JPS59500352A

JPS59500352A - Ｍｈｃ遺伝子によりコ−ドされる組織タイプの決定方法

Info

Publication number: JPS59500352A
Application number: JP58501036A
Authority: JP
Inventors: ペテルソン・ペル・ア−ツル; ラスク・ラ−ス; レルンマ−ク・オ−ケ; オウア−バ−ク・デイビツド
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1982-03-11
Filing date: 1983-03-11
Publication date: 1984-03-08
Also published as: WO1983003260A1; EP0103000B1; EP0103000A1; DE3375160D1; DK105582A; JPH0427840B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＭＭＣ遺伝子によυコードされる組織タイプの決定方法本発明は、ヒトのＭＨＣによる組織のタイプ分けの決定あるいは遺伝子地図作成の方法および手段、換言すればヒトのＭＭＣの多形性の決定の方法および手段に関する。

ｒＭＨｃ」（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｊｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ）すなわち（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａ）すなわちヒト白血球、Ｉ％Ａとも呼ばれる。ＭＨＣおよびＨＬＡ−Ｃｏｍｐｌｅｘは共に一般的に受容されている用語である〔例えばＣ，Ｗ、　Ｐａｒｋｅｒ氏編ｒＣ］ｊｎ−■ｍｍｕｎｏ１．Ｊ第１巻第６３〜８０頁、（Ｗ、　Ｂ、サランダース社１９８０年刊）参照〕。

ＭＨＣはヒトの第６染色体上に存在する１区域で、真宗移植拒絶反応その他の免疫的および体液的応答を含む多くの免疫学的現象に関与する生産物をコードする遺伝子を含んでいる。現在知られているＨＬＡ遺伝子は、２種類の主要なカテゴリーに分けられる。すなわちＨＬＡ−Ａ、　ＢおよびＣ組織抗原は、大多数の有核細胞について発現される糖蛋白質（抗原）の生成を支配する少なくとも５か所の異なる遺伝子座の存在を反映する。これらの抗原は「第１群抗原」と呼ばれる。他のセットの遺伝子例えばＨＴ、Ａ−ＤまたはＤＲ（Ｄ−関連）およびＤＣ遺伝子（以下総括的にｒ　ＨＬＡ−Ｄ遺伝子」と呼ばれる）は、いわゆる「第■群抗原」の形成を支配する。これらの抗原は限定された組織分布を有する。すなわち第■群抗原はそれらが主として免疫系の細胞上に現われるであろう点において第１群抗原と異なる。数種類の補体成分もまたＭＨＣにおいてコードされる。これらの成分は「第■群分子」と呼ばれる第３のグループの物質類を構成する。

ヒトの第６染色体の短腕上にあるＭＨＣの模式的構成を下記に示す。

Ｃｅ　Ｄ　Ｃｆ　Ｂ　Ｃｏ　−−−−−−−−−− セントロメア（Ｃｅ）は左方にある。Ａ、　Ｂ、　Ｃおよびその他の未確認の遺伝子座はすべて第１群抗原の重い鎖をコードするのに対し、Ｄ遺伝子座はＤＲ，ＤＣおよびその他の第■群抗原のαおよびβ鎖をコードする。

ＨＬＡ抗原の構造および組織分布ＭＨＣのＡ、ＢおよびＣ遺伝子座においてコードされる第１群抗原は、はとんどすべての有核細胞上に現われる。

しかし量的な発現度はタイプの異なる細胞の間で著しく異なる。

第１群抗原の構造は詳細にわたって解明されている。

すべての第１群抗原は１本の重い鎖と１本の軽す鎖よりなる。ＭＨＣにおいてコードされる重い鎖は、グリコ／ル化されたポＩＪ　６プチドであり、それは原形質膜にまたがり、そのＣ０ＯＨ末端部の一部を膜の細胞質側に提示する。

第１群抗原の軽い鎖は、どの対立遺伝子産物と結合していようとも差異はない。

β２−ミクロクロプリンとも呼ばれる軽い鎖は、ヒトの第１５染色体によりコードされ、従ってその遺伝子はＭＨＣには属しない。

第１群抗原の蛋白質構造、生合成およびゲノム構造は第１群抗原に関するほど詳細には知られていない。しかし第１群抗原はα鎖およびβ鎖とよばれる２本の不同で非共有結合的に結合され、膜にまたがるグリコポＩＪ　６プチドよりなる。

これらのポリはプチドをコードする遺伝子がＭＨＣの９区域の一部であることは非常に可能性が大きい。ともあれ、ＤＲおよびＤＣ遺伝子座のα鎖とβ鎖が共にＭＭＣにおいてコードされることは決定的に確立された。

第１群抗原は、第１群抗原よりも限定された組織分布を示す。第１群抗原に富む細胞は抗原を造成する樹状細胞、・マクロファージ、抗体を産生ずるＢ−淋巴球および活性化Ｔ細胞である。さらに第１群抗原は数種類のタイプの上皮細胞の表面に出現する。

ＨＬＡ遺伝子座の多形性ＨＬＡ抗原は、補体成分を支配する遺伝子は第１群および第１群抗原をコードする遺伝子よりも多形性の程度は低いが、それでも大部分の遺伝子座において広範囲に遺伝的多形性を示す。ＨＬＡ抗原の多形性は、多数のＨＬＡ半数体タイプの出現によシ細胞集団レベルにも反映されている。それぞれのＨＬＡ半数体タイプは、遺伝子の一定のセットを表わし、そのすべてはメンデルの法則に従って遺伝する。ＨＬＡ半数体タイプの多様なことは、実質的にすべてのＭＢＣ遺伝子座は多数の対立遺伝子を表現するという事実からの帰結である。対立遺伝子は類似ではあるが互いに異なり、しかし異なるＨＬＡ半数体タイプにおいて同じ位置を占める。正常な個体は１箇所の遺伝子座において２個の対立遺伝子を発現するのみである。しかし細胞集団全体ではそのような遺伝子座において多数の対立遺伝子を発現し得る。現在のところ約２５の対立遺伝子がＨＬＡ−Ａ遺伝子座において同定され、Ｂ遺伝子座において約同数、Ｃ遺伝子座において約１０、そしてＤ遺伝子座において合計約１５が同定された。［Ｗ、Ｆ、　Ｂｏｄｍｅｒ氏編ｒＢｒ１ｔ、　Ｍｅｄ、　Ｂｕｌｌ、Ｊ第３４巻第６頁（１９７８年）参照〕。組換えＤＮＡ法は、ＤＲ遺伝子座のただ１種類のα鎖のみが同定されたのに対してＤＲ遺伝子座に由来するβ鎖は遺伝的に多形性であることを示した。対照的にＤＣ遺伝子座のα鎖およびβ鎖は共に遺伝的に多形性であるらしい。

新たな対立遺伝子が数多く発見されるので、対立遺伝子の確定的な数は示され得ない。さらにまた新たな対立遺伝子を定義するために用いられる特別な血清学的試薬の特異性を検討する面倒をいとわぬ国際的協力が確立されるにつれて最近発見された対立遺伝子が以前に発見されたものと同一であると判明することもあり得る。しかしながら、細胞集団中における数多くの対立遺伝子およびそれらの頻度分布からすれば、同一の遺伝子のセットを共有する遺伝的に関係のない２個体すなわち同一のＨＬＡ半数体タイプｔ−表わす個体を見出すことは異例である。

１対の対立遺伝子は、ポリｇプチド鎖として発現されるに必要なすべての遺伝情報を包含するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）　（Ｄ断切（セグメント）よりなる。

すなわちヌクレオチド配列の異ガる対立遺伝子は、異なるホＩＪ　ｇプチド鎖を生成せしめ得る。しかしながら、もしヌクレオチド配列の差異が翻訳のレベルにおいて「サイレント」（無言である場合には、同一のホリ×プチド鎖が異なる対立遺伝子から由来することもあシ得る。さらにまた対立遺伝子の間のヌクレオチド配列の差異は、それがイントロン内またはエクソンの翻訳されない部分内に生ずる場合には４　ＩＪ　スプチド鎖配列に影響しないであろう。従って、ＤＮＡのレベルにおいて認められた対立遺伝子が対立遺伝子として出現せず、蛋白質のレベルにおいて同一の遺伝子の産物として出現することもあり得る。ポリｇプチド鎖多形性のこの限界にもかかわらず、ＭＭＣの種々の遺伝子座における多数の対立遺伝子が、対立遺伝子に由来する蛋白質の血清学的分析により発見された。

現況における組織タイプ分けの示唆ＭＭＣ遺伝子座によりコードされる産物を同定する組織タイプ分けは、生物医学の多くの分野において多大の重１Ｒ４ｆ有する。本来ＭＨＣにおいてコードされる蛋白質は移植された組織の拒絶を起す過程に深くかかわっていることが示された。「移植抗原」という名称はこの知識に根のヲ有する。供与者と被供与者とがＭＭＣについて適合することが、移植片の生存を予察する上に価値のあることが速やかに理解された。対立遺伝子を適合させるためには、ＤＮＡでなく蛋白質を検査する限りにおいては間接的方法が用いられる。この操作は組織のタイプ分けと呼ばれる。

