡ
ＴＡＣＣＣＣ，ＧＣＣＡＣＴＣＡＣ（：ＧＴＧＡＴＡＣ
ＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡ　　Ｔ丁ＴＧＣＧＡＧＧＴＧＧＴ
ＣＴＧＧＴＣＴ　　ＣＣＴＧＡＣＧ（：Ｇ（：　　ＴＴ
ＴＡＴＴＴＡＴＣＣ（、ＴＧＧＴＣＴ（：Ｔ　　ＣＣＣ
Ｃ，ＡＣＴＡＧＣＴＧＴＴＣ（：ＴＧ（、にＣＧＴ（、
ＣＡＴＣＴ（、Ｔ（：Ｔ（、−３′はＣＡＴ領域及びＴ
ＡＴＡ領域を示し、＋１は転写開始点を示す。

上記プローブは、ＤＮＡ５°を末端標識キットｒＭＥＧ
ＡＬＡＢＥＬＴ１１Ｊ　　（宝酒造（株）製）と［γ−
３２ＰコＡＴＰ　（６，ＱＯＱｃｉ／ｍｍｏＬ／１Ｏｔ
ｎｃｉ／ｌｎｌ　；ニューイングランド社製）を用いて
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの５°末端リン酸化反
応により１０’　〜１０’ｃｍｐ／ｐｆｆｌｏｌ　ＤＮ
Ａとなる様に標識を行った。

エメリセラ・ニドランス染色体ＤＮＡライブラリーのニ
トロセルロース・フィルター上への固定は、以下の操作
により行った。先ず、エメリセラ・ニドランス染色体Ｄ
ＮＡライブラリーである２３．０００個のシャーレ寒天
培地上のコロニーを、ニトロセルロースフィルター（ミ
リボア社製）でレプリカ後、新しいＴ−Ｙ培地プレート
上に置き、３７℃に保温してフィルター上にコロニーを
新たに形成させた。次にこれらフィルターを、（０，５
〜ＮａＯＨ１にｌＯ０分間浸て溶菌及び［ｌＮＡ変性を
行ない、その後（０，５Ｍ　トリス・塩酸（ｐＨ７，５
ｌｌｓ分間、さらに（１，５Ｍ　ＮａＣ１１０，ＳＭ　
トリス−塩酸（Ｔ）Ｈ７，５１）に５分間、最後１．１
ｍ２Ｘ　ＳＳ（：（ＬＸ　ＳＳＣを、０．１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１／　０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）　　とする。以下、同じ。）に５分間浸し風乾後、８
０℃で２時間加熱して、それぞれのコロニーを形成する
大腸菌内に含まれるプラスミドＤＮＡをニトロセルロー
スフィルター上に固定した。この様にして作成されたニ
トロセルロースフィルターは、ハイブリダイゼーション
溶液（３０％ホルムアミド／　５Ｘ　ＳＳＣ／　１００
ｕ　ｇ／ｍ１子ウシ胸腺ＤＮＡ／　５ＸデンＡ　Ｊｌ、
ｔト后液（０，０１％（ｗ／ｖ）フィコール／　０．０
１％ｆＷ／Ｖ）ポリビニルピロリドン１０．０１％（ｗ
／ｖｌ　ウシ血清アルブミン）／１０ａ＋Ｍナトリウム
・ホスフェート（ｐＨ７，ｏ）１０．５％　ＳＤＳ＋　
中テ、３７℃で２時間ブレパイプリダイゼーションを行
い、その後、新しい上記ハイブリダイゼーション溶液中
に［γ−１ａｐコ標識ＤＮＡプローブ（５０−１００ｎ
ｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で終液ハイブリダイゼーショ
ンを行った。反応後の洗浄は、先ず、（３１１１％ホル
ムアミド１５Ｘ　ＳＳ（，１０，１％５ＤＳｊ中で３７
℃で１時間板とうし、次に、２Ｘ　ＳＳＣ中で３７°Ｃ
で１５分間同じく振とうして、その後、風乾し、コダッ
クＸＲ−１フィルム（コダック社製）を用いて、−７７
℃で終夜露出してオートラジオグラフィーを行った。オ
ートラジオグラフィーの結果、ＰＧＫのプロモーター領
域を含有すると思われる数個のポジティブなコロニを固
定し、マスタープレート上のコロニーに含量れるプラス
ミドを回収後（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　、７、１５１３．（１９７９））、プラスミド内に含
まれるエメリセラ・ニドランス染色体ＤＮＡ由来のＢａ
ｍＨＩ　ＤＮＡ断片について制限酵素切断地図を作成し
たところ、すべて公知の値（Ｇｅｎｅ、　４４．９７．
　（１９８６）　ｌ　と一致することから、目的のＰＧ
Ｋのプロモーターを含む上流領域であることがわかった
。このプラスミドは、ｐＳＡＫ３２３と命名し、その概
要は、第３図に示す。

ＨＰＴ構造遺伝子５゛末端との連結が直接可能なＰＧＫ
プロモーター上流領域を運ぶプラスミドの構築を行った
（第３図）。先ず、ｐＳＡＫ３２３からプロモーターを
含む）！ｉｎｄｍ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　ＤＮＡ断片約
１．８ｋｂを、ｐＵｃ１９　　（全酒造（株）袈）のＨ
ｉｎｄｍ部位にサブクローニングした（第３図・■）即
ち、ｐＳＡＫ３２３　ＤＮＡ約ＩＱμｇを、５０μｍの
制限酵素緩衝液１ｖｉ（ｌｏ＋ｎＭ　トリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，５）／１１１ｎＭ　ＭｇＣ１ｚ／５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ］、７１ｍＭジチオスレイトール）中で、２０単位の
制限酵素ｔ（ｉ　ｎ　ｄ　ｍ　（全酒造（株）製）の添
加により３７°Ｃで２時間切断反応を行った。反応液を
０８％の低融、屯アガロースゲルｒｓｅａＰｌａｑｕｅ
ＲＡｇａｒ。

−ｓｅ」（ＦＭＣ（社）製）を用いた電気泳動に供し、
ＰＧＫプロモーター領域を含むＨｉｎｄｍ　−Ｈ１ｎｄ
　ＤＩ　ＤＮＡ断片約１．８ｋｂに相当するバンドのゲ
ルを切り出し、６５°Ｃで５分間加熱することによりゲ
ルを融解した。融解したゲルに２倍容のＴＥ緩衝液を加
えＴＥ飽和フェノールを等量添加、撹拌した。遠心分離
後、水成を分取してエタノール沈殿を行ない真空乾燥後
、ＤＮＡ断片を回収した。上記と同様な操作（以下、ｒ
ＤＮＡのδ出摸作」とする）でｐＵＩ：１９１θμｇを
ＨＬｎｄＵｌで切断し、低融、屯アガロースゲル電気泳
動後、切断ＤＮＡを溶出してベクターＤＮＡ画分とした
。得られたＰＧＫのプロモーターを含むＢｉｎｄＩＩＩ
　−Ｈ１ｎｄ　ＩＩＩ　ＤＮＡ画分とｐＵｃ１９Ｈｉｎ
ｄ　ｍ　ＤＮＡ画分のそれぞれを１〜２μｇずつ混合し
、ライゲーション操作により両ＤＮＡ断片を連結し、大
腸菌に形質転換後、形質転換株からプラスミドｐＳＡＫ
３２４を回収した。

