JPH03277276A - 新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規なβ−ガラクトシル基転移酵票、その製
造法及びその用途に関するものであり、さらに詳しくは
、サツカロポリスボラ属等の放線菌に属する微生物が生
産し、高い熱安定性を有する新規なβ−ガラクトシル基
転移Ｎ素およびその製造法並びにその利用法に関する。

［従来の技術］ 糖や配糖体を更に糖で修飾することにより、それらの糖
や配糖体（以下、「糖類」と略称する）に新たな生理活
性や物性を付与できることが知られている０例えば、甘
味度を増加させたり、苦味を緩和あるいは消去したり、
水に対する溶解度の低い配糖体（漢方薬の有効成分等に
その例が見られる）の水溶性を高めたり、生体内安定性
や腸管吸収性を増加させたりする作用が知られている。

糖の修飾により付与される機能やその程度は、用いられ
る糖および修飾される糖類の種類によって異なるが、糖
類をガラクトシル基でｇ飾することによって、上述の目
的に対して好ましい効果を得られる例が多く報告されて
おり、これに基づき様々な機能性オリゴ糖や機能性配糖
体が開発されてきた。

例えば次の式 ％式％ （式中、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｘは糖類若しく
は配糖体を示し、ｍは整数である）で表されるオリゴ糖
またはＷＭ修飾配糖体において、Ｘがグルコース残基（
Ｇｌｕ）　、ｍが０〜４の整数であるオリゴＩＮ（ガラ
クトオリゴ糖）は善玉腸内細菌であるビフィズス菌の増
殖促進性物質として知られ（特開昭　５５−１０４８８
５号）、またその優れた甘味度、甘味質、難う触性、低
カロリー性、加工安定性、保湿性、水分活性低下能、着
色性などにより、食品素材として幅広く利用されつつあ
る。

また、蔗糖のガラクトシル化により、前記式においてＸ
がシュークロース、ｍが０であるガラクトシルシューク
ロース（特開昭６４−８５０９０号）が、また、ラクチ
ュロースのガラクトシル化により、前記式中、Ｘがラク
チュロース、ｍが０であるガラクトシルラクチュロース
（特開昭　６３−９４９８７号′）がそれぞれ得られ、
これらもガラクトオリゴ等と同様、新しい機能性食品素
材として利用されつつある。更に、せ昧配糖体ルブソシ
ドについては、そのガラクトシル化により甘味度、甘味
質の改善が達成されている　（Ａｒｇｉｃ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、　５３．２９２３−２９２８．１９８９
）。

以上のように、糖類にガラクトシル基あるいはオリゴガ
ラクトシル基を付加させ、ガラクトシル基付加物を製造
するには、β−ガラクトシダーゼのガラクトシル基転移
反応が利用されている。

この反応は、高濃度のβ−ガラクトピラノシド（例えば
ラクトース）の存在下、いくつかのβ−ガラクトシダー
ゼが、糖（あるいは配糖体の糖部分）へのβ−Ｄ−ガラ
クトシル基転移反応を触媒するという事実に基づいてい
る。

酵素のβ−Ｄ−ガラクトシル基転移能の高さは、その起
源によって様々であり、効率良く反応を進めるためには
、高い転移能を持つβ−ガラクトシダーゼを用いる必要
があった。

従来用いられているβ−ガラクトシダーゼの例としては
、糸状菌アスペルギルス・オリゼー（ρ５ｐｅｒｒｌｉ
／１ｒｔ５　ｏｒｊｌｌｌｅ、特公昭５５−１０４８８
５号）、細菌バチルス・サーキュランス（Ｉｔｉｃｉｌ
／ｌｒｓ　ｃｉｒｃｕ／ａｒｔｓ、特公昭６２−２０９
７８０号）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（５
１ｒｅｐｌｏｃｏｃｃｔｔｓ　ｌ／ｒｅｒｚｏｐｈｉ／
ｕｓ。

Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｗ、　１０．１９５−２０４．（１９
８３））起源の酵素があり、これらの酵素をラクトース
に作用させることにより、実際にガラクトオリゴ糟が製
造されている。　また、β−ガラクトシダーゼ活性をも
つ酵母菌体の例としては、リボマイセス（ｌ　１ｐｏｚ
）ｔｃｅｓ　）　、ロドトルラ（ｔｉｈｏｄｏｔｒｔｔ
ｔｚ　）　、シロバシディウム（５ｔｒａｉｔｓｔｉｔ
ｌａｓ＞−ステリグマドマイセス（５１ｅｒｔ’ｇｕｚ
ｚｔｏａ／ｃ＃ｓ、　　日本農芸化学会誌、６３巻、３
号、６２９ページ、１９８９年）、スポロボロマイセス
　（５ｐｏｒｏｂｏｒｏｚｐｃｅｓ　。

特公昭６２−２０８２９３号）、クリプトコツカス（Ｃ
ｒｐｐｔｏｃｏｃｃｔｔｓ、　　特公昭６０−２５１８
９６号、特公昭６２−１３０６９５号、特公昭６１−２
３６７９０号）、クリベロマイセス（Ｋ／ｕ）ｔｖｅｒ
ｏＢｔｃｔｔｓ、特公昭６１−２７１９９９号）などが
知られており、これらを利用するガラクトオリゴ糖の製
造も試みられている。

