JPH03277275A - 新規酵素及びその酵素を用いた配糖体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はステビア属植物より得られる新規酵素及び医薬
品その他で重要な生理活性又は物性を有する配糖体の新
規な製造法に関する。

（従来の技術） ステビア属に属する植物は１５４種以上あることが知ら
れているがその中の１種であるステビア・レバウディア
ナ・ベルトニーは特に甘味を有するステビオサイドやレ
バウデイオサイドＡ等の配糖体を著量に生産するので現
在天然甘味料の原料として栽培されている。これら甘味
成分はいずれもステビオール骨格をアグリコンとした配
糖体である。このことよりステビア・レバウディアナ・
ベルトニーの中には糖転移酵素の存在が推察されている
。

しかし、これまでその酵素を取り出して、性質を明らか
にされたこともないし、又それを利用して配糖体を製造
する試みもまったくなされていない。

（本発明が解決しようとする課Ｍ） 本発明は、ステビア属植物特にステビア・レバウディア
ナ・ベルトニーに存在する新規な糖転移酵素及びそれを
利用した新規な配糖体の製造方法を提供することである
。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、ス
テビア属植物より以下の性質を有する糖転移酵素（Ｉ）
（以下Ｅｎｚ■という）及び糖転移酵素（■戸以下Ｅｎ
ｚＩ［という）、並びにこれらを用いて配糖体を製造す
る方法である。　　以下、本発明の構成について詳細に
説明する。

（構成） ここで用いるステビア属植物としては、例えばステビア
レバウディアナ　ベルトニー（ＳＴＥＶＩＡ　　ｒｅｂ
ａｖｄｉａｎａ　　ＢＥＲＴＯＮＩ）、ステビア　ロン
ビフォリア（ＳＴＥＶＩＡ　　ｒｈｏｍｂｉｆｏｌｉａ
）、ステビア　サツレイネフォリア（ＳＴＥＶＩＡ　　
５ａｔｕｒｅｉｎｅｆ。

１ｉａ）等があけられる。この中で、特にステビア　レ
バウディアナ　ベルトニ〜が甘味成分を生産する目的で
大量に栽培されていること、及び原料入手の点から最も
好ましい、勿論その中のステビオール配糖体の含量及び
組成比を限定するものではない。

ＥｎｚＩとは以下の性質を有するものである。

（ＥｎｚＩの酵素的性質〕 ■作用及び基質特異性 主としてウリジン−５−〜ジフオスフオグルコース（以
下ＵＤＰＧという）を糖の供与体とし、アグリコンにグ
ルコースを転移する。

この場合のアグリコンはステビオール骨格を有するもの
として、ステビオール、ステビオールモノサイドかあげ
られる。又アントシアン合成系の例えばフラボノイド類
やキノン類もアグリコンとなる。

■至適ｐＨ 本酵素の至適ＰＨは７．０〜８．０である■作用至適温
度 ４０℃。

■熱安定性 ４０℃以上で失活する。

■阻害 ウリジン−５′−シフオスフェート（以下ＵＤＰという
）及びアンモニウムイオンにより阻害される。

■分子量 約６万である。

又ＥｎｚＩＩとは以下の性質を有するものである。

［ＥｎｚＩ［の酵素的性質〕 ■作用ｎび基＃′″”性 主としてＵＤＰＧを糖の供与体としてアグリコンにグル
コースを転移する。この場合のアグリコンはステビオー
ル骨格を有するものとして、ルプソサイド、ステビオー
ルバイオサイド、ステビオサイドがある。又長鎖アルコ
ールもアグリコンとなり、例えばヘキシルアルコール、
オクチルアルコール、デシルアルコールがある。

■至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは７．０〜８．０である。

■作用至適温度 ４０℃である。

■熱安定性 ４０℃以上で失活する。

■阻害 ＵＤＰ及びアンモニウムイオンで阻害。

■分子量 約６万である。

ステビア属植物よりこれらの酵素を取り出す方法は植物
体またはカルスより常用の手法を用いて行うことができ
る０例えば、ステビア葉の生葉その凍結されたもの、又
はカルスの適量に２〜１０倍量好ましくは３〜５倍量の
緩衝液を加えるが、そこに酵素の失活を防ぐ目的で適当
な金属塩やキレート剤または還元剤を適当量加えても良
い、これをミキサーなどで数分間磨砕し、濾過及び遠心
分離をおこなって透明な酵素液を得る。