ｐＳＡＫ３２４により運ばれるＰＧＫのプロモーターを
含むＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｈ１ｎｄ　ｍ　ＤＮＡ領域は、
その３゛末嬬にＰＧＫ構造遺伝子の５′末端側に相応す
る余分な領域２０ｂｐを持つ。よって、その領域を除去
するため、以下、一連の操作を行った。先ず、　ｐＳＡ
Ｋ３２４ＤＮＡ約ｌＯμｇを５０μｍの制限酵素緩衝液
Ｍ中で２単位の制限酵素Ｈｉｎｄｍの添加により３７℃
で１時間部分切断反応を行った。ＴＥ飽和フェノールで
抽出しエタノール沈殿後、　ＤＮＡを減圧乾燥し、５μ
ｍのＫＨ衝液（０，５Ｍ　トリス−塩酸（＋）８７．５
１１０．１Ｍ　ＭｇＣ１ｘ）に懸濁した。そして、２０
０ｏ＋ＭのｄＣ，ＴＰ、　ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰｄＧＴＰ
それぞれを０．５μ土ずつ、ＤＮＡポリポリゼ■の大き
い〔フレノウ）フラグメント（全酒造（株）製）１μｍ
　（１単位を含む〉、及び滅菌蒸留水２μｍを添加して
３７℃で１５分間インキュベトした。フレノウフラグメ
ントを７０℃、１０分間加熱失活させ、エタノール沈殿
後、減圧乾燥したＤＮＡ画分を、アルカリホスファター
ゼ処理し脱リン酸化反応を行った。そして、ＴＥ飽和フ
ェノールで抽出後、エタノール沈殿し真空乾燥し、その
１１５１容量とｐＥｃｏＲＩリンカ−、ｄ（ＰＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ）　　（全酒造（株）製）０．２μｇを混合、
ライゲーション反応を行った。その後、大腸菌に形質転
換し、得られた形質転換株、数珠に関してプラスミドを
回収し、制限酵素切断地図を作成、ＰＧＫのプロモータ
ーを含む）Ｉｉｎｄｏｌ　−Ｈ１ｎｄ　ＩＩＩ　ＤＮＡ
断片の５°側のＨｉｎｄ１１１部位のみが、ＥｃｏＲＩ
部位に代っているプラスミドをＩ）ＳＡＫ３２５とした
（第３図■）。

得られたｐＳＡＫ３２５　ＤＮＡを用いて、ステイーブ
ン・ヘニコフ（Ｓｔｅｖｅｎ　）Ｉｅｎｉｋｏｆｆｌの
方法（Ｇｅｎｅ２８．３５１．　（１９８４））及びセ
レステ・ヤニッシュ・ペロン１ｃｅｌｅｓｔｅ　Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）らの方法（Ｇｅｎｅ３３、１
０３．　（１９８５）　）に従ったキットｒＫｉｌｏ−
３ｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ＫｉｔＪ　　（
全酒造（株）製）により、Ｈｉｎｄｍ部位からＰＧＫプ
ロモーター５°上流の方向へ［ＩＮＡデリイーシゴンを
行った（第３図・■）。即ち、先ずｐＳＡＫ３２５　Ｄ
ＮＡ約１０１ｇを、５０μｌの制限酵素緩衝液Ｍ中で制
限酵素ＨｉｎｄＩＩｌ及びＰｓｔＩ　（全酒造（株）製
）それぞれ２０単位の添加により３７℃で、２時間二重
切断反応を行った。フェノール抽出、エタノール沈殿後
、減圧乾燥し、１００μｍのエキソヌクレアーゼｍ緩衝
液°に溶解した。１８０単位のエキソヌクレアーゼ■を
加え、２５℃で１５〜９０秒間反応させ、エメリセラ・
ニドランスＰＧＫの構造遺伝子５“末端１１１］を欠失
さぜた。

＊エキソヌクレアーゼｍ緩衝液 ５０ｏ＋Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０１５ｍＭ
塩化マグネシウム １０ｍＭ　２−メルカプトエタノール 反応液２０μｍに対して、２０Ｌｌｌのムングビンヌク
レアーゼ緩衝液を加え、激しく撹拌後、６５°Ｃ１５分
間処理して反応を停止した。

ムングビーンヌクレアーゼ緩衝液 ３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，ｏ）１００ｍＭ塩化
ナトリウム １ｆｆｌ！１１酢酸亜鉛 １０％（Ｗ／Ｖ）グリセロール Ｑきつづき１０〜５０ｔ４位／μｌのムングビーンヌク
レアーゼを０．５μｍ加え、３７°Ｃ１３０分間反応後
フェノール処理し、エタノール沈殿した。減圧乾燥後、
５０μｌのフレノウ緩衝液に溶解した。

フレノウ緩衝液 ＬＵＸニックトランスレーション緩衝液２μ上 ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　２ｍＭＨ２Ｏ２
３μエ ニツクトランスレーシヨン緩　− ０，５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）０、ＩＭ＆
Ｍ酸マグネシウム ］、ｍＭジチオスレイトール ５００μｇ／ｎｌウシ血清フルブミン 実施例１記載のフレノウ・フラグメントを０．５μｍを
加え３７℃、１５分間反応させた後、７０℃、ＩＯ分間
処理して反応を停止し、プラスミドの末端を平滑化した
。

最後に、アルカリホスファターゼ処理して、ｐｉ（ｉｎ
ｄ　［１リンカ−；ｄ（ＰＣＡＡＧＣＴＴＧ）　　（宝
酒造（株）製）を用いてライゲーション反応を行った。

この様な一連の実験により得られたＤＮＡサンプルを大
腸菌に形質転換し得た形質転換株数珠に関して、プラス
ミドを回収し、ＨｉｎｄＩ１１部位からＰＧＫプロモー
ター５′上流の方向ヘダイデオキシＤＮＡシークエンシ
ング（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ
、７４，５４６３゜（１９７７）　）を行なったところ
、第３図に示すプラスミドｐＳＡＫ３２６を得た。

実施例２ エメリセラ・ニドランスＰＧＫｉｉｉ伝子の３゛側非翻
訳領域１３２ｂｐを、アプライド・バイオシステムズ３
８０Ｂ型ＤＮＡ合成機により前述同様、化学合成した。

この領域は、ＰＧＫのターミネーションコドンの３番目
の塩基Ａから下流に存在し、ポリＡアディショナルシグ
ナルＡＡＵＡＡＡ配列と思われる領域及び強力なステム
・アンド・ループ構造が存在する。尚、ベクター構築の
都合上、５°−末端側にＢａｍＨＩ部位を、３°−末端
側にＨＴｎｃ　ＩＩ　、　　Ｐｖｎ　１１部位を連結し
て化学合成した。以下、化学合成した配列を示す。

Ｓ　’−ＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡ丁ＧＡＡ　　ＧＡＡＴ
ＴＴＴＧＴＧ　　ＡＡＡＣＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡ丁ＴＴ
ＡＣＴＴ　　ＣＴＴＡＡＡＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＣＧＣ
：ＴＡＧＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴ
ＴＣＡＴＴＴＴ　ＧＡＣＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＴＧ
ＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡ　　
ＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＴＡＣＡＴＴＡＣＡＴＧ　　Ｇ丁
ＡＣＴＧＡＡＧ　　ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ　　ＡＧＴ
ＴＣＴＡＡＡＣ（：ＣＴＧＣＣ：ＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧ
−３ＧＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＣ 傘は、ｍＲＮＡの３′末端と思われる位置を示し、□ば
、Ｐｏ１ｙＡ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｓｉｇｎａｌを
示し、ト→は、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔを示す
。

合成後、プラスストランド、マイナスストランドそれぞ
れを７Ｍ尿素・６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
供し、長さの相当するバンドのゲルを切り出してＤＮＡ
抽出を行いその精製を行った。精製標品各ｌμｇを混合
し、３７℃で３０分間インキュベートにしてアニーリン
グを行ない、その後、５０μｌのＰ緩衝液（０１■トリ
ス−塩酸（ｐＨ７，５）／ｌｏｍＭ　ＭｇＣＬｚ／１０
ｏ＋Ｍβ−メルカプトエタノール１０．ｌｆｆ１Ｍ　Ａ
ＴＰ）中で５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造■製）を添加して３７℃で３０分間インキュベート
することにより５“末端のリン酸化を行った。上記ＤＮ
Ａ断片は、ｐＢＲ３２２ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＴ１部位に
ＤＮＡライゲーション反応により挿入し、ｐＳＡＫ３０
５とした。（第４図）。