通常、β−Ｄ−ガラクトシル基の供与体としては、ラク
トースを用いるのが産業上もっとも有利である。ラクト
ースは牛乳中に多量に含まれ、また、海外において酪農
廃棄物として多量に産出され、原料としてはもっとも安
価であるからである。ちなみに、β−ガラクトシダーゼ
を用いた乳糖分解乳の製造が既に実用化されていること
（フードケミカル、第７巻、３８−４４、（１９８６）
　）を背景として、転移活性の高いβ−ガラクトシダー
ゼを用いたガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法が近年
報告された（特開平１−１６８２３４号）。

［発明が解決しようとする課題］ ところで、−ａに糖転移反応は、糖供与体（ここではラ
クトース）の濃度が高いほど速やかにかつ収率良く進行
する。そして、このためには反応溶液中のラクトースの
濃度を上げれば良いのであるが、高濃度のラクトース溶
液は、常温では粘度が高いうえに結晶が析出しやすく、
製造工程上での取り扱いが困難であるという問題があっ
た。

そこで、反応系の温度を上げて（例えば、６０″Ｃ以上
ン、ラクトースの析出を押さえ、粘度を低下させること
が求められていた。

また、溶解度を上げることにより単位体積当たりの反応
物（ラクトース等）の仕込み量を多くすればコスト的に
も有利であり、しかも化学反応は温度が高いほど早く進
行するので、反応系の温度を上げることによって、＃素
反応速度を大きくし反応時間を短縮化することも可能と
なる。　更に、反応温度の高温化によって雑菌が成育し
にくなり、また、高温によって達成される高濃度糖の高
い浸透圧による静菌作用が働き、製造工程の雑菌汚染防
止にも役立つことが予想される。

このように、高温によるがラク゛トシル基転移反応は利
点が多いのであるが、このように高温で反応を行なうた
めには、酵素に高い熱安定性が要求される。更に、上記
反応を工業的に有利に利用するためには、付加物の量産
化と製造コストの低減化のために、酵素を固定化し、反
応工程を自動化、連続化することが求められている。

一般に、β−ガラクトシダーゼは高濃度のラクトースに
よｒ）官憲化されるが、これを固定化して、高温で長期
間にわたり縁り近し使用するためには、さらに高度な耐
熱性が要求される。　しかし、前述の糸状菌アスペルギ
ルス・オリゼー、細菌バチルス・サーキュランス、スト
レプトコッカス・サーモフィラス起源の酵素、あるいは
りボマイセス、ロドトルラ、シロバシディウム、スポロ
ボロマイセス、クリプトコツカス、クリベロマイセスな
どのβ−ガラクトシダーゼ活性をもつ酵母菌体は、熱安
定性が必ずしも高くなく、高温での繰り返し使用には適
切ではない。

一方、熱安定性を有し、しかも高温繰り返し使用に耐え
うるβ−ガラクトシダーゼとしては、ペシロマイセス　
（Ｐｚｅｃｉｌｏａｙｃｅｓｖｚｒ；ａｔｌ）の酵素（
Ａｐｐｌ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　２７．３８３−３８８．１９
８８　）が知られているが、この酵素の反応最通ｐＨは
３．５であって、例えば牛乳（ｐＨ７付近）中のラクト
ースを利用する製造工程には不適当であった。

したがって、実際の高温酵素反応に適する酵素の提供が
求められていた。

［ｆｆ！！９！を解決するための手段］本発明者らは、
高いβ−Ｄ−ガラクトシル基転移能ならびに高い熱安定
性をもち、中性域で作用しうる酵素を自然界より探索し
た結果、放線菌に属する微生物、特にサツカロポリスボ
ラ　（５ｚｃｃｈｉｒｏｐｏｌｐｓｐａｒｚ）　、サー
モモノスポラ（Ｉｈｅｒａｏｚｏｎａｓｐｏｒｚ　）ま
たはサーモアクチノマイセス　（Ｉｈｅｒｚａｉｃｔｉ
ｎｏａｙｃｅｓ　）に属する菌株中に上記の目的にかな
うβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するものがあるこ
とを見いだした。

そして、これらの菌株を液体培養または固体培養するこ
とによりβ−ガラクトシル基転移酵素を生産させ、これ
を必要に即して精製純化あるいは固定化することにより
、−ａ式（） ％式％） （式中、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｘは糖類若しく
は配糖体を示し、ｎｌ、ｔＯ−４の整数である） で示されるオリゴ環あるいは糖峰飾配糖体の製造に利用
することができることを見出した。

即ち、本発明は、新規なβ−ガラクトシル基転移酵素、
該酵素の製造法、および該酵素の利用法を提供するもの
であ石。

本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素は、放線菌に属す
る微生物、特にサツカロポリスボラ、サーモモノスポラ
、サーモアクチノマイセス等に属する菌株の培養物から
得ることができる。

本発明者らは、前記したように、高い熱安定性を有し、
中性域で作用しうるβ−ガラクトシル基転移酵素生産菌
を自然界より探索した結果、上記に属する菌株中に目的
とするβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するものが存
在することを見いだしてお、ワ、その中でも特に石川系
の牧草地土壌から分離したサツカロポリスボラに属する
菌株、ＳＡＭ１４００株が、目的とするβ−ガラクトシ
ル基転移酵素をとりわけ多量に生産している。

そこで、本発明において用いることができるβ−ガラク
トシル基転移酵素産生菌の代表例として、微生物ＳＡＭ
　　１４００株をあげ、その菌学的特徴を以下に述べる
。

菌　　学　　的　　特　　徴　　： （１）形態学的所見 ＳＡＭ　　１４００株は、直径０．４〜０．８μｍの基
底菌糸および気中菌糸を形成する。

基底菌糸は分岐し、まれに分断が認められる。

気中菌糸は分岐し、その先端に３ないし７個、まれに１
０個以上の直鎖状の胞子連鎖を形成する。一方、気中菌
糸を形成していない場合でも、基底菌糸において２ない
し６個の胞子鎖を、寒天培地内部、寒天培地表面、およ
び表面より気中に向かって形成する。胞子は球状であり
、その大きさは直径０．８〜１．０μｍで、その表面は
平滑である。胞子嚢、菌糸束、菌核などの構造体は、１
４日培養後も認められなかった。

