JPH03284628A - 牛疫ウイルスワクチン - Google Patents
牛疫ウイルスワクチンInfo
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- JPH03284628A JPH03284628A JP2081240A JP8124090A JPH03284628A JP H03284628 A JPH03284628 A JP H03284628A JP 2081240 A JP2081240 A JP 2081240A JP 8124090 A JP8124090 A JP 8124090A JP H03284628 A JPH03284628 A JP H03284628A
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- Japan
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- vaccinia virus
- virus
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- plasmid
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発胡は牛疫ウィルスに対するワクチンに関し、さらに
詳しくは牛疫ウィルスの抗原性ヘマグルチニン遺伝子が
ワクチニアウィルスに組込まれている組換ワクチニアウ
ィルスを含んで成る牛疫ウイルスワクチンに関する。
詳しくは牛疫ウィルスの抗原性ヘマグルチニン遺伝子が
ワクチニアウィルスに組込まれている組換ワクチニアウ
ィルスを含んで成る牛疫ウイルスワクチンに関する。
中近東からアフリカにかけて半没の流行が頻発している
。このため牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔν１ｒ
ｕｓ）に対するワクチンの開発が強く望まれている。こ
れらの地域では特に気温が高い等の諸条件のだ約、熱安
定性が高く長期間保存でき、かつ免疫効果が大きく長期
間に渡ってその効果が持続するものが望まれる。
。このため牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔν１ｒ
ｕｓ）に対するワクチンの開発が強く望まれている。こ
れらの地域では特に気温が高い等の諸条件のだ約、熱安
定性が高く長期間保存でき、かつ免疫効果が大きく長期
間に渡ってその効果が持続するものが望まれる。
近年、従来天然痘の予防に用いられて威力を発揮したワ
クチニアウィルスのゲノム中に遺伝子工学的技術を用い
て各種病原体の抗原遺伝子を組込んで組換えワクチニア
ウィルスを作製し、生ワクチンとして利用する技術が開
発されている。
クチニアウィルスのゲノム中に遺伝子工学的技術を用い
て各種病原体の抗原遺伝子を組込んで組換えワクチニア
ウィルスを作製し、生ワクチンとして利用する技術が開
発されている。
牛疫ウィルスについては、該牛疫ウィルスの抗原蛋白質
であるヘマグルチニンの構造遺伝子の上流にワクチニア
ウィルスの７．５Ｋプロモーターが連結されて成る発現
カセットがワクチニアウィルスのヘマグルチニン遺伝子
中に挿入された組換ワクチニアウィルスかに、Ｔｓｕｋ
ｉｙａｍａ、 Ｙ、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ。
であるヘマグルチニンの構造遺伝子の上流にワクチニア
ウィルスの７．５Ｋプロモーターが連結されて成る発現
カセットがワクチニアウィルスのヘマグルチニン遺伝子
中に挿入された組換ワクチニアウィルスかに、Ｔｓｕｋ
ｉｙａｍａ、 Ｙ、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ。
）１．Ｋａｍａｔａ、 Ｋ、Ｉｍａｏｋａ、 Ｋ、＾５
ａｎｏ、 Ｓ、Ｆｕｎａｈａｓｈｉ、 Ｔ。
ａｎｏ、 Ｓ、Ｆｕｎａｈａｓｈｉ、 Ｔ。
Ｍａｒｕｙａｍａ、 ＨｏＳｈｉｄａ、 Ｍ、 Ｓｕｇ
ｉｍｏｔｏ、及びに、 Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ（１９８
９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｒｔ−ｓｔａ
ｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒ＋ｎｄｅｒｐｅｓｔ
ｖａｃｃｉｎｅ、 Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、 ｌＱ７
：２２５−２３５Ｋ記載されている。この組換ワクチ
ニアウィルスは、牛疫ウィルスのヘマグルチニンの構造
遺伝子の上流にワクチニアウィルスの７．５Ｋプロモー
ターが連結された発現カセットが挿入されたワクチニア
ウィルスのヘマグルチニン遺伝子を含有する組換プラス
ミドとワクチニアウィルスきの間の相同性組換えにより
構築されたものである。そして前記組換プラスミドの一
