JPH03292898A - ヒト白血球抗原型決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト白血球抗原の整合に係る。

ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＢＣ）のヒト白血球
抗原（ＨＬＡ）クラス■の遺伝子は、免疫応答において
ヘルパーＴ細胞に抗原ペプチドを与えるという基本的な
役割を有する細胞表面糖タンパク質をコードする。ヘル
パーＴ細胞により自己１４Ｈｃクラス■の分子と共に外
来抗原が認識されると、カスケード状免疫応答が誘発さ
れ、その結果、細胞毒性Ｔ細胞及びＢ細胞が活性化され
、夫々一方は抗原付与細胞を殺し、他方は抗体応答を誘
導する。

少なくとも６個のＨＬＡクラス■遺伝子座が規定されて
おり、そのうちの３個（ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ及びＤＰ）
は機能的産物を発現することが知られている。これらの
３つの遺伝子座の内側の＾（以前はα）及びＢ（以前は
β）の遺伝子対は、複対立遺伝子及びアロ反応性である
ようなヘテロニ量体タンパク質産物をコードする。更に
、ＤＲ及び／又はＤＱ分子上のエピトープの組み合わせ
は、アロ反応性Ｔ細胞により認識される。この反応性を
使用して、混合リンパ球反応（ＨＬＲ）に基づく細胞ア
ッセイにより０ｗ型が規定された。

ＤＲ及びＤＱアロ反応性の結果として、同種移植前に供
与体と受容体との■Ｌ＾−ＤＲ及びＤＱ対立遺伝子を整
合させると同種移植片の生存に重要な影響を及ぼすこと
が立証された。従って、ＨＬＡ−ＤＲ及びＤＱの整合（
ｍａｔｃｈｉｎｇ）は今日一般に腎及び骨髄移植の臨床
前提条件とみなされる。

アロ反応性エピトープの認識方法は最近まで血清及び細
胞型別（ｔｙｐｉｎｇ）に限られていた。ＤＲ及びＤＱ
の血清型別は確立されており、ＤＲ及びＤＱアロ抗原に
対する体液性応答の結果として生成される抗血清を使用
するものである。しかしながら、血清型別はアロ抗血清
の入手可能性と交差反応性、及び生存細胞が必要である
という理由によりしばしば問題を伴う。

最近では、ＨＬＡクラス■領域の分子遺伝子分析の発展
により、ＤＮＡレベルでＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ及びＤＰ対
立遺伝子を規定できるようになった。現在、ＤＮＡレベ
ルで検出される多くの多形性は予め血清学的に規定でき
ないことが認められている。しかしながら、血清学的ス
プリット（ｓｐｌｉｔ）を規定することが可能な新規ア
ロ抗血清が報告されつつあることから、ＤＮＡプローブ
により明示される多形性は機能的であることが徐々に確
認されつつある。従って、ＤＮＡレベルで検出される多
形性は機能的エピトープを十分に反映し得ると思われる
。従って、ＤＮＡ型別は血清学的試験を補うもの又はこ
れに代わるものとして次第に広く使用されるようにな一
ノている。

今日まで、これらの対立遺伝子の認識に最も広く使用さ
れているＤＮＡ型別方法は、制限フラグメント長さ多形
性（ＲＦＬＰ）分析であった。この方法はＨＬＡクラス
Ｉ［ＤＮＡ型別方法として確立されているが、多数の欠
点を内在する。即ち、ＲＦＬＰ型別は死体の腎移植以前
の臨床使用のためには時間がかかり過ぎるので、生体供
与体の移植又は既往調査に最適である。更に、ＲＦＬＰ
は一般に、機能的に重要なＨＬＡクラス■エピトープを
コードするエキソンの内側の多形性を検出せず、これら
のエキソンの内側の対立遺伝子に特異的なヌクレオチド
配列間の強い結合と、周囲の一般に非コーディング性Ｄ
ＮＡの内側の制限エンドヌクレアーゼ認識部位分布とに
基づく。

ＨＬＡクラス■対立遺伝子を配列決定するために多くの
グループの尽力が払われた結果、ＤＲＢ、　ＤＱＢ、Ｄ
Ｑ＾及びＤＰＢタンパク質産物産物ロ反応性エピトープ
の大多数は夫々の遺伝子の第２のエキソンによりコード
される膜遠位領域に限定されることが判明した。これら
のエキソンのフランキング配列は遺伝子座特異的であり
且つ対立遺伝子間で高度に維持され、それ自体ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａ　ｉ　ｋ　ｉ他、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２３０．１３５０．１９８５；　５ｃｈａ
ｒｆ他、Ｉ（ｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２３．１４
３．１９８８）を使用する酵素的増幅を実施することが
できる。この技術は、対立遺伝子のほぼ全部のヌクレオ
チド配列データの取得を促進し、こうして対立遺伝子特
異的ヌクレオチド配列の微小異種性（ｍｉｃｒｏｈｅｔ
ｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を検出することが可能な対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチド（＾ＳＯ）プローブの構
築を可能にした。

その結果、ＰＣＲ−ＡＳＯ型別方法が開発された。これ
らの方法は、スロット又はドツトプロットハイブリダイ
ゼーション分析を使用してＡＳＯプローブにより型別を
可能にするに十分なターゲットＤＮＡをＰＣＲ増幅によ
り製造するものである。こうして、ＰＣＲ−ＡＳＯ型別
を使用して、ＨＬＡ−ＤＲ型別、ＨＬ八−ＤＱ型別及び
ＨＬＡ−ＤＰ型別の改良手順が開発された。