これに硫酸アンモニウムで３０−７５％飽和として濃縮
し、透析により脱塩する。更にセファデックスＧ−２５
でゲル濾過して得られたものを粗酵素液とし、ＤＥＡＥ
Ｉ−ヨパールを用いてカラムクロマトを行う、このとき
カラムを素通りした画分をＥｎｚＩとし、約０．１５Ｍ
のＫＣＩで溶出される画分をＥｎｚＩＩとして両酵素が
得られる。又本酵素を用いて反応を行うには適当な緩衝
液にアグリコンとすべき基質を加え、グルコース供与体
としてＵＤＰＧを加えるが、この場合、生成物の確認を
容易に行うためにＵ　Ｄ　Ｐ　−”Ｃグルコースを用い
る。この組成液に酵素標品を添加し、１５℃〜６０℃好
ましくは２５°Ｃ〜４０℃、ｐＨ６，０〜９．０好まし
くはｐＨ７，０〜８．０で反応させればよい４反応生成
物の同定は、ラジオ液体クロマトグラフィー及びオート
ラジオグラフィーによっておこない得る。

（実施例） 以下に実施例を挙げてより詳細に説明する。

実施例１　影ｌ互上二Ｍ 凍結しておいたステビア葉に、５％ポリビニルポリピロ
リドン（ＰＶＰＰ）と１％イソアスコルビン酸ナトリウ
ムを加え、４倍量の５ｎｌｌＥＤＴ八と２０１Ｈの２−
メルカプトエタノールを含有する０、２Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液、（ｐＨ７，５）と共にミキサーで合計３分間
磨砕した。布で沢過した後、２０．００００　Ｘｌｌ　
２０分の遠心で得た上澄液を硫酸アンモニウム３０−７
５％飽和でタンパク質を濃縮し、ｌ　１ＨＥＤＴＡと１
０１２−メルカプトエタノールを含む５０１Ｈリン酸カ
リウム緩衝液、（ｐＨ７，５）に対して一晩透析後、生
成した沈澱物を遠心で除き、まだ混在しているステビオ
サイド類を更に除くために上記の緩衝液で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５でゲル７濾過して溶出されたタン
パク画分を粗酵素液とした（可溶性粗酵素）、この可溶
性粗酵素画分を更に１　ｎ＋ＨＥＤＴＡと１（ｌｎＨ２
−メルカプトエタノールを含む５０ｎＨリン酸カリウム
緩衝液、（ｐＨ７，５＞で平衡化しておいたＯＥ＾［−
トヨパールのカラムにかけ、吸着されない両分はステビ
オールを基質としてＵＤＰＧよりυＤＰを遊離した。

即ちＥｎｚＩを得ることができた。（第１図参照実施例
２　乱ｌ互１９ＩＩ 実施例１で得られた可溶性粗酵素をこれも実施例１と同
様の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−）ヨバールのカラム
にかけ、吸着された画分のうちおよそ０、１５８のＫＣ
Ｉで溶出される両分は、ステビオールバイオサイドを基
質としてｔｌＤＰＧよりＩＪＤＰを遊離することが確認
された。即ちＥｎｚｌＩを得ることができた。（第１図
参照） 標準的な反応混液として、Ｏ，ｉＨトリス塩酸緩衝液、
ＥＩＨ７，５，１０−４０μＨのステビオサイド類（ス
テビオール、ステビオールモノサイド、ルプソサイド、
ステビオールバイオサイド、ステビオサイド、レバウデ
イオサイドＡ）、グルコース供与体として１−２μＨの
ｔｌＤＰ−”Ｃグルコース（０，０５−１μＣｉ　）　
、更にＥｎｚＩまたはＥｎｚｌＩを添加し、全量０．２
５ｍ１として３５゛Ｃで反応させた反応結果は表−１の
とおりであるが、 ステビオ ール誘導体をアグリコンとしたＥｎｚＩ、Ｅｎｚ■の反
応を示したものである。この表からＥｎｚＩはステビオ
ールに特異的に作用しステビオールモノサイドとも反応
した。一方Ｅｎｚ［はステビオールバイオサイドを最良
の基質とし、ルプソサイドやステビオサイドとも反応す
ることが認められる。尚このときの反応の確認は、ＵＤ
ＰＧやグルコースがブタノールにほとんど溶解しない性
質を利用して、予めＵＤＰＧを含む水で飽和させておい
たブタノールで分液させて未反応のＵＤＰＧをのぞいた
ブタノール層について、ステビオサイド類に取り込まれ
た１４Ｃを液体シンチレーションカウンター（アロカ社
製　ＬＳＣ−７００）で測定した。