移植抗原に対する興味は、若干のＭＨＣ対立遺伝子とある種の疾患との間に相関が存在することが認められたときにさらに増大した。すなわちインシュリン依存性糖尿病は、対立遺伝子Ｄｗ３および／またはＤｗ４を有する個体に広１つているのに対し、対立遺伝子Ｄｗ２　ｆ有する個体はこの疾患に対して耐性であるらしい（第１表参胛）。

従って組織タイプ分けは、個体のレベルにおいである種の疾患にかかる相対的危険度を予察するために用いられ得る。このことは、例えば各個人にある種の職業的危険物を避けるように助言する上で重要性を有する。組織タイプ分けは、法医学においてもその全面的価値はまだ理解されていないが、特に父親認知の訴訟において価値が大きい。最終的に若干の自然的流産と父親および母親のある特定のＨＬＡ半数体タイプとの間に相関が存在することが観察されている。

組織タイプ分けの価値ある場合の３例を下記に詳しく記述する。すなわち１）例えば接値された骨髄、腎臓およびその他の器官の生存可能性は、供与者と被供与者のＨＬＡタイプに依存する。

２）輸血における血液要素の生存可能性は、供与者と被供与者のＨＬＡタイプに影響される。

３）ある種の疾患にかかり発病する可能性はＨＬＡタイプに関係がある。

移植例えば腎臓移植を受ける患者の蛋白質レベルにおけるＨＬＡタイプ分けは、移植片の生存可能度が供与器官と被供与者のＨＬＡタイプの適合性に依存することを明らかにした。ＨＬＡが同一である兄第姉妹の間の腎臓移植は、ＨＬＡが同一でない兄第姉妹の間の移植よりも移植臓器の生存率が高いことがわかった。最近の結果は、ＨＬＡ−Ｄについての適合が受容された移植片における高率の成功をもたらすことを示唆する。事実、腎臓供与者と被供与者が同一のＨＬＡ−ＤＲタイプを有する場合には、移植腎臓の９０係の生存が得られることが見出された。ＨＬＡ−Ｄにおける些少な差異でさえも、移植腎臓の拒絶をもたらす免疫応答を引き起すに足ると考えられる。免疫応答は複合的であり、第■群抗原依存性の機作においては警報を発しまた細胞分解性の淋巴球および移植された組織に対する抗体の発達を促進するいわゆるＴ補助細胞の活性化を包含することを指摘すべきである。

輸血ある種の血液細胞欠乏症における輸血もまた蛋白質しくルにおけるＨＬＡタイプの適合により影響される。ある種の血小板異常症において、輸血による置換療法はしばしば血小板の表面において発現されるＨＬＡ抗原に対抗する細胞毒性の抗体の形成をもたらす。この反応は供与者および被供与者の血液のＨＬＡ−ＤＲの適合により防止され得る。

罹病感受性発病がある特定のＨＬＡ抗原に関係している可能性をテストするために多くの疾患が研究された。罹病している個体群中におけるある抗原の頻度が健康な対照個体群中における同一のＨＬＡ抗原の頻度と比較された。ある特定のＨＬＡ抗原と疾患との連係の程度を、［相対的危険度Ｊ　（ＲＲ）として表わす。相対的危険度は、ある特定の抗原を有する個体群において、対照個体群の何倍の頻度で疾患が発生するかを示す。ある特定のＨＬＡ抗原に関係することが明らかになった多くの疾患を下記の表に総括する。この主題について数篇の総説が利用可能であるｌＪＩｍｍｕｎｏ１ｏｇ］ｃａＩＲｅｖｉｅｗＪ第７０巻第１〜２１８頁（１９８３年）参照〕。

本件特許出願中に提示された結果によれば、これら若干の疾患の進行および発症はＭＨＣ’ｉｉ７コードするＨＬＡ抗原の１個またはそれ以上の遺伝子の構造および発現に関係すると考量され得る。

組織タイプ分けのための現状の方法組織のタイプ分け、すなわち細胞表面において発現されるある特定のＨＬＡ対立遺伝子の決定は、従来間接的方来する蛋白質が（ＤＮＡではなく）検査されるからである。

これは面倒な操作であり、それぞれの移植抗原に対抗して特異な反応をする抗血清を用意せねばならない。若干のＨＴＪＡ遺伝子座において発現される対立遺伝子の決定には、同型接合のタイプ分は細胞が用いられる。両者の方法ともしばしば質が不良でまた直ちには得られない試薬５　を要することが容易に理解される。

第　１　表ＨＬＡと疾患との関係強直性背椎炎　Ｂ２７　Ｂ、６　８９　９０．１ライタ一氏症候群　Ｂ２７　Ｂ、６．　７７　３５．９急性前部ぶどう膵炎　Ｂ２７　Ｂ、６　４７　９．４リウマチ性関節炎　Ｄｗ４　１９．４　４８　３．９多発性硬化症　Ｄｗ２　２５．８　６０　４．３重症筋無力症　Ｂ８　２３．７　５６４．１腹　腔　症　ＤＷ３　２６．３　９６　７５．０ヘルハス様皮膚炎　Ｄｗ３　２６．３　Ｂ５　１３．５慢性自家免疫肝炎　Ｄｗ３　２６．３　７１　６．８シラ力症候群　Ｄｗ３　２６．３　８７　１９．０特発性アジソン氏病　Ｄｗ３　２６．３　７６８．８グレ一プス氏病　Ｄｗ３　２６．３　６１４．４インシユリン依存性糖尿病　Ｄｗ２　２５，８　０　０．０Ｄｗ３　２６．５　４Ｂ　２．５Ｄｗ４　１９．４　４９　３．９亜、伸性甲状腺炎　Ｂ′ｌ１３５　１ろ１　７２　１６．８特発性血色素症　Ａ３　２６．９　７３　７．４Ｂ１４’　４．５　１９　５．ＯＣ２欠　乏　症　ＤＷ２、特にＡ２５、Ｂ１８、Ｄｗ２半数体タイプと強く連係［ＳｖｅｊｇａａｒｄおよびＲｙｄｅｒ両氏（Ｆ、　Ｈ，Ｂａｃｈ　、　Ｐ、、Ａ、　Ｇｏｏｄ両氏編）ｒｃ１ｉｎｊｃａｌ工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙＪ第１７３〜１８１頁にューヨーク、アカデミツク・プレス社１９８０年刊）より〕現状においては、Ａ、　Ｂ、　ＣＸＤＲおよびＤＣ遺伝子座の対立遺伝子は、対立遺伝子に由来する蛋白質とそれに特異的に対抗す−る抗体とを反応させることにょシ同定される。

すなわちある特定の遺伝子座の１個の対立遺伝子蛋白質のみを認識する注意深く選ばれた抗血清が微量力価検定用プレートのくぼみ孔に入れられる。組織タイプ分けすべき個体の細胞を６孔に加える。保温期間の後に補体全加える。細胞と反応した抗体は補体を固定し、細胞は分解される。どの抗血清が細胞分解を誘発したがを点検して組織タイプ分けがなされる。しかしながら、まだ発見されない対立遺伝子に由来するポリペプチドは勿論のことながら検出を免かれる。

ＨＬＡ−Ｄ遺伝子座の対立遺伝子はまた「混合淋巴球反応」と呼ばれる操作により同定されつつある。その方法においては、同型接合のタイプ分は細胞がタイプ分けすべき細胞と混合され、共に培養される。第１群抗原がタイプ分けすべき細胞と同型接合細胞との間で異なる場合には増殖が起るであろう。この方法および前に言及した方法の詳細は、Ｃ，Ｗ、　Ｐａｒｋｅｒ氏編ｒｃｈｊｎ、工ｍｍｕｎｏ１．Ｊ第１巻第６７〜８９頁（Ｗ、　Ｂ、サランダース社１９８０年刊）にすぐれた記述がある。

現在用いられている組織タイプ分けの方法の短所は下記の通りである。すなわち１）方法は間接的である。

２）疑問の余地のないタイプ分けの結果をもたらす血清学的試薬は容易に手に入らず、また標準化が困難である。

３）抗血清およびタイプ分は細胞は、長期間貯蔵すれば有効性が低下する。

４）多くの試薬は、１個の対立遺伝子のみを同定するほど充分な選択性を有しない。

５）未だ同定されていない対立遺伝子は検出されないままに終る。すなわちもし異型接合の個体がそれに対抗する試薬のないＨＬＡ抗原を発現するならば、その遺伝子座における同型接合と異型接合とを判別することは不可能であろう。

６）現在の方法は退屈でまた面倒である。

従って、本発明の目的は従来の方法よりも明確な判別をもたらし、また限界にとられれないヒトのＭＭＣの多形性の判定のための簡単化された方法を提供することである。

さらにまた本発明の目的は、ＭＭＣ特異性のヌクレオチド配列を決定し、また高度の特異性および再現性を有し、しかも低コストで多量に生産され得る探査体（プローブ）を提供することである。

