JPH0330678A - ルシフェラーゼをコードするｄｎａ化合物およびそれを含有する発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、海洋性甲殻類であるウミホタル（Ｖａｒｇｕ
ｌａ　ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ、以前はＣｙｐｒｉｄ
ｔｎａ　ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｒｉｉと分類されていた）
の発光現象を触媒する酵素であるウミボタルルシフェラ
ーゼをコードするＤＮＡ化合物および該ＤＮＡ化合物を
含有する発現ベクター、並びに該発現ベクターを用いて
適当な宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培
養することからなるウミボタルルシフェラーゼの製造方
法に関するものである。

［従来技術と発明が解決すべき課題］ ルシフェラーゼは様々な生物種で観察されている化学発
光反応を触媒する酵素である。この発光反応は、酸素の
存在下、基質ルシフェリンがルシフェラーゼの酵素作用
によってオキジルシフェリンに酸化される反応であって
、下記式で示される。

ルシフェリン＋Ｏ１→ オキジルシフェリン＋ＣＯ１十光 反応機構は生物種によって異なっており、補助因子とし
てＡＴＰなどのヌクレオチドを必要とするものもある。

近縁種間では相互に反応し得ることも知られているが、
基質特異性が極めて高く、同一種生物から得られたルシ
フェリンとルシフェラーゼとは反応するが、異種実物に
由来する酵素と基質とは原則として、交差反応しないと
されている。

このようにルシフェラーゼの基質（ルシフェリン）特異
性は極めて高く、その発光は鋭敏であることから、この
酵素−基質の化学発光反応を利用して様々な物質の検出
および／または定量を行うことができると考えられる。

一般に酵素反応は、その基質特異性に起因して高感受性
であり、かつ反応条件が温和であるために、様々な分野
で応用されている。例えば、過酸化水素の存在下で酸化
反応を触媒する西洋ワサビのベルキシダーゼは、極めて
広範囲に利用されている酵素の１つである。

とりわけ、この酵素は過酸化水素の発生を伴う反応を通
じて検出し得る物質の分析には重要である。

これ以外にも有用な酵素が抽出、単離されているが、様
々な分野で、多様化する目的に応じて更に多くの利用可
能な酵素が必要とされている。従って、発光反応を触媒
する酵素であるルシフェラーゼを安定的に供給し得る方
法が確立されれば、該酵素の新たな用途が開発されると
考えられる。

ところでルシフェラーゼには、その触媒活性の発現に、
酸素およびルシフェリン以外の補助物質（微量のＡＴＰ
などのヌクレオチド）を必要とするものと、必要としな
いものがある。前者に属するルシフェラーゼは補助物質
（微量のＡＴＰ）の検出などに利用されている。これに
対して後者に属する酵素、例えばウミボタルルシフェラ
ーゼは酸素と基質（この場合はウミホタルルシフェリン
）以外の物質を必要としないことから、反応が単純であ
り、従って応用範囲が広く、有用性が高いと推測される
。ウミボタルルシフェラーゼの応用分野の開発研究、並
びに実用化を推進するためには、高純度のウミボタルル
シフェラーゼが安定的に供給される必要がある。しかし
ながら、他の生物由来の酵素と同様に、生物からの酵素
の抽出、単離および精製には、多くの時間と経費を要す
るので上記の需要を満たすことは困難である。従って、
簡便かつ効率のよい、ウミボタルルシフェラーゼの製造
方法の確立が望まれている。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、このような状況に鑑み、ウミボタルルシ
フェラーゼを遺伝子工学により製造することに着目し、
該酵素をコードするｃＤＮＡをクーニングし、そのＤＮ
Ａ配列を決定した。次いで、このようにして得たＤＮＡ
化合物を含有する発現ベクターを構築し、該発現ベクタ
ーを哺乳類の細胞で発現させ、培地中にウミボタルルシ
フェラーゼを分泌させることに成功した。

即ち、本発明は、ウミボタルルシフェラーゼをコードす
るＤＮＡ化合物を提供するものである。

また、本発明は、該ＤＮＡ化合物を含有する発現ベクタ
ーを提供するものである。

また本発明は、該発現ベクターを用いて宿主細胞をトラ
ンスフェクトし、培養して培地からウミボタルルシフェ
ラーゼを回収することからなるウミボタルルシフェラー
ゼの製造方法を提供するものである。