これらのシステムの主要な方法上の欠点は、技術の複雑
さが被験対立遺伝子の数に直接関係するという点にあり
、即ち、対立遺伝子間たり少なくとも１個の＾ＳＯプロ
ーブを使用し、従って、使用される各＾ＳＯプローブに
つきターゲットＤＮＡを固定した１個の膜が必要である
。別の方法も５ｃｈａｒｆ他（１９８８）により開発さ
れており、この方法によると、酵素標識し、増幅したタ
ーゲットＤＮＡに固定化＾ＳＯプローブをハイブリダイ
ズし、こうして必要な＾ＳＯプローブの全部を含む単一
の膜を使用して増幅した各ＤＮＡを型別することができ
る。

本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の第２エキソン配
列のＰＣＢ増幅と、それに続く電気泳動分離による産物
分析とを使用する新規且つ簡単な）ＩＬ＾−ＤＲ／ｌｈ
アロタイプ整合方法をこのほど開発した。非変性ポリア
クリルアミドミニゲルで迅速分離が得られる。現在使用
可能なりＮＡ型別技術と異なり、ターゲットＤＮＡ変性
／中和、固体支持膜への固定化、放射性同位体もしくは
酵素標識した＾ＳＯプローブとのハイブリダイゼーショ
ン、又はハイブリダイゼーションシグナルの展開のよう
な増幅後サンプル処理を必要としない。

従って、本発明は（ｉ）第１のＤＮＡサンプルのＨＬＡ
ＤＲＢ遺伝子の第２エキソンヌクレオチド配列のＰＣＲ
増幅を実施する段階と、（ｉｉ）該増幅から得られたＤ
ＮＡフラグメントをサイズに従って分離する段階と、（
ｉｉｉ）こうして分離したＤＮＡフラグメントの長さ多
形性を決定する段階と、＜ｉｖ）こうして決定した長さ
多形性を、第２のＤＮＡサンプルの該ＨＬＡＤＲＢ遺伝
子の第２エキソンヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅から得
られたＤＮＡフラグメントの長さ多形性と比較する段階
とを含む、ヒトＩＩＬへ−ＤＲ及び／又はＤｗアロタイ
プ整合方法を提供するものである。

該方法の基礎は、特徴的な対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物
（ＰＣＲフィンカープリント）を生成するために、規定
されたＰＣＢプライマーを使用してＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝
子の第２エキソン配列をＰＣＲ増幅する点にある。該方
法は、増幅後酵素消化、化学的処理、ＤＮＡ固定化、タ
ーゲットーブローブハイブリダイゼ−ション、又はＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマーの多重組み合わせの使
用を必要としないという点において、他の確立されたＤ
ＮＡ型別方法と異なる。ＨＬＡ−ＯＲ及びＤｗＰＣＲフ
ィンガープリントはＤＲ／Ｄｗホモ接合又はへテロ接合
個体で８時間以内に容易に認識され得る。こうして、個
体のパネルのＰＣＲフィンガープリントを直接視覚的に
比較する本発明の方法は、例えば骨髄移植のための■Ｌ
＾−ＤＲ／Ｄｗ整合血縁又は非血縁の生体ボランティア
供与体の選択におけるＨＬＡ−ＤＲ／ＤＩ＋＋対立遺伝
子整合に適切であり得る。

ＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｕ＋ヘテロ接合個体のＤＮＡを調査し
た処、観察されたＰＣＲフィンガープリントは類似して
いるが、単に２つの対応するＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｗホモ接
合細胞を加えることにより予想されるパターンには一致
しなかった。しかしながら、２つのＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｗ
ホモ接合細胞からのＤＮＡをＰＣＢ増幅前に予め混合す
るならば、対応するヘテロ接合体で観察されるようなパ
ターンが再現される。従って、本発明の方法はＨＬＡ−
ＤＲ／Ｄｗアロ型別全般に応用できる。従って、ヘテロ
接合個体のＤＲ及び／又はＤｗ特異性を分析することが
できる。

本発明の方法は第１のＤＮＡサンプルで実施される。Ｄ
ＮＡサンプルは調査が所望されるＨＬＡ−ＤＲ及び／又
はＩ）ｗアロタイプを有する固体又は任意の対象から得
られる。固体は胎児を含む。ＨＬＡ　ＤＮＡは全有核細
胞から抽出され得る。典型的には、Ｈし八〇Ｎ＾は適宜
末梢血球から得られる。胎児ＨＬＡ　ＤＮＡは胎盤細胞
又は羊水から得られる。他のＤＮＡ源は、毛包、ミイラ
等を含む。

ＤＮＡは分解を妨げる条件下で単離される。ＤＮａｓｅ
活性が殆ど又は全く予想されないような条件下で細胞を
プロテアーゼで消化する。消化物をＤＮＡ溶媒で抽出す
る。抽出したＤＮＡは例えば透析又はクロマトグラフィ
ーにより精製され得る。適当なりＮ＾単離技術はＫａｎ
他、Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９７゜１０８
０−１０８４．１９７７及びＮａｔｕｒｅ　２５１．３
９２−３９３．１９７４並びにＫａｎ及びＤｏｚｙ、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７５．５６３１−５６３５．１９７８により記載
されている。