本発明本発明は、組織のタイプ分けのためのヒトのＭＭＣ対立遺伝子、好適にはＨＬＡ −Ｄ組織タイプの多形性を判定するための新規な方法を提供する。その方法は、ＭＨＣにおける塩基配列と交雑し得るプローブが異なる個体からのＤＮＡの制限酵素切断位置地図に用いられること、および最初の個体に由来しまたプローブと交雑するＤＮＡ断片のサイズの分布が第２の個体からの対応する断片の分布または多形性の特定の　を反映する対応する分布と比較されることを特徴とする。比較が行われたのは、ａ）上記の第１の個体に移植または輸血の目的で組織を供与する上記の第２の個体の遺伝的適合を判定するため、ｂ）第１の個体がＭＨＣ中の１個またはそれ以上の対立遺伝子と関係のある疾患にかかる相対的危険を測定するため、ｃ）第１の個体の生物学的父親認知または母親認知のため、またはｄ）第１および第２の個体が１個またはそれ以上のＭＭＣ対立遺伝子について同一の多形性を示すか否かの判定すなわち法医学における利用のためである。特定的には、そ（１３）の比較は特異的に交雑する断片の存否をしらべるものである。

好適な範囲においては、本発明の方法はＨＬＡ−Ｄ組織タイプをコードするかまたは関係のある遺伝子の構造を分析することに基礎を置き、またプローブはＨＬＡ−Ｄ　（第ｎ群）抗原をコードするｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ、第１群抗原をコードするかまたはコードしない配列を含む実際の遺伝子（または遺伝子複合体）を表わすゲノムＤＮＡ　、およびそれらの断片から選ばれることを特徴とする。この範囲において、１個体からのＤＮＡ断片の分布が、たとえば上記のａ）およびｂ）に言及したところにより比較される。

これに対応して、本発明により好適なプ・ローブはそれがＨＬＡ−Ｄ　（第ｎ群）抗原をコードするｍＲＮＡと相補性のＣＤＮＡ　％第■群および第１群抗原をコードするかまたはコードしない配列を含む実際の遺伝子（または遺伝子複合体）を表わすゲノムＤＮＡ　、およびそれらの断片から選ばれることを特徴とする。その他の本発明の範囲は、請求の範囲第１項〜第１９項中に特徴づけられる。

ＤＮＡの単離ＭＭＣ多形性に関して検査されるべきＤＮＡの単離は、すでによく確立された方法［Ｎ、　Ｂｌｊｎおよびり、　Ｗ、　５ｔａｆｆｏｒｄ両氏ｒＮｕｃ１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪ〜２３０Ｂ頁（１９７６年）〕により達成される。好適には、ＤＮＡは血液細胞やその他の有核細胞から単離される。

制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの断片化ＤＮＡの制限酵素切断位置地図の作成はそれ自体既知であり、１）ヒ）　ＤＮＡの制限酵素による分解、２）得られた断片のサイズによる分画化、および３）特定のＤＮＡ断片を核酸ブロー、ブと交雑させて検出するという諸段階よりなる。

単離されたＤＮＡは、１種類またはそれｖ上のＤＮＡ特異性制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化される。２種類またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを同一のＤＮＡ標品の別々の一定量に対して用いることができる。また２種またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼをＤＮＡの同一の一定量の分解のために順次または同時に用いることができる。それぞれの酵素は、完全な分解を達成するために各々特別な条件を必要とする。従って分解のための特定の条件は用いられる酵素により異なる。しかしながう制限エンドヌクレアーゼの使用の一般的原理については数篇の総説に総括されている［Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ氏ｒＮｕｃ１．　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、Ｊ総説第１１７頁（１９８２年）参照〕。

ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる分解は常にｐＨ４〜９の範囲に調整された緩衝水溶液中において行われ、すべてではないがほとんどの場合分解の温度は１５°〜６５℃の範囲である多種類の制限エンドヌクレアーゼは商業的に入手できる。本発明の操作に適する制限エンドヌクレアーゼには、２つのグループが認められる。すなわち１）塩基４個の特定のＤＮＡ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼ、および２）塩基６個の特定のＤＮＡ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼである。

制限エンドヌクレアーゼのそれぞれのグループは各々異なる塩基配列を認識する数種類の酵素よりなる。第１グループの制限エンドヌクレアーゼは平均的に第２グループの酵素よりも多くのＤＮＡ断片を生成する。しかしながらそれぞれの酵素による特定の塩基配列の認識は、ある酵素により生成されるＤＮＡ断片の数は別の酵素による断片の数と異なることを意味する。ある個体のＭＨＣ区域内にまたがる特定の対立遺伝子を確立するために使用に適する制限エンドヌクレアーゼは、Ｅｃｏ　ＲＴ、Ｐｖｕ　ｎ、ＢａｍＨｌ、　Ｂｇｌ　ＩＩ、　Ｐｓｔ　Ｉ等である。将来新規な制限エンドヌクレアーゼが発見されるであろうから、適当な酵素のリストは拡大するにちがいない。

ＤＮＡ断片の分離制限エンドヌクレアーゼによる分解は、分子量従ってサイズの異彦るＤＮＡ断片を生成する。酵素により生成されるＤＮＡ断片の分子量は、ＤＮＡ断片中の塩基、燐酸基および炭水化物部分のそれぞれの数と実質上完全に相関する。ｆｆｔｌＪ　限エンドヌクレアーゼにより生成されるＤＮＡ断片のサイズ分画化は、上記の各成分の数を有利に用いる分画操作よりなる。制限エンドヌクレアーゼ分解により生成されるＤＮＡ断片を分離するための目下好適とされる方法は、アガロースまたは、４１Ｊアクリルアミドのいずれかを支持体とする電気泳動である。しかしながらゲルクロマトグラフィー、親和性分離法等の操作によってもＤＮ人断片の分画化を達成し得る。

交雑の後可視化された制限断片の電気泳動的挙動により、それら断片の分子量、従ってそれらが含有する塩基の数の決定が可能となる。良好に決定されたＤＮＡ断片の標準試料を、検査されるべき試料と平行に泳動せしめれば、制限断片の分子量決定の正確度が商才るのは当然でプローブは制限エンドヌクレアーゼ分解によりヒトのＭＨＣに由来するＤＮＡ断片と交雑すべきものである。プローブの塩基配列またはその配列の一部分は、ＭＨＣの塩基配列と相補的でなくてはならない。そのような配列は、必ずしもポリはプチド鎖をコードしないが、もしコードする場合にはプローブは一層良好に決定される。しかしながらプローブの主要な必要条件は、それがＭＢＣの塩基配列、好適には多形性り遺伝子座の１個の対立遺伝子の一部分と全面的または部分的に相補性を有することである。プローブはＲＮＡ型またはＤＮＡ型の核酸よりなる。

ＤＮＡはＲＮＡよシも安定であるから、ＤＮＡプローブはＲＮＡプローブよシも好適である。

多形性ＭＨＯ遺伝子座のすべてのまたは若干の対立遺伝子と交雑するプローブの一つの型は、当初に１４　ｍＲＮＡ分子と相補的なｃＤＮＡより調製される。ｍＲＮＡは、第１群および第１群抗原の構成分、ｔ９１７　ハプチド鎖のようにＭＭＣ遺伝子座の１個の対立遺伝子に由来するポリハプチド鎖の充分な景を発現する細胞から集積されるのが常である。所望のｍＲＮＡの集積は既述（Ｓ、　Ｋｖｉａｔ氏その他ｒｃｅ１１ｊ第２９巻第６１〜６９頁（１９８２年）〕の通りに実施される。

単離されたｍＲＮＡ画分は、多くのタイプのｍＲＮＡ分子よりなる。すべてのｍＲＮＡ分子種は２重鎖のｃＤＮＡを生成する逆転写のためのテンプレートとして用いられる。２重鎖のｃＤＮＡ分子は線状化されたプラスミドに別々に連結され、そしてそれは後に大腸菌の株を形質転換させるために用いられる。形質転換された大腸菌はクローニングされ、ＭＨＣの多形性対立遺伝子に対応するｃＤＮＡ挿入部を含むプラスミドの複製を支持するものが選出される。その操作はよく知られており、米国特許第４２３７２２４号明細書中に概説されている。上記の手法はしばしば対応する蛋白質の一部のみに対応するＣＤＮＡを生成する。

プローブの調製には、例えば短い塩基配列を含むプローブのための合成的経路のような他の経路もある。−変調製された上は、ｃＤＮＡクローンまたはそのクローンの一部分に対応する合成的ＤＮＡ断片は、そのようなコードするＤＮＡの部分により側面を守られたゲノムＤＮＡの単離に使用され得る。すなわちコードする配列とフードしない配列の両者を含む適切な染色体ＤＮＡを精製することが可能であり、そしてそれは米国特許第４２３７２２４号明細書により多量に生産され、全面的または部分的にプローブとして使用され得る。

ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ遺伝子座の対立遺伝子においてコードされるポリｇプチド鎖は、著しい配列の類似性を示す。対応する類似性は今や塩基配列レベルにおいても存在することが見出された。それゆえ数箇所の遺伝子座例えばＨＬＡ −Ａ、　−Ｂ、および−Ｃ遺伝子座の対立遺伝子と交雑するプローブも調製され得る。そのようなプローブは、ＨＬＡ−Ａ、　−Ｂおよび−Ｃの対立遺伝子に由来するＤＮＡ断片を検出すると共に、プローブと充分な塩基配列の類似性を共有する他の遺伝子座の対立遺伝子に由来する断片を検出するのにも用いられ得る。