例であるプラスミドｐＨＡ−７，５ｐＮ−ＲＶＨを含有
する大腸菌ε５ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＭＶ−ＨＡ
−７，５ｐＮ−ＲＶＨが工業技術院微生物工業技術研究
所に、ブタペスト条約に基き、微工研条寄第１７６５号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７６５） として国際寄託され
ている。
ｉｍｏｔｏ、及びに、 Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ（１９８
９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｒｔ−ｓｔａ
ｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒ＋ｎｄｅｒｐｅｓｔ
ｖａｃｃｉｎｅ、 Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、 ｌＱ７
：２２５−２３５Ｋ記載されている。この組換ワクチ
ニアウィルスは、牛疫ウィルスのヘマグルチニンの構造
遺伝子の上流にワクチニアウィルスの７．５Ｋプロモー
ターが連結された発現カセットが挿入されたワクチニア
ウィルスのヘマグルチニン遺伝子を含有する組換プラス
ミドとワクチニアウィルスきの間の相同性組換えにより
構築されたものである。そして前記組換プラスミドの一
例であるプラスミドｐＨＡ−７，５ｐＮ−ＲＶＨを含有
する大腸菌ε５ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＭＶ−ＨＡ
−７，５ｐＮ−ＲＶＨが工業技術院微生物工業技術研究
所に、ブタペスト条約に基き、微工研条寄第１７６５号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７６５） として国際寄託され
ている。
しかしながら、前記組換プラスミドにおいては７．５Ｋ
プロモーターと牛疫ウィルスのヘマグルチニン構造遺伝
子の翻訳開始コドンとの間に５２ｂｐのＤＮＡが介在し
ており、この中にはフレーム外（ｏｕｔｆ ｒａｍｅ）
ＡＴＧが含まれており、この様な構造が牛疫ウィルス
のヘマグルチニンの効率的発現の障害になっている可能
性がある。
プロモーターと牛疫ウィルスのヘマグルチニン構造遺伝
子の翻訳開始コドンとの間に５２ｂｐのＤＮＡが介在し
ており、この中にはフレーム外（ｏｕｔｆ ｒａｍｅ）
ＡＴＧが含まれており、この様な構造が牛疫ウィルス
のヘマグルチニンの効率的発現の障害になっている可能
性がある。
従って本発明はプロモーターと牛疫ウィルスのヘマグル
チニン構造遺伝子との間の構造を改良し、該構造遺伝子
の発現効率を高めることによって強力な牛疫ウィルスワ
クチンを開発しようとするものである。
チニン構造遺伝子との間の構造を改良し、該構造遺伝子
の発現効率を高めることによって強力な牛疫ウィルスワ
クチンを開発しようとするものである。
本発明者らは、前記の組換プラスミドにおいて、そして
それにより作製された組換ワクチニアウィルスにおいて
７．５Ｋプロモーターと牛疫ウィルスへマクルチニン構
造遺伝子との間にフレーム外ＡＴＧが存在すること、及
び一般にワクチニアウィルスの後期プロモーターと該プ
ロモーターによって制御される構造遺伝子との間にＴＡ
ＡＡＴモチーフと呼ばれる特異な配列ＴＡＡＴＡＡが存
在することに着目し、７．５Ｋプロモーター領域と牛疫
ウィルスヘマグルチニン遺伝子をＴＡＡＴＡＡ配列によ
って直接連結することにより該構造遺伝子の発現効率を
約１０倍増強することができるという驚くべき知見を得
、この知見に基いて本発明を完成した。
それにより作製された組換ワクチニアウィルスにおいて
７．５Ｋプロモーターと牛疫ウィルスへマクルチニン構
造遺伝子との間にフレーム外ＡＴＧが存在すること、及
び一般にワクチニアウィルスの後期プロモーターと該プ
ロモーターによって制御される構造遺伝子との間にＴＡ
ＡＡＴモチーフと呼ばれる特異な配列ＴＡＡＴＡＡが存
在することに着目し、７．５Ｋプロモーター領域と牛疫
ウィルスヘマグルチニン遺伝子をＴＡＡＴＡＡ配列によ
って直接連結することにより該構造遺伝子の発現効率を
約１０倍増強することができるという驚くべき知見を得
、この知見に基いて本発明を完成した。
従って本発明は、牛疫ウィルスのヘマグルチニンの構造
遺伝子、該構造遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに隣接し
て該ＡＴＧの上流に連結されたＴＡＡＴＡＡ配列及び該
ＴＡＡＴＡＡ配列の上流であってその近傍に連結された
ワクチニアウィルス７．５Ｋプロモーターを含んで成る
発現カセットがワクチニアウィルスのヘマグルチニン遺
伝子中に挿入されている組換ワクチニアウィルスを含ん
で成る牛疫ウィルスワクチンを提供する。
遺伝子、該構造遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに隣接し