実施例３、 匹昼赳工旦旦蓬 エメリセラ・ニドランスＰＧＫのプロモーター及びター
ミネータ−領域それぞれをＨＰＴ構造遺伝子の５′末端
側、３′末端側に付加したプラスミドｐＳＡＫ３３３の
構築過程を（第５図）に示す。ｐＳＡＫ３３０　（１）
ＳＡＫ３３３の構築に使用する中間体）の構築方法は、
ｐＹ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　４゜２９２９、　（１９８４）
）のＳａｃ　Ｉ部位をＨｉｎｄＩｎ部位に変えることに
より行なった。即ち、先ずｐＹ３ＤＮＡを５ａｃｔ（宝
酒造■製）で完全に切断後、フレノウ・フラグメント処
理により突出末端を平滑末端にした。そしてアルカリホ
スファターゼ処理後、ｐＨ１ｎｄＩＩＩリンカ−；　ｄ
ｆｐｃＡＡＧｃＴＴＧｌ共存下でライゲーション反応を
行なうことにより、ｐＳＡＫ３３０をＷ＋築した（第５
図の） ｐＳＡＫ３３１１ｐＳＡＫ３３３の構築に使用する中間
体）の構築方法は、ｐＳＡＫ３３０のＫｐｎ　Ｉ部位を
ＢａＪＩ部位に変えることにより行なった。即ち、先ず
、ｐＳＡＫ３３（ｌ　ＤＮＡをＫｐｎＩ　　（宝酒造印
製）で完全に切断後、フレノウ・フラグメント処理によ
り突出末端を平滑末端にした。そして、アルカリホスフ
ァターゼ処理後、ｐＢａｍＨＩ　　リンカ−；　ｄ（ｐ
ＣＧＧＡＴＣ（：Ｇ）共存下でライゲーション反応を行
なうことにより、ｐＳＡＫ３３１を構築した（第５図■
）。ｐｓｉ３３２　（ｐＳＡＫ３３３の構築に使用する
中間体）の構築方法は、ｐＳＡＫ３０ｓのＨｉｎｄＩＩ
［−ＥｃｏＲＩラージＤＮＡ断片（エメリセラ・ニドラ
ンスＰＧＫのターミネータ領域を含むＤＮＡ断片）とｐ
ＳＡＫ３２６のＨｉｎｄＩ［ｌ　　ＥｃｏＲニスモール
ＤＮＡ断片（エメリセラ・ニドランスＰＧＫのプロモー
ター領域を含むＤＮＡ断片）とを連結することにより行
なった。即ち、ｐＳＡＫ３０５．　ｐＳＡＫ３２６それ
ぞれのＤＮＡを、ＨｉｎｄｌＩｌ　／ＥｃｏＲＩで完全
に消化後、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動に供
し、泳動後、ｐＳＡＫ３０５のターミネータ−の領域を
含むラージＤＮＡ断片２．δｋｂと　ｐＳＡＫ３２６の
プロモーター領域を含むスモールＤＮＡ断片１．８ｋｂ
にに相当するバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡの溶出
操作を行なった。精製した両ＤＮＡ断片は、ライゲーシ
ョン反応により連結し、　ｐＳＡＫ３３２を得た（第５
図■）。

ｐＳＡＫ３３３の構築方法は、ｐＳＡＫ３３２のＨｉｎ
ｄＩｎ　−ＢａｍＨＩ　ラージＤＮＡ片と　ｐＳＡに３
３１のＨｉｎｄｍ　−Ｂａｍ旧スモールＤＮＡ断片ＨＰ
Ｔ構造遺伝子を含むことを連結することにより行なった
。即ち、　ｐＳＡＫ３３２．ｐＳＡＫ３３１それぞれの
ＤＮＡを、）Ｉｉｎｄｍ　／Ｂａｍ旧で完全に消化後、
同じ（，０，８％低融点アガロースゲル電気沫動に供し
、泳動後、ｐＳＡＫ３３２のプロチーター・ターミネー
タ−領域を含むラージＤＮＡ断片４．２ｋｂとｐＳＡＫ
３３１のＨＰＴ構造遺伝子を含むスモールＤＮＡ断片１
．１ｋｂに相当するバンドをゲルから切り出し、　ＤＮ
Ａの溶出操作を行なった。精製した両ＤＮＡ断片は、ラ
イゲーション反応により連結し、ｐＳＡＫ３３３を得た
（第５図■）。

実施例４゜ 形質転換にとって好ましいペニシリウム・シトリナムの
菌株は、微生物工業技術研究所に寄託しである微工研菌
寄第２６０９号である。ＭＬ−２３６Ｂの生産性を増大
させるために、該菌株を遺伝的改良もしくは突然変異／
選択等の操作により誘導させた任意の菌株ち使用できた
。また、これ以外のペニシリウム・シトリナム菌株も使
用できた。

ペニシリウム・シトリナム細胞の遺伝的形質転換を効率
良く行なうため、細胞壁を除去して安定なプロトプラス
トを形成させる必要がある。このようなプロトプラスト
の調製にあたり、均一の接種菌から始めるのが極めて有
利である。さもなければ、培養物中の細胞の調製の生産
性が低下し、不適当または不十分な量の細胞からペニシ
リウム・シトリナムのプロトプラストを調製しようとす
る試みによって時間が浪費されることになる。

細胞培養のための均一な接種菌液の調製は以下の方法に
従った。

ペニシリウム・シトリナムのスラント（培地ＰＧＡ培地
、１０ｍ１／　１８ｍ１径試験管）に生理食塩水を１０
ｍ１添加して、胞子をスラントから、遊離せしめて、　
１００ａ＋土のＰＧＡ培地上に２ｍｌ塗布して、２６℃
で２週間培養した。

ＰＧＡ培地 Ｐｏｔａｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ”　　　　ｌｏｏＯｍｌ
Ｇｌｙｃｅｒｉｎ　　　　　　　１５０ｍｌＡｇａｒ（
Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　１７．２５ｇ傘Ｐｏｔａｔｏ
　２００ｇを約１ｃｍ”に切断して水道水１Ｃを添加し
て、　１時間、１００℃で処理し、チーズ布で濾過して
、最終的に８２にした抽出液、これに滅菌蒸留水を１０
０ｍ１添加して、直径５．５ｍｍのガラス・ビーズを添
加して菌糸表面から分生胞子を遊離せしめて、チーズ布
にて分生胞子のみを濾過した。８．ＯＯＯｒｐｍで１０
分間遠心後、上清をすてて、分生胞子が１０９個になる
ように調製した。

プロトプラスト調製のための細胞の増殖法を以下に記す
。

水性培地Ａに懸濁した接種細胞の入ったヘソ付三角フラ
スコを、振どう撮に取り付け、２００ｒ、ｐ、ａ＋、に
て２６℃で２４時間インキュベートした。形質転換可能
なプロトプラストの調製に好適な細胞を得るためには、
培養工程中、推奨される２５〜２６°Ｃの温度を維持す
ることが重要であった。

水性培地Ａは以下のごとく調製した。：溶液Ａ　８０ｍ
１を５００＋ｎｌのヘン付三角フラスコ中に調合する。

このフラスコを市販の密閉手段で覆い、　１２１”Ｃで
１５分間オートクレーブにかけた。

溶液Ａ　：　ＹＰＬ−２０酵母エキス（Ｄｉｆｃｏｌ　
Ｏ，１％Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｏｎ　（大五栄養化学■製〕
０５％ ラクトース　　　　　２０％ ｐＨ５，０ ペニシリウム・シトリナムのプロトプラストの調製法を
以下に記す。