（２）ｌ巖り上 ＥｎｚＩとＥｎｚＩＩの至適ｐＨは第２図に示した様に
最５１！ｌｐＨはどちらもｐＨ７−８の範囲にあった。

尚反応条件は、ＥｎｚＩでは基質としてステビオールを
用い、Ｅｎｚ［ではステビオールバイオサイドを用い１
−２時間反応後液体シンチレーションカウンターにより
測定した。

（３）作用至適温度 ＥｎｚＪとＥｎｚｌｌの作用至適温度は表−２に示した
。

表−２ この表から４０℃で最大の活性を示すことが認められる
。

（４）熱安定性 表−２から２０．３０，４０，５０°Ｃで３０分間保温
した後、４０°Ｃで１時間反応させたところ予備保温温
度４０℃までは活性の低下は認められなかったが、５０
°Ｃでは８０％失活したことが認められる。

（５〉阻害 ＥｎｚＩとＥｎｚＩＩの阻害物質の検討を表−３に示し
た。

両者ともＵＤＰとアンモニウムイオンにより阻害される
ことが示された。

（６）分子量 ＧＰＣカラムを用いた高速液体クロマトクラフィーによ
り測定したところ、ＥｎｚＩ及び■とも約６万という値
を得た。

実施例４　　ＥｎｚＩを用いた　　体の　造反応混液は
実施例３の（１）で用いた方法と同様に行った。ステビ
オサイド類をアグリコンとした場合の反応生成物である
配糖体の確認は標準物質を指標としたオートラジオグラ
フィー及びラジオスキャナー（ベルホールド社製　トレ
ースマスターズ　ＬＢ−７８５）で１４０の分布を分析
することにより行った。又標準物質のないものについて
は、アグリコンに取り込まれた１４Ｃグルコースを液体
シンチレーションカウンターにより測定して確認しな。

（１）ステビオールからの　　体の製造第３図に示した
ようにステビオールとＵＤＰＧを基質としてＥｎｚ　工
を作用させた場合の生成物はステビオールモノサイドで
あることが確認された。

表−４はステビオール誘導体にＥｎｚＩを反応された結
果を示すが、この表からステビオールの１３位の水酸基
をメチル化した基質では１４Ｃの取り込みがないことよ
り、得られた生成物はステビオール１３−０−モノサイ
ド（Ｓｔｅｖｉｏｌ　１３−Ｏ−ｎｏ−ｎｏｓ＋ｄｅ）
であることが認められる。

（２）ステビオールモノサイドからの　糖　の製造 ステビオール１３−〇モノサイドとＵ［ｌＰＧを基質と
した場合の生成物は第３図に示したようにステビオール
バイオサイドである。

（３）クエルセチンからの　　体の　造表−５はその他
のアグリコンにＥｎｚＩ、ＥｎｚＩＩを反応させた結果
を示している。

この表からクエルセチンとＵＤＰＧを基質として反応さ
せたとき、ＥｎｚＩは高い活性を示し、クエルセチンに
グルコースが取り込まれ配糖体が生成されていることが
ｉｉ！認された。

（４）ケンフェロールからの　糖体の　造ｔた、ケンフ
ェロールとＵＤＰＧを基質として反応させたとき、表−
５に示したようにアグリコンへのグルコースの取り込み
が確認され、配糖体が生成したことを示した。

（５）ハイドロキノンからの　糖　の ハイドロキノンとＵＤＰＧを基質として反応させたとき
、表−５に示したようにアグリコンへのグルコースの取
り込みが確認され、配糖体が生成したことを示した。

実施例５　　ＥｎｚＩＩを　いた　糖　の製゛６反応混
液は実施例３の（１）で用いたのと同様の方法で行った
。ステビオサイド類をアグリコンとした場合の反応生成
物の確認は標準物質を指標としてオートラジオグラフィ
ー及びラジオスキャナーで行い、標準物質のないものに
ついては、アグリコンに取り込まれた１４Ｃグルコース
を液体シンチレーションカウンターで測定することによ
り確認した。