て該ＡＴＧの上流に連結されたＴＡＡＴＡＡ配列及び該
ＴＡＡＴＡＡ配列の上流であってその近傍に連結された
ワクチニアウィルス７．５Ｋプロモーターを含んで成る
発現カセットがワクチニアウィルスのヘマグルチニン遺
伝子中に挿入されている組換ワクチニアウィルスを含ん
で成る牛疫ウィルスワクチンを提供する。
前記組換ワクチニアウィルスは、牛疫ウィルスのヘマグ
ルチニンの構造遺伝子、該構造遺伝子の翻訳開始コドン
ＡＴＧに隣接して該ＡＴＧの上流に連結されたＴＡＡＴ
ＡＡ配列及び該ＴＡＡＴＡＡ配列の上流であってその近
傍に連結されたワクチニアウィルス７．５Ｋプロモータ
ーを含んで成る発現カセットが挿入されたワクチニアウ
ィルスのヘマグルチニン遺伝子を含む組換プラスミドと
ワクチニアウィルスとの間の相同性組換えによって構築
される。
ルチニンの構造遺伝子、該構造遺伝子の翻訳開始コドン
ＡＴＧに隣接して該ＡＴＧの上流に連結されたＴＡＡＴ
ＡＡ配列及び該ＴＡＡＴＡＡ配列の上流であってその近
傍に連結されたワクチニアウィルス７．５Ｋプロモータ
ーを含んで成る発現カセットが挿入されたワクチニアウ
ィルスのヘマグルチニン遺伝子を含む組換プラスミドと
ワクチニアウィルスとの間の相同性組換えによって構築
される。
牛疫ウィルスの抗原蛋白質の１種であるヘマグルチニン
のアミノ酸配列をコードするＣＤＮＡはすでにクローニ
ングされており（特開昭６４−２５８１号）、該ｃＤＮ
Ａを含有するプラスミドｐＤＨ−ＲＶＨ−２を含む大腸
菌ニジエリシャ・コリ （Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉＤＨ−ＲＶＨ−２Ｉｔ微工研条Ｗ第１３１９号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ −１３Ｉ９＞ として工業技術院微生物
工業技術研究所に、ブタペスト条約に基き国際寄託され
ている。このプラスミド中のｃＤＮＡの制限酵素地図は
第１図に示す通りであり、該ｃＤＮＡ領域の塩基配列及
びそれから推定される牛疫ウィルスのヘマグルチニンの
アミノ酸配列もすでに記載されている（特開昭６４２５
８１号）。従って、本発明においてはこのプラスミドか
ら牛疫ウィルスヘマグルチニンをコードする遺伝子を得
る。
のアミノ酸配列をコードするＣＤＮＡはすでにクローニ
ングされており（特開昭６４−２５８１号）、該ｃＤＮ
Ａを含有するプラスミドｐＤＨ−ＲＶＨ−２を含む大腸
菌ニジエリシャ・コリ （Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉＤＨ−ＲＶＨ−２Ｉｔ微工研条Ｗ第１３１９号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ −１３Ｉ９＞ として工業技術院微生物
工業技術研究所に、ブタペスト条約に基き国際寄託され
ている。このプラスミド中のｃＤＮＡの制限酵素地図は
第１図に示す通りであり、該ｃＤＮＡ領域の塩基配列及
びそれから推定される牛疫ウィルスのヘマグルチニンの
アミノ酸配列もすでに記載されている（特開昭６４２５
８１号）。従って、本発明においてはこのプラスミドか
ら牛疫ウィルスヘマグルチニンをコードする遺伝子を得
る。
しかしながら、このプラスミドにはフレーム外ＡＴＧを
含む５′−末端非翻訳領域が含まれているので、これを
除去するため、該遺伝子のコード領域中で５′末端に近
い位置に存在するＸｈｏ Ｉ部位と７．５Ｋプロモータ
ーの下流で遺伝子を切断して除去し、そしてこれによっ
て除去された５′末端側配列及びその翻訳開始コドンに
隣接するＴＡＡＴＡＡ配列を合成りＮＡにより補う。こ
の合成りＮＡの塩基配列を第２図に示す。この合成りＮ
Ａを、前記遺伝子の切断除去部位に連結することにヨリ
、牛疫ウィルスヘマグルチニン遺伝子の翻訳開始コドン
ＡＴＧに隣してその上流にＴＡＡＴＡＡ配列が結合され
ているプラスミドｐ１９−ＲＶＨ３を得る。
含む５′−末端非翻訳領域が含まれているので、これを
除去するため、該遺伝子のコード領域中で５′末端に近
い位置に存在するＸｈｏ Ｉ部位と７．５Ｋプロモータ
ーの下流で遺伝子を切断して除去し、そしてこれによっ
て除去された５′末端側配列及びその翻訳開始コドンに
隣接するＴＡＡＴＡＡ配列を合成りＮＡにより補う。こ
の合成りＮＡの塩基配列を第２図に示す。この合成りＮ
Ａを、前記遺伝子の切断除去部位に連結することにヨリ
、牛疫ウィルスヘマグルチニン遺伝子の翻訳開始コドン
ＡＴＧに隣してその上流にＴＡＡＴＡＡ配列が結合され
ているプラスミドｐ１９−ＲＶＨ３を得る。
この過程を第３図に示し、また実施例２に記載する。
他方、ワクチニアウィルスのヘマグルチニン遺伝子中に
ワクチニアウィルスの７．５ｐＮプロモーターが挿入さ
れているプラスミドｐ）ＩＡ −７，５ｐＮを第４図及
び実施例３に記載するようにして作製する。
ワクチニアウィルスの７．５ｐＮプロモーターが挿入さ
れているプラスミドｐ）ＩＡ −７，５ｐＮを第４図及
び実施例３に記載するようにして作製する。
次に前記プラスミドｐ１９−ＲＶＨ３かうＴＡＡＴＡＡ
