JPH03275632A

JPH03275632A - リポソーム製剤

Info

Publication number: JPH03275632A
Application number: JP2072165A
Authority: JP
Inventors: Yahachiro Hori; 堀　弥八郎
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1991-12-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、卵胞刺激ホルモンを含有するリポソーム製剤
に関する。

（従来の技術）卵胞刺激ホルモンは、人では不妊症の治療薬として、ま
た、家畜では卵胞嚢種、排卵障害・卵胞発育不全等の繁
殖障害の治療および受精卵移植技術の一環である過剰排
卵誘起のために用いられる。

卵胞刺激ホルモンを用いて家畜に過剰排卵を誘起する場
合、所定量を通常は１日２回、３〜５日間連続して投与
する方法が採用される。一般に、１日２回投与の方が１
日１回投与に比べて黄体数および回収される卵子数も多
い。雌牛に対する過剰排卵誘起処置は卵胞刺激ホルモン
を発情周部の９〜Ｉ４日目（発情日を０白目とする）か
ら投与を開始し、投与開始後４８時間目と６０時間目５
ニブロスタグランデインＦ２α１５■を！王射する。

（発明が解決しようとする課８）このような卵胞刺激ホルモン投与プログラムは非常に煩
雑であり、これに携わる技術者に多大の負担を強いてい
る。また、頻回投与に伴う４射のストレスが動物の卵巣
反応に悪影響を及ぼす危険性も存在する。

本発明は、少ない投与回数で卵胞刺激ホルモンの薬効を
確実に発揮させ長時間持続させるための製剤を提供する
ことを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明は、卵胞刺激ホルモンを含有することを特徴とす
るリポソーム製剤を提供する。

本発明は、卵胞刺激ホルモンを脂質二重膜構造のリポソ
ーム中に捕捉することによって徐放性を与え、新しいド
ラノグディリバリーシステムを提供し、従来と異なる過
剰排卵誘起プログラムを実現させるものである。

卵胞刺激ホルモン投与プログラムにおいて、従来、過剰
排卵を誘起するために卵胞刺激ホルモンを１２時間間隔
で反復投与しているが、これは卵胞刺激ホルモンの代謝
速度が速やかで作用持続時間が短いためである。この問
題を解決する手段として、本発明は、数ρ〜数ｎｍオー
ダーの脂質二重膜ヘジクルのリポソーム中に卵胞刺激ホ
ルモンを捕捉する方法を採用した。この方法により、頻
回投与を避けても有効血中濃度が持続され、なおかつ標
的器官である卵巣に従来よりも多量に作用させることが
でき、結果的にその投与回数を削減することが可能にな
る。

本発明に用いる卵胞刺激ホルモンは特に制限はなく、市
販品が使用できる。例えばデンカ製薬社製のアントリン
（商品名）等が好ましく使用できる。その使用量は例え
ば雌牛では１０〜１００■、兎では０．５〜５■程度で
あり、動物の種類や体重によって適宜窓める。

本発明においてリポソームを形成する脂質としてリン脂
質を用いる。

リン脂質は、特に限定されるわけではないが、次式：％式％）（但し、式中Ｒ１およびＲ２は、炭素数１２〜２２のア
シル基であり、好ましくは１４〜１８のアシル基、例え
ばミリストイル基、バルミトイル基、ステアロイル基、
オレオイル基、リルオイル基またはリルノイル基である
。また、Ｘは、エステルを形威する基であり、例えばコ
リン、セリン、エタノールアミン、またはグリセロール
基である。）で表すことができ。

有利な例としては、該リン脂質のホスホリル基を、アミ
ノアルコールたとえばコリン（２−ヒドロキシエチルト
リメチルアンモニウムヒドロキシド）、エタノールアミ
ン、セリン等のアミノアルコールまたはオール官能基例
えばイノシトールのような糖誘導体によりエステル化し
て形成したものがある。特に炭素数１４〜１８のアシル
基を有するホスファチジルコリンが好ましい。

リン脂質に多かれ少なかれ非常に類似し、リポソームを
形成しうる他の脂質も利用できる。

一方、本発明のリポソームは種々の方法により製造する
ことができ、その−例を示せば、まずリン脂質をｎ−へ
キサン等の有機溶媒に溶解したもの２部と、これに対し
約０．３〜２部好ましくは約０．７〜１．２部の卵胞刺
激ホルモンを含有する水溶液とを混合攪拌してＷ２Ｏ型
のエマルションを作成する。この際、ｎ−へキサンの代
わりに、低沸点の溶媒、例えばエーテル、塩化メチレン
或いはクロロホルムなども使用でき、又荷電物質（正の
場合は、ステアリルアミンを用い、負の場合はホスファ
チジン酸又はジセチルホスフエートを用いる）を少量添
加しても良い。次に、この−１０型エマルジョン１部に
対し約５〜１５部好ましくは約７〜１２部の水相中に攪
拌混合することにより、−１０／−型の複合エマルジョ
ンを作り、攪拌をさらに長時間連続的に行い、油相に含
まれる有機溶媒（ｎ−へキサン）を水中に移行させて、
水相表面から蒸発させると、油相に溶解していた脂質が
、親水性の部分を内相および外相の水相に向けて配向し
、閉鎖形の脂質二重層小包体、即ち本発明のリポソーム
が得られ、この方法によれば、大量のリポソームを得る
ことができる。