第１群抗原の遺伝子座の対立遺伝子に関しては、α鎖およびβ鎖の対立遺伝子を認識するプローブが第１群抗原の多形性を確立するために用いられねばならない。そのようなプローブが得られ、それらは第１群抗原の遺伝子座の対立遺伝子と交雑しない。

ある特定の対立遺伝子に特有の配列に由来するプローブは、その特定の対立遺伝子に由来するＤＮＡ断片のみを検出するために使用され得る。第１群および第１群抗原遺伝子について得られる配列情報は、対立遺伝子特異性のプローブは短くなければならないことを示している。

従ってそのようなプローブの大多数は標準的手法を用いる自動化されたヌクレオチド合成により甚た容易に調製される［Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ氏その他ｒＧｅｎｅｔｉｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｊｎｇＪ第６巻第１〜１７頁（＝ニーー１７り、−？レナム・プレス社１９８２年刊行）参照〕。１ケ所の遺伝子座の１個または数個の対立遺伝子に特有のプローブを用いれば、所与のＤＮＡ試料中にどの対立遺伝子が存在するかの決定が簡単化される。しかしながら多くの場合に同様な情報は、もＬ適当な制限エンドヌクレアーゼが分解のために選ばれ上記に概括したように、対立遺伝子に特異的なプローブは短いものでなければならない。しかしながられずか数個の塩基よりなるプローブは、ＭＨＣによってつながれていないＤＮＡ配列とも交雑し得る。従って１００〜１５００個の塩基よりなるプローブが最も特異的な結果をもたらす。事実この範囲のサイズの２種類のプローブで第■群抗原に対応するものは、１５種類以上の抗血清を用いて笑施せねばならない血清学的分析よりも多くの情報を含む交雑のパターンをもたらす。さらに配置地図作成技法により発見された対立遺伝子の産物の若干に対抗する抗血清は入手できない。

使用されるべきプローブは好適には、それ自体既知の方法により分析的に指示可能な化合物または基により標識される。そのような化合物の例は、酵素的に活性な物質、酵素の基質、補助因子、補酵素、ならびに螢光性、発光性または放射性の化合物である。それ自体において指示可能性ではないが分析的に指示可能性の化合物と反応する特性を有する物質の例は、標識骨ＩｇＧ　Ｉｃ結合する特性を有する蛋白質Ａ（およびての逆も真である）、標識付アビジンに結合する特性を有するビオチン（およびその逆も真である）、チオールを含み分析的に指示可能性の化合物に結合しまたそれと反応する特性を有する活性化されたチオール化合物（およびその逆も真である）、および標識付抗体に結合する特性を有する不完全抗原および抗原（およびその逆も真である）である。

交　雑交雑とは、１重鎖ＤＮＡ断片の塩基と１重鎖ＤＮＡプローブの相補的塩基との間の水素結合の形成と定義される。

交雑の結果は、交雑するＤＮＡ断片およびＤＮＡプローブよりなる２重鎖ＤＮＡの形成である。ここに定義される交雑がＤＮＡ断片とプローブの間の完全な相補性を必要とはしないが相補性がプローブをＤＮＡ断片に選択的に結合せしめるに足ることを必要とすることは明白である。

プローブを制限エンドヌクレアーゼ断片と交雑するためには、多くの場合１）１種類またはそれ以上のプローブ、２）ホルムアミド、および３）０１〜１，５モル濃度の塩化ナトリウムを含有する水溶液が用いられる。

さらにその溶液はフィコール、ポリビニルピロリドン、牛血清アルブミンおよび／または変性された非相同のどのタイプの変性ＤＮＡにも結合する紙上の結合部位がプローブと非特異的に粘着するのを避けるために用いられる。予備交雑が用いられる場合には、プローブに接触させるべきシートはプローブとの交雑に先立って非相同の（２１）変性されたＤＮＡで処理される。交雑溶液はｐＨ５〜９に調整され、交雑は１８〜６５℃で３〜４８時間実施される。プローブと交雑するＤＮＡ断片のサイズは、下記のような各種要因に依存する。すなわち１、ＤＮＡ断片の生成に用いられる制限エンドヌクレアーゼ。所与のＤＮＡ試料および所与のプローブについて、交雑するＤＮＡ断片のパターンは用いられる制限エンドヌクレアーゼの特異性により異なる。これは当然のことに特定の配列に対する酵素の特異性による。種類の異なる制限酵素は、しばしば単一の対立遺伝子からサイズの異なる断片を生成する。

２、　分析されるべき試料中のＭＨＣの特定の対立遺伝子。

所与のプローブおよび所与の酵素を用いて、多形性ＭＭＣ遺伝子座の異なる対立遺伝子はプローブと交雑するサイズの異なる断片を表わす。別途の場合には、若干の対立遺伝子はプローブとのヌクレオチド配列の同一性により強い交雑を示すのに対して他の若干の対立遺伝子はプローブと交雑するには不充分な程度の配列の類似しか有しないこともある。

５　使用されるプローブ。所与のＤＮＡ試料および所与の１種類またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼについて、プローブと交雑する断片は、同一のｃＤＮＡまたはゲ゛ツムの断片に由来するがヌクレオチド配列の異なる２種類のプローブが同一の制限断片中に存在する配列と交雑し女いことがある通り、用いられるプローブに依存する。

本発明の有用性は、３つの重要な応用分野よりの５つの実施例を示すことにより、下記において論議されるであろう。これらの実施例は、何等本発明の限定をなすものではなく、平均的専門家はここに示されないその他の応用分野を容易に理解するであろう。

実施例すべての実施例は下記よりなる共通の技術を用いる。

すなわち１）ゲ“ツムＤＮＡの抽出および単離２）単離されたＤＮＡの制限酵素による分解３）制限断片のサイズによる分離４）分離されたすべてのＤＮＡ断片を、ＭＭＣ遺伝子座のコピーまたはゲノムＤＮＡに由来する少なくとも１種類の標識付プローブと交雑させること５）プローブと交雑したＤＮＡ断片の同定６）記録された交雑パターンを他の１個体またはそれ以上の個体の／ξグーンと比較することここに記述される実施例に適切な実験的操作手順は下記に概説される。

血液細胞血液（２０ｍ）は、予め血清学的方法によｇ　ＨＬＡ−ｔｌＲ抗原に組織タイプ分けされた個体から採取された。

ゲノムＤＮＡの調製典型的な調製物において、白血球が血液２０Ｔｎｌから遠心分離された。細胞は００１モル濃度のＮａＣ１および９００１モルのＥＤＴＡを含有する０、０５モルのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）４０−中に懸濁された。ドデシル硫酸ナトリウム（水０５−中に０．１　ｆｔ　）およびプロティナーゼＫ（メルク社製）（水０．４ｄ中４　ｍｙ　）が加えられた。試料は３７℃において振盪しつつ１６時間保温され、しかる後１ミリモルのＥＤＴＡを含有する２０ミリモルのトリス−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ７，５）で飽和されたフェノール（４０ｍｌりを用いて抽出された。遠心分離による相の分離後に上相は水飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（容量比２５：２４Ｍ）混合液４０−を用いて抽出された。生成した上相は最後に水飽和クロロホルム／イソアミルアルコール（容量比２４：１）２０−を用いて抽出された。

上相はＥＤＴＡ　１ミリモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣ７緩衝液（ｐＨ７，５）２ｔずつに対して３回４℃において合計２４時間透析された。九量の３モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）および２．５倍量の冷エタノールが透析物に加えられた。ＤＮＡは２５０ｄのガラス管中で一２０℃において１２時間沈澱せしめられ、しかる後４℃において６，０ＯＯＸりで３０分間の遠心分離により沈降せしめられた。

ＤＮＡ沈澱物はＥＤＴＡ１ミリモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解された。臭化エチジウム（最終濃度８００μ２／−）およびＣ５Ｃｔ（最終密度１．３９７）が加えられた。溶液（全量３０−）はソーパル社製Ｔｉ８６５型ローター中において毎分４１，０００回転で２０℃において４０時間遠心分離された。染色体ＤＮＡはしかる後紫外線下で回収されＥＤＴＡ　１　ミＵモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）２ｔずつを４回とりかえて透析された。しかる後試料は上記の通りにエタノールおよび酢酸す）　ＩＪウムを用いて沈澱せしめられた。沈澱物は氷冷水中７０％（ｖ／ｖ　）のエタノールで洗浄され、次に真空中で軽度に乾燥され、最後にＫＤＴＡ　１ミリモルを含有する１０ミリモルのトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７，５）　５００μｔに注意深く懸濁された。

制限酵素分解ＤＮＡの試料（１０μｆずつ）は別々にＢａｍ　Ｈｌ、　Ｐｖｕ　ＩＩ、Ｅｃｏ　Ｒ１およびＢｇｔｎのような制限酵素（−ニー・イングランド・／２イオラブズ社製品）１０単位を用い２時間３７℃において分解された。分解は６５℃に２分間熱することにより止められた。