ウミボタルルシフェラーゼと基質ウミホタルルシフェリ
ンの化学発光反応は十分に研究されている［ハーベイ（
Ｈａｒｖｅｙ、　Ｅ、　Ｎ、　）、　　Ａｍ、　Ｊ　、
　Ｐ　ｈｙｓｉｏｌ。

４２３１８−３４１．　１９１７およびジョンソン（Ｊ
　ｏｈｎｓｏｎ、　Ｆ　。

Ｈ，）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　５７
３３１−３６４．　１９７８］。

その反応は下記の反応式で示される。

ジオキセタノン中間体 オキシルシフェリン Ｒ３＝−ＣＨ（ＣＨ，）ＣＨ，ＣＨ，を表す。）なお、
λ□え一４６０ｎｍである。

ウミボタルルシフェラーゼのｃＤＮＡのスクーニング、
ヌクレオチド配列の決定、発現ベクターの構築、宿主細
胞のトランスフェクションおよび培養は当該技術分野で
既知の方法を用いて行なわれた。その概要を以下に示す
。

文献［ツジ（Ｔ　ｓｕｊ　ｉ、　Ｆ　、　Ｉ　、　）Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ。

（５７，３６４−３７２，１９７８）］記載の方法で部
分精製したウミボタルルシフェラーゼをアフィニティー
カラムを用いて完全に精製した。この標本を、そのまま
エドマン分解法に付した場合にはアミノ酸を帰属するこ
とができなかった。これはペプチドのＮ末端アミノ酸の
アミ７基がブロックされていることを意味する。そこで
、精製ウミボタルルシフェラーゼをエンドペプチダーゼ
で消化し、得られたペプチド断片をエドマン分解法に付
すことによりアミノ酸配列を決定した。次いで、適当な
部分を用いてオリゴヌクレオチドプローブを設計し、Ｄ
ＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　Ｉ　ｎｃ、、　Ｍ。

ｄｅ１３８１Ａ）を用い、ホスホラミダイト法（ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）［カルーサ
ーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｍ、Ｈ，）＋　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ、
編集二ナラング（Ｎ　ａｒａｎｇ、　ＳＡ、）（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　
ｐｐ、４７−９４ｒ１９８７］によりオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成した。

他方、千葉系で採集したウミホタル（ツジ、前掲）を液
体窒素中で微粉末に粉砕し、この粉末をチオシアン酸グ
アニジン／塩化セシウム法［チグイン（Ｃｈｉｇｗｉｎ
、　Ｊ　、　Ｍ、　）ら、ＢｉｏｃｈｅＩｌｉｓｔｒｙ
　Ｌ８．　５２９４−５２９９．１９７９］で処理して
全細胞ＲＮＡを抽出した。次いで、オリゴ（ｄＴ）セル
ロースカラムクロマトグラフィ［アビブ（Ａ　ｖｉｖ、
　Ｈ、）ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　６９．１４０８−°１４１２
．１９７２］にかけてポリ（Ａ）ＲＮＡを精製し、モリ
シタ（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、　Ｋ、）らによるＪ　、　
Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（２６２，３８４４３８５
１、１９８７）の記載に準じてｃＤＮＡライブラリーを
構築した。

このｃＤＮＡライブラリーを上記オリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、プラークハイブリダイゼーション法［ヘ
ントンおよびデイビス（Ｂ　ｅｎｔｏｎ、　Ｗ。