又、リン脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解して
、ナス型フラスコなどの容器に移し、ロータリーエバポ
レータを用いて溶媒を除き、容器の底にリン脂質膜を薄
く均一に形威し、さらにこの膜を室温で乾燥して残存し
ている溶媒を完全に除去する。これに、卵胞刺激ホルモ
ンを含有している少量の水溶液を加え、ξキサー又は超
音波などにより脂質を容器から剥離し、水中に分散させ
て、目的とするリポソームを得ることができるが、本発
明リポソームの製造方法は、これらの方法に限定される
ものではない。なお、リポソームの安定性を与え、血中
消失速度の遅延のためにコレステロールをさらに添加し
ても良く、用いるコレスチロールの使用量はリン脂ｒｔ
ｌに対し０．３〜１．０程度が好ましい。

そのようにして得られたリポソームは水性媒体より、例
えば遠心法、透析法あるいはゲル濾過法により分ける。

沈降物中に含有されるリポソームは、次いで望むならば
洗浄して、リポソーム中に含有されなかった活性物質が
あれば除去する。このリポソームは次いで緩衝液に取り
、なるべくは、冷所、そしてなるべくはプラス４℃の温
度に保存する。このようにして保存したものは、１〜２
ケ月の長期間安定である。

（発明の効果）本発明の卵胞刺激ホルモン含有リポソーム製剤は、はと
んど１回の投与で長時間薬効を持続させることができ、
投与の人手を省き、家畜に注射のストレスを滅して確実
に排卵を誘発させることができる。また安定な製剤であ
るから注射用製剤の形態で長時間保存でき、家畜増殖の
面で有用な製剤である。

（実施例）以下、実施例に基づき本発明を具体的↓こ説明する。

実施例１卵黄レシチン（卵黄ホスファチジルコリン）１．４０ｍ
ｍｏｌとコレステロール０．４０ｍｍｏｌ　）１をｎ−
ヘキサン１０−に溶解して得られた溶液と、卵胞刺激ホ
ルモン（アントリン：デンカ製薬（株製商品名）　１０
■を含む生理食塩水５−とを合わせ、ホモジナイザーに
より乳化し、Ｗ２Ｏ型のエマルションを作った。次いで
蒸留水１５〇−中に、攪拌下、前記の一１０型エマルジ
ョンを添加し、Ｗ１０／Ｗ型の複合エマルジョンを得、
この系を３０℃に保って、攪拌をさらに１時間続けると
、脂質（レシチン）を溶解しているｎ−ヘキサンが徐々
に水中に溶解し、さらに、このｎ−ヘキサンが水性母液
の表面から萬発し、次第に脂質（レシチン）が内外相の
水相に対して極性基を配向して脂質二重層を形成して、
卵胞刺激ホルモンを含有するリポソームが生成した。

次に、リポソームと遊離の卵胞刺激ホルモンを分離する
ため、１４．　ＯＯＯｒｐｍで１時間超遠心操作を行い
、卵胞刺激ホルモンを含有するリポソーム製剤を得た。

実施例１において調製した卵胞刺激ホルモンを含有する
リポソームサスペンノヨン２　ｍｌにオクチルグルコシ
ドの０．４５％水ン容液２ｎｒｌを加えてリポソームを
破壊し、内部または表面にトラ、プされた卵胞刺激ホル
モンを放出させ、５０ｍＭホウ酸／ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ８，２）を加えて２０−とした。この溶液２ｍｌを取
りフルオレスカごンの１ｍＭホウ酸緩衝液１−を加えて
、室温で２時間反応させた。反応液は蛍光分光光度計（
島津ＲＦ５４０）を用いて３８０ｎｍにて励起し、４８
０ｎｍでの蛍光強度を測定した。

予め作製したフルオレスカミンの蛍光強度と濃度との関
係の検量線からリポソームに包含されたフルオレスカミ
ン量を計算した。その結果、リポソームに捕捉された卵
胞刺激ホルモンは２８％と計算された。

実施例２下記の配合成分をクロロホルム−メタノール（２：１）
液ＬＭに溶解した。

コレステロール　　　　　２９．４■　　７ジセチルホ
スフエート　　７．２■　　ｌこの溶液にアントリン１
０■を加えてプローブ型超音波発振器にて４０−で１０
分間超音波処理を行った。これを実施例１と同様にして
リポソームを形成した。この後、遠心（５’Ｃ，１４，
ＯＯＯｒｐｍ　１５分）を二回行い、その都度、上清を
捨てた。