電気泳動分解された試料からのＤＮＡ断片は、０．０４５モル濃度のトリス−酢酸塩緩衝液中０．７％（ｗ／ｖ　）アガロースゲル（ｐＨ８，３）、５０Ｖ　１２時間の電気泳動により分離された。

電気泳動は室温でアイスパーグＭ１００Ａ型装置により実施された。ＤＮＡ　％片は、しかる後５ｏｕｔｈｅｒｎ氏の記述による方法［ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｊｏｌ、Ｊ第９８巻第５０８頁（１９７５年）〕ニヨリニトロセルロースフィルター（シュライヘル・アンド、シュル社製Ｂ、Ａ　８５号）上へ移された。しかる後フィルターは真空中８０℃で２時間乾燥された。

ヒトの第■群移植抗原に対応するプローブの単離ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＣのそれぞれのβ鎖に対応するｃＤＮＡクローンの翻訳済みおよび３′−未翻訳プローブは別別にアガロースゲル電気泳動によシ単離された。ＨＬＡ−ＤＲおよびＴ（ＬＡ−ＤＣのそれぞれのα鎖の翻訳済み部分に対応するプローブは、同じ方法により精製された。第１図は各種の異なるプローブおよびそれら−が由来する元のｃＤＮＡクローンを模式図的に示す。

プローブの放射能標識使用されるプローブは、いわゆるニック翻訳法［Ｒｉｇｂｙ氏その他「Ｊ、　Ｍｏｌ　ｌＨｏ１．Ｊ第１１３巻第２３７〜２５１頁（１９７７年）〕によりαＣ５２ｐ］ＡＴｐで放射能標識された。プローブの比放射能は約３×１０７Ｃｐψ りＤＮＡであった。使用の直前に、容量１−中のプローブは０．２モル濃度のＮａ０ＨＯ５−を加え、１０分間室温において変性され、しかる後１．５　モ＃濃度の燐酸ナトリウム液（ｐＨ７，５）　０．６２５ｍｌを加えて中和され、氷上に置かれた。

ニトロセルロースフィルター上における交雑ニトロセルロースフィルターは、ホルムアミＩ’（５０％容量）、硫酸デキストラン（１９／ｒｎｌ）、０．９モル濃度１（ａｃｔ％００４５モル濃度燐酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７，５）、０００２モル濃度ＥＤＴＡ、牛血清アルブミン（１Ｍｇ／ｄ）、フィコール（１■／ｄ）、ポリビニルピロリドン（１ｍ９／−）、００５モル濃度へ×ス、ドデシル硫酸す）　ＩＪウム（−１Ｑ／ｍｅ　）および−重鎖の超音波処理した鮭精子ＤＮＡ　（８０μｙ／ｍｌ）を含有する液中で４２℃３時間予備交雑された。しかる後、予備交雑液は牛血清アルブミン、フィコールおよびＪ　ＩＪビニルピロリドンの量がＡに減らされた以外は予備交雑液と同じ組成で、１０ｒＩｄ！、中に変性された放射能標識付ゾローブ（Ｕ５Ｘ１０６　ｃｐｍ）を含有する交雑液と交換された。さらにまたヘズス濃度も予備交雑液中の半分に減らされた。

プローブの交雑は４２℃において２４時間実施された。

しかる後フィルターは下記の通りの操作手順により洗浄された。すなわち１　）　ＩＪａＣＬ　０．３６モル、燐酸ナトリウム０．０１８七ｋ　（ｐＨ７，５）、ＥＤＴＡ　Ｏ，００１モル、ドデシル硫酸ナトリウム１１１ｇ／−を含有する溶液で室温において２回２）　ＮａＣ４０，０３６モル、燐酸ナトリウム０．００１８モル（ｐＨ７５）、ＥＤＴＡ　Ｏ，０００１モル、ドデシル硫酸ナトリウム１１Ｉ９／−を含有する溶液で１５分間５５℃において２回３）最終的にＮａＣｔＯ，ＯＳ　６モル、燐酸ナトリウム０．（）［１１Ｂモル（ｐＨ７，５）、Ｔ２ＤＴＡ　０．００１モルを含有する溶液で室温において１回オートラジオグラフィーニトロセルロースフィルターは乾燥され、Ｘ線カセット中にコダック社製ＭＡＲ −５号フィルムおよびデュポン社製クロネツクスライドニングープラススクリーント共ニー７０℃で３日間置かれた。しかる後フィルムはアグファ／ゲ゛・ぐルト社製自動現像装置により現像された。

実施例　１血清学的組織タイプ分は法は、比較対照となる細胞の入手可能性に依存する。そのような細胞は、通常１ケ所またはそれ以上の多形性ＭＭＣ遺伝子座において同型接合である。本発明の方法が従来の方法に優ることを明示するために、同型接合のタイプ分は細胞のＤＮＡを上述の操作に付した。用いられた細胞は、ＤＲ遺伝子座において同型接合であり、それぞれ１．２．３．４．５．６．７および８の特異性を有する第１群抗原を表わした。ＤＣ遺伝子座の第１群抗原に関する血清学的タイプ分はデータは得られていなかった。

多くの場合第■群抗原のタイプ分けに用いられる抗血清が第１群抗原の鎖の両方または一方に対抗する抗体を含むか否かは明らかでない。しかしＤＲおよびＤＣのα鎖およびβ鎖のｃＤＮＡ挿入体が単離されたので、それらはすべて交雑におけるプローブとして用いられた。

ＤＲのα鎖のｃＤＮＡば、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１またはＰｓｔ　Ｉが分解に用いられた場合には、ＤＮＡがどのタイプ分は細胞から単離されたかにかかわらず、同一サイズの単一なバンドと交雑した。しかし分解が酵素ＢｇＡ　ｎを用いて行われた場合にはＤＲタイプ１．３および６を検査したときにＤＲのα鎖のプローブと交雑する特徴のある断片が得られた。その他すべてのＤＲタイプについては、単一の交雑する断片はサイズにおいて同一であった（第２図のＰ列〜Ｘ列参照）。

酵素Ｂａｍ　ＨｌまたはＰｖｕ　Ｕのいずれかにより分解された同一のＤＮＡ標品を用いてＤＣα鎖プローブとの交雑が実施された。第２図は異なるＤＲ特異性を表わす８種類の細胞タイプがすべて独得な交雑パターンを生ずることを示す。

血清学的分析は現在のところ４種類のＤＣ抗原を表わしたのみであるから、ここに示した分析は改善された分解能を提供すると結論され得る。さらに新規なりＣ α鎖対立遺伝子の発見は明白である。

ＤＲ同型接合細胞よりのＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　ＩＩで分解され、サイズ分離の後ＤＮＡ断片はＤＲおよびＤＣのβ鎖プローブとそれぞれ交雑せしめられた。第３図は、その結果を示す。交雑パターンが、用いられたプローブおよび細胞について独得であったことは明白である。

従って本発明は、ＤＲおよびＤＣのβ鎖対立遺伝子を同定する手段を提供し、本発明の方法はさらに多くのβ鎖対立遺伝子を解像明示する。

第３図のデータは、ＤｐｉおよびＤＣのβ鎖対立遺伝子が用いられたｃＤＮＡプローブと交雑する多種類の断片を生ずることを示す。プローブ中の交雑する隣接の配列部分は、イントロン配列により２回またはそれ以上中断されている対立遺伝子のゲノム的配列に対応するから、このことは期待された結果である。このようなイントロンは、制限酵素切断部位を含むが用いられたプローブとは交雑しない。しかしプローブと交雑する単一の試料中の多種類のＤＮＡ断片についての観察は、プローブが１個以上の遺伝子のＤＮＡ断片と反応することを示す。第３図のデータはＤＲおよびＤＣのβ鎖配列が用いられた条件下でごく僅力・ながら交差的に交雑することを明らかに示すけれども、そのデータは解明を要する。この目的のために、第３図の実験は反復され、ｃＤＮＡの翻訳済み区域および３′未翻訳区域にそれぞれ対応するＤＲおよびＤＣのβ鎖プローブを用いた比較分析が用いられた（第１図参照）。ＤＮＡ試料は、電気泳動および交雑に先豆ちＢａｍＭｌで分解された。

第４図は２種類のＤＲβ鎖プローブを用いて得られた結果を示す。この制限酵素を用いた場合にも未翻訳のプｏ　−ブが、翻訳済みプローブが生じさせたようなそれぞれのＤＲタイプに対する独得の交雑パターンを生じさせないことは明白である。しかし制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩを用いてＤＮＡ試料が分解された場合にはプローブ中の３′未翻訳のＤＲβ鎖により生ずる配置図は、ＤＲ特異性の異なるそれぞれの細胞のタイプについて独得である（第５図）。しかしこのプローブと交雑する制限断片の数は、Ｉ）Ｒβ鎖翻翻訳済プローブと交雑する断片数より少ない（第５図参照）。