（２）培養所見（５５°Ｃ１１４日間培養）ショ糖・硝
酸塩寒天培地； 生　　　育　：　　　　貧　　弱 気中菌糸　：　　形成せず 裏面の色調：　　灰黄色 可溶性色素：　　な　し グルコース・アスパラギン寒天培地； 生　　　育　：　　　　貢　　弱 気中菌糸　：　　形成せず 裏面の色調：　　灰黄色 可溶性色素：　　な　し グリセリン・アスパラギン寒天培地； 生　　　育　：　　　　良　　好 気中菌糸　：　　形成せず 裏面の色調：Ｗｌ黄色 可溶性色素：　　な　し スターチ・無機塩培地： 生　育：　貧弱 気中菌糸　：　　形成せず 裏面の色調：　　黄　色 可溶性色素：　　な　し チロシン・寒天培地； 生　　　育　：　　　　良　　好 気中菌糸　：　　形成せず 裏面の色調：　　灰黄色 可溶性色素：　　な　し 栄養寒天培地； 生　　　育　：　　　　良　　好 気中菌糸　：　　かすか 裏面の色調：　　黄　色 可溶性色素：　　な　し ｎ母エキス・麦芽エキス寒天培地； 生　　　育　：　　　　良　　好 気中菌糸　：　　貧弱、白色 裏面の色調：　　黄褐色 可溶性色素：　　な　し オートミール寒天培地； 生　　　育　：　　　　良　　好 気中菌糸　：　　形成せず 裏面の色調：　　黄　色 可溶性色素：　　な　し ＮａＣ１寒天培地１ 生　　　育　：　　　　良　　好 気中菌糸　：　　豊富、白色 裏面の色調：　　黄　色 可溶性色素：　　な　　し １１０％　ＮａＣ１を含むトリブチケースソイブロス（
ＢＢＬ）　＋２％寒天培地 （３）生理学的所見 ■生育温度範囲 １％グルコースを含む栄養寒天培地で、５０℃、５５“
Ｃ２６５℃での生育が認められ、トリプチケースソイブ
ロス（ＢＢＬ）＋２％寒天培地で、３０°Ｃ１３７℃で
の生育が認められた。最適生育温度は５０〜５５℃と思
われた。

■ゼラチンの液化（５５°Ｃ） ゼラチン液化試験用培地のいずれにおいても、生育が認
められなかった・ ■スターチの加水分解：　　　陰　性 ■脱脂乳の凝固：　　　　　　陰　性 ■脱脂乳のペプトン化：　　　陰　性 ■メラニン様色素の生成 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地二 陰　　性８ チロシン寒天培地：　　　　　陰　性 トリプトン・酵母エキス寒天培地： 陰性 ネ：　培地の底に、薄褐色の色素の沈降が見られる。

硝酸塩の還元＝ １０％ＮａＣ１耐性ニ ゲアニンの分解： エラスチンの分解： 陽性 陽　　性 陽　　性 陰性 ■キサンチンの分解：　　　　陽　性 ＠ヒボキサンチンの分Ｍ：　　陽　性 ■炭素源の利用性（ブリドハム・ゴトリーブ寒天培地、
５５℃、１７日間培養）：Ｄ−グルコース　　　＋ Ｄ−キシロース　　　＋ ラクトース　　　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　士 Ｌ−アラビノース　　士 Ｄ−フルクトース　　＋ ラフィノース Ｄ−マンニトール　　＋ イノシトール　　　　＋ シュクロース ただし、＋；利用する、±；利用するかどうか髪わしい
、−；利用しない。

（４）化学分類学的性質 （ａ）２．６−ジアミノピメリン酸 全菌体を、スタネック（Ｓｔａｎｅｃｋ、Ｊ、Ｌ、　）
およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｇ、Ｄ、　）の方法
（アプライドマイクロバイオロジー （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、　２
８巻、２２６ベーシ、　１９７４年）に準拠して調べた
結果、メソ−２，６−ジアミツビメリン酸の存在が認め
られた。

（ｂ）　　ｔｍ 全菌体の加水分解物中に、アラビノースとガラクトース
の存在が認められた。

（ｃ）　　キノン系 ＭＫ−９（Ｈ４）を主成分として有し、そのほかにＭＫ
−９（Ｈ６）　、ＭＫ−９（Ｈ８）、ＭＫ−１０（Ｈ４
）、ＭＫ−１０（Ｈ６）、ＭＫ−１０（Ｈ８）、 ＭＫ−１０（ＨＩＯ）を有していた。

（ｄ）　　リン脂質タイプ フォスファチジルコリン、フオスファチジルグリセロー
ルを含む。これは、ルシェバリｘ　　Ｍ、Ｐ、　（Ｌｅ
ｃｈｅｖａｌｉｅｒ、　Ｎ、　Ｐ、ンおよびＨ，Ａ、ル
シエバリエ（Ｈ，Ａ。

Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ）　　（Ａ、　Ｄｉｅｔｚ　ａ
ｎｄ　Ｄ、　Ｗ。

Ｔｈａｙｅｒ　（編）、アクチノマイセート　タフソノ
ミー（Ａｃｔｉｎｏｓｙｃｅｔｅ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ）
、２２７２９１頁、１９８０年）によるＰ−ＩＩＩタイ
プに属する。