次に、サンプルＤＮ＾のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の第２エ
キソンヌクレオチド配列をＰＣＲにより増幅する。第２
エキソンのフランキング配列はＤＲＢ対立遺伝子間で高
度に維持される。　ＨＬＡ　ＤＮＡに、第２エキソンの
両端で相補的配列にアニールするための２つのオリゴヌ
クレオチドプライマー、Ｔａｑ　ｉ　、ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのような熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼを加える。ＤＮＡは変性し、オリゴヌクレオチ
ドプライマーは相互に向かい合う３“末端を有するその
相補的配列にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼはアニー
ルしたブライマーを伸長させると共に、ブライマーの５
゛末端により規定されるＤＮＡセグメントを増幅させる
。

ＤＮＡ変性、プライマーアニーリング及びプライマーの
５′末端により規定されるＤＮＡセグメント合成のサイ
クルは、本発明の方法の段階（ｉｉ）で使用できるよう
に十分になるまでＨＬＡ−ＩＩＲＢ　ＤＮＡを増幅する
に必要回数反復される。増幅は２０〜４０サイクル、例
えば２５〜３５サイクル継続され得る。

適当な任意のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する
ことができる。ブライマーはＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＤ
ｕ＋複対立遺伝子の増幅、又はこのような対立遺伝子の
特異的増幅に適当であり得る。複対立遺伝子増幅に好適
なプライマーは、 ＧＨ４６（左）：　　ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣにＴＧＴ
ＣＣＣＣＡＣ八ＧＣＡＣＧＧＨ５へ（右）：　ＣＴＣＣ
ＣＣ＾＾ＣＣＣＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣ＾であ
る。

１１Ｌ＾−ＤＲ＋ａ８及び−ＤＲｗ５（ｕ＋１２）の特
異的増幅のためには、Ｇ）１５０を右側ブライマーとし
て使用し、左側ブライマーとして、ＰＬ８／１２：　Ｔ
ＴＣＴＴＧＣ：ＡＣ：ＴＡＣＴＣＴＡＣ（：ＣＧを使用
することができる。

プライマーは、本発明の方法の段階（ｉｉｉ）の分析を
容易にするために標識され得る。プライマーは直接検出
可能なタッグ、例えば放射性核種（例えば３２Ｐ、　３
５Ｓ、　＋４（：又は１２Ｊ）、蛍光化合物（例えばフ
ルオレセイン又はローダミン誘導体）、酵素（ペルオキ
シダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、アビジン又は
ビオチンで標識され得る。２つのプライマーのラベルは
同一でも異なってもよい。

増幅したＤＮＡ、即ちＰＣＲブライマーにより規定され
るようなサンプルＤＮへのＨＬΔ−ＤＲＢ遺伝子の第２
エキソンヌクレオチド配列の増幅産物のフラグメントを
次にサイズに従って分離する。これは、電気泳動又は高
圧液体クロマトグラフィーにより達せられる。分離は支
持体上で実施される。電気泳動の場合、典型的にはポリ
アクリルアミドゲルのようなりＮ八を変性させないゲル
である。

増幅したＤＮＡを各フラグメントのサイズに従ってゲル
上で分離する。電気泳動はフラグメントを所望の程度に
分離するような条件下で実施される。

通常は、サイズの差が約１０ｂｐ程度のフラグメントを
分離する分離度で十分である。フラグメントのサイズを
算定できるようにサイズマーカーもゲル上に泳動させて
もよい。

増幅したＤＮＡフラグメントのサイズ分布、即ち分離パ
ターンは対立遺伝子特異的である。この分離パターン又
はＰＣＲフィンガープリントを次に可視化することがで
きる。ＰＣＲプライマーが標識されている場合、このラ
ベルが明示され得る。分離された標識化ＤＮＡフラグメ
ントを担持する支持体を、ラベルの存在を検出する試薬
と接触させる。

ＰＣＢプライマーを標識しなかった場合、ＰＣＲフィン
ガープリントを担持する支持体を臭化エチジウムと接触
させ、ＤＮＡフィンガープリントを紫外線で可視化させ
る。

こうしてＤＮＡフィンガープリントの長さ多形性が決定
される。これを第２のＤＮＡサンプルのＨＬＡＤＲＢの
第２エキソンヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅から得られ
たＤＮＡフラグメントの長さ多形性と比較する。こうし
て、ＤＮＡサンプルのＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＤｗアロ
タイプ間の対応が得られる。ＤＮＡフラグメントの長さ
多形性が得られたか否か、従って、２種のサンプルのア
ロタイプが同一であるか否かを確認することができる。

第２のＤＮＡサンプルのアロタイプがわかっている場合
、第１のＤＮＡサンプルのアロタイプが同一であるか否
かを認識することができる。

第２のＤＮＡサンプルの長さ多形性は、第１のＤＮＡサ
ンプルの長さ多形性を得るために使用されるのと同一条
件を使用することにより得られる。典型的には同一ブラ
イマーが使用される。しかしながら、必ずしも同一数の
サイクル又は同一反応条件下でＰＣＲ増幅を行う必要は
ない。また、各ＤＮＡサンプルの増幅によって得られる
ＤＮＡフラグメントの長さ多形性の相対対応性を決定す
ることが可能であるならば、得られたＤＮＡフラグメン
トの分離も同様に実施する必要はない。