２４時間培養した培養物より得た細胞を遠心分離（４０
００ｒｐｍ、　１０°）で、集菌し、Ｏ，６５Ｍ−Ｍｇ
Ｃ，ｌ−溶液に懸濁した。

該溶液５ｍｌにつき細胞塊１ｇの最終的細胞温度を達成
するに充分な該溶液を加えた。

さらに、細胞を４０＋ｎｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌａｓｅ−
２０Ｔ　　（生化学工業）　、　２０ｍｇ／ｍｌのＣｈ
ｉＬｉｎａｓｅ　（シグマ製）を加えた５ｍｌの０．５
５Ｍ　ＭｇＣ１ｚ溶液に再懸濁した。

最終細胞温度は、酸素溶液１０ｍ１につき処理細胞塊１
ｇであった。この細胞懸濁液を往復水浴振どう機にかけ
、　１００ｓｐａ＋（ｓｔｒｏｋｅ　ｐｅｒ　ｆｆ１ｉ
ｎ）にて２９−３０６Ｃで１時間インキュベートした。

プロトプラストの懸濁液を４倍容の洗浄溶液（０，５５
Ｍ−Ｍｇ（，１ｇ）で希釈し、次いで３Ｇ３−ガラスフ
ィルターによる自然濾過を４℃にて行なった。

プロトプラストを含む濾液を得た。

２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清をデカンテ
ーシゴンし、プロトプラストのベレットを１０ｍ１の洗
浄溶液に懸濁した。洗浄操作を２回反復し、洗浄したプ
ロトプラストを、　ｌｎ１当り　２３ＸｌＯ”のプロト
プラスト温度（血球針による計測）とするに充分な［０
，５５Ｍ−ＭｇＣ１ｚ／ＩＯＩｎＭＭＯＰＳ１５０１１
１！Ｉｔ　ＣａＣ１ｚ（ｐＨ６，３１）液に再懸濁した
。

（０，５５Ｍ−ＭｇＣ１＊／１０ｍＭ−ＭｏＰＳ（ｐＨ
６，３）１５０ｍＭ　ＣａＣ１−）溶液中のペニシリウ
ム・シトリナムのプロトプラスト（２３Ｘ　１０’／ｍ
ｌ）の懸濁液０．４０１１に２５μβの０５％ヘパリン
液（０，５５Ｍ−Ｍｇ（：ｌｘ／ｌＯｆｆ１Ｍ−ＭＯＰ
ｌｏｆｆｌ、３１１５０ＩｎＭ　ＣａＣ１ａ液）、さら
にＯ，１ｍｌの４０％ポリエチレングリコール（以下ｒ
ＰＥＧ」　とする）　４０００ｆｌＯｆｆ１Ｍ−ＭＯＰ
Ｓ（ｐＨ６，３）／５０ｍＭ　Ｃ，ａＣＬに溶解）を加
えて、容量０．５２５ｍ１の混合物とした。この混合物
９６μεにプラスミドｐＳＡＫ３３３を１２μｌ２ｆＤ
ＮＡ濃度としてｌＯμｇ／μ℃）を添加した。これらの
混合物を０℃で、３０分間静置し、１．２ｍｌの４０％
ＰＥＧ４００Ｑ液（５０ｍＭ−（：ａｃｌｘ／１０ｍＭ
−ＭｏＰＳ　（ｐＨ６，３）に溶解）を加え、均一化後
、室温（２５°Ｃ）で２０分間静置した。

プロトプラストを安定化させるために、１１＋ｌ−ソル
ビトールを加えたＶｏｇｅｌ最小培地（寒天２７％）Ｓ
Ｏｍｌに添加して、均一化後、あらがじめ４９°Ｃに加
温しておいたＶｏｇｅｌ最小培地（寒天１．５％ｌ　１
ＯＩｎｌ含有ペト含有シトリ１重層した。

このペトリ皿を２６℃で２０時間インキュベートした後
、最終温度を２００℃ｇ／ｍｌとするに充分なハイグロ
マイシンを含む液状寒天ｌ、５％ｗ／ｖ、　４２℃にお
いて）　１０ｏ＋１を、各ベトリ皿に加える。積層物が
固化した後、ペトリ皿を加温室中で２６℃でインキュベ
ートした。二次培養をするに充分な大きさの形質転換体
コロニーは、形質転換後１０日で出現するが、より紐慢
に増殖する形質転換体を３０日後まで取得することがで
きた。非形質転換体は、新たな選択培地に対する二次培
養の際、増殖できないため、容易に安定な形質転換体と
識別できた。

実施例５゜ サザン・ハイブリダイゼーションは、例えば、ハイグロ
マイシンＢ耐性ペニシリウム、シトリナム形質転換体が
、ペニシリウム・シトリナムのプロトプラストおよびプ
ラスミドｐＳＡＫ３３３を含む形質転換実験から獲得で
きるということの決定的な証拠を提供する。プラスミド
ｐＳＡＫ３３３　ＤＮＡＬＯｕ　ｇを伴う形質転換混合
物約５０ｍ１中に約０．３〜０．６×１０’のプロトプ
ラストを存在させた。ベトリ皿１枚に付き５ｆｆＩｌず
つの形質転換混合物の全量を選択培地に移し、１０日間
観察した。この期間内に数個のコロニーが形成された。

ペニシリウム・シトリナムの形質転換体を無作為に選択
しＴ、、ＴｈＴ、とじた。「ダミーＪ　ｐＳＡＫ３３３
形質転換混合物も使用した。他の点では操作は同一にし
た。「ダミー」混合物の一部を非選択培地（ハイグロマ
イシンが存在しない）で培養することによって、形質転
換混合物１ｍｌにつき総数３ｘ　ｌｏ’のコロニー形成
単位が得られた。「ダミー」形質転換混合物を蒔いた選
択培地上には、コロニーは形成されなかった。希釈した
（対数にして４倍）「ダミー」形質転換混合物を蒔いた
非選択培地から１個のコロニーを選択し、「対照」と名
付けた。Ｔ、、Ｔ、、およびＴユ形質転換体の一部に貯
蔵した。形質転換実験１の一部を非選択培地上で二次培
養し、このＴｌＴ、。

およびＴ３二次培養体および「対照」二次培養体から以
下の方法により　ＤＮＡを調製した。

凍結菌体的２ｇを一８０°Ｃで冷却した乳鉢中で、粉砕
して、（５％ＳＤＳ／６２．ＳｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎａ
／ＳＯｍＭ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，２１１液２０ａ＋１中
に懸濁して、０℃で２時間静置した。その後、１０ｍ１
のＴＥ飽和フェノール１０ｍ１を添加して、５０°Ｃで
１時間静置後、さらに５１１１↓のＴＥ飽和フェノール
を加えて、均一化後、２０００ｒｐＩ＋＋で１５分間遠
心して、水層を分取した。この水層に１７２７２倍容Ｍ
−酢酸アンモニウムを加え、さらに、２５倍容の冷エタ
ノールを加えると、ＤＮＡＲＮＡ混合物が不溶性となっ
て沈澱した。これを８０℃で、　１時間放置後、１０．
０００ｒｐので遠心して、沈１２を得て、　２ｍｌのＴ
Ｅを添加して、溶解して当量のイソプロパツールを加え
ることにより、全ＤＮＡ−ＲＮＡ混合物は不溶化した。

全ＤＮＡは糸状の高分子体として、不溶化し、容易に他
の夾雑物と分離できた。全ＤＮＡを新しいエッペンドル
フ・チューブ（１，５ｏ＋１容）に移し、乾燥後、ＴＥ
を加えて、ｌＯμｇ／ＬＬＩ２の濃度になるように調製
した。