（ｅ）　　ミコール酸 菌体内にミコール酸を含まない。

これらの結果から、ＳＡＭ　　１４００株の細胞壁は、
メソ−２，６−ジアミツビメリン酸とガラクトース、ア
ラビノースを含む、ＩＶ−Ａタイプと判断される。

形態的特徴としては、ＳＡＭ１４００株は気中菌糸を形
成し、分岐して平滑な球状の胞子を連鎖上に着生する。

胞子の連鎖は短く、その数は３〜７個が普通で、まれに
１０個以上の胞子連鎖も認められる。その一方で、気中
菌糸の形成が認められないときには、基底菌糸において
、胞子連鎖の形成が認められた。これは、基底菌糸から
短い胞子柄（認められない場合もある）の先に２〜６個
の平滑な球状の胞子が寒天培地表面より上に向かつて連
鎖するものである。キノン系はＭＫ−９（Ｈ４）を主成
分として有し、リン脂質タイプはＰ−ＩＩＩで、ミコー
ル酸を含まない。グアニン、ヒボキサンチン、キサンチ
ンを分解し、エラスチンを分解せず、３０〜６５℃で生
育し、１０％　Ｎ　ａ　Ｃ１ｊ：耐性を示す。

以上の菌学的性質より、Ｓ、Ｔ、ウィリアムス（Ｓ、Ｔ
、Ｗｉｌｌｉａａｓ　）編の、パージエイズ　マニュア
ル　オブ　システマティック　バクテリオロジー、第４
巻、１９８９年（Ｗｉｌｌｉａｗｓ。

Ｓ、Ｔ、（ｅｄ、）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｓａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、　ｖｏ１４．１９８９）に従って、本菌株の分類学
的位置を求めたところ、ＳＡλ（１４００株はファエニ
ア・レクチヴイルグラ（Ｆｌｅｎｉｚ　ｒｅｃｔｔｒｔ
ｒｌｌｕｌｇ）に属する放線菌であることが判明した。

そこで、Ｆ、レクチヴイルグラ（Ｆ。

ｒｅｃｔｉｖｉｒｇｕｌｚ　）の基準菌株と同種と同定
された菌株２株を入手し、ＳＡＭ　　１４００株と培養
性状、 生理的性状及びキノン系の比較状 験を行った。

その結果を第１表に示す。

（ 以 下 余 白 ） 第１表に示すようにＳＡＭＬ４００株とＦ。

レクチヴイルグラの基準法を含む３株は、非常に良く一
致する菌学的性質を示した。

以上のことから、本発明者らはＳＡＭ １４００株をＦ、レクチヴイルグラであると同定した。

　しかしながら、コーンーウエンデッシュ（Ｋｏｒｎ−
Ｗｅｎｄｉｓｃｈ　）ら（インターナテヨナルジャーナ
ルオブシステマテイツクハクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）３９巻、４３０
−４４１頁、１９８９年）は、菌体脂肪酸組成、キノン
系、リン脂質タイプ等の化学分類学的性質によって、フ
ァエニア属はサツカロポリスボラ属と同一であるとし、
Ｆ、レクチヴイルグラをサツカロポリスボラ属に移し、
新組合せ、サツカロポリスボラ・レクチヴイルグラ（５
ｚｃｃｈｚｒ。

ｐａｌｙｓｐｏｒｉｔ　ｒｅｃｌｉｙｉｒｇｔｔｌｚ）
を提唱している。

そこで、本発明者らは、コーンーウエンデッシュら（イ
ンターナテヨナル　ジャーナルオブ　システマテイック
　バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｔｏｎａｌ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ’　）３９巻、４３０−４４１頁、
１９８９年）に従い、本菌株をサツカロポリスボラ・レ
クチヴイルグラと同定した。

なお、ＳＡＭ　　１４００株は、サツカロポリスボラ・
レクチヴイルグラ　ＳＡＭ ｌ　　４　０　０　　（Ｓｚｃｃｈｚｒｅｔｐｏ／ｙｓ
ｐｏｒｚ　　ｒｇｃｌｔ’ｖｉｒｇｕｌｉＳＡに１４０
０　）と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に
、受託番号微工研条寄第２７６８号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
２７６８）として寄託されている。

また、他の属に属する本発明の新規β−ガラクトシル基
転移酵素産生微生物の例としては、サーモアクチノマイ
セス　ｓｐ、ＳＡＭｌ　５４４　（Ｉｈｅｒｚｏｚｃｔ
ｉｎｏｚｐｃｅｓ　　ｓｐ、　　ＳＡＭ１５４４）、サ
ーモアクチノマイセス　ｓｐ。

Ｓ　　ＡＭ　　　１　５　４　５　　（Ｉｈｅｒａｏｚ
ｃｔｉｔｔｏｉりｃｅｓ　　　ｓｐ。

ＳＡＭ　１５４５）　、サーモモノスポラ　ｓｐ、ＳＡ
Ｍｌ　５４６　（Ｉｈｅｒｚｏｚｏｔｔｏｓｐｏｒｚ　
ｓｐ、　ＳＡＭ　１５４６　）、サーモモノスポラ　ｓ
ｐ、ＳＡＭ　　１５４７（１ｈｅｒｚｏｚｏｎｏｓ戸ｏ
ｒｉ　ｓｐ、　ＳＡＭ　１５４７　）等が挙げられる。