配列及び牛疫ウィルスヘマグルチニン構造遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を得、これを前記プラスミドｐ）（Ａ−７、
５ｐＮの７．５ｐＮプロモーターの下流に挿入してプラ
スミドｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶＨ３ヲ４ル。コノフ
ラスミドの作製過程を第５図及び実施例４に記載する。
配列及び牛疫ウィルスヘマグルチニン構造遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を得、これを前記プラスミドｐ）（Ａ−７、
５ｐＮの７．５ｐＮプロモーターの下流に挿入してプラ
スミドｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶＨ３ヲ４ル。コノフ
ラスミドの作製過程を第５図及び実施例４に記載する。
次に、コノプラスミ）’ ｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶ
Ｈ３と、７．５Ｋプロモーターと牛疫ウィルスヘマグル
チニン構造遺伝子との間にフレーム外ＡＴＧを含むプラ
スミ）’ ｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶＨとを用い、こ
れらとワクチニアウィルスとの間で常法に従って相同性
組換を行い、ｐＨＡ−７，５ｐＮ−ＲＶＨ３から組換ワ
クチニアウィルスｍ０−ＨＡ／ Ｐ−ａ）Ｉを得、そし
てｐＨＡ７、５ｐＮ−ＲＶＨから組換ワクチニアウィル
スｍローＨＡ／Ｐ−ｎＨを得る。この方法を実施例５Ｋ
詳細に記載する。
Ｈ３と、７．５Ｋプロモーターと牛疫ウィルスヘマグル
チニン構造遺伝子との間にフレーム外ＡＴＧを含むプラ
スミ）’ ｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶＨとを用い、こ
れらとワクチニアウィルスとの間で常法に従って相同性
組換を行い、ｐＨＡ−７，５ｐＮ−ＲＶＨ３から組換ワ
クチニアウィルスｍ０−ＨＡ／ Ｐ−ａ）Ｉを得、そし
てｐＨＡ７、５ｐＮ−ＲＶＨから組換ワクチニアウィル
スｍローＨＡ／Ｐ−ｎＨを得る。この方法を実施例５Ｋ
詳細に記載する。
次に、こうして得られた組換ワクチニアウィルスの牛疫
ウィルスに対するワクチンとしての効果をウサギを用い
て試験した。これを実施例５Ｋ記載する。この結果、ｍ
ｏ−ＨＡ／ Ｐ−ａＨはｍｏ−ｆｌＡ／Ｐ−ｎＨに比べ
て１０分の１の投与量で発症を抑制することができ、本
発明の組換ワクチニアウィルスが従来技術の組換ワクチ
ニアウィルスに比べて牛疫ウィルスに対するワクチンと
して非常に有効であることが立証された。
ウィルスに対するワクチンとしての効果をウサギを用い
て試験した。これを実施例５Ｋ記載する。この結果、ｍ
ｏ−ＨＡ／ Ｐ−ａＨはｍｏ−ｆｌＡ／Ｐ−ｎＨに比べ
て１０分の１の投与量で発症を抑制することができ、本
発明の組換ワクチニアウィルスが従来技術の組換ワクチ
ニアウィルスに比べて牛疫ウィルスに対するワクチンと
して非常に有効であることが立証された。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に記載する。
いてＴＡＡＡＴＧとなっている。この配列は、後期蛋白
質遺伝子がｍＲＮＡに転写されるために重要な配列であ
ると思われる。この配列が半没つィルスＨ遺伝子の上流
にくるようにＤＮＡを設計し、合成した。
質遺伝子がｍＲＮＡに転写されるために重要な配列であ
ると思われる。この配列が半没つィルスＨ遺伝子の上流
にくるようにＤＮＡを設計し、合成した。
また今後の組みこみに便利なように両末端にいくつかの
制限酵素のサイドを設けた。合成領域が長いた杓、２つ
の領域に分け、その各々に相補的なりＮＡを合わせて＃
１〜４の４つのＤＮＡを合成した。
制限酵素のサイドを設けた。合成領域が長いた杓、２つ
の領域に分け、その各々に相補的なりＮＡを合わせて＃
１〜４の４つのＤＮＡを合成した。
これらのＤ Ｎ Ａ単鎖はフォスファアミダイド法によ
りＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）て各々合成し、精製した後、連結し、ｐＵｃ９にク
ローニングしプラスミドｐＡ−Ｒｖｌ（を作製した。こ
の塩基配列が正しい事はＭ１３ｍｐ１８ファージにクロ
ーニング後Ｍ１３シークエンスキッ） （Ｔａｋａｒａ
）を用いて塩基配列を調べて確認した。
りＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）て各々合成し、精製した後、連結し、ｐＵｃ９にク
ローニングしプラスミドｐＡ−Ｒｖｌ（を作製した。こ
の塩基配列が正しい事はＭ１３ｍｐ１８ファージにクロ
ーニング後Ｍ１３シークエンスキッ） （Ｔａｋａｒａ
）を用いて塩基配列を調べて確認した。
成（第２図）
ワクチニアウィルス後期蛋白質遺伝子の開始コドンΔＴ
Ｇの近傍の配列は非常によく保存されてｃＤＮＡを含有
するプラスミドｐＤＨ−ＲＶＨ−２を高塩濃度溶液中で