単離体Ｔ、および「対照」単離体から得た同等量のＤＮ
Ａを、アガロースゲル中で電気泳動する。比較のために
、ラムダファージからの精製ＤＮＡ調製物であるラムダ
ＤＮＡを、電気泳動に先立ちＥｃｏＲＩ／Ｉ（ｉｎｄ　
ｍによって消化した。電気泳動およびエチジウム染色の
後、ＥｃｏＲＩ／）Ｉｉｎｄｍ　ＤＮＡフラグメントの
位置を、これらの既知の大きさによりキロベース（ｌ］
、ｓ５５〜２１５）で記録した。サザン・ハイブリダイ
ゼーションは（”Ｐ）　ｐＢＲ３２２をＤＮＡプローブ
として、アガロースゲル上で実施した（リフビー（Ｒｉ
ｇｂｙｌ等、Ｊ、Ｍａｌ、ＢｉｏＬ、、　１１３　２３
７［１９７７）の方法によるニック・トランスレーショ
ン）。形質転換体Ｔ、由来の高分子量ＤＮＡに対応する
バンドは、（”Ｐｌ　ｐＢＲ３２２プローブに対する明
確な且つ強いハイブリダイゼーションを示した。これと
は著しく対照的に、「対間」、即ち「ダミー」形質転換
から得られる非形質転換受容菌株由来のＤＮＡに対して
は、ハイブリダイゼーションは全く行なわれなかった。

（”　”Ｐｌ　ｐＢＲ３２２に対する、ハイグロマイシ
ン耐性ペニシリウム・シトリナム単離体の高分子量ＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションは、この単離体が、プラス
ミドｐＳＡＫ３３３の全体または一部分がペニシリウム
・シトリナムゲノムに組込まれている形質転換体を示す
ことを証明した・ Ｔ１由来のＤＮＡにおいては、プラスミドｐＳＡＫ３３
３に相当するハイブリダイゼーションのバンドは観察さ
れなかった。別の実験においては、ハイグロマイシン耐
性単離体Ｔ２およびＴ３の高分子量ＤＮＡもまた（”Ｐ
ｉ　ｐＢＲ３２２とハイブリダイズすることが示された
。また、非形質転換ペニシリウム・シトリナム対照由来
のＤＮＡは、ハイブリダイゼーションを行なわなかった
。

実施例６゜ ペニシリウム・シトリナム細胞（クローンＴ１より）は
、プラスミドｐＳＡＫ３３３ＯＮＡによる形質転換によ
り、遺伝子型のハイグロマイシン耐性をＷｉｌｔした。

プラスミドｐＳＡＫ３３３はプラスミドｐＢ８３２２由
来のＤＮＡを含んでいるため、このハイグロマイシン耐
性細胞由来の切断されていない全ＤＮＡ中に（”Ｐ）　
ｐＢＲ３２２と種雑形成するＤＮＡが存在することは、
クローンＴ１の細胞がｐＳＡＫ３３３　ＤＮＡを含もこ
との明白な証拠となる。形質転換前の菌株から得た全Ｄ
ＮＡ中にｆ”Ｐ）　ｐＢＲ３２２とハイブリダイズする
ＤＮＡが無いことにより、ハイグロマイシン耐性の獲得
がプラスミドｐＳＡＫ３３３の獲得に関連していること
が証明できる。ＴＩ由来の切断されていない全ＤＮＡ中
の、［”Ｐ）　ｐＢＲ３２２とハイブリダイズするＤＮ
Ａによって示される、アガロースゲル中でのイオン移動
は、プラスミドｐＳＡＫ３３３が高分子ペニシリウム・
シトリナムＤＮＡ中に組込まれたことを立証する。ハイ
グロマイシン耐性細胞の全ＤＮＡ中に（”ＰＩ　ｐＢＲ
３２２とハイブリダイズする低分子量のＤＮＡが存在し
ないことは、プラスミドｐＳＡＫ３３３がクローンＴｌ
の細胞中に自律的複製形態として存在しないことを証明
する。　（３２ＰｌｐＢＲ３２２とハイブリダイズする
ペニシリウム・シナリナム形質転換体ＴＩ由来の制限処
理した全ＤＮＡにおける複数の配列は、部分的ＤＮＡ消
化を反映するものではない。プラスミドｐＳＡＫ３３３
の組み込みが１以上の部位で起こることも示された。

実施例７゜ ペニシリウム・シト富ナムの′　　　　　の、プラスミ
ド　５ＡＫ３３３のちたらしたＩＩＰＴ遺伝ペニシリウ
ム・シトリナム形質転換体子、によって表わされるハイ
グロマイシン耐性の根拠をより明確にするには、プラス
ミドｐＳＡＫ３３３のもたらしたＨＰＴ遺伝子配列の存
在を物理的に確かめる必要があった。プラスミドｐＳＡ
Ｋ３３３のＢａｍ　ＨＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片（１，
１ｋｂ）ば、この物理試験の実験に好適なプローブであ
る。ｐＳＡＫ３３３のＢａｍＨｌ・Ｈｉｎｄ［ＩＩ断片
（１，１ｋｂｌは全てのＨＰＴ遺伝子配列を含んでいる
。

適当なプローブは、）ＩＰＴ遺伝子は含むが、受容ペニ
シリウム・シトリナム菌株とハイブリダイズするような
性質のＤＮＡを含まない。プラスミドｐＳＡＫ３３３は
３つのタイプのＤＮＡ　、即ち、■ｐＢＲ３２２配列、
■２個のエメリセラ・ニドランス配列（１個は、　ＰＧ
Ｋ　　プロモーターを含もエメリセラ・ニドランスＤＮ
Ａの１．１ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメ
ント上に、２個目は、ＰＧＫターミネータ−〜１４０ｂ
ρ配列上に）、および■プラスミドより得たＨＰＴ遺伝
子の配列、を含む。これらのＤＮＡの位置は、記述した
プラスミドｐＳＡＫ３３３の構造かられかる。

ｐＳＡＫ３３３のＢａｍＨＩ　・ＨｉｎｄＩｎ断片（１
，１ｋｂ）のｉｍｐ標識体は、サザン・ハイブリダイゼ
ーションにより、ＨＰＴ遺伝子配列を含むフラグメント
のみがｐＳＡＫ３３３のＢａｍＨＩ　・Ｈｉｎｄｍ断片
（１，１ｋｂ）のＳａｐ　ｇ識体プローブとハイブリダ
イズすることが示された。

実施例８ １、ペニシリウム・シトリナムＰＧＫ遺伝子のクローニ
ンク ペニシリウム・シトリナム染色体ＤＮＡ　１０μｇを５
０μｍの制限酵素緩衝液旧５０ｍＭトリスー塩酸（ｐＦ
Ｉ７．５＋／ＩＯＱＩＭ　ＭｇＣ１，／１ｍＭジチオエ
リスリトール／１００ｍＭ　ＮａＣ１）中でＥｃｏＲＩ
　２０単位で３７℃、２時間処理した後、さらにＥｃｏ
ＲＩ　２０単位を添加し、３７℃、２時間反応させた。

ひきつづいて丁Ｅ飽和フェノール抽出を行ない、等量の
クロロホルムを加え撹拌後、軽く遠心して上清（水層）
を分離した（以下「クロロホルム処理」とする）。

その後エタノール沈澱を行ないＥｃｏＲＩ消化ペニシリ
ウム・シトリナム染色体ＤＮＡ断片を得た。

ｃＤＮＡクローニングシステム（アマジャム社製）を用
い、λｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部位に上述のペニシリウム
・シトリナム染色体のＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片をライ
ゲーション換作により捜人後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケ
ージングを行ない、ペニシリウム・シトリナム染色体ラ
イブラリーを作製した。

ペニシリウム・シトリナム染色体ＤＮＡを組み入れたλ
ｇｔｌｌを大腸菌Ｙ１Ｏ９０株（アマジャム社製）に感
染させ、λファージが溶菌サイクルに入る条件下、プレ
ート上でプラークを形成させた。

ファージがまかれたプレートを４℃、１時間冷却後、ニ
トロセルロースフィルターをプラークに約１分間接触さ
せ、プレートがらニトロセルロースフィルターをはがＬ
　（０，１Ｍ　ＮａＯＨ／＊１．５Ｍ　ＮａＣ１１溶液
中ニ３０〜６０秒浸し、ツいテ（２Ｘ　５ＳＣＰ傘／Ｑ
、　２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　［ｐＨ７，５）　ニより
、　３０秒処理した。さらに、フィルターを風乾後８０
’Ｃで２時間処理し、ＤＮＡをニトロセルロースフィル
ターに焼き付け、これをプラーグハイブリダイゼーショ
ン用のフィルタとした。