これらの微生物も、それぞれ工業技術院微生物工業技術
研究所に、受託番号微工研条寄第２７６９号（ＦＥＲＮ
　ＢＰ−２７６９）、同２７７０号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
２７７０）　、同２７７１号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７７
１’）　、同２７７２号（ＦＥＲＮ８Ｐ−２７７２）と
して寄託されている。

上記各微生物を利用する新規β−ガラクトシル基転移酵
素の製造は、常法にしたがって当該微生物を培地に接種
し、これを培養することにより行なわれる。

各菌株の培養は、通常行なわれている通気撹拌培養、振
盪培養、静置培養等の潜体培養法もしくは固体培養法に
より行なうことができる。

培地は、炭素源として、ラクトース、グルコース、シュ
クロース、デンプンなど、窒素源としてペプトン、酵母
エキス、尿素、硫酸アンモニウム、アミノ酸などを、無
機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化カルシウムなどや、また必要に応じてＭ　ｎ”、　Ｚ
　ｎ’−、Ｎ　ｉ　２−等の微量金属、ヒオチン、チア
ミンなどのビタミン類等を適宜加えたものを用いる。

培養温度は生育できる温度範囲ならとくに限定されない
が、５０°Ｃ付近が望ましい。

また、培養は、２４〜１９２時間程度行なわれる。

かくして得られた培養物から本発明のβ−ガラクトシル
基転移酵素を採取するには、まず遠心分離法や濾過法な
どにより培養物をブロス画分と菌体画分に分画する。β
−ガラクトシル基転移酵素活性画分につき、さらに限外
濾過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点沈殿など周知
の方法を、単独あるいは組み合わせて行なうことにより
、β−ガラクトシル基転移酵素の濃縮あるいは精製標品
を得ることができる。

以上のようにして分離、Ｗｉｌｌされた、本発明のβ−
ガラクトシル基転移畦素のうち、サツカロポリスボラ・
レクチヴイルグラＳＡＭ１４００の産生する酵素の酵素
化学的性質はつぎのとおりである。

酵素化学的性質： （１）作用 転移反応： β−Ｄ−ガラクトピラノシド Ｇａｌ−Ｘ１モルと、ガラクトシル基 受容体Ｙ　１モルとから、あらたなβ −Ｄ−ガラクトピラノシドＧａｌ−Ｙ １モルと、ｘ　１モルを生成する。

ここで、Ｘ、Ｙはいずれも木繊外の 化合物で、糖あるいはアグリコンで ある。

加水分解： １モルのβ−Ｄ−ガラクトピラノシ ドＧａｌ−Ｘを加水分解し、１モルの Ｘと１モルのガラクトースを生成す る。

（２）　ｐＨ安定性 ０、ＯＩＭ！酸緩衝液（ＰＨ３，５−６，５）、０、Ｏ
ＩＭ　　リンＷｌ＊衝液（ｐ）ｆ　６．０−８．０）、
あるいは０．０ＩＭ　ビロリン酸緩衝液（ｐＨ８，０−
９，５）中で５５℃、１５分間インキュベートし、各ｐ
Ｈでの残存活性を測定した結果、ｐＨ５，０以上で安定
であった。

＜３）熱安定性 ０、ＯＩＭ　　リンＭＩＮ衛液（ｐＨ７，２）中にて、
３０〜８０″Ｃで１時間インキュベートし、各温度にお
ける残存活性を測定した結果、６０℃まではほぼ安定で
あった。また１Ｍラクトースを含有する０、ＯＩＭ　　
リンａｌ１面液（ｐ！（７，２）中で、６５℃、２４時
間処理し、残存活性を測定した結果、失活は認められな
かった。

（４）最適ｐ）（ ０，１λイ　リン酸Ｐｉ衝溌（ｐＨ６，０−８，０）に
おける最適ｐＨは７．２であった。

（５）基質特異性ならびにミカエリス定数各種のβ−ガ
ラクトピラノシドおよびその類縁体について、基ｊｉｔ
濃度１０５Ｍにおける加水分解反応を行なった結果を第
２表に示す。

（以下余白） 第 表 基　　　質　（１０ｍＭ） 相対活性 ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−ガラクトピラノシド ｐ−ニトロフェニル−α− Ｄ−ガラクトピラノシド ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−キシロピラノシド ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−グルコピラノシド ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−フルコシド ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−マンノシド ラクトース １００　％ ０　％ 〉　１　％ 〉　１　％ ０　％ ０　％ １６１　％ （６）分子量 ＴＳＫ−Ｇ３０００　５Ｗ−ＸＬカラムを用いた高速液
体ゲルクロマトグラフィー（移動相：　　０．１５８　
ＫＣＩを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２，流速
＋　１．０　ｍｌ／ｇａｉｎ　）により、オリエンタル
酵母社製の各種標準タンパク質との相対溶出保持時間か
ら分子量を求めた結果、本酵素の分子量は１４０，００
０±２０，０００であった。

（７）サブユニット分子量およびサブユニット構造 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により本酵素
のサブユニットの分子量を求めたところ、１４０，００
０±２０，０００であった。ファスト−ゲル（Ｐｈａｓ
ｔ−Ｇｅｌ　）　１ｊｌ気泳動装置を用い、各種標準蛋
白質との相対移動度から求めた。本酵素は単量体と思わ
れる（８）阻害剤 本酵素はＨｇ”、　Ｃｕ　ｓ＋、などの金属イオンおよ
びエチレンジアミン四酢酸により阻害された（第３表）
。