本発明によると、第２のＤＮＡサンプルは第１のＤＮＡ
サンプルの分析と同時又は別に分析され得る。

実際には、ＲＮ＾サンプルの多重度が分析され得る。

典型的には各サンプルは選択されたサンプルである。選
択された個体からのサンプルを分析することができる。

各サンプルに決定された長さ多形性はコンピュータに保
存され得る。

従って、異なるサンプル、異なるＤＲ及び／又は０ｗ特
異性、又は実際に全ＤＲ及び０ｗ特異性のサイズ分布パ
ターンを含むコンピュータデータベースが作成され得る
。サンプル及び／又は既知のサンプルに決定された異な
るＤＲ及び／又はＤＷ特異性に関してＰＣＲにより生成
したフラグメントの種々の分子寸法をコンピュータにイ
ンプットすることができる。従って、未知のサンプルの
ＤＮＡのＰＣＲ後に形成されるフラグメントのサイズを
参照データベースに比較することにより、あらゆる未知
のＤＲ及び／又はＤｗ型を決定（型別）することができ
る。従って、本発明の方法の段階（ｉｖ）において、第
１のＤＮＡサンプルに関する長さ多形性を、第２のＤＮ
Ａサンプルに関してコンピュータデータベースに保存さ
れた長さ多形性に比較することができる。

ＰＣＲフィンガープリントを別のＰＣＢフィンガープリ
ントに比較し、２つのフィンガープリントを得るために
ＤＮＡを試験した個体が整合するＨＬＡ−ＤＲ及び０ｗ
アロタイプを有するか否かを決定することができる。従
って、本発明の方法は２以上の個体からのＤＮＡサンプ
ルに適用することができる。あるいは、ＰＣＲフィンガ
ープリントを先に得られた標準フィンガープリントに比
較することもできる。

こうして、フィンガープリント間の対応を決定すること
ができる。

本発明の方法は、移植又は輸液の供与体と移植又は輸液
の受容体又は申請受容体とが整合するＨＬΔ−ＤＲ及び
Ｄｕ＋アロタイプを有するか否かを決定するために使用
することができる。供与体と受容体又は申請受容体から
のＰＣＲフィンガープリントを比較することができる。

移植片は心臓、肺、肝臓もしくは腎臓移植片のような組
織移植片又は骨髄移植片であり得る。輸液は輸血であり
得る。従って、同種移植のために血縁又は非血縁の生体
供与体のＨＬＡ−ＤＲ／ＤＷ整合が得られる。

あるいは、本発明の方法は個体の父系決定に使用するこ
とができる。個体、個体の母親及び個体の父親の疑いの
ある対象で得られるＰＣＲフィンガープリントを比較す
ることにより、この決定を行うことができる。また、本
発明の方法は個体がＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＤＩｌｌア
ロタイプに関連する疾患に罹患し易いか又はこのような
疾患に罹患しているか否かを決定するのに使用すること
ができる。このような疾患はＩｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ
、　７０．１−２１８．１９８３に記載されている。

本発明は、（ａ）ＰＣＲでの使用に適しており且つＨＬ
Ａ−ＤＲＢ遺伝子の第２エキソンの夫々の末端で相補的
配列にアニールすることが可能な２つのオリゴヌクレオ
チドプライマーと、（ｂ）コントロールＤＮＡ及び／又
はコントロールＰＣＢ増幅産物とを含むテストキラＩ・
も提供する。

プライマーは上記のように標識され得る。コントロール
ＤＮＡ及びコントロールＰＣＲ増幅産物も典型的には標
識され得る。キット更に、Ｔａｑ　■のような熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰ、並びに選択されたＤＮＡサンプルのＰＣ
Ｒ増幅により生成されるＤＮＡフラグメントの長さ多形
性を含むデータベースの１以上を含み得る。

データベースに保存される長さ多形性は、既知のＤＲ及
び／又はＤｗ特異性のＤＮＡサンプルの多形性であり得
る。従って、データベースは既知のＤＲ及び／又はＤＩ
ｌｌアロタイプ、実際には入手可能なあらゆるこのよう
なアロタイプのＰＣＲフィンガープリントを含み得る。

第２．３及び５図（ＤＲ又は０ｗアロタイプ）又は第４
図（これらのアロタイプの可能な組み合わせ）に示すよ
うな長さ多形性はこうしてデータベースに含まれ得る。

以下、添付図面を参考に実施例により本発明を説明する
。

第９回及び第１０回国際組織適合性研究会Ｎ１ｎｔｈａ
ｎｄ　Ｔｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ旧ｓｔ
ｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＷｏｒｋｓｈｏｐｓに参
加した実験室、又は適宜、英国、Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗ
ｎに所在のＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　
ｏｆΔｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓがら、
ＤＬ八−Ｄｒ／Ｄｕ＋対立遺伝子にヘテロ接合性の十分
に特徴付けられたＢＬＣＬを入手した。ｌ（ＬΔ−ＤＲ
／ＤＩ１１へテロ接合細胞はＥ、Ｂｉｄｕ＋ｅｌ１女史
（英国、Ｂｒ１ｓｔｏｌに所在のＵｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎ
ｇｄｏｍＴｒａｎｓｐｌａｎｔ　５ｅｒｉｖｅ）により
特徴付けられたものを入手した。）ＩＬ＾−ＤＲ及び０
ｗアロタイプは従来の記載（Ｂｉ＋（ｕｅｌｌ、　Ｉ＋
＋＋ｍｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ　９．１８−２３．１９
８８；Ｂｉｄｗｅｌｌ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ
ｏｎ　４５．６４０−６４６．１９８８）に従って短い
ＤＲＢ、　ＤＱＢ及びＤＱＡｃＤＮ＾プローブを使用し
てＴａｑ　Ｉ消化ゲノムＤＮＡのＲＦＬＰ型別により確
認した。