３ａｍＨＩ消化しＲＶＨ２を含む約２，２ｋｂ断片を得
た。他方、市販のプラスミドｐ［Ｉｃ１９ も同様にＢ
ａｍＨｒ消化して開裂し両者をＴ、リガーゼで連結し、
プラスミドｐ１９−ＲＶ）１２を得た。このｐ１９−Ｒ
ＶＨ２をＳａｌ Ｉ及びＸｈｏ Ｉにより高塩濃度緩衝
液中で消化し、ＲＶＨ２のＸｈｏ Ｉから上流部をＳａ
ｌ Ｉまで除いた。この線状プラスミドと前記の合成り
ＮＡのＳａｌ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ断片をＴ４ リガーゼ
で連結し、大腸菌ＴＢ−１を形質転換した。
Ｇの近傍の配列は非常によく保存されてｃＤＮＡを含有
するプラスミドｐＤＨ−ＲＶＨ−２を高塩濃度溶液中で
３ａｍＨＩ消化しＲＶＨ２を含む約２，２ｋｂ断片を得
た。他方、市販のプラスミドｐ［Ｉｃ１９ も同様にＢ
ａｍＨｒ消化して開裂し両者をＴ、リガーゼで連結し、
プラスミドｐ１９−ＲＶ）１２を得た。このｐ１９−Ｒ
ＶＨ２をＳａｌ Ｉ及びＸｈｏ Ｉにより高塩濃度緩衝
液中で消化し、ＲＶＨ２のＸｈｏ Ｉから上流部をＳａ
ｌ Ｉまで除いた。この線状プラスミドと前記の合成り
ＮＡのＳａｌ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ断片をＴ４ リガーゼ
で連結し、大腸菌ＴＢ−１を形質転換した。
得られたプラスミドを制限酵素により分析し、これらの
ＤＮＡ断片が確かにＸｈｏ Ｉ部位において連結されて
おり、方向が一致しているプラスミドを得た。さらに正
しく連結されているか否かを確かめるために、このプラ
スミドよりＳａｌ ｌ−３ａｃＩ断片を得、これをＭ１
３ｍｐ１８にクローニングして、その塩基配列を確認し
た。その結果、得られたプラスミドは目的のプラスミド
であることが明らかとなった。これをｐ１９−ＲＶ）１
３と命名した。
ＤＮＡ断片が確かにＸｈｏ Ｉ部位において連結されて
おり、方向が一致しているプラスミドを得た。さらに正
しく連結されているか否かを確かめるために、このプラ
スミドよりＳａｌ ｌ−３ａｃＩ断片を得、これをＭ１
３ｍｐ１８にクローニングして、その塩基配列を確認し
た。その結果、得られたプラスミドは目的のプラスミド
であることが明らかとなった。これをｐ１９−ＲＶ）１
３と命名した。
実施例３． プラスミドｐＨＡ −７，５ｐ〜の作製（
第４図）ワクチニアウィルスＷＲ株のウィルスを精製し
、５ＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４） （１
ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム含
有）中に懸濁し、プロティナーゼＫを２５０〜１０００
．ｉ／ ｍｅに加えて３７℃にて一夜インキユベートし
た後、緩衝液で飽和されたフェノール：クロロホルム（
１，：１）で３回抽出し、そしてエタノールによりウィ
ルスＤＮＡを沈澱せしめた。このＤＮＡを１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ！ （ｐｔ１８．０） （１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有）に溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により約５０ｋｂｐのＨｉｎｄＩ
ＩＩＡ断片を単離した。この旧ｎｄＩＩＩＡ断片を、高
塩濃度緩衝液中でＳａｌ Ｉにより消化し、旧ｎｄｌｌ
Ａ断片の３′末端に存在する約１．８ ｋｂｐのＨｉｎ
ｄｌＩ−３ａｌＩ断片を、アガロース電気泳動により単
離した。
第４図）ワクチニアウィルスＷＲ株のウィルスを精製し
、５ＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４） （１
ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム含
有）中に懸濁し、プロティナーゼＫを２５０〜１０００
．ｉ／ ｍｅに加えて３７℃にて一夜インキユベートし
た後、緩衝液で飽和されたフェノール：クロロホルム（
１，：１）で３回抽出し、そしてエタノールによりウィ
ルスＤＮＡを沈澱せしめた。このＤＮＡを１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ！ （ｐｔ１８．０） （１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有）に溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により約５０ｋｂｐのＨｉｎｄＩ
ＩＩＡ断片を単離した。この旧ｎｄＩＩＩＡ断片を、高
塩濃度緩衝液中でＳａｌ Ｉにより消化し、旧ｎｄｌｌ
Ａ断片の３′末端に存在する約１．８ ｋｂｐのＨｉｎ
ｄｌＩ−３ａｌＩ断片を、アガロース電気泳動により単
離した。
他方、プラスミドρＣ［Ｊ１３を生塩濃度Ｍ衡液中でＨ
ｉｎｄＩ［により、次に高濃度緩衝液中でＳａｌ Ｉに