Ｄ、　＆　Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、）、　　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　１９６．　１８０−１８２゜１９７７］でスクリー
ニングした。陽性を示す８個のクローンから２個のクロ
ーンＶＬ１６およびＶＬ１８を選択し、制限酵素地図を
作成した。クローン■Ｌ１６はルシフェラーゼのＮ−末
端側を、ＶＬ１３　はＣ−末端側を夫々コードしており
、互いに８３０ヌクレオチドの重複部分を有する（第２
図すおよびＣ）。そこでこれらの２断片をＥｃｏＲ１消
化し、得られた断片をサブクローニングし、７−Ｄｅａ
ｚａ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定キット（宝酒造）、および［
α−３１Ｐ］ｄｃＴＰ（２２２ＴＢｑ／ｉｍｏｌ）（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖成長停止反応［サンガー（Ｓ　ａｎ
ｇｅｒ、　Ｆ　、　）ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　７４．５４６３
−５４８７゜１９７７およびチェノ（Ｃｈｅｎ、　Ｅ、
Ｙ、）ら、ＤＮＡ４゜１６５−１７０．１９８５］によ
ってヌクレオチド配列を決定した。完全長のｃＤＮＡの
制限酵素地図を第２図ａに、ヌクレオチド配列および推
定のアミノ酸配列を第３図に示す。この推定のアミノ酸
配列は上記のエドマン分解法で決定したアミノ酸配列と
完全に一致していた。

次にクローンＶＬ１６およびＶＬ１８から構築した完全
長のｃＤＮＡクローン（第２図ｄ参照）を用いて発現ベ
クターを構築した。発現ベクターは原核性または真核性
のいずれであってもよい。当業者にとっては、適当な出
発物質としてのベクターを選択し、これに所望のペプチ
ドをコードするＤＮＡ化合物を挿入し、該ペプチドの発
現ベクターを構築する方法は周知である。本明細書では
、生成物が培地に分泌されるために処理が容易であるこ
とから、哺乳類の細胞で発現可能な発現ベクターを例示
した。本発明の例示ベクターであるプラスミドｐＲＳ　
Ｖ　Ｖ　Ｌは、ウミボタルルシフェラーゼをコードする
ｃＤＮＡをラウス肉腫ウィルスのロングターミナルリピ
ートのプロモーターの下流に含有している。このプラス
ミドｐＲＳ　Ｖ　Ｖ　Ｌを用い、常法通り宿主細胞をト
ランスフエフ：・する。

トランスフェクションの方法および宿主細胞は適宜選択
し得るが、本発明においては、リン酸カルシウム法（Ｇ
　ｒａｈａｍ、　Ｆ　、　Ｌ　、ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　５２．　４５６４６７、　１９７３およびＷｉｇｌｅ
ｒ、Ｍ　ら、Ｃｅ１ｌ　１４．７２５−７３１．１９７
８）によりサルのＣＯＳ細胞［グルラマン（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ、Ｙ、）、　　Ｃｅ１ｌ　２３．　１７５−１８２
．　１９８１゜（７ＸＩＯ’）］をトトランスフエフし
た。ウミボタルルシフェラーゼの発現に適した培地でイ
ンキュベートした後、培地を回収し、細胞を収穫して細
胞抽出物を調製した。

このようにして得られた培地および細胞抽出物のウミボ
タルルシフェラーゼ活性をＭｉｔｃｈｅｌｌＨａｓｔｉ
ｎｇｓ光度計により測定した［ミッチェル（Ｍｉｔｅｈ
ｅｌ　Ｉ、　Ｇ　、　Ｗ、　）ら、Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　
ｉｏｃｈｅｍ、　　３９．　２４３−２５０］。

その結果、細胞抽出物から検出されるウミボタルルシフ
ェラーゼ活性は僅かであったが、培地からは明確なトラ
ンスフェラーゼ活性が検出されたく第４図）。この発光
は極めて鋭敏であって、培地１〇−中の５μＱを用いバ
ックグラウンドよりも明らかに高いシグナルが検出され
た。

このように、本発明によればウミボタルルシフェラーゼ
を遺伝子工学的に、容易に製造することができる。

本発明によりホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ
化合物のヌクレオチド配列か明らかにされたので、当業
者は遺伝子工学における既知の手段を用いて容易にホタ
ルルシフェラーゼを製造することができる。本発明のウ
ミボタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ化合物の発
現に適した発現ベクターの構築のための出発物質（プロ
モーター等を含む発現ベクター）および宿主細胞は多数
知られており、本明細書に例示したプロモーター−宿主
系以外の系を選択して本発明方法と同様の効果をあげる
ことができる。当業者にとって、適当なプロモーター−
宿主系を選択し、発現ベクターを構築し、得られた発現
ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、培養して生成
物を単離する方法は既知である。従って、当業者ならば
、本発明が例示のプラスミド、ｐＲＳＶＶＬに限定され
るものではな（、本発明のウミボタルルシフェラーゼを
コードするＤＮＡ化合物の発現に適したあらゆる発現ベ
クターを包含するものであるということを容易に理解す
るであろう。そのような他の発現ベクターに適するプロ
モーターとして、下記のものを挙げることができる。