匹紐１１ 反応混合物（１０ｈｆｆｉ＞は文献（Ｂｉｄｗｅｌｌ他
、１９８Ｂ）の記載に従って調製したゲノムＤＮ＾ｌｕ
ｇ（ＢＬＣＬの場合）又は２μｇ（ＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｗ
ヘテロ接合細胞の場合）、１０ｍＮＴｒｉｓ−ＨＣＩ、
　ｐＨ８，３，１，５＋ａＭ　ＭｇＣＬ、　０．０１％
（、／Ｖ）ゼラチン、ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ各０．２ｍＭ、並びにＨＬＡ−ＤＲＢ遺
伝子の第２エキソンの５′（左）及び３′（右）オリゴ
ヌクレオチドプライマー各１μ−を含有するものとした
。使用したブライマーは、（ａ）複対立遺伝子増幅の場
合はＧＨ４６（、左、ヌクレオチド配列５’　ＣＣＧＧ
ＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ３’
　）（Ｓｃｈａｒｆ他、Ｈｕｍａｎ、　　ｒｍ＋＋＋ｕ
ｎｏ１．　垣、　６１−６９．１９８８）とＧＨ５０（
右、ヌクレオチド配列５’　ＣＴＣＣＣＣ＾＾ＣＣＣＣ
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ３’　）（Ｓｃｈａｒ
ｆ他、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２２．６１−６
９゜１９８８）、（ｂ）■Ｌ＾−ＤＲｗ８及びＤＲｗ５
（ｗ１２）の特異的増幅の場合はＰＬ８／１２（左、ヌ
クレオチド配列５’　ＴＴＣＴＴＧＧ＾ＧＴＡＣＴＣＴ
ＡＣＧＧＧ３’　）とＧＨ５０（右）である。組み合わ
せ増幅の場合は、ＧＨ４６、ＰＬ８／１２及びＧｌ（５
０各１．Ｍを使用した。混合物を５分間９４℃に加熱し
、２分間氷上に置き、２，５単位のＴａｑポリメラーゼ
（米国、ＮｏｒｗａｌｋＣＴＯ６８５９に所在のＰｅｒ
ｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を加えた。

プログラマブルサイクリック反応器（米国、ＳａｎＤｉ
ｅｇｏ、　Ｃ＾９２１２１に所在のＥｒｉｃｏｍｐ　Ｉ
ｎｃ、）を使用してＤＮＡ増幅を実施した。増幅サイク
ルパラメータは６０秒間の９４℃く第１図（ｄ））、９
０秒間の冷却傾斜部（第１図（ｅ））、１２０秒間の６
５℃（第１図（ｆ））、７０秒間の加熱傾斜部（第１図
（ａ））、１２０秒間の７２℃（第１図（ｂ））及び１
６０秒間の加熱傾斜部（第１図（Ｃ））とした。３５回
の増幅サイクル後、７２℃の加熱段階を１０分間行った
。

ポリアクリルアミドゲル　　゛ 特許製品である鉛直ミニゲル電気泳動システム（米国、
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾９４８０４に所在のＢｉｏ−
ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）を使用して非変性
ポリアクリルアミドミニゲル（ＩＸＴＢＥ（８９＋ｎＭ
　Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　ｐＨ８，ｏ）中の１２％−／ジアクリルアミド：
Ｎ、Ｎ’−ビスアクリルアミド（２９：１））中で、Ｐ
ＣＲ増幅したＤＮＡのアリコート（１０μりを２００ボ
ルトで９５分間電気泳動にかけた。形成されたゲルの寸
法は８２ｍｍ（ｗ）　Ｘ　７２ｎｕａ（ｈ）　Ｘ　０．
７５ａｕａ（ｄ）であり、３ｍｍ（ｕ＋）Ｘ１０＋ａｍ
（ｈ）　Ｘ　０．７５＋ａｍ（ｄ）の寸法の１５個のサ
ンプルスロットを含んでいた。電気泳動後、臭化エチジ
ウム（０，５同／ｉｌ）を含有するｌ　Ｘ　ＴＢＥにゲ
ルを３０分間浸漬させ、３０２ｎｍ紫外線の徹照器を使
用してＤＮＡを可視化した。再増幅実験のためにＤＮＡ
をポリアクリルアミドゲルから切り出し、等速電気泳動
及びエタノール沈澱により精製した。上記と同一条件を
使用してアリコートを再増幅した。

１ ＨＬＡ−ＤＲ０ｗホモ　ム　　のＰＣＲフィン　−プリ
ントＨし＾−ＯＲ及びＤｕ＋アロタイプの決定のための
簡単且つ再現可能な分子方法を確立するために、ＰＣＲ
増幅技術を使用して対立遺伝子特異的配列を増幅した。