より消化して線状化し、この線状化プラスミドをアガロ
ース電気泳動により単離した。
ｉｎｄＩ［により、次に高濃度緩衝液中でＳａｌ Ｉに
より消化して線状化し、この線状化プラスミドをアガロ
ース電気泳動により単離した。
前記の旧ｎｄＩＩＩ −Ｓａｌ Ｉ断片と、線状化プラ
スミドとをライゲーション緩衝液中てＴ４ Ｄ＼Ａリガ
ーゼにより連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ
１０３を形質転換した。個々のクローンから迅速アルカ
リ抽出法によりプラスミドを抽出し、制限酵素分析によ
り目的とする構成を有するプラスミドを選択し、ｐＨＡ
１３と命名した。
スミドとをライゲーション緩衝液中てＴ４ Ｄ＼Ａリガ
ーゼにより連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ
１０３を形質転換した。個々のクローンから迅速アルカ
リ抽出法によりプラスミドを抽出し、制限酵素分析によ
り目的とする構成を有するプラスミドを選択し、ｐＨＡ
１３と命名した。
他方、ワクチニアウィルスのＷＲ株よりＤ Ｎ Ａ抽出
し、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎらの方法（Ｖｅｎｋａｔｅｓ
ａｎ及びＢＭｏｓｓ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ３３，７３８
−７４５ （１９８１）により７．５Ｋプロモーターを
単離した。即ち、ＷＲ株のＤＮＡをＳａｌ Ｉで消化し
、０．９ ｋｂｐの断片をｐＬｌｃｌｇのＳａｌ Ｉ部
位にクローニングした。次に、こうして得たプラスミド
をＲｓａ Ｉ及び旧ｎｃＩＩで消化し、０、２６ｋｂｐ
のＲｓａ Ｉ −Ｈｌｎｃ ■断片を得、これをｐ［Ｉ
ｃ１８に挿入し、７．５Ｋプラスミドを有するプラスミ
ドを得、これをｐ７．５−１８と命名した。
し、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎらの方法（Ｖｅｎｋａｔｅｓ
ａｎ及びＢＭｏｓｓ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ３３，７３８
−７４５ （１９８１）により７．５Ｋプロモーターを
単離した。即ち、ＷＲ株のＤＮＡをＳａｌ Ｉで消化し
、０．９ ｋｂｐの断片をｐＬｌｃｌｇのＳａｌ Ｉ部
位にクローニングした。次に、こうして得たプラスミド
をＲｓａ Ｉ及び旧ｎｃＩＩで消化し、０、２６ｋｂｐ
のＲｓａ Ｉ −Ｈｌｎｃ ■断片を得、これをｐ［Ｉ
ｃ１８に挿入し、７．５Ｋプラスミドを有するプラスミ
ドを得、これをｐ７．５−１８と命名した。
このプラスミドｐ７．５−１８を中塊濃度緩衝液中でＥ
ｃｏＲｒと旧ｎｄＩＩ［により消化することにより約０
．２９ｋｂの７．５Ｋプロモーター含有ＤＮＡ断片を切
出し、アガロースゲル電気泳動により単離した。次にプ
ラスミドｐＨＡ１３をＮｒｕ Ｉで消化して開裂せし杓
、線状プラスミドとした。この両者をＫｌｅｎｏｗ断片
で１丁Ｐ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰの
存在下、ニックトランスレーション緩衝液中で反応させ
末端を平滑化した。この両者をＴ＜’）ガーゼで連結し
、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドを得た。
ｃｏＲｒと旧ｎｄＩＩ［により消化することにより約０
．２９ｋｂの７．５Ｋプロモーター含有ＤＮＡ断片を切
出し、アガロースゲル電気泳動により単離した。次にプ
ラスミドｐＨＡ１３をＮｒｕ Ｉで消化して開裂せし杓
、線状プラスミドとした。この両者をＫｌｅｎｏｗ断片
で１丁Ｐ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰの
存在下、ニックトランスレーション緩衝液中で反応させ
末端を平滑化した。この両者をＴ＜’）ガーゼで連結し
、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドを得た。
制限酵素による分析の結果、ＨＡの方向と７．５Ｋプロ
モーターの方向が一致するものを選びプラスミドｐＨＡ
−７，５ｐＮとした。
モーターの方向が一致するものを選びプラスミドｐＨＡ
−７，５ｐＮとした。
（第５図）
プラスミドｐ１９−ＲＶＨ３を高塩濃度緩衝液中でＢａ
ｍＨＩにより消化し、改変ＲＶＨ遺伝子断片を得た。ま
た、７．５Ｋプロモーターを含むワクチニアウィルスＨ
ＡベクターであるプラスミドｐＨＡ７．５ｐＮを高塩濃
度緩衝液中でＢａｍＨＩにて消化した。
ｍＨＩにより消化し、改変ＲＶＨ遺伝子断片を得た。ま
た、７．５Ｋプロモーターを含むワクチニアウィルスＨ
ＡベクターであるプラスミドｐＨＡ７．５ｐＮを高塩濃
度緩衝液中でＢａｍＨＩにて消化した。
両者をライゲーション緩衝液中でＴ、リガーゼを用いて
連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＴＢ−１を形質