第６図は、酵素ＢａｍＨ１で分解され、ＤＣのβ鎖の翻訳済区域および３′未翻訳区域のそれぞれに対応するプローブと交雑した同型接合のタイプ分は細胞からのＤＮＡの制限パターンを示す。翻訳済区域のプローブが各々の細胞タイプについて独得の制限酵素切断配置図を呈するのに対して３′未翻訳区域のプローブは大部分の場合単一の断片とのみ交雑し、８種類の細胞タイプ中の５種類については対立遺伝子を判別し得ながった（第６図のＪ列〜Ｎ列参照）。額面通りに受け取れば、これらのデータはヒトの半数体ゲノムが単一のＤＣβ鎖遺伝子を含むことを示唆する。

第２〜６図に示されたデータは、各種のプローブおよび制限酵素を用いることにより、組織タイプ分けは本発明の方法に従って実施され得ることを明示している。本方法はＤＣ遺伝子座に関するデータが例示するように、新規な第１群抗原（ＨＬＡ−Ｄ）対立遺伝子の検出を可能ならしめるのみでなく、またα鎖およびβ 鎖の対立遺伝子を判別に分析する手段を提供し、それは従来がって血清学的手法によっては達成し得ながったものである。

実施例　２本発明の方法の解像分離能を検討するために、ＤＮＡが血清学的タイプ分けでそれぞれＤＲ７／７　（１個体）、ＤＲ２／７　（゛２個体）およびＤＲ２／２　（１個）を発現するとタイプ分けされた４個体から単離された。被検者４個体はすべて遺伝的なつながりはなかった。それぞれからの試料は別々に酵素Ｐｖｕ　（［およびＢａｍ　Ｈｌ　で分解され、ＤＲおよびＤＣのβ鎖のＣＤＮＡクローンの翻訳済プローブを用いて制限酵素切断位置地図が確立された。結果は第７図に総括されている。予期の通りに、ＤＲβ鎖のプローブは用いられた酵素の種類にかかわりなく２種類の同型接合の試料について特別な・ξターンをもたらした。しかしながら、同型接合の２個体の合併した制限酵素切断位置地図は異型接合の個体について記録された位置地図と同一であった。同様にＤＣβ鎖プローブは、ＤＲ同型接合の個体について独得の位置地図を提供した。しかしながら、異型接合の２個体についての位置地図は類似ではなく、そのうちの１個体についてのみ同型接合の個体の合併した位置地図と対応している。ＤＲおよびＤＣ遺伝子座は、第６染色体上に互に近接して位置する。

この密接な連鎖関係により、所与のＤＲ対立遺伝子はしばしば所与のＤＣ対立遺伝子と共に存在すると予期される。

しかしながら第７図に示されたデータは、この密接な連鎖関係にもかかわらず、本発明の方法がＤＲおよびＤＣ遺伝子座をそれぞれ独立に分析し得ることを明示している。

実施例　３ＨＬＡ−ＤＲ表現型を評定するための血清学的分析も「混合淋巴球培養法］も共に多大の熟練を要する。またそのような分析の再現性は容認し得ないほど近い。

本発明の方法の再現性を検討するために、ＤＮＡが２組の単一接合体性（−卵性）双生児から単離された。それぞれの試料は別々に扱われ、酵素分解の後に制限切断位置地図作成に向けられた。第８図は、得られた制限切断位置地図がそれぞれの組の双生児について同一であったことを示す。

すなわち制限酵素分解も、用いられたプローブもそれぞれの組の双生児に人工的な差異を生せしめることはなかった。本発明の方法は明らかに再現性が高い。

実施例　４５２ｐ標識付のＤＣβ鎖ｃＤＮＡプローブ（以前よ、ｊ：ｌ　ｐＤＲ−β−１と呼ばれる）　（Ｗｉｍａｎ氏その他ｒＰｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ　、Ｓｃｊ　、ＵＳＡＪ第７９巻第１７０３〜１７０７頁（１９８２年）参服〕が合計９２個体から単離されたＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分解の研究に用いられた。ラムダ・ファージのＤＮＡ断片が分子サイズの指示体として用いられた。

ヒトのＤＮＡは制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ＋で分解され、生成した断片はゲル電気泳動により分離され、サウザーン氏法による交雑に付された。

Ｅｃｏ　Ｒ１分解は、少なくとも８種類の異なる断片を生成。

した。すなわちｋｂ（キロベース）単位によるおよそのサイズが、２０．１３．１１．９．６．４．３５および２，２であった。

６ｋｂの断片は９２個体全部に存在した。１１ｋｂの断片は、完全にすべてでは々いがほとんどすべてに存在した。

その他の断片は可変的に出現した。９ｋｂおよび２．２ｋｂの断片は対になって出現した。すなわち両方共に出現かまたは不存在かのいずれかであった。

９２の個体はプローブと交雑するＤＮＡ断片について１７種類の異なる切断位置図を示したが総個体数の２０％を包括する地図はなかった。器官移植または輸血の供与者は、そのような処置を要する側の個体と同じ地図を示すグループ中から探しめられる。

この研究において９２個体中の４５個体は健康な対照であり、３１個体はインシュリン依存性糖尿病（よりＤＭ　）患者であり、１６個体は非インシユリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者と診断された。９　ｋｂ／２．２　ｋｂの同胞断片の分離を下記に示す。

健康な対照　よりＤＭ　ＮよりＤＭ断片を有する個体数　２２　３　８断片を有しない個体数　２３　２８　８ＩＤＤＭ患者の分析は二重の分析により確認された。

この観察の意義は、ＩＤＤＭ患者妃は２．２／９ｋｂ同胞断片の欠落が一般の個体群よりも高い頻度で生ずることである。可能な説明はよりＤＭ患者ではＨＬＡ −ＤＣβ鎖をコードする対立遺伝子中にＥｃｏ　Ｒ１による切断部位が欠けているということである。用られたプローブはＤＣβ鎖であυＤＲβ鎖ではな−ことに注目する必要がある。１または２個所の制限酵素切断部位の欠落が、遺伝子にょクコードされる生成分子に影響を及ぼすことがあり得る。

■ＤＤＭ患者に２．２７９　ｋｂ同胞断片の頻度が低いという観察はまた、よりＤＭ患者ＬＤ１ＤＤ％近くがＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４あるいはＨＬＡ− ＤＲ３／４を発現するという観点からすれば劇的である。これらの対立遺伝子は健康な個体群中の６０−以下にしか存在しない。

他の研究において発明者はＤＮＡがそれぞれ予めＢａｍＨｌおよびＰｓｔ　Ｉにより分解された場合にプローブと交雑する制限断片を検査した。比較のためにＥｃｏＲＩにより分解されたＤＮＡも検査した。個体群は関係のない５４個体で健康人２５、そしてよりＤＭ患者２９であった。対象は交雑する断片の個体群中における頻度を想定するためにすべて無作為に選んだ。どの個体も予めＨＬＡ−ＤＲについてタイプ分けされていなかった。

健康な個体に比べてＩＤＤＭ恵者は交雑する２、２および９゜ｋｂのＲｃｏＲＩ断片の予期された通りに低い頻度を示した（ｐ＜０．０１、上記参照）。またＤＣβ鎖プローブと交雑する３、２ｋｂおよび３．７ｋｂの２個のＢａｍＨＩ断片はよりＤＭ患者のＤＮＡ試料中では健康人に比べて低い頻度であった（ｐｃ＜０．００．１、第２表参照）。５８ｋｂのＢａｍＨＩ断片（ｐｃ　＜　０．０５　）オヨびＰｓｔ　Ｉ　Ｋ　ヨル４．９　ｋｂ　オヨび６．０ｋｂ（７）断片（１）ｃ＜　ｏ、ｏ　５　）はよりＤＭ患者において増大した頻度を示した。

２群の間の制限酵素切断位置地図の差異は、ＩＤＤＭ患者においてＨＬＡ−ＤＲ３および／またはＤＲ４対立遺伝子が優勢であることにより説明され得る。しかし用いられたプローブはＤＣβ鎖のｅＤＮＡであり・、ＨＬＡ−ＤＲおよび−ＤＣ遺伝子座の間の正確な連鎖関係はまだ知られていないので、データについて疑問の余地のない説明はまだ与えられない。

それにもかかわらず、よりＤＭ患者のＤＮＡにおいてＢａｍＨｌによる３、７ｋｂ断片の頻度が低下していることはよりＤＭと）（ＬＡ−ＤＲ２との間に確立された負の連結に依存するとは考えられない（第１表参照）。それはＨＬＡ−ＤＲ２同型接合のタイプ分は細胞のＤＮＡはとのＢａｒｎ　Ｈｌ断片を表わさないからである（第６図のＢ列参照）。３．７ｋｂ断片の正確な超厚を確定するためにはさらに多くの分析を要する（下記参照）。しかし３．７　ｋｂのＢａｍ　ＨＩ断片はＩＤＤＭ患者の鳳を検査したときにはまれにしか観察されないのに対して、同じ断片は健康人がＨＬＡ−ＤＲ４を発現している場合にもＤＮＡ中に一層高い頻度（３０〜４０％）で現われることは多少とも充足を与える。