第 表 化 合　　　物 残存活性 ｄＣ１２ ｎＣｌ２ ＣａＣ１□ ａＣ１２ Ｎ　ｉ　Ｃ１２ Ｍｎ　Ｃ１２ ０Ｃ１２ ｅＣ１２ ＣｕＣ１□ ＤＴＡ ２−メルカプトエタノール ＴＮＢ モノヨード酢酸 ９６　％ １２２％ ８７　％ ９６％ ５９％ １０３　％ ９７　％ ８７％ ２８％ ５　％ ９６　％ １０７　％ ６９％ （９）活性測定 ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加
水分解の活性測定は、基質の加水分解により生成するｐ
−ニトロフェノールを分光学的に追跡することにより行
なった。

すなわち、０．ＯＩＭのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドを含有する０、ＯＩＭリンリン酸緩
衝液Ｈ７，２）　　０．６０ｍｌに、０．１ｏ■ｌの酵
素液を加え、４０５ｎ■における吸光度の増加を５５℃
において追跡した。ｐ−ニトロフェノールの生成量（μ
ｍｏ１）を、ｐＨ７，２におけるｐ−ニトロフェノール
の分子吸光係数（ε４゜、＝１．３４　Ｘ　１０’）を
用いて計算により求めた。ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドの加水分解により定義したｊｌ素
１単位（ｐＮＰＧＬりは、１分間に１Ｍ口Ｏ１のｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解
する酵素量である。　ラクトースの加水分解の活性測定
は、基質の分解により生成するグルコースを分光学的に
定量することにより行なつ力。すなわち、０．１Ｍのラ
クトースを含有する０　０　、　Ｉ　Ｍ　　リン酸緩衝
液（ρ）１７．２）　　０．９０ｍ１に、Ｏ，ｌＯａ＋
１の酵素液を加え、５５°Ｃで１０分間反応させ、３３
％トリクロロ酢酸０．０５＠１を加えて反応を停止させ
た。反応停止させた上記反応液０．１ｖｌに、ベーリン
ガーマンハイム社製グルコース定量キット１．０１を加
え、室温で４５分間放置したのち、６６０ｎｅにおける
吸光度を測定した。

ラクトースの加水分解により定義した酵素１単位（ＬＵ
）は、１分間に１μ［０１のラクトースを加水分解する
酵素量である。

本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素は、上記の酵素化
学的諸性質から新規であると判断された。

［実Ｎ例コ 次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例　１ ラクトース　３．０％、アミノサンＶ３（甜菜抽出Ｍ）
１．４％、グルタミン酸１ナトリウム塩０．２％、酵母
エキス　０．１％、リン酸１カリウム０．１％、硫酸マ
グネシウム０．０５％を含有する培地（ｐ）（７，２）
　１００ｗｌずつを５００＋１マイヤーフラスコにいれ
、１２０℃　１気圧にて１５分間オートクレーブ殺菌し
たものに、ＳＡＭ　　１４００株を１白金耳ずつ植菌し
、５５“Ｃにて１２０時間通気撹拌培養した。　培養終
了後、培養物を遠心処理して得た上清２　、２７７を、
１０１Ｍ　リンｒａｅ緩面液（ｐＨ７，２）で平衡化し
たイオン交換樹脂セパビーズ（ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ）　
　ＦＰ−ＤＡ１３カラム（三菱化成製、５ｃｍ　Ｋ　２
０ｃｍ）に負荷し、上記ｌ！衝液、次いで０．３Ｍ塩化
カリウムを含有する上記ｍｉ液でカラムを洗浄後、０．
５Ｍ塩化カリウムを含有する上記ｍ％液にてβ−ガラク
トシル基転移酵素を溶出した。活性画分を限外濾過法に
て濃縮し、１０ｗＭ　ワン酸１衝液（ｐＨ７，２）に対
して透析した。

実１Ｍ例２ 上記透析内液を、１０ｄリン！２緩衝液（ｐＨ７，２）
で平衡化したイオン交換樹脂ＤＥＡＥ−セファロース（
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−６Ｂ（ファ
ルマシア製、２．８Ｃ■Ｘ　２０ｃ■）に負荷し、上記
緩衝液、次いで、０．２Ｍ塩化カリウムを含有する上記
緩衝液にてカラムを洗浄後、０．２Ｍから０　、６　Ｍ
の塩化カリウムの直ｗＡ濃度勾配（総量４００ｍ１　）
をかけることによりβ−ガラクトシル基転移酵素を溶出
した。

活性画分を限外濾過法にて濃縮した後、０．１５Ｍ塩化
カリウムを含む１０■Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で
平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ−ＸＬ　　（東ソ
ー製）に、濃縮液を数回に分けて負荷し、クロマトグラ
フィーを行なった（流速、１．０　ｍｌ／■ｉｎ；　　
検出、２８０ｎ−における吸光度）。　活性画分を限外
濾過法にて濃縮し、１０−に　リン酸１１！！面液（ｐ
Ｈ７，２）に対して透析した。

以上の操作によりえられた精製β−ガラクトシル基転移
酵素の聴話性は２４０　ｐＮＰＧＵ、比活性は１０　ｐ
ＮＰＧＵ／ｓｇであった。

実施例３ ラクトース５ｇを０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）
に溶解して１０−１とし、これに実施例１で得られたβ
−ガラクトシル基転移酵素［品ｔｏｐＮＰＧＵを加え、
６５℃Ｔ４Ｒ間反応させた。反応液を９５°Ｃで５分間
処理して反応を停止させ、１部分を１０倍に希釈してこ
れをショーデックス・イオンバックＫ　Ｓ　８０１カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー（移動相、水；
カラム温度、７０℃：流速、１　ｓｌ／ｗｉｎ　；検出
、示差屈折計）で分析することにより、反応液の糖組成
を決定した。反応液には、７％の四糖以上のオリゴ糖、
２１％の三糖類、４８％の三糖類、及び２４％の単糖類
（いずれも全糖に対する重量％）が含まれていた。