＊　ＳＳ１：Ｐ　ｆ２Ｘ） ＮａＣ１２４０ｍＭ クエン酸三ナトリウム　　　３０ｍＭ ＫＬＰＯ４２６ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ　　　　　　　　　　２ｍＭ　（ｐＨ７
，２１ペニシリウム・シトリナム染色体のＥｃｏＲＩ処
理ＤＮＡ断片を含むんｇｔｌｌプラークを１プレートあ
たり２２０００ｐ−ｆ−ｕ・（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒＩ
ＩＩａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔｌ形成させ、前述のようにＤ
ＮＡをニトロセルロースフィルターに焼き付けた後、同
フィルターｌＯ枚を実施例１記載のハイブリダイゼーシ
ョン液２（Ｉｏ＋１中で３７℃、２時間ゆっくり振とう
し、プレハイブリダイゼーションを行った。

ブレハイブリダイゼーション溶液を同じ組成のハイブリ
ダイゼーション溶液２０ｍ１に置き換えた後、実施例１
においてプロモータとともにクローニングされたエメリ
セラ・ニドランスＰＧＫ遺伝子のＨｉｎｄｍ断片（２，
５ｋｂｌを［ａ　”Ｐｌ　−ｄ　ＣＴＰを用いてニック
トランスレーションキット（アマジャム社製）により標
識したプローブｌ（第６図）を５０〜１．００ｎｇ加え
、３７℃でゆっくり振とうしながら加温し、−晩ハイブ
リダイズさせた。

ハイブリダイゼーション溶液を除いた後、フィルターを
（３０％ホルムアミド／Ｓ　Ｘ　５ＳＣ１０，１％５Ｄ
Ｓ）に浸し、３７℃でゆっくり振とうしながら１時間処
理した。ひきつづいてｚｘｓｓｃで３７℃、１５分間処
理し、ニトロセルロースフィルターに吸着しないプロー
ブを除いた。フィルターを風乾後Ｘ線フィルム、増感紙
を重ね、−７７℃で一晩露出しオートラジオグラフィー
を行なった。

約１００万個のペニシリウム・シトリナム染色体ライブ
ラリーからスクリーニングを行なったところ、８個の陽
性クローンを得た。

８個の陽性クローンの制限酵素切断部位を調べるためフ
ァージＤＮＡを以下の方法により精製した。

純化したファージを大腸［Ｙ２Ｏ２［１株に感染させ、
プレート−面にプラークを形成させた。（〉１０５ｐ・
ｆ・Ｕ・／プレート）。プレート■枚につき５Ｍ緩衝液
中をＳｍｌ加え、おだやかに１時間室温で振とうして、
５Ｍ緩衝液中にファージを溶出させた。

＊鋒援ま羞 Ｎａ１１　　　　５．１１１　ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２ｇ Ｔｒｉｓ　　　　　６．０５ｇ ２％ゼラチ：’　　Ｓｍｌ　　　ＬＯ１ｆ２中（ｐＨ７
，５）１０．０００ｒｐｍ、　４°Ｃ１１０分間遠心分
離し、上清にＲＮａｓｅ（Ａ＋Ｔ＋ｌ　、　０Ｎａｓｅ
　Ｉを最終濃度でそれぞれ１Ｍｇ／ｆｆ＋１になるよう
に加え、３７°Ｃ１３０分間処理した。同量の２０％（
ｖ／ｖ）　ＰＥＧ　６０００，２１＋！　ＮａＣ：ｌを
含む５Ｍ緩衝液を加え、激しく撹拌後、１１００００ｒ
ｐ、　４°Ｃ，２分間遠心分離し、上清にｌＯ％ＳＤＳ
　５μｍ及び０．２５ＭＥＤＴＡＩＯμｍを加え、６８
℃、２５分間処理後、ＴＥ飽和フェノール処理した。そ
の後、エタノール沈澱して、減圧乾燥後ファージＤＮＡ
をＴＥ緩衝液に溶解し、ＣｓＣ１を１ｇ１０＋１になる
ように加えた。５００００ｒｐｍ、２０°Ｃ９１５〜１
７時間超遠心分離し、エチジウムブロマイドで染まるバ
ンドを分取し、ＮａＣ１及び５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ［ｐ
Ｈ８，０）で飽和したインプロパツールで３回抽出後、
水層をＴＥ緩衝液に対して４℃で透析した。

透析後、これをエタノール沈澱、減圧乾燥し、精製ファ
ージＤＮＡとした。

精製ファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全消化し、前述の
条件でサザンハイブリダイゼーションしたところ、エメ
リセラ・ニドランスのＰＧＫ遺伝子のＢｉｎｄ■断片２
．５ｋｂ　　（第６図）とハイブリダイズしたペニシリ
ウム・シトリナムの染色体ＤＮＡは、？、９ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ断片であることが明らかになった。

ペニシリウム・シトリナム染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断
片７．９ｋｂを含むＬｇｔｌｌのＤＮＡを前述の方法に
より精製した。

精製ＤＮＡを各種の制限酵素で処理し、簡単な制限酵素
地図を作製した結果、エメリセラ・ニドランスＰＧＫの
ＨｉｎｄＩＩｌ断片２．５ｋｂとハイブリダイズする領
域は７．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中ＢａｍＨＩ断片４．
５ｋｂ内であることがわかった。そこで、この４．５ｋ
ｂ断片をｐＵｃ１１＋１　（宝酒造■製）にサブクロー
ニングしたｐＳＡＫ３３７を構築した（第７図■）。ｐ
ＳＡＫ３３７をさらに各種制限酵素で完全消化後０．８
％アガロースゲルで分離し、ＤＮＡをニトロセルロース
フィルターに転写後、サザンハイプリダイゼーションを
行なった。プローブはエメリセラ・ニドランスＰＧＫ構
造遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片１．５ｋ
ｂ（プローブ２）を使用した（第６図）。

［ａ　二”Ｐｌ−ｄＣＴＰによるニックトランスレーシ
ョン法により標識し、ハイブリダイゼーションは前述の
条件で行なった。その結果、ＢａｍＨＩ断片４．５ｋｂ
内のＢａｍ）ＩＩ−５ａｌ　Ｉ領域１．６ｋｂにＰＧＫ
構造遺伝子領域が存在した。そこで、この１．６ｋｂ断
片をｐＵＣｌｌｇにサブクローニングしたｐＳＡＫ３３
８を作製した（第７図■）。

ｐＳＡＫ３３ｇ　ＤＮＡ約ｌＯμｇを５０μｍの制限酵
素緩衝液Ｈ中でＳａｔ　Ｉ　（宝酒造■製）２０単位の
添加により３７℃で２時間切断反応を行なった。フェノ
ール抽出、エタノール沈澱後、減圧乾燥し以下、実施例
１と同様にステイーブン・ヘニコフ（Ｓｔｅｖｅｎ　Ｈ
ｅｎ１ｋｏｆｆｌの方法（Ｇｅｎｅ、２８．３Ｓ１．　
（１９８４）　）及びセレステ・ヤニッシュ’ペロンｆ
ｃｅｌｅｓｔｅ　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｖｒ。

ｎ）らの方法ｆＧｅｎｅ、　３３．１０３．　（１９８
５）　ｌに従ツタキットｒｋｉｌｏ−５ｅｑｎｅｎｃｅ
用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｋｉｔＪ　　（宝酒造■製）によ
り、ペニシリウム・シトリナムＰＧＫをコードする領域
を連続的に欠失させた。即ち、エキソヌクレアーゼ■に
より、欠失反応を行ない、ムングビーンヌクレアーゼ及
びフレノウ断片により、プラスミドの末端を平滑化した
後、アルカリホスファターゼ処理を行なった。