無作為に選ばれたＩＤＤＭ患者と健康人か・のＤＮＡは、Ｐｓｔｌによる１　８　ｋｂの断片の頻度について差異はない。■ＤＤＭ患者と健康人とのＤＮＡ中におけるこの断片の頻度の差は、同一のＨＴ、Ａ、−ＤＲ表現型を表わす個体の間で比較が行われた場合に妥当であるらしく思われる。

実施例　５ＨＬＡ−ＤＲについて同一であるか１ｆｃは無作為に選ばれた健康人および糖尿病患者からのＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼにより分解されたときに生成するサイズの異なる断片とＨＬＡ−ＤＣβ鎖のｃＤＮＡプローブとが交雑するか否かがテストされた。血清学的にＨＬＡ−ＤＲ４および／またはＶ４とタイプ分けされた個体のうちで、インシュリン依存性糖尿病（よりＤＭ　）患者はＰｓｔ　Ｉによる１８ｋｂのＤＮＡ断片の増大した頻度を示した。Ｂａｍ　ＨＩによるろ、７ｋｂのＤＮＡ断片は、健康人では頻度が高いが（３０〜４０％）、■ＤＤＭ患者のＤＮＡ中にはまれにしか検出されなかった（０〜２％）。

スエーデンのリンケピング大学小児科において年令１８才以下で診断され、ＨＬＡ−ＤＲ３／−（５人）、ＤＲ４／−（８人）、またはＤＲろ／４（９人）を発現しているよりＤＭ患者２２人からＤＮＡが単離された。ＨＬＡ−ＤＲ３３／３　ｔたは３／−（５人）、ＨＬＡ−ＤＲ４／４または４／−（７人）、あるいはＨＬＡ−ＤＲ３／４　（１５人）を発現しているよりＤＭ患者２５人とＨＴ、Ａ −ＤＲ３（４人）、ＨＬＡ−ＤＲ４（９人）あるいはＨＬＡ−ＤＲ３／４　（１３人）を発現している健康対照人からの追加のＤＮＡ試料が凍結保存し予めＤＲタイプ分けされた淋巴球から単離された。

第　２　表無作為に選ばれたよりＤＭ患者および対照における制限断片の分布ＥｃｏＲＩ　よりＤＭ（２９個体）　対照（２５個体）　ｐ値２．２　３　（１０％）　１２（４８％）　０．００２（！３．５　２３（７９％）　１６（６４％）　ＮＳ４．０　２６（７９％）　２０（８０％）　ＮＳ９．０　３（１０％）　１２（４８％）　０．００２゜１ｇ−ｏ　２１（７３％）　１５（６０％）ＮＳ２０．０　２５（８６％）　１４（５６％）　ｏ、ｏｉａＢａｍＨｌ　＊　よりＤＭ（２９イ琳）　対照（２５イｌ１Ｂ）３．２　３（１０％）　１５（６０％）　ｏ、ｏｏｏｌ（１３，７０（０％）　１０（４０％）　０．０００１ｄ５．８　２５（７９％）　１０（４０％）　０．００４ｂ６．２　’３（１０％）　１０（４０％）　ｏ、ｏｌａＰｅｔ　ｌ”　よりＤＭ（２７個体）　対照（２５個体）　ｐ　値４．０　７　（２６％）　３（１２％）　ＮＳ４．９　２１　（７８％）　９（３６％）　［１，００３ｂ５．１　１０（５７％）　１Ｂ（７２％）　０．０１ａ５．４　４（１５％）　１２（４Ｑ）　０．０１ａ６．０　２６（９６％）　１６（６４％）　０．００４ｂ／１．３　１８　（６７％）　７（２８％）　０．００６ｂ１８．０　２３　（８５％）　１８（７２％）　ＮＳよりＤＭと対照との間の差（フィッシャー比法により断片数に対して補正した正確な検定値）　ａｐｃ＞０．０５、　ｐｃ＜０．０５、Ｃｐｃ＜０．０１、ｄＩ’ｃ＜０．００１ＮＳは有意差なしの意味傘ＢａｍＨＩ配列片中の３．２ｋｂと３．４　ｋｋ＋　、　４．Ｏｋｂと４．３に’ｂ、および１０．Ｏｋｂと１２．０に’ｂは分解解像されなかった。個体間で差のある配列片のみを示す。

傘＊Ｐｓｔｌによる１０ｋｂ、７．２ｋｂおよび６５ｋｂ配列片は調べられなかった。

無作為に選んだよりＤＭ患者（２９人）および対照健康人（２５人）から単離された酵素分解されたＤＮＡの交雑、ξターンも比較された。全部の患者は年令３０才以前に診断され、インシュリン処置を受けていた。これらの患者および対照健康人はすべてコーカサス人種であった。ＤＮＡ試料は別々に３種類の制限エンドヌクレアーゼで分解さく３８）れた。ＤＣβ鎖ｃＤＮＡのプローブは、テストされた異なる個体におけるＢａｍＨＩによる断片５〜９個、ＩＩ！；ｃｏＲＩによる断片４〜７個およびＰｓｔ　Ｉによる断片４〜８個と交雑した（第２表）。Ｂａｍ　Ｈｌによる配列片１０ｋｂ、’８．Ｏｋｂ、、７．０ｋｌ）および５．［ｌｋｂならびにＫｃｏＲＩによる配列片１１ｋｂおよび６．５に’Ｏは検査された全個体に存在したが、その他の配列片の存否は一定でなかった。

第９図はそれぞれＢａｍＨｌ（第１〜第６列）、ＥＣＯＲ＋（第４〜第６列）およびＰｓｔ　Ｉ　（第７〜第９列）により分解された３人の無関係なＨＬＡ−ＤＲ３／４の対照健康人で検出された制限酵素断片を示す。ＢａｍＨｌによる３、７ｋｂおよび１２ｋｂの配列片、ＥｃｏＲＩによる２０ｋｂならびにＰｓｔ　Ｉによる１８ｋｂおよび５．１ｋｂの配列片は個体により存否一定でなかった。

ＢａｍＨＩによる３、７ｋｂおよびＰｓｔ　ｌによる１８ｋｂの配列片の頻度はＨＬＡ−ＤＲに関して同一と血清学的にタイプ分けされたよりＤＭ患者と健康人との間で異なっていた（第４表）。

Ｐｅｔ　ｌによる１８ｋｂの配列片は、ＨＬＡ−ＤＲ４およびＤＲＩを発現するＩＤＤＭ患者において増大した頻度で存在した。

ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者は、ｐ値が観察されたＰｓｔｌ断片の数について補正された場合でさえも対照と差異があった（ｐ。＜０．０１）。ＢａｍＨＩによる３、７ｋｂの配列片の頻度は、対照に比べてＩＤＤＭ患者において明らかに低下した（ｐｃ＜ｏ、ｏ　１）。３．７ｋｂの配列片を有するＨＬＡ− ＤＲ３および／またはＤＲ４陽性の８個体のうち６個体はＰｓｔ　Ｔにょる（３９）１８　ｋｂの断片を欠いていた。これらの結果は、ＨＬＡ−Ｄ区域のβ遺伝子のヌクレオチド配列片が存在し、そしてそれがよりＤＭに結びつくことを明示する。

第　３　表テストされた個体中のＨＬＡ−ＤＣβ鎖のｃＤＮＡプローブにより検出された制限断片のうち変動するものと一定のもへ＊）ＫｃｏＲＩ　２０　１３　１１”　９．０　６５　４．０　３．５　２２　ｋｂＢａｍＨｌ　１２　１０”　８．０ ”　７．０”　６．２　５．８　５．０”　４．３　３．７　３．２ｋｂＰｓｔ　ｌ　１８　１０　７．２　６．５　６．３　６．０　５Ａ　５．１　４．９　４．０ｋｂＨＬＡ−ＤＲタイプのよりＤＭおよび対照個体中のＨＬＡ−ＤＣ婦プローブにより検出されたＰｓｔｌによる１８ｋｂ、Ｉ５−よびＢａｍＨｌによる３、７ｋｂ制限工ンドヌクレアーゼ切断片ＨＬＡ−ＤＲ３／４全個体（４０）　１８表昭５９−５００３６２（１２）＊　ＩＤＤＭおよび対照個体は、共にそれぞれＨＬＡ−ＤＲ３（３／３または３／−）およびＨＬＡ−ＤＲ４（４／４または４／−）を発現するもののみを選んだ。

ａ　フィッシャー氏の正確な検定法がよりＤＭ個体と対照個体との間の差を検定するために用いられた。ｐ値に観察された断片数を乗じた結果は、補正されたｐ値（ｐ。）としてｂｐ。〉００５、Ｃｐｏ〈００１となった。

図　面　の　説　明第１図　二硫化物（ジスルフイツド）を含むαおよびβ鎖よりなる第■群抗原分子の模式図（中段）。第■群抗原のα鎖およびβ鎖ｃＤＮＡプローブなもびにそれらを単離するために用いられた制限酵素切断位置は図の上段および下段に示されている。それらのおよその長さは、１００ｂｐ（塩基対）ごとの目盛をつけた線により推定される。β鎖ｃＤＮＡクローンの翻訳済（ＴＲ）および６′未翻訳（ＵＴ）プローブが用いられたのに対して、α鎖プローブは両者とも翻訳済部分に対応する。