即ち、動物細胞での発現のプロモーターとしては、サル
５Ｖ４Ｑウイルスプロモーター、サイトメガロウィルス
プロモーター、アデノウィルスプロモーター、ＡＩＤＳ
ウィルスプロモーター、蚕多角形ウィルスプロモーター
などである。この際、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃ１２
７細胞、Ｌ細胞、ハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ
細胞や蚕などを宿主細胞として用いることができる。ま
た、原核細胞での発現プロモーターとしては、λファー
ジＰＬプロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモ
ーター、ｌａｃプロモーターなどが知られており、大腸
菌を宿主として発現させることができる。さらに、酵母
や枯草菌を宿主として、それに適するプロモーターを使
用して、ウミボタルルシフェラーゼを発現させることも
可能である。

以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１　ウミホタルｃＤＮＡのクローニング１、ウミ
ボタルルシフェラーゼの精製および配列決定 ッジ（Ｔｓｕｊｉ、　Ｆ、　１．）の方法［Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（５７，３６４−３７２，１９
７８）コに従って部分精製したウミボタルルシフェラー
ゼを２．０Ｍ　ＮａＣＱ１０゜０７Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｃ（ｐＨ７，２）中で平衡させたトリブタミンアフイニ
ティカラム（Ｐ　１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用
い、３０％エチレングリコール１０．１７Ｍ　ＮａＣｌ
２１０．０７Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐＨ７，２）で段
階的に溶離した。次いで、限外濾過によって濃縮した後
、ｐ−アミノベンズアミジンアフィニティ力ラム（Ｐ　
１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い、同様のクロマ
トグラフィ条件下、均質になるまで精製した。

精製したウミボタルルシフェラーゼのドデシル硫酸ナト
リウム／勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた
。勾装置０−１５％ファストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌＸ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により試料を分析し、ファストゲ
ル銀染色キット（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）でタンパク質
を観察すると、Ｍｒ６８，０００の一本の帯を示した。

結果を第１図に示す。図中、レーン１はファルマシア製
の低分子量マーカーであり、レーン２はアフィニティク
ロマトグラフィで精製したウミボタルルシフェラーゼ（
５０ｒ＋９）である。マーカータンパク質の分子量は牛
ロダルトンで示されている。

精製したタンパク質１２０μ９を、トリプシン（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉＩｌｌ）、リシルエン
ドペプチダーゼ（和光純薬）またはアルギニルエンドペ
プチダーゼ（宝酒造）によってエンドペプチダーゼ消化
した。

この消化物をＣ１ａ−タンパク質−ペプチドＨＰＬＣカ
ラム（Ｖ　ｙｄａｃ）を用いる逆相クロマトグラフィに
かけ、各々のペプチド断片を単離した。次いで気相タン
パク質シークエネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　　Ｉ　ｎｃ、、　Ｍｏｄｅｌ　４７７　Ａ
）を用いるエドマン分解法によって、未消化のルシフェ
ラーゼと精製ペプチドのＮ−末端アミノ酸配列を決定し
た。