（１）ステビオールバイオサイドがらの　　　の１童 ステビオールバイオサイドとＵＤＰＧを基質としてＥｎ
ｚｌＩを作用させた場合の生成物は第３図に示したよう
にステビオサイドであることが確認された。

（２）ステビオサイドからの　　　の　遺ステビオサイ
ドとＩＩＤＰＧを、基質として反応させた時、第３図に
示したようにレバウデイオサイドＡが生成物であること
が確認された。

（３）ｎ−オフ　ルアルコールからの　　　め達 ノルマルオクチルアルコール（ｎ−Ｏｃｔｙｌ　ａｌｃ
ｈｏ−１）とＩＩＤＰＧを基質として反応させたとき表
−５に示したようにアグリコンペのグルコースの取り込
みが確認され、配糖体が生成したことを示した。

（４）イソオクチルアルコールからの　　　の１逍 イソオクチルアルコール（ｓｅｃ−Ｏｃｔｙｌ　ａｌｃ
ｈｏｌ）と１１０ＰＧを基質として反応させたとき表−
５に示したようにアグリコンペのグルコースの取り込み
が確認され、配糖体が生成したことを示した。

（発明の効果） 本発明により、初めてステビア属植物より新規な糖転移
酵素かえられるとともに、その諸性質を明らかにするこ
とができ、又本酵素を用いて医薬品その他で重要な生理
活性または物性をしめす配糖体を得る方法が提供された
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩ）ＥＡＥ−トヨバールを用いたカラムクロマ
トグラフィーでのＥｎｚ　ＩとＥｎｚＩＩの溶出パター
ンを、第２図はＥｎｚＩとＥｎｚＩＩの作用ＰＨを、そ
して第３図は姓下段に示した糖受容体との反応生成物を
薄層で展開させラジオスキャナーで１４０の分布を見た
ものである。Ａ〜Ｆにはそれぞれの異なる糖受容体での
反応を示し、Ｆの反応液ではＥｎｚＩを使用し、その他
はＥｎｚ■を用いた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ステビア属植物より得られる下記の性質を有する糖
   転移酵素（ I ）。 ［１］作用及び基質特異性 主としてウリジン−５＾−−ジフォスフォ グルコースを糖の供与体としてアグリコン にグルコースを転移する。 ステビオールをアグリコンとした時、ステ ビオールモノサイドを生成し、ステビオー ルモノサイドをアグリコンとして、ステビ オールバイオサイドを生成する。 ［２］至適ｐＨ 至適ｐＨは７．０〜８．０である。 ［３］件用至適温度 ４０℃。 ［４］熱安定性 ４０℃以上で失活する。 ［５］阻害 ウリジン−５＾−−ジフォスフェート及びアンモニウム
   イオンにより阻害される。 ［６］分子量 約６万。 ２、ステビア属植物より得られる下記の性質を有する糖
   転移酵素（II）。 ［１］作用及び基質特異性 主としてウリジン−５＾−−ジフォスフォ グルコースを糖の供与体としてアグリコン にグルコースを転移する。 ステビオールバイオサイドをアグリコンと したとき、ステビオサイドを生成し、ステ ビオサイドをアグリコンとして、レバウデ ィオサイドＡを生成する。 ［２］至適ｐＨ 至適ｐＨは７．０〜８．０である。 ［３］件用至適温度 ４０℃。 ［４］熱安定性 ４０℃以上で失活する。 ［５］阻害 ウリジン−５＾−−ジフォスフェート及びアンモニウム
   イオンで阻害される。 ［６］分子量 約６万。 ３、糖転移酵素（ I ）又は糖転移酵素（II）をアグリ
   コンに作用させることを特徴とする配糖体の製造方法。 ４、糖転移酵素（ I ）を作用させて得られる配糖体が
   フェノール糖化合物である請求項３、記載の配糖体の製
   造方法。 ５、糖転移酵素（II）を作用させて得られる配糖体が長
   鎖の糖アルコールである請求項３、記載の配糖体の製造
   方法。 ６、フェノール糖化合物が、アントンアン糖化合物又は
   キノン糖化合物である請求項３、又は４、記載の配糖体
   の製造方法。