肌＾−ＤＲＢ遺伝子の第２エキソンに特異的なＧＨ４６
及びＧＨ５０プライマーを使用して一連の）ＩＬ＾−Ｄ
Ｒ／Ｄｕ＋ホモ接合ＢＬＣＬからＤＮＡを増幅すると、
個体ＨＬＡ−ＤＲ血清型に関連する多形性ＰＣＢ産物（
ＰＣＲフィンガープリント）の対立遺伝子特異的パター
ンを形成することができた（第２図）６更に、アロ反応
性Ｔ＃ｌ胞（ＤＷアロタイプ）及びＤＮＡ−ＲＦＬＰ型
別により規定されるＨＬＡ−肝性異性のスプリットは別
の対立遺伝子特異的ＰＣＲフィンガープリントをもたら
した。各ＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｗ特異性に関して同一の表現
型のＢＬＣＬ群を試験した処、各群は同一のＰＣＢフィ
ンガープリント（図示せず）を示した。ＰＣＲフィンガ
ープリントは一次産物（一連のＩＩＬ＾−ＤＲＢ遺伝子
の第２エキソンヌクレオチド配列から予想される２７１
ｂｐ）と、より高分子量の多重産物（以下、サテライト
ＤＮＡと呼称する）とから構成されていた。ＨＬＡ−Ｄ
Ｒｗ８ホモ接合ＢＬＣＬ（下記参照）以外に、２９０ｂ
ｐ〜１０００ｂｐの範囲の対立遺伝子特異的多重サテラ
イトＤＮＡが観察された。サテライトＤＮＡの１つのク
ラスター（６５０ｂｐ〜１０００ｂｐ）はＨＬＡ−ＤＲ
４、ＤＲ７及びＤＲ９に関連する超型別ＨＬＡ−Ｄｒｗ
５３血清学的特異性に相関することが判明したく第２図
、レーン７〜１１．１９〜２１及び２４）。

ＨＬＡ−ＤＲＤ四へ一ロ　ム　　のＰＣＲフィン　−ブ
）ン上− ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＩＩｌホモ接合及びヘテロ接合細胞の
ＰＣＲフィンガープリントを比較するために実験を行っ
た。

その結果、ＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｗヘテロ接合細胞のＰＣＲ
フィンガープリントは対応するＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｗホモ
接合細胞に観察されるパターンの単純な和から完全には
予想できないことが判明した（第４図及び第５図）。

しかしながら、前者のＰＣＲフィンガープリントはＰＣ
Ｒ増幅前の対応するＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｕ＋ホモ接合細胞
からのＤＮＡを予備混合することにより確実に再現可能
であった。第４図は５つのこのような代表的実験結果を
示す。こうしてＤＮＡを予備混合することにより、コン
トロールＤＮＡとして使用されるようなＨＬＡ−ＤＲ／
ＤＩｌｌ特異性の所定の組み合わせを構築することがで
きる。

ＨＬＡ−ＤＲ…１０ホモ接合細胞については何ら記載さ
れていないので、本発明者らはＩＴＬ＾−ＤＲ２１０ヘ
テロ接合個体のＰＣＲフィンガープリントの分析により
この特異性を試験した。検討した各ケースにおいて、独
特のＰＣＲフィンガープリントが観察されたが、ＨＬＡ
−ＤＲｗｌＯ特異的サテライトＤＮＡバンドの一致は観
察されなかった（第３図）。

ＨＬＡ−ＤＲｗ８ホモ接合ＢＬＣＬのＰＣＲフィンガー
プリントは一次（２７１ｂｐ）産物を示したが、検出可
能なサテライトＤＮＡを示さず（第２図、レーン２２及
び２３）、ＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｕ＋ヘテロ接合個体におけ
るＨＬＡ−ＤＲｗ８対立遺伝子の認識には潜在的困難が
あることが判明した。そこで、対立遺伝子特異的増幅の
目的で５゜（左）ＰＣＲプライマーを構築した。このプ
ライマーＰＬ８／１２（材料及び方法の項参照）はＦＩ
Ｌ＾−Ｄｈ＋８及びＤＲ…５（ｗ１２）ＤＲＢＩＩｌ伝
子の第２エキソンの５′−配列のみに相補的である。Ｈ
し＾−ＤＲ／Ｄｕ＋ホモ接合及びヘテロ接合細胞の拡張
パネル（図示せず）にＰＬ８／１２の特異性が確認され
、ＨＬＡ−ＤＲｗ８及びＤＲ２５（ｗ１２）陽性細胞は
ブライマーアニーリング位置から予測されるように２４
２ｂｐの一次増幅産物を示した（第５図、レーン２及び
４）。しかしながら、ＧＨ４６及びＧＨ５０ブライマー
によるＰＣＲ増幅にＰＬ８／１２プライマーが含まれよ
うが含まれまいが、得られるＰＣＲフィンガープリント
に影響しなかった。試験した他の全ＨＬΔ−ＤＲ／ＤＩ
Ｉｌへテロ接合細胞については、該当するホモ接合細胞
に観察されない別の独特のサテライトＤＮＡバンド（第
５図、レーン５〜１３）が示された。こうして、対立遺
伝子特異的ＰＣＢプライマーに頼ることなく　、ＨＬＡ
−Ｄｒ／Ｄ１１ヘテロ接合体におけるＨＬＡ−ＤＲｖＭ
８特異性を認識することができた。

した　テライトＤＮＡ　　からの−”　ＰＣＲ産　の観
察されるサテライトＤＮＡ配列の可能な起源を調査する
ために、−次（２７１ｂｐ）産物バンド及びサテライト
ＤＮＡバンドをポリアクリルアミドゲルから切り出し、
精製し、上記のように再増幅した。

ＨＬＡ−ＤＲＩホモ接合細胞系ＢＡＦからの一次産物バ
ンドを再増幅した処、ゲノムＤＮへの増幅後に観察され
るサテライトＤＮＡ配列を再生することができず（第６
図（ａ））、従ってこれらのサテライトはフランキング
ＤＮＡから分離されるＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の第２エキ
ソンの配列によるものではないと考えられる。