第２図　ＤＣα鎖ｃＤＮＡプローブ（第１図参照）とＤＲ特異性（１〜８）について同型接合であると血清学的にタイプ分けされた個体のＤＮＡとの交雑（Ａ列〜Ｐ列）。ＤＮＡは別々にＢ＠ｍＨＩ（Ａ列〜Ｈ列）およびＰｖｕ　ｎ　（Ｉ列〜Ｐ列）により分解された。同じＤＮＡはまたＢｇｌ　ＩＩにより分解され、ＤＲα鎖ｃＤＮＡプローブと交雑せしめられた（Ｑ列〜Ｘ列）。ＤＲ’　１同（４１）型接合ＤＮＡはＡ列、１列および。列に出現し、ＤＲ８同型接合ＤＮＡはＰ列、Ｈ列および、１列に現われている。

第３図　ＤＲ（Ａ列）およびＤＣ（Ｂ列）β鎖翻訳済プローブとＤＲ特異性（１〜８）について同型接合であると血清学的にタイプ分けされた個体のＤＮＡとの交雑（上記の各列）。図には断片のサイズ（ｋｂ）によるバンドの位置を標示しである。

第４図　ＤＲ特異性（１〜８）について同型接合であると血清学的にタイプ分けされた個体のＤＮＡとＤＲβ鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブ（Ａ列〜Ｈ列）および６′未翻訳プローブ（工列〜Ｐ列）との交雑（Ａ列および１列はＤＲＩＤＮＡを示し、Ｈ列およびＰ列はＤＲ８ＤＮＡを表示する）。ＤＮＡ　ｌ′ｉＢａｍ　ＨＩにより分解された。

第５図　第４図と同一の実験。ただしＤＮＡはＢａｍ　Ｈｌではな（ＰｖｕＩｌによシ分解された。

第６図　第４図に記述したのと同様のＤＣβ鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブ（Ａ列〜Ｈ列）および５′未翻訳プローブ（１列〜Ｐ列）の交雑。ＤＮＡはＢａｍＨＩにより分解された。

第７図　ＤＲ（第１〜第８列）およびＤＣ（第９〜第１６列）β鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブと、ＤＲβ鎖遺伝子座において表現型的に同型接合である２個体のＤＮＡとの交雑（ＤＲ７／７は第１、第５、第９および第１３列ならびにＤＲ２／２は第４、第８、第１２および第１６（４２）列）およびＤＲ特異性（ｖ７）を発現すると血清学的にタイプ分けされた２個体のＤＮＡとの交雑（第２、第６、第１０および第１４列は異型接合の１個体の制限パターンを示し、これに対して他の１個体のパターンは第３、第７、第１１および第１５列に示される）。ＤＮＡの一定量は別々にＰｖｕＩＩ（第１〜第４列および第９〜第１２列）ならびにＢａｍＨＩ（第５〜第８列および第１３〜第１６列）により分解された。

第８図　ＤＣ（第１、第２、第５、第６、第９、第１０．第１６および第１４列）およびＤＲ（第３、第４、第７、第８、第１１、第１２、第１５および第１６列）β鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブと２組（それぞれ品およびＢＢ）の１卵性双生児のＤＮＡとの交雑。第１〜第８列は品双生児のＤＮＡを示し、第９〜第１６列はＢＢ双生児のＤＮＡを示す。第１〜第４列および第９〜第１２列のＤＮＡはＰｖｕ　［１により分解されたのに対して第５〜第８列および第１３〜第１６列のＤＮＡはＢａｍＨｌにより分解された。

２０　第９図　ＤＣβ鎖ｃＤＮＡの翻訳済プローブと健康で遺伝的に無関係な３個体のＤＮＡとの交雑。各個体のＤＮＡ調製物は、別々にＢａｍＨＩ（第１〜第３列）、Ｅｃｏ　Ｒ１（第４〜第６列）およびＰｓｔ　ｌ　（第７〜第９列）により分解された。

国際調査報告＋０＋＊ｒｌ＋−＋＋ローａ＋ＡＤ９１１ｅｓｌｌｏｎ＋＋ｅ、ＰＣＴ／５Ｅ８３１０００８４第１頁の続き ■出　願　人　ラスタ・ラーススウェーデン国ニス−７５２６３ウプサラ・セーヴエスヴ工−グ１４ ■出　願　人　レルンマーク・オーケスウェーデン国ニス−２１６１１マルミヨ・ビルイエルヤールスガタン６１ ■出　願　人　オウアーバーク・デイビッドデンマーク国デ・ニー２８２０ゲントフテ・エアメルンスヴアイ４５

Claims

【特許請求の範囲】１　ヒトのＭＭＣの塩基配列と交雑するプローブが制限酵素切断位置地図の作成に用いられ、第１の個体に由来しプローブと交雑するＤＮＡ断片のサイズ分布が第２の個体よりの対応する断片の分布または対応する特定のタイプの多形性の断片分布と比較され、その比較はいずれもａ）上記の他の個体が上記の第１の個体に移植または輸血の目的で組織を供与する場合の遺伝的適当性、ｂ）上記の第１の個体が１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子に関係する特定の疾患にかかる相対的危険度、Ｃ）上記第１の個体の父Ｍまたは母親認知、または、ｄ）法医学に用いる上で上記の第１および第２の個体が１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の同一の多形性を示すか否かをしらべるために行われることを特徴とする、器官移植、輸血、法医学における利用、父親または母親の認知またはある個人がある種のＭＭＣ対立遺伝子に関係する疾病にかかる相対的危険度を予察する目的で組織タイプ分けにおけるヒトのＭＭＣの多形性を決定するための方法。２、　プローブがａ）第■群遺伝子産物（抗原）をコードするｍＲＮＡと相補的なＣＤＮＡ　、　ｂ）実際の第■群遺伝子および／またはそれらの両翼を守る塩基配列を表わすケ゛ツムＤＮＡ　、およびＣ）それらの断片から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。６、　第■群遺伝子がＨＬＡ−Ｄ遺伝子産物をコードする遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第１項および第（４４）２項記載の方法。４、　プローブが第■群抗原のα鎖またはβ鎖をコードするｍＲＮＡのいずれの部分とも相補的であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。５　プローブが実際の第■群遺伝子および／またはそれらの両翼を守る塩基配列あるいはそれらの断片を表わすゲノムＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。６　ヒトのＤＮＡが１種類またはそれり上の制限エンドヌクレアーゼで処理され、生成するＤＮＡ断片が分子のサイズにより分離され（好適にはゲル電気泳動により）　、ＤＮＡを結合するシート（好適にはニトロセルロースシート）に移され、しかる後フィルターがプローブに接触せしめられ、プローブとサイズの異なるＤＮＡ断片の相補性の塩基配列との結合が同定されることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法、ｌ　プローブが分析的に指示可能な基または原子により標識付けられていることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。８　断片の分布が断片の出現について検査され、その存在または不存在がある個体が１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子に関係する疾患に罹病する相対的危険度の指標となることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。９　制限酵素がＫｃｏＲＩであり、ｍＲＮＡが第■群抗原のβ鎖をコードし、断片の分布が２個の対になった断片９ｋｂおよび２．２１ｃ’ｂの出現について検査され、個体におけるその不存在はその個体ではインシュリン依存性糖尿病に罹患する相対的危険度の増大を示すことを特徴とする請求の範囲第４項および第６項記載の方法。１０　制限酵素がＢａｍＨｌであり、断片の分布が３．７ｋｂ断片の出現について検査され、個体中にそれが不存在の場合にはその個体がインシュリン依存性糖尿病に罹患する相対的危険度の増大を示すことを特徴とする請求の範囲第４項および第６項記載の方法。１１　制限酵素がＰｓｔ　Ｉであり、断片の分布が１８ｋｂ断片の出現について検査され、それが血清学的に定義されるＨＬＡ−ＤＲ４’ｔたはＤＲ３／４を発現する細巾に存在することはその個体がインシュリン依存性糖尿病に罹患する相対的危険度の増大を示すことを特徴とする請求の範囲第４項および第６項記載の方法。１２、第■群遺伝子産物（抗原）、実際の第■群遺伝子を表わすゲノムＤＮＡおよび／またはその両翼を守る配列片および断片をコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡがら選ばれることを特徴とする請求の範囲前記各項記載の方法のいずれかにおいて用いられるプローブ。１３、第■群遺伝子産物（抗原）をコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。１４、実際の第■群遺伝子および／またはその両翼を守る塩基配列およびその断片を表わすゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。１５、第■群遺伝子がＨＬＡ−Ｄタイプのものであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。１６　選ばれた個体群（好適には家族）中の各個体からのＤＮＡの地図が作成され、その地図が患者および健康者の地図中の特定の断片の存在または不存在とその個体群中における特定の疾患の出現とが関係づけられることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。１Ｚ　第■群遺伝子および遺伝子産物がＨＬＡ−ＤＣタイプのものであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。１８、第■群遺伝子および遺伝子産物がＨＬＡ−ＤＲタイプのものであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のプローブ。１９　第■群遺伝子および遺伝子産物がＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＣ区域のものであることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。