実施例４ ５ｇの酵素固定化用担体ＦＥ４６１２（オルガノ製）を
４％ＮａＯＨ中　５０°Ｃで２時間撹拌し、純水にて洗
浄後、５％グルタルアルデヒド１５　ｍ　１１＝懸濁し
１時間撹拌する。

その佳、担体を１０ｍＭ　　リン酸緩衝液にて洗浄し、
１００ＯＵの酵素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液中に懸濁
し、２０間撹拌して固定化する。担体を１０　ｍ　Ｍ　
　リン酸ｍ？ｌｉｉにて洗浄し、これを固定化β−ガラ
クトシル基転移酵素とした。固定化における活性収率は
８７％であった。　固定化β−ガラクトシル基転移酵素
１ｇを、６０％（Ｗ／Ｖ）ラクトースを含有する０、０
５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）　１００　ｍ　ｌに懸濁
し、６５℃で２４時間撹拌し反応を行なった。反応液の
１部分を１０倍に希釈してこれをショーデックス・イオ
ンバックＫＳ８０１カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー（移動相、水：カラム温度、７０Ｃ；流速、１
　ｍｌ／ｓｉｎ　；検出、示差屈折計）で分析すること
により、反応液の糖組成を決定した。　反応液には、３
％の四糖以上のオリゴ糖、２５％の三糖類、５８％の三
糖類、及び１４％の単糖類（いずれも全糖に対する重量
％）が含まれていた。また、以上の反応を１サイクルと
してこれを繰り返し、固定化β−ガラクトシル基転移酵
素の活性半減期を１次反応に従うものとして計算により
求めたところ、固定化β−ガラクトシル基転移酵素の活
性半減期は少なくとも３００サイクル以上と求められた
。

実施ｇ４５ サーモモノスポラ　ｓｐ、ＳＡＭ　　１５４６、同　ｓ
ｐ、ＳＡＭ　　１５４７、サーモアクチノマイセス　ｓ
ｐ、ＳＡＭ　　１５４４および同ｓｐ、ＳＡＭ　　１５
４５の４菌株を、５００ｍ１のフラスコ中、１００ｍ１
のラクトース３％、ペプトン０．２％、酵母エキス０．
０２％、ＫＨ２Ｐ０．０．２％、ＮａＣ１０，３％およ
びＭｇ　Ｓ　Ｏ，１−Ｈ２Ｏ０，０１％ヲ含ｔｉ培地（
１）Ｉ（７，２）を用い、５５℃で４日間振盪培養して
β−ガ２クトシル基転移＃票を得た。

得られたβ−ガラクトシル基転移酵素は、それぞれ第４
表に示すような性質を有するものであった。

（以下余白） 実施例６ アスペルギルス・オリゼー（ｌ５ｐｚｔｌＩｉ／）１５
ａｇｚｔｔｅ　）起源のラクターゼ（ヤクルト本社製ラ
クターゼＹ−ＡＯ）、バシルス・サーキュランス（８ｚ
ｃ＃／ａｓ　ｃｉｒｃｔｔｌｔｔｎｓ　）起源のラクタ
ーゼ（大和化成製、ビオラフタ）、および本発明のβ−
ガラクトシル基転移酵素を、それぞれ０、ＯＩＭ　　リ
ン酸Ｉ！衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、０．１ｍｇ／ｍ
ｌの溶液を調製した。各酵素溶液を６０″Ｃで１時間イ
ンキュベートした後、ただちに氷冷した。次いで、各酵
素の残存活性をそれぞれの説明書に記載しである最適条
件に従い測定した結果、アスペルギルス・オリゼー起源
のラクターゼ、バシルス・サーキュランス起源のラクタ
ーゼ、および本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素の残
存活性は、それぞれ１％、１％および９６％であった。

実施例７ ラクトース　０．５ｇを０．０５Ｍ酢酸５９衛溶液（ρ
）１６．０）に溶解した溶液に、サーモモノスポラ　ｓ
ｐ、ＳＡＭ　　１５４６、サーモモノスポラ　ｓｐ、５
Ａ）ｓｉ　　１５４７、？−モ７クチノマイセス　ｓｐ
、ＳＡＭ　　１５４４およびサーモアクチノマイセス　
ｓｐ、ＳＡＭ１５４５の各培養物より得たβ−ガラクト
シル基転移酵素、１９ＮＰＧＵを加えて最紡容量　１．
０ｍｌとし、６５℃で８時間反応させた。

反応液を９５°Ｃで５分間処理して反応を停止させ、１
部分を１０倍に希釈してこれをショーデックス・イオン
バック　ＫＳ−８０１カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（移動相、水；カラム温度、７０℃；流速、
１ｍｌ／ｍｉｎ；検出：、示差屈折計）で分析すること
により反応液の糖組成を決定した。

この結果、いずれの起源のβ−ガラクトシル基転移酵素
を用いた場合でも、反応液には３〜７％の４糖以上のオ
リゴ糖、１８〜２１％の３ＷＭ類、４８〜５２％の２［
類および２１〜２６％の単糖類（いずれも全糖に対する
重量％ンが含まれていた。