転換した。得られたプラスミドを制限酵素により分析し
、７．５Ｋプロモーターの下流に該プロモーターと同じ
方向で前記改変ＲＶＨ遺伝子断片が正しく連結されてい
ることを確認した。コノプラスミドをｐＨＡ −７，５
ｐＮ−ＲＶＨ３と命名した。
連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＴＢ−１を形質
転換した。得られたプラスミドを制限酵素により分析し
、７．５Ｋプロモーターの下流に該プロモーターと同じ
方向で前記改変ＲＶＨ遺伝子断片が正しく連結されてい
ることを確認した。コノプラスミドをｐＨＡ −７，５
ｐＮ−ＲＶＨ３と命名した。
ルスの作製
ウサギ腎臓細胞株ＲＫ１３を２５ｃｎｆのボトルに接種
し、３７℃、５％ＣＤ２にて５％牛血清を含むイーグル
のＭＥＭ培地で１晩培養しモルレーヤーを形成させた。
し、３７℃、５％ＣＤ２にて５％牛血清を含むイーグル
のＭＥＭ培地で１晩培養しモルレーヤーを形成させた。
次にベクターとしてのワクチニアウィルスｍ０株をｍｏ
ｉＱ、ｌで１時間、３７℃で吸着させた。
ｉＱ、ｌで１時間、３７℃で吸着させた。
次に実施例３において作製したプラスミドｐＨＡ−７、
５ｐＮ−ＲＶＨ、あるいは、実施例９において作製した
プラスミドｐＨＡ −ＡＴＪｐ −ＲＶ）ｌをリン酸カ
ルシウム−ＤＮＡ共沈法［：Ｗｅｉｒ、 Ｊ、Ｐ、ら（
１９ｇ２） Ｐｒｏｃ。
５ｐＮ−ＲＶＨ、あるいは、実施例９において作製した
プラスミドｐＨＡ −ＡＴＪｐ −ＲＶ）ｌをリン酸カ
ルシウム−ＤＮＡ共沈法［：Ｗｅｉｒ、 Ｊ、Ｐ、ら（
１９ｇ２） Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｉ、ＬＩＳＡ、 ７９． １２
１０−１２１４）を用いてトランスフェクトした。この
培養物から凍結融解にてウィルスを回収した。９ｃｍシ
ャーレのＲＫ１３細胞のモルレーヤーにこのウィルスを
５００〜１０００プラーク／シヤーレになるように接種
し、２日間培養してプラークを形成させた。次にニワト
リ赤血球を添加し赤血球を吸着しないＨＡ−のプラーク
を拾った。
１０−１２１４）を用いてトランスフェクトした。この
培養物から凍結融解にてウィルスを回収した。９ｃｍシ
ャーレのＲＫ１３細胞のモルレーヤーにこのウィルスを
５００〜１０００プラーク／シヤーレになるように接種
し、２日間培養してプラークを形成させた。次にニワト
リ赤血球を添加し赤血球を吸着しないＨＡ−のプラーク
を拾った。
これらのプラークより得たウィルスを３ｃｍのシャーレ
中のＲＫ１３細胞のモルレーヤーに感染させ、プラーク
を形成させた。次に、このプラークをナイロンメンプラ
ン（アマ−ジャムハイボンドＮ）に写しとり、０．５Ｎ
ＮａＤＨにより５分間処理してＤＮＡを変性させた後
、ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＲｐ）１７．４で中和し、１．
５Ｍ ＮａＣＡ 、 ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ
ｐＨ７，４で吸着後、紫外線（３０５ｎｍ）照射５分で
固定した。
中のＲＫ１３細胞のモルレーヤーに感染させ、プラーク
を形成させた。次に、このプラークをナイロンメンプラ
ン（アマ−ジャムハイボンドＮ）に写しとり、０．５Ｎ
ＮａＤＨにより５分間処理してＤＮＡを変性させた後
、ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＲｐ）１７．４で中和し、１．
５Ｍ ＮａＣＡ 、 ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ
ｐＨ７，４で吸着後、紫外線（３０５ｎｍ）照射５分で
固定した。
ｐＤＨ−ＲＶＨ２を高塩濃度緩衝液で１３ａｍＨＩによ
り消化した後、アガロースゲル電気泳動でＲＶＨ２を含
む断片を得てプローブとした。プローブＤＮＡはニック
トランスレーションキット（Ｔａｋａｒａ）にて３２ｐ
でラベルしたのち、先のウィルスＤＮＡを固定したプロ
ーブＤＮＡと６０℃１晩ハイブリダイズせしめた。オー
トラジオグラフィーでハイブリダイズしたプラークを検
出した結果、ｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶ［Ｉ３を糾込
んだウィルス株及びｐ）ＩＡ−７，５ρＮ−ＲＶＨヲ組
込んだウィルス株を得、それぞれｍｏ−ＨＡ／ＰａＨ１
及びｍｏ−ＨＡ／ Ｐ−ｎＨと命名した。
り消化した後、アガロースゲル電気泳動でＲＶＨ２を含
む断片を得てプローブとした。プローブＤＮＡはニック
トランスレーションキット（Ｔａｋａｒａ）にて３２ｐ
でラベルしたのち、先のウィルスＤＮＡを固定したプロ
ーブＤＮＡと６０℃１晩ハイブリダイズせしめた。オー
トラジオグラフィーでハイブリダイズしたプラークを検
出した結果、ｐＨＡ −７，５ｐＮ−ＲＶ［Ｉ３を糾込
んだウィルス株及びｐ）ＩＡ−７，５ρＮ−ＲＶＨヲ組
込んだウィルス株を得、それぞれｍｏ−ＨＡ／ＰａＨ１
及びｍｏ−ＨＡ／ Ｐ−ｎＨと命名した。
実施例６