最後に、ｐＢａｍＨＩリンカ−；ｄ　（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）（宝酒造■製）を用いて、ライゲ
ーション反応を行ない、種々の長さのＰＧＫ構造遺伝子
を含むプラスミドを構築した（以下「プリージョン・プ
ラスミド」とする）（第７図■）。

ペニシリウム・シトリナムＰＧにのプロモータ領域も塩
基配列を決定するため、ｐＳＡＫ３３７の）ｌｉｎｄＩ
ＩＩＳａｌ　Ｉ断片２．４ｋｂ　′４！：ｐＵｃ１１９
　（宝酒造側製）にサブクローニングしたｐＳＡＫ３４
１を構築した（第７図■）。

前述したプリージョン・プラスミドを用いて大腸菌ＭＶ
１１８４株を形質転換し、ヘルパー・ファージＭ１３Ｋ
Ｏ？　（宝酒造■製）を感染させて一本鎖ＤＮＡを調製
した。具体的にはプラスミドを含有している大腸菌ＭＶ
１１８４株を２Ｘ　ＹＴ”　１ｍｌｍｌコテ３フ−晩振
どう培養後、培養液３０μｍに対してＭ１３ＫＯ７（１
０”　ｐｆｕ）３０μｍを加え、３７℃、１５分間加温
して感染させた。

＊Ｕ１罎吐 １．６％（ｗ／ｖ）　　　トリプトン １０％［Ｗ／Ｖｌ　　イースト・エキストラクト０．５
％（ｗ／ｖ）　　ＮａＣ１ （１５０μｇ７ｍｌアンピシリン／７０μｇ／ｍｌカナ
マイシン）を含む２Ｘ　ＹＴ　２ｍｌを加え、３７℃、
ｌ　ｓ　時ｒＪ　培Ｉ＆後、１４５ＯＯｒｐｍ、０℃、
５分間遠心分離して上清を得た。この上清１ｍｌにつき
２００μｌの（２０％ＰＥＧ　６０００／２．ＳＭ　Ｎ
ａＣ１１を加え、室温で１５分間静置後、１４ＳＯＯｒ
ｐｍ、　０℃、５分間遠心分離して沈澱を得た。この沈
澱に（１０＋ｎＭ　Ｍｇ（：ｌａ／ｌｏＯｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）１２００ｕｌを加え懸濁後
、ＤＮａｓｅ　Ｉ及びＲＮａｓｅ　（Ａ＋Ｔ、）をそれ
ぞれ１００μｇ／ａ＋１．　ｔｏμｇ／酎になるように
加え、３７℃、１時間処理した。再度（２０％ＰＥＧ６
００００／２．ＳＭ　ＮａＣ１）４０＋ｕ　ｌを加え、
室温で１５分間静置後、１４５００ｒｐｍ、　０℃、５
分間遠心分離し沈澱を得た。ＴＥ緩衝液４００μｌを加
え、沈澱を懸濁後、ＴＥ飽和フェノール処理してエタノ
ール沈澱した。

減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液１０μ（に溶解して、これを精
製１本ｇＤＮＡとした。

以上、横築した一連のプリージョン・プラスミドから作
成したＬ本ｇＤＮＡを用いてｒｓｅｑｕｅｎａｓｅ”キ
ットＪ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．（ｌｆ東洋紡■製）によ
りペニシリウム・シトリナムＰＧＫの塩基配列を決定し
た。

ＰＧＫの塩基配列と制限酵素断片の解析結果から制限＃
素切断部位を決定した（第８図）。

２、ペニシリウム・シトリナムＰＧＫプロモータを使用
したベクターの構築 ペニシリウム・シトリナムのプロモーター領域と構造遺
伝子のＮ末端部分を含むベクターｐＳＡＫ３４１１０μ
ｇをＨｉｎｄｍ　２Ｏ単位で３７℃、４時間処理した。

フェノール抽出、クロロホルム処理を行ない、エタノー
ル７尤澱、減圧乾燥し、１０μＬのＴＥ緩衝液に溶解し
た。

以下この抽出操作、エタノール７尤澱、減圧乾燥を常法
とする。ここまでで得られたＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＡ
Ｋ３４１をＤＮＡ　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ（宝酒造
■製）により末端部位を平滑化し、！注により、［］Ｎ
ＡをＲ製した。その後、アルカリホスファターゼ処理を
行ない、再び常法によりＤＮＡを精製後、ＴＥ緩衝液１
０μｍに溶解した。このＤＮＡ（４ｍｇ／　ｕ　１）　
４ｕ　１にεｃｏＲＩ　リンカ−；　ｄ（ｐＧ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ）　［宝酒造（陶製）０．５μｍ
、ＴＥ緩衝液０，５μｌを加え、ＤＮＡライゲーション
操作により、ＤＮＡを連結した。再び常法によりＤＮＡ
を精製後１１２０３５μｍにＤＮＡを溶解し、Ｈｉｎｄ
ＩＩｌ　１Ｏ単位で３７’Ｃ１３時間処理した。以下、
このプラスミドを用いて大腸菌８８１０１株を形質転換
し、ｐＳＡＫ３４２を得た（第９図の）。

ｐＳＡＫ３４２はペニシリウム・シトリナムＰＧＫプロ
モーター領域とＮ末端領域を含有するプラスミドである
。従って、そのプロモーターを利用した新しいベクター
を構築するためにはＮ末端領域を欠失させる必要がある
。そこでｐＳＡＫ３４２２１μｇにＳａｌ　Ｉ　　ＬＯ
Ｏ単位を加え、３７℃、２．５時間反応後、常法により
ＤＮＡを精製した。このＳａｌ　Ｉで処理したＤＮＡに
５ａｃＩ］００単位を加え、３７℃、２．５時間反応後
、常法によりＤＮＡを精製した。このＤＮＡをエキソヌ
クレアーゼ■緩衝液１００μ王に溶解しエキソフレアー
ゼＩＩＩ　（６＃Ｌ位／μｌ）を１μ上加え、３７℃で
２〜６分間反応させた。順次採取した反応液２０μｌに
対してムングビーンヌクレアーゼ緩衝液を２０μ上加え
、激しく撹拌後６５℃、５分間処理して欠失反応を停止
した。

反応液４０μｍに対してムングビーンヌクレアゼ（１０
〜５０単位／μｍ）を０．５μｌ加え、３７℃３０分間
反応後、常法によりＤＮＡを精製しフレノウ緩衝液２０
μｌに溶解した。フレノウフラグメント（４，５単位／
μｍ）を０．５μｍ加え、３７℃、１５分間反応させて
末端部位を平滑化し、７０”Ｃ１１ｏ分間処理した。再
び常法によりＤＮＡを精製後、アルカノホスファターゼ
処理した。

再度常法にてＤＮＡを精製後、５μｍのＴＥ緩衝液に溶
解した。このＤＮＡ　２μｍ（４〜２０ｍｇ／μＬ）に
）１ｉｎｄＩＩｌリンカ−；　ｄ（ｐＣ−Ａ−Ａ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ）　　（宝酒造■製）２μ１．Ｈ，０１
μ工加え、ＤＮＡライゲションキットによりプラスミド
を環状化した。このプラスミドを用いて大腸菌８８１０
１株を形質転換した（第９図■）。前述の方法により精
製したプラスミドの塩基配列を調べ、プロモーター領域
において欠失させた塩基の位置を決定した。その結果ｐ
ＳＡＫ３４３はＡＴＧ（転写開始コドン）上流１８塩基
対を欠失したペニシリウム・シトリナムのＰＧＫプロモ
ーターを含むことがわかった（第１Ｏ図）。