実ＩＭ例８ サツカロポリスボラ・レクチヴイルグ ラ　（５ｚｃｃｌｒｚｒａｐａ／ｐｓｐｏｒｚ　　ｒｇ
ｃｌｉｖｉｒｇｕｌｉ　）のβ−ガラクトシル基転移酵
素を利用 した、ガラクトオリゴ糖を含有する乳 糖分解乳の製造： 牛乳（乳糖濃度４．８％、篇脂乳固形分濃度８．３％〉
を６０″Ｃに加温し、これにサツカロポリスボラ・レク
チヴイルグラがら得たβ−ガラクトシル基転移酵素を乳
１！Ｉｇあたり１６〜２４ＬＵ添加し、４〜７時間反応
させた。次いでショーデックス・イオンバックＫＳ８０
１カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（移動相
、水：カラム温度、７０℃；流速、１．０ｍｌ／ｍｉｎ
；検出、示差屈折計）により、上記処理後の牛乳中の糖
組成を分析した。その結果は第５表のとおりてあった。

なお、ガラクトシル基転移酵素のラクトース加水分解活
性は、上記反応後もほぼ１００％残存していた。

第　　　５　　　表 未１６１１　ｌａ／ｇｌ’ｌＪＩ　価／ｇＦＪ７時間　
　４時間 ３目以上のオリゴ― ０．０（り １０７■ １１．４（り １１１１１戚 対量１ 頗 ２３．３ （％） 単一ＩＩ　　　　Ｏ，ｏ　　６６．０　６３．９実施例
９ ガラクトオリゴ糖を含有する乳糖分解乳の製造における
、サツカロポリスボラ・レクチヴイルグラから得たβ−
ガラクトシル基転移酵素の牛乳中での安定性をさらに詳
しく調べた。

牛乳（乳Ｉ！濃度４．８％、無脂乳固形分濃度８．３％
）を６０．６５．７０“Ｃの各温度に加温し、これにサ
ツカロポリスボラ・レクチヴイルグラのβ−ガラクトシ
ル基転移酵素を牛乳１ｍｌあたり２４ｐＮＰＧＵ添加し
、反応を開始した。反応中の酵素の残存活性を求めるた
め、反応開始後１．２．４．８時間後に、反応液の一部
（０，０２ｍ１）をサンプリングして１．０ｍｌの牛乳
に添加し、６０°Ｃで１時間反応させ、その牛乳中の乳
糖の減少速度を測定した。また、これと同様の実験を、
バシルス・サーキュランス ＜Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕ／ａｒｔｓ）のβ−ガ
ラクトシダーゼ（ビオラフタ、大和化成製）についても
行ない、比較した。この結果を第６表に示す。

（以下余白） 第 表 ＯＯ ００ ００ ００ ００ ００ ００ 以 上 出 願 人 サンド リー株式会社 手続補正書（自発） 平成２年 １１月 ８日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質をもつ新規β−ガラクトシル
   基転移酵素。 ［１］作用 転移反応： β−Ｄ−ガラクトピラノシドＧａｌ−Ｘ　１モルと、ガ
   ラクトシル基受容体Ｙ　１モルとから、あらたなβ−Ｄ
   −ガラクトピラノシドＧａｌ−Ｙ１モルと、Ｘ　１モル
   を生成する。 ここで、Ｘ、Ｙはいずれも水以外の化合物で、糖あるい
   はアグリコンである。 加水分解：１モルのβ−Ｄ−ガラクトピラノシドＧａｌ
   −Ｘを加水分解し、１モルのＸと１モルのガラクトース
   を生成する。 ［２］基質特異性ラクトースおよびｐ−ニトロフェニル
   −β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解するが、ｐ−
   ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドは加水分
   解しない。 ［３］至適ｐＨ５．０〜８．０ ［４］ｐＨ安定性５５℃、１５分間の処理の場合、ｐＨ
   ５以上８以下で安定。 ［５］熱安定性０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
   中、６０℃、１時間のインキュベート後でも８０％以上
   の活性を有する。 あるいは、少なくとも１Ｍラクトースを含有する同上緩
   衝液中、６５℃で少なくとも２４時間インキュベートし
   た後も、８０％以上の活性を有する。
2. （２）放線菌に属する微生物により産生される請求項第
   １項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵素。
3. （３）放線菌に属する微生物がサッカロポリスポラ（Ｓ
   ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、サーモモノス
   ポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属またはサー
   モアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙ
   ｃｅｓ）属に属する微生物から選ばれたものである請求
   項第２項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵素。
4. （４）放線菌に属し、請求項第１項記載の新規β−ガラ
   クトシル基転移酵素を産生する微生物を培養し、該培養
   物よりβ−ガラクトシル基転移酵素酵素を分離、取得す
   ることを特徴とする新規β−ガラクトシル基転移酵素の
   製造法。
5. （５）放線菌に属し、請求項第１項記載の新規β−ガラ
   クトシル基転移酵素を産生する微生物がサッカロポリス
   ポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、サー
   モモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属ま
   たはサーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
   ｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である請求項第５項記
   載の新規β−ガラクトシル基転移酵素の製造法。
6. （６）請求項第１項記載の新規β−ガラクトシル基転移
   酵素を用いることを特徴とする、次の一般式（ I ） Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｘ（ I ） （式中、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｘは糖類若しく
   は配糖体を示し、ｎは０−４の整数である） で表されるオリゴ糖または糖修飾配糖体の製造法。
7. （７）請求項第１項記載のβ−ガラクトシル基転移酵素
   を獣乳に作用させ、原料乳中の乳糖の一部または全部を
   一般式（II） Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（II） （式中、Ｇａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコ
   ース残基示し、ｎは１−４の整数である） で表されるガラクトオリゴ糖に変換することを特徴とす
   るガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造方法。