沈澱層に生理食塩水５−を加えてリポソーム製剤の分散
液とした。卵胞刺激ホルモンの捕捉率は２２％であった
。

実施例３下記の配合成分をクロロホルム−メタノール（２：１）
液に溶解した。

コレステロール　　　　　４．９■　　７ジセチルホス
フエート　　　１．２■　　１この溶液を１００　ｍ容
量のナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレータにて
、溶媒を蒸発して除き、内壁に脂質をフィルム状に付着
させた。減圧乾燥後、アントリン１５■を含む生理食塩
水５−をナスフラスコに入れ、ポルテックスミキサーに
て混合処理した。実施例１と同様に処理した後、遠心処
理を二回行い、沈澱層を生理食塩水５−に分散した。卵
胞刺激ホルモンの捕捉率は１９％であった。

実施例４下記の配合成分をクロロホルム−メタノール（２：　１
）液に溶解した。

コレステロール　　　　　２９．４■　　７ジセチルホ
スフエート　　７．２■　　１この溶液を１００　ｄ容
ナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレータにて、溶
媒を蒸発して除き、内壁に脂質をフィルム状に付着させ
た。減圧乾燥後、アントリン２０■を含む生理食塩水５
Ｎ１を加えてポルテックス処理した。さらにマイクロフ
ルイダイザー（６６０ｋｇ／ｍ”、３回）にて処理した
。遠心処理を二回行い、沈澱層を生理食塩水５ｍに分散
した。

以上いずれも滅菌した器具を使い、濾紙にて濾過した。

実施例５家兎へのリポソーム化卵胞刺激ホルモン製剤投与による
過剰排卵誘起試験１）材料および方法供試動物：日本白色在来種戒雌家兎実験区：Ａ区−リポソーム化卵胞刺激ホルモン（３■）
を背部皮下に１回投与後、７２時間目に人絨毛性性腺刺
激ホルモン（ｈＣＧ）　１００ＩＵを耳静脈中に注射し
、その６０時間後に開腹して卵巣反応を観察した。

Ｂ区−市販の卵胞刺激ホルモン製剤（アントリン、デン
カ製薬）３■を生理食塩水で溶解し、家兎の背部皮下に
１回で投与した後、７２時間目に、ｈｃＧｌｏｏｌＵを
耳静脈中に注射した。その６０時間後に開腹して卵巣反
応を観察した。

０区−予め生理食塩水で１ｍｇ／ｌ−の濃度で溶解し、
冷蔵庫内に保存しておいた市販の卵胞刺激ホルモン製剤
（アントリン、デンカ製薬）を０．５■ずつ１２時間ご
とに計６回、背部皮下に注射した。

最終卵胞刺激ホルモン投与後１２時間目にｈｃＧｌｏｏ
ｌＵを耳静脈に注射した。その６０時間後に開腹して卵
巣反応を観察した。

表１実験区　　　　排卵数Ａ　　　　　　　２５８６０５３Ｂ　　　　　　　　　　１３Ｃ３７３１０２）結果過剰排卵誘起処置後の卵巣反応の結果を表１に示した。

リポソーム化卵胞刺激ホルモンを投与した家兎（Ａ区）
の排卵数は、卵胞刺激ホルモン３■を１回投与した家兎
（Ｂ区）の排卵数よりも明らかに多かった。また、Ａ区
の排卵数は従来の方法（０区）による排卵数と差は認め
られなかった。

従って本発明は１回の投与で薬効が持続し、十分な効果
が得られることがわかる。

実施例６肉牛へのリポソーム化卵胞刺激ホルモン製剤投与による
過剰排卵誘起試験１）材料および方法供試動物：黒毛和種威雌牛過剰排卵誘起方法：Ａ：性周期の９日目（スタンディング発情開始日＝０日
目）にリポソーム化卵胞刺激ホルモン３０■を頚部皮下
に注射した。その４８時間後と６０時間後にＰＧＦ、α
を１５■ずつ頚部筋肉内に注射し、発情を誘起した０発
情発現後７日目に超音波断層装置を用いて卵巣の反応を
観察した。

Ｂ：市販の卵胞刺激ホルモン（アントリン、デンカ製薬
）４■ずつを性周期の９日目から１日２回、４日間連続
して計８回投与した。初回の投与から起算して４８時間
後と６０時間後にＰＧＦ２αを１５■ずつ頚部筋肉内に
注射し、発情を誘起した。発情発現後７日目に超音波断
層装置を用いて卵巣の反応を観察した。

Ｃ：アントリン３０■を性周期の９日目に頚部皮下に全
量を１回投与した。その４８時間後と６０時間後にＰＧ
Ｆ、αを１５■ずつ頚部筋肉内に注射し、発情を誘起し
た。発情発現後７日目に超音波断層装置を用いて卵巣の
反応を観察した。

２）結果供試牛４頭（Ａ、Ａ、Ｂ、Ｃ）の卵巣反応の成績を表２
に示した。Ａの２頭は１回の投与で十分過剰排卵の効果
が得られるのに対し、Ｂは投与に手間が掛かりすぎ、ま
たＣは効果が非常に小さい。

表２

Claims

【特許請求の範囲】

卵胞刺激ホルモンを含有することを特徴とするリポソー
ム製剤。