組換ワクチニアウィルスｍ０−ＨＡ ／ Ｐ −ａＨ又
はｍ。
はｍ。
ＨＡ／Ｐ−ｎＨを、それぞれ１０２〜１０！′ｐｆｕ又
は１０３−１Ｑ”ｐｆｕの投与量でウサギに皮内接種し
て免疫感作した。この投与の４週間後、半没つィルスー
Ｌ株ヲ１０３ＬＤ５ｏの量で静脈内チャレンジし、その
後１週間臨床症状を観察した。なお、免疫感作の後４週
間で牛疫ウィルスに対する中和抗体力価を測定した。対
照としていずれの組換ワクチニアウィルスも投与しなか
ったウサギ８頭はすべてチャレンジ後３臼目又は４日目
に死亡した。
は１０３−１Ｑ”ｐｆｕの投与量でウサギに皮内接種し
て免疫感作した。この投与の４週間後、半没つィルスー
Ｌ株ヲ１０３ＬＤ５ｏの量で静脈内チャレンジし、その
後１週間臨床症状を観察した。なお、免疫感作の後４週
間で牛疫ウィルスに対する中和抗体力価を測定した。対
照としていずれの組換ワクチニアウィルスも投与しなか
ったウサギ８頭はすべてチャレンジ後３臼目又は４日目
に死亡した。
この結果を次の表に示す。
組換ウィルスｍ０−Ｈ＾／Ｐ −ｎｌ−１０６
０５
０４
０３
４、００
６６
３３
４、０ＣＩ
３３
３．６６
〈１００
３．５０
３５［１
＜１００
２３
００
５０％感染防御量 １０” ５ｐｆｕ／ １羽＋
＋
０／３
０／３
１／３
２／３
２７
１３０
３３
組換ウィルスｍ０−Ｈ＾／Ｐ−ａＨ
ｌ（１’
２．３３
Ｏ４
５，００
０３
４，３３
０／３
０／３
０／３
一２中の太線領域はＨ蛋白質をコードする塩基配列に該
当する領域である。
当する領域である。
第２図は５′非躬訳領域が改変された合成牛疫ウィルス
遺伝子部分の塩基配列を示す。
遺伝子部分の塩基配列を示す。
第３図は第２図に示す合成遺伝子とｃＤＮＡとの連結に
よるプラスミドｐ１９−ＲＶＨ３の作製方法を示す。
よるプラスミドｐ１９−ＲＶＨ３の作製方法を示す。
第４図は、７．５Ｋプロモーターを含有するプラスミド
ｐ）ＩＡ−７，５ｐ〜の作製方法を示す。
ｐ）ＩＡ−７，５ｐ〜の作製方法を示す。
第５図は組換用プラスミドｐＨＡ −７，５９〜−ＲＶ
Ｈ３の作製を示す。
Ｈ３の作製を示す。
０２
２．３３
１．３３
十
１／３
５０％感染防御量 ＜１０２ｐｆｕ／１羽
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、牛疫ウィルスのヘマグルチニンの構造遺伝子、該構
造遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに隣接して該ＡＴＧの
上流に連結されたＴＡＡＴＡＡ配列及び該ＴＡＡＴＡＡ
配列の上流であってその近傍に連結されたワクチニアウ
イルス７．５Ｋプロモーターを含んで成る発現カセット
がワクチニアウイルスのヘマグルチニン遺伝子中に挿入
されている組換ワクチニアウイルスを含んで成る牛疫ウ
イルスワクチン。 ２、牛疫ウィルスのヘマグルチニンの構造遺伝子、該構
造遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに隣接して該ＡＴＧの
上流に連結されたＴＡＡＴＡＡ配列及び該ＴＡＡＴＡＡ
配列の上流であってその近傍に連結されたワクチニアウ
イルス７．５Ｋプロモーターを含んで成る発現カセット
が挿入されたワクチニアウイルスのヘマグルチニン遺伝
子を含む組換プラスミドとワクチニアウイルスとの間の
相同性組換えによって構築された組換ワクチニアウイル
スを含んで成る牛疫ウイルスワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2081240A JPH03284628A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 牛疫ウイルスワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2081240A JPH03284628A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 牛疫ウイルスワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03284628A true JPH03284628A (ja) | 1991-12-16 |
Family
ID=13740904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2081240A Pending JPH03284628A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 牛疫ウイルスワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03284628A (ja) |
-
1990
- 1990-03-30 JP JP2081240A patent/JPH03284628A/ja active Pending
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