２、　ｌｌｌＲＮＡの調製およびｃＤＮＡのライブラリ
二〇桿茅 千葉県で採集したウミホタル（ツジ、前掲）を即座に液
体窒素中で凍結させた。このウミホタル（オスタコッズ
、ｏｓｔａｃｏｄｓ）　（重量５９）を、ウルトラター
ラックスホモジナイザー（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ　ｈ
ｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒＸＪ　ａｎｋｅ　＆　Ｋｕｎｋｅ
ｌ）を用い、液体窒素中で微粉砕した。この微粉末をチ
オシアン酸グアニジン／塩化セシウム法［チグイン（Ｃ
ｈｉｇｗｉｎ、　Ｊ　、　Ｍ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　１ｇ、　５２９４−５２９Ｌ　１９７９コに
付して全細胞ＲＮＡを抽出した。次いで、オリゴ（ｄＴ
）セルロースカラムクロマトグラフィ法［アビブ（Ａｖ
ｉｖ、Ｈ，）　　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９、１４０８−１４１２．１９７２
］によってボ１バＡ）ＲＮ　Ａを精製した。このｍＲＮ
Ａを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築したが、その際
低融解アガロース（ＢｉｏＲａｄ）を用いる２回の精製
で二本鎖のＥｃｏＲ１消化ｃＤＮＡをサイズ選別する外
は、モリシタ（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、　Ｋ、）らの方法
［Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（２６２，３ｇ
４４−３８５１．　１９８７コに従った。

３、　　ｃＤＮＡクローンのスクリーニング上記１．で
調製したペプチドフラグメントの一部分はコドンアンビ
ギュイティが最小であるペプチド配列、Ｔ　ｈｒ−Ｍｅ
ｔ−Ｇ　１ｕ−Ａ　５ｎ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｐ−Ｇ　Ｉ
ｙＧｌｎ−Ｌｙｓを有していた。これを用い、コドン縮
重性が高い３箇所にデオキシイノシンを含ませ［オーツ
カ（Ｏｈｔｓｕｋａ、　Ｅ、）ら、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ
、　Ｃｈｅｒａ、　２６０゜２６０５−２６０８．１９
８５］、下記の相補オリゴヌクレオチドプローブを設計
した： ５°（Ｔ／Ｃ）ＴＴ　（Ｔ／Ｃ）ＴＧ　Ｉ　ＣＣ（Ａ／
Ｇ　）ＴＣＩ　ＡＧＧＴＴ　（Ｔ／Ｃ）ＴＣＣＡＴ　Ｉ
　ＧＴ　３’さらに、１５位にＧの代わりにＡを有する
第２の相補プローブを合成した。オリゴヌクレオチドプ
ローブの合成はＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉ　ｎｃ、、　Ｍｏｄｅｌ　
３８１　Ａ）により、ホスホラミダイト法［カルーサー
（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ。

Ｈ，）＋　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡａｎｄ　ＲＮＡ、　Ｎａ
ｒａｎｇ、Ｓ、Ａ、編、（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　ｐ９．４７−９４．　
１９８７］で行った。

このオリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造）および［γ−”Ｐ］ＡＴ　Ｐ（
２２２Ｔ　Ｂｑ／＊ｍｏｌ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いて５゛末端標識しく比活性：
５−６ｘｌＯ”ｃｐＩＩｌ／　ｐｍｏｔ）、得られた２
プローブの混合物を用いてプラークハイブリッド法［ベ
ントンおよびデイビス（Ｂｅｎｔｏｎ、Ｗ、　Ｄ、　　
＆　　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、）＋５ｃｉｅｎｃｅ　１
９６．１８０−１８２．１９７７］により、上記２゜で
調製したウミホタルｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングした。即ち、このプローブを用いてｌＸｌ０＠個の
組換えファージをスクリーニングした。ハイブリダイゼ
ーションは、温度を２８℃に下げ、フィルターを３７°
Ｃ−？？Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，１５ＭＮａＣＱ、１５ａＭク
エン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）により洗浄する外は、
ウオール（Ｗａｈｌ、　Ｇ、　Ｍ、　）らの方法［Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（７６、３
６８３−３６８７，１９７９）］に従って行われた。ラ
イブラリーから８つの陽性クローンを単離し、その内、
挿入長さ１　、２　ｋｂおよび１．５ｋｂのクローンＶ
Ｌ１５およびクローンＶＬ１８を選択してさらに分析し
、制限酵素地図を作成した。これらのクローンの制限酵
素地図を第２図に示す。