ＨＬＡ−ＤＲ３（ｕ＋１７）ホモ接合細胞系Ｃ＾＾−０
からの精製サテライトＤＮＡバンドを再増幅した処、ゲ
ノムＤＮＡＰＣＲフィンガープリントで観察される低分
子量、バンドが再増幅した各バンドに再生された。即ち
、上部のサテライ１〜＜Ｕ＞バンドから一次産物（Ｐ）
及び下部サテライト（Ｌ）バンドが再生され、Ｐバンド
はＬバンドから再生された（第６図（ｂ））。このこと
から更に判断すると、サテライトＤＮＡバンドは夫々Ｐ
配列の一部又は全部を含む１組の組重ね代配列（ｎｅｓ
ｔｅｃｌ　ｓｅｔ　ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）から構
成され得る。

全長ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子ｃＤＮ＾クローンからサテラ
イ）　ＤＮＡ配列を生成することができたか否かを試験
するために、ＤＲ９ハブロタイブからのゲノムＤＮΔ及
びｃＤＮ＾の増幅産物を比較した。Ｐ配列のみがｃＤＮ
＾ＤＮＡンから生成され（第６図（Ｃ））、サテライト
ＤＮＡを生成するためには特異的なフランキング配列が
必要であることはこのことからも明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＣＢ増幅中のサンプル温度を示す。ＩＰＣＲ
サイクルを示す。サイクルセグメント（ａ）〜（ｆ）の
長さについて−は実施例中に説明する。 第２図はＨＬＡ−ＤＲ／Ｄｕ＋ホモ接合Ｂ−リンパ芽球
細胞系（ＢＬＣＬ）のＰＣＲフィンガープリントを示す
。ＧＨ４６及びにＨ５０のＰＣＲブライマーを使用して
ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の第２エキソンの配列を増幅した
。Ｍｌ及びＭｌは分子サイズマーカー（阿１はバクテリ
オファージλのＢｓｔＥｎ消化物、ＭｌはｐＢＲ３２２
のＭｓｐ　ｌ消化物であり、分子サイズは塩基対（ｂｐ
）で表す）である。図中ニ示した細胞ハ、レ−’ｙ　１
カＢＡＦ（ＥＣＡＣＣ８７０３３００１）、レーン２が
ＣＩ（９ｗ０２０１）ルー’Ｊ３がＢＧＥ（９ｕ＋１２
０１）、レーン４がＲＭＬ　（１０ｗ９０１６）、レ−
’ｙ　５カＣＡＡ−０（ＥＣＡＣＣ８５０５１６２６）
、レーン６カＱＢＬ（ＥＣＡＣＣ８５０２２８０７）、
レーン７がＢＯＢ−２、レーン８がＴＳ−１０（９ｗ１
００５）、レーン９がＳＳＴＯ（９ｗ１３０３）、レー
ン１０がＬＳ−４０（９ｗ１４０３）、レーン１１がＲ
ＡＳ−１５（９Ｗ９９０２）、レーン１２がＲＡＧ、レ
ーン１３がＪ−ＳＩＮ（Ｔ２９６３９：　Ｅ、　Ｂｉｄ
ｕ＋ｅｌｌがら入手）、レーン１４がＨＢＳ（９ｕ＋０
６０１）、Ｌｙ−ン１５がＥＭＪ　（９ｗ０６０６）、
レーン１６がＪＴＥＤ　（９ｕ＋０６０３）　ルー　ン
１７カＨＡＧ　（９Ｉｕ１８０２）、レーン１８がＢＲ
Ｕ（９ｗ０９０１）、レーン１９がＰＩＴ（９ｗ０７０
４）、１ｉ−ン２０カＢＨ１３（９ｕ＋１９０１）ルー
フ２１カＫＩＪ（９ｗｌ１０４）、レーン２２がＢＡＥ
（９ｗ０８０７）、’ｖ−ン２３がＬＵＹ（９ｕ＋０８
０５）、レーン２４がＤＫＢ　（９Ｉ１１及び１０ｗ：
第９回及び第１０回国際組織適合性研究会Ｎ１ｎｔｈ　
ａｎｄ　Ｔｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｌｏｎａｌ　Ｈｉ
ｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　１ｉｌｏｒｋｓｈ
ｏｐリファレンス番号、ＥＣＡＣＣ：　Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ＡｎｉｍａＣｅｌｌ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓリファレンス番号）である。ＨＬＡ
−ＤＲ及び０ｗアロタイプを示し、分かり易くするため
に研究会（ｗ）プレフィクスは省略した。適宜ＲＦＬＰ
で規定したスプリットも示す。 第３図はＨＬＡ−ＤＲｗｌＯ陽性へテロ接合細胞のＰＣ
Ｒフィンガープリントを示す。図中に示した細胞は、レ
ーン１がＣＩ（９ｗ０２０１）、レーン２がＣ１６４、
レーン３がＢＯＢ−２、レーン４がＣ１１０３、レーン
５がＫＲＯ（９ｗ０９０５）、レーン６がＲ２８７、レ
ーン７がＢＵＰ（９ｕ＋０７０２）、レーン８がＲ２９
５である。ＤＲ血清学的特異性を示す６Ｍは分子サイズ
マーカー（ｐＢＲ３２２のＭｓｐ　ｌ消化物）である。 使用したプライマー及び略記は第２図と同様である。 第４図はＨＬＡ−ＤＲ／ＤＷヘテロ接合細胞のＰＣＲフ
ィンガープリントを示す。示した５群の細胞の各々につ
いて、ホモ接合及びヘテロ接合細胞のＰＣＲフィンガー
プリントを比較する。阿はＰＣＲ増幅前に混合した２つ
のホモ接合細胞からのＤＮＡ（各ＤＮ＾０．５ｕｙ）で
ある。ＨはＨＬＡ−ＤＲ／ｌｈへテロ接合個体からのＤ
ＮＡである。図中に示した細胞はレーン１がΔＬ（９ｕ
＋０１０１）、レーン２がＢＯＢ−２、レーン３が＾Ｌ
及びＢＯＢ−２、レーン４がＣ８４、レーン５がＣＩ（
９ｗ０２０１＞、レーン６がＢＯＢ−２、レーン７がＣ
Ｉ及びＢＯＢ−２、レーン８がＣ６５０、レーン９カＣ