ｐＳＡＫ３３３のＨＰＴ及びエメリセラ・ニドンスのＰ
ＧＫターミネータ−をペニシリウム・シトリナムのＰＧ
Ｋプロモーターに連結するためにはｐＳＡＫ３３３のＰ
ｖｕ　Ｕ部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位に変換することが必
要である。そこでｐＳＡＫ３３３５１ｇにＰｖｕＩＩ５
０単位を３７℃、３時間作用させた後、エタノール沈澱
を行ない、減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液２００μｍにン容解
した。ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ２７（単位
／μｌ）を１μｍ加え、３７℃、３０分間反応させ、末
端部位を脱リン酸化した。常法によってＤＮＡを精製後
、１０μｍのＴＥ緩衝液に溶解した。ここで得られたＤ
ＮＡ　４．５μ上に対して０．１μｇ／μｌのＨｉｎｄ
ｌｌｌリンカ−；　ｄ（ｐに−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ
−Ｇ）　　（宝酒造（剛製）を０．５μｍを加え、以下
ライゲーション操作によりＤＮＡを環状化した。再び常
法によりＤＮＡを精製後Ｈｘ０１２．Ｓμｌに溶解し、
ＰｖｕＩＩＩＯ単位を３７℃で作用させ、残存するｐＳ
ＡＫ３３３を開環した。

以下、このプラスミドを用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形
質転換し、　ｐＳＡＫ３４４を得た（第９図■）。

ｐＳＡＫ３４４　９．５０ｇをＨｉｎｄｍ　２０単位、
３７℃で反応させ完全消化後、エタノール沈澱、減圧乾
燥後、３，５％ポリアクリルアミドゲルにより２００Ｖ
、２時間電気泳動した。ＨＰＴ遺伝子とエメリセラ・ニ
ドランスＰＧＫターミネータ−が連結した１、１ｋｂ　
Ｈｉｎｄ■断片を切り出しＤＮＡの溶出操作をした。以
下、常法によりこの１．１ｋｂ断片を精製した。

一方、ｐＳＡＫ３４３９．５０ｇにＨｉｎｄＩＩＩ　２
０単位を加え、３７℃で反応させ、完全消化後、エタノ
ール沈澱、減圧乾燥した。このＤＮＡをＴＥ緩衝液４０
０Ｉｉ１に后解後、アルカリホスファターゼ処理した。

このＨｉｎｄｍ処理、及び脱リン酸化したｐＳＡＫ３４
３と先に述べた１、１ｋｂ断片をライゲーション操作に
より連結後、連結したプラスミドを用いて大腸菌Ｈａｌ
。

１株を形質転換し、ｐＳＡＫ３４５を得た。（第９図■
） 実施例９゜ 炙裏 ペニシリウム・シトリナム形質転換体Ｔ４によって表わ
されるハイグロマシン耐性の根拠をより明確にするには
、プラスミドｐＳＡＫ３４ｓの６たらしたＨＰＴ遺伝子
の存在を物理的に確かめる必要があった。プラスミドｐ
ＳＡＫ３４５のＢａ＋ｎ［−ＢｉｎｄＩＩＩ断片（１，
１ｋｂｌは、全てのＨＰＴ遺伝子配列を含んでいる。適
当なプローブはＨＰＴ遺伝子は含むが、受容ペニシリウ
ム・シトリナム菌株とハイブリダイズするような他のＤ
ＮＡを含まない。プラスミドｐＳＡＫ３４５は、３つの
タイプのＤＮＡすなわち■ＰＵＣ１１９配列、■２個の
糸状菌由来の配列（１個は、ＰＧＫプロモーターを含む
ペニシリウム・シトリナムＤＮＡの２．４ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｈｉｎｄｍ断片上に、２個目はエメリセラ・ニド
ランスのＰＧＫ・ターミネータ−〜１４０ｂｐ配列）お
よび■プラスミドｐＹ３より得たＨＰＴの配列を含む。

これらのＤＮＡの位置は、既述したプラスミドｐＳＡＫ
３４５の構造かられかる。

ｐＳＡＫ３４５のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（１
，１ｋｂｌのｓｉｐ標識体は、サザンハイブリダイゼー
ションによりＨＰＴ遺伝子配列を含むブラグメントのみ
がｐＳＡＫ３４５のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍ断片（１，
１ｋｂ）の３２Ｐ標識体プローブと結合することが示さ
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＳＡＫ３３３の制限酵素地図を
示し、 第２図は、プラスミドｐＳＡＫ３４５の制限酵素地図を
示し、 第３図は、プラスミドｐＳＡＫ３２６の構築方法を示し
、 第４図は、プラスミドｐＳＡに３０５の制限酵素地図を
示し、 第５図は、プラスミドｐＳＡＫ３３３の構築方法を示し
、 第６図は、エメリセラ・ニドランスのＰＧＫ　ｉｊｔ伝
子の制限酵素地図を示し、 第７図は、ペニシリウム・シトリナムＰＧＫ遺伝子の塩
基配列決定のためのエキソヌクレアーゼｍを用いるデイ
リージョン・プラスミドの作成方法を示し、 第８図は、ペニシリウム・シトリナムのＰＧＫ遺伝子の
制限酵素地図を示し、 第９図はプラスミドｐＳＡＫ３４５の構築方法を示し、 第１Ｏ図はペニシリウム・シトリナムのＰＧＫプロモー
ターのエキソヌクレアーゼ■による欠失方法を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ベクター・プラスミドであつて、 （１）（イ）プロモーターとして、 （ｉ）ペニシリウム・シトリナムに近縁または同種の菌
   株由来であり、 （ｉｉ）発現活性が強力である、 プロモーターを有し、 （ロ）選択マーカーとして、薬剤耐性遺伝子を有し、 （ハ）ターミネーターを有し、 （２）大腸菌で選択および複製が可能なベクター由来で
   あり該ベクター中に存在する、 （ｉ）大腸菌で複製可能なｏｒｉ領域、および（ｉｉ）
   大腸菌で選択可能な薬剤耐性遺伝子、を含み、 （３）ペニシリウム・シトリナムの形質転換能を有する
   、ベクター・プラスミド。 ２、プロモーターが、糸状菌の３−ホスホグリセレート
   キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素
   、アルコール脱水素酵素、エノラーゼ、トリプトファン
   合成酵素、β−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ、オ
   ロチジン−５′−リン酸脱水素酵素、チトクロム酸化酵
   素、グルコアミラーゼ、グルタミン脱水素酵素、α−ア
   ミラーゼおよびアセトアミダーゼの遺伝子のプロモータ
   ーのいずれか１つである、請求項１記載のベクター・プ
   ラスミド。 ３、プロモーターが、エメリセラ・ニドランスまたはペ
   ニシリウム・シトリナムの３−ホスホグリセレートキナ
   ーゼ遺伝子のプロモーターである、請求項１または２記
   載のベクター・プラスミド。 ４、薬剤耐性遺伝子が、大腸菌由来のハイグロマイシン
   Ｂ耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子である、請
   求項１記載のベクター・プラスミド。 ５、大腸菌由来のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が、ハ
   イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子であ
   る、請求項１または４記載のベクター・プラスミド。 ６、大腸菌由来のネオマイシン耐性遺伝子が、ネオマイ
   シンホスホトランスフェラーゼ I 遺伝子またはネオマ
   イシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子である、請求
   項１または４記載のベクター・プラスミド。 ７、ターミネーターが、エメリセラ・ニドランスの３−
   ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のターミネーターで
   ある、請求項１記載のベクター・プラスミド。 ８、ＤＮＡ鎖長が５．４キロ塩基対であり、第１図の制
   限酵素地図で表わされる、請求項１ないし６記載のベク
   ター・プラスミド、ｐＳＡＫ３３３。 ９、ＤＮＡ鎖長が６．８キロ塩基対であり、第２図の制
   限酵素地図で表わされる、請求項１ないし６記載のベク
   ター・プラスミド、ｐＳＡＫ３４５。 １０、請求項１ないし８記載のベクター・プラスミドを
   用いて、ペニシリウム・シトリナム菌株を形質転換する
   方法。