４、ウミボタルルシフェラーゼのヌクレオチド配列の決
定 第２図すおよびＣから分かるように、クローン■Ｌ１６
およびクローンＶＬ１８には夫々、単一の内部ＥｃｏＲ
１部位があり、８３０個のヌクレオチド配列の重複部分
がある。これらの両クローンのＥｃｏＲ１断片をｐＵＣ
３でサブクローニングした。７−Ｄｅａｚａ　ＤＮＡ配
列決定キット（Ｔ　ａｋａｒａＳ　ｈｕｚｏ）を使用し
、［ａ−”Ｐ］ｄＣＴＰ（２２２ＴＢｑ／ｚｍｏｌ）（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いるジ
デオキシヌクレオチド鎖成長停止反応［サンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ＋　Ｆ　、　）ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ　
１．Δｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　５Ａ７４、５４６３
−５４６７、１９７７およびチェノ（Ｃｈｅｎ、ＥＹ、
）ら、ＤＮＡ　４．　１６５−１７０．　１９８５）］
に付してヌクレオチド配列を分析した結果、クローンＶ
Ｌ１６はルシフェラーゼのＮ−末端部分をコードし、ク
ローンＶＬ１８はＣ−末端部分をコードしていることが
わかった。これらのクローンから構築される完全長のウ
ミボタルルシフェラーゼｃＤＮΔの制限地図を第２図ａ
に、ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を第３
図に示す。第２図ａにおいて、斜線部分は、推定のシグ
ナル配列である。第３図において、各列の上に記した番
号はヌクレオチド位置であり、各列の下に記した番号は
アミノ酸位置である。水平方向の矢印は、エンドペプチ
ダーゼ消化によって得られたアミノ酸配列と同一のアミ
ノ酸配列を有する領域を表す。Ｎ−グリコジル化に適合
する配列を四角で囲み、ポリアデニル化シグナルＡＡＴ
ＡＡＡを下線で示した。

この配列から計算されるウミボタルルシフェラーゼの分
子量は６２，１７１ダルトンであり、５５５個のアミノ
酸からなるタンパク質をコードする、１６６５個のヌク
レオチドからなるオーブンリーディングフレームを含ん
でいる。このオープンリーディングフレームには、オリ
ゴヌクレオチドプローブの構築に用いたアミノ酸配列が
含まれている。また、エドマン分解法によって決定した
他の７個のペプチドのアミノ酸配列は、ヌクレオチド配
列から推定されるアミノ酸配列と完全に一致していた。

翻訳開始コドンを１６番目のヌクレオチドから始まるＡ
ＴＧコドンに当てた。この推定の開始コドンの周囲のヌ
クレオチド配列は、多くの真核生物のｍＲＮＡに特徴的
なコンセンサス配列ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧと一致
している［コザック（Ｋ。

ｚａｋ、Ｍ、）、　Ｃｅ１ｌ　１５．１１０９−１１２
３．１９７８］。Ｎ−末端のアミノ酸配列は、分泌タン
パク質としてのルシフェラーゼの生物学的役割を果すた
めに、シグナル配列の特徴を多数有している［フォノ・
ハイネ（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、Ｇ、）、　　Ｅｕｒ、
　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１３３゜１７−２１．１９
８３］。なお、ブロックされているＮ−末端は後述の方
法で予想された。

過ヨウ素酸−シッフ反応によるルシフェラーゼ陽性染色
によっても示されたが、アミノ酸残基１８６および４０
８位に２つのＮ−グリコジル化部位（Ａ　５ｎ−Ｘ　−
Ｓ　ｅｒ／　Ｔ　ｈｒ）がある。残基２５８位には配列
Ａ　５ｎ−Ｐ　ｒｏ−３ｅｔが存在しているが、一般に
この配列は効率良くグリコジル化されない［マーシャル
（Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｒ，Ｄ、）、　　Ａｎｎ、　Ｒ
ｅｖ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ虹、　６７３−７０２．　１
９７２］。Ｎ−グリコシダーゼＦを作用させるとルシフ
ェラーゼ分子の大きさは２０００−３０００ダルトン減
少するが、０−グリコジル化部位に特異的な消化酵素で
はこのような減少は認められない。これらの結果は、ウ
ミボタルルシフェラーゼがＮ−グリコジル化されること
、ならびにヌクレオチド配列から推定されるポリペプチ
ドの理論分子量と、ゲル電気泳動（第１図）およびゲル
濾過と沈降平衡分析（ツジら、Ｂ　１ｏｃｈｅ＋＋＋１
ｓｔｒｙ　１３．５２０４−５２０９．　１９７４）で
測定した天然タンパク質の分子量との差が炭水化物部分
の非存在または存在に関連していることを示している。