ＡＡ−０（ＥＣＡＣＣ８５０５１６２６）、Ｉｙ−ン１
０がＢＯＢ−２、レーン１１がＣＡＡ−０及びＢＯＢ−
２、レ−ン１２がＣ５０８、レーン１３がＫＲＯ（９ｗ
０５０５）、レーン１４がＢＯＢ−２、レーン１５がＫ
ＲＯ及びＢＯＢ−２、レ−ン１６カＣ５９５、レーン１
７がＢＵＰ　（９ｕ＋０７０２）、レーン１８がＢＯＢ
−２、レーン１９がＢＵＰ及びＢＯＢ−２、レーン２０
がＣ６６７である。ＩＩＬΔ−ＤＲ血清学的特異性を示
す。使用したプライマー及び分子サイズマーカーＭｌ及
びＭｌは第２図と同様である。 第５図はＨＬＡ−ＤＲ…８陽性細胞のＰＣＲフィンガー
プリントを示す。使用したＰＣＲブライマーの組み合わ
せは、ａがＧＨ４６とＧＨ５０、ｂがＰＬ８／１２とＧ
Ｈ５０、ＣがＧＨ４６とＰＬ８／１２とＣＩ（５０であ
る。ＤＲｗ８及びＤＲｗ１２の対立遺伝子特異的増幅を
示す（夫々レーン２及び４）。 他のＤＲハブロタイブの増幅は観察されなかった（図示
せず）。図中に示した細胞は、レーン１及び２がＢＡＥ
（９ｗ０８０７）、レーン３及び４がＪ−ＳＩＮ（Ｔ２
９６３９）、レーン５がＢＯＢ−２、レーン６及び７が
Ｃ８１０、レーン８がＲへＧ、レーン９及び１０がＣ２
４６、レーン１１がＪＴＥＤ　（９ｗＯ６０３）、レー
ン１２及び１３がＣ３７２である。）ＩＬ＾−ＤＲ血清
学的特異性を示す。分子サイズマーカーＭ１及びＭ２は
第２図と同様である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ）第１のＤＮＡサンプルのＨＬＡ−ＤＲＢ遺
   伝子の第２エキソンヌクレオチド配列のポリメラーゼ鎖
   反応（ＰＣＲ）増幅を実施する段階と、（ｉｉ）該増幅
   から得られたＤＮＡフラグメントをサイズに従って分離
   する段階と、（ｉｉｉ）こうして分離したＤＮＡフラグ
   メントの長さ多形性を決定する段階と、（ｉｖ）こうし
   て決定した長さ多形性を、第２のＤＮＡサンプルの該Ｈ
   ＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の第２エキソンヌクレオチド配列の
   ＰＣＲ増幅から得られたＤＮＡフラグメントの長さ多形
   性と比較する段階とを含むことを特徴とするヒトＨＬＡ
   −ＤＲ及び／又はＤｗアロタイプ整合方法。
2. （２）夫々放射性核種、蛍光、酵素、アビジン又はビオ
   チンラベルを有する２つのオリゴヌクレオチドプライマ
   ーで段階（ｉ）を実施することを特徴とする請求項１に
   記載の方法。
3. （３）【遺伝子配列があります】、及び【遺伝子配列が
   あります】【遺伝子配列があります】のヌクレオチド配
   列を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを段階
   （ｉ）で使用することを特徴とする請求項１又は２に記
   載の方法。
4. （４）段階（ｉ）でＰＣＲ増幅を２５〜３５サイクル実
   施することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項
   に記載の方法。
5. （５）段階（ｉｉ）を電気泳動又は高圧液体クロマトグ
   ラフィーにより実施することを特徴とする請求項１から
   ４のいずれか一項に記載の方法。
6. （６）ＤＮＡを変性させないポリアクリルアミドゲル上
   でＤＮＡフラグメントを電気泳動にかけることにより段
   階（ｉｉ）を実施することを特徴とする請求項５に記載
   の方法。
7. （７）移植片又は輸液の供与体からのＤＮＡサンプルと
   、移植片又は輸液の受容体又は申請受容体からのＤＮＡ
   サンプルについて段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）を実施し、こ
   うして決定した長さ多形性を段階（ｉｖ）で比較し、供
   与体と受容体とが整合するＨＬＡ−ＤＲ及びＤｗアロタ
   イプを有するか否かを確認することを特徴とする請求項
   １から６のいずれか一項に記載の方法。
8. （８）（ａ）ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の第２エキソンの夫
   々の末端で相補的配列にアニールすることが可能な２つ
   のオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｂ）コントロー
   ルＤＮＡ及び／又はコントロールＰＣＲ増幅産物とを含
   むことを特徴とする、ヒトＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＤｗ
   アロタイプ整合用テストキット。
9. （９）プライマーが夫々放射性核種、蛍光、酵素、アビ
   ジン又はビオチンラベルを有することを特徴とする請求
   項８に記載のキット。
10. （１０）更に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はｄ
    ＡＴＦ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むことを
    特徴とする請求項８又は９に記載のキット。