アミン末端は、ルシフェリンの構造および反応機構が類
似している他の海洋生物の生物発光反応を触媒する酵素
の構造から類推した。そのような生物としてクラゲ（７
ｖ　ｉ　ｃ　ｔ　ｏ　ｒ　ｉ　ａ　）を選び、その生物
発光反応と直接比較した［ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ
、　Ｆ　、　Ｈ、）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、　　５７．　２７１２９１、１９７８］。

クラゲの発光は、カルシウム結合タンパク質、エクオリ
ンによるものであって、このエクオリンがカルシウムイ
オンの存在下で励起されて発光する。エクオリンは、ア
ポエクオリン（アポタンパク質）、コエレンテラジンお
よび酸素分子の錯体であって、エクオリンがカルシウム
イオンと結合すると、配座変化が起こり、タンパク質が
オキシゲナーゼに転換され、次いで、分子内反応により
コエレンテラジンが酸化される。この反応における発光
体はアポエクオリンに結合した励起状態のコエレンテラ
ジンである［シモムラ（Ｓ　ｈｉＩＩｌｏｍｕｒａ。

０、）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　　Ｎ
ｏ、３１．　２９６３−２９６６、１９７３］。

ウミホタルとクラゲの生物発光反応の基質構造および機
構は相互に類似しているが殆ど交差反応しない。しかし
ながら、両者のアミノ酸配列の比較から、ウミボタルル
シフェラーゼの２領域（残基９７〜１５４および残基３
５３〜４１１）のアミノ酸配列が、アポエクオリンの１
領域（残基８２〜１４４）のアミノ酸配列と有意な類似
性を示すことが分かった（第５図参照）。第５図は、ウ
ミボタルルシフェラーゼ（ａ）とクラゲ（Ａ　ｅｑｕｏ
ｒｅａ）のエクオリン（ｂ）とのアミノ酸配列の相同性
を示す図であって、Ｄ　ａｙｈｏｆ４の突然変異データ
ーマトリックス［デイホッフ（ＤａｙｈｏｆＴ、Ｍ、Ｏ
，）、　　Ｓｃｈｗａｒｔｚ。

Ｒ，Ｍ、ら、　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５
ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄＳ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎ　ａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
、Ｄ、Ｃ，）、　Ｖｏｌ、５．　ｐｐ。

３４５−３５２．１９７８］における同一残基を２つの
点（＝）で示し、類似アミノ酸を１つの点（・）で示し
たものである。番号は各タンパク質のＮ−末端からの位
置を表す。アポエクオリン分子の大きさはウミボタルル
シフェラーゼの約１／３であり、１８９個のアミノ酸残
基からなっており、ウミボタルルシフェラーゼの類似領
域の一方または両方が発光に関与していると予測される
。

アポエクオリンの残基８７〜１４４に相当するウミボタ
ルルシフェラーゼの領域は残基９７〜１５４であり、明
らかに１０アミノ酸残基のシフトが認められる。このこ
とは、最初の１１個のアミノ酸残基が分泌に必要なリー
ダーペプチドであり、ウミボタルルシフェラーゼのＮ−
末端が１２番目のチロシンであることを示唆するもので
ある（第３図参照）。さらに、アラニンと隣接アミノ酸
残基との関係はシグナル配列の開裂部位に適合している
ジオン・ハイネ（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ＋　Ｇ、　）ら
、Ｅ　ｕｒ。

Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　１３３．１７−２１．１
９８３］。以上から、ペプチドの開裂部位は１１位であ
り、アミノ末端はチロシンであると予想される。

ウミボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列のもう１つの
特徴は、非常にシスティンに富む領域がＮ−末端部分に
存在することである。この領域ではアミノ酸残基３９〜
８２の間に９個のシスティン残基が認められる。しかし
ながら、ウミボタルルシフェラーゼには遊離のスルフヒ
ドリル基が検出されなかった（ツジら、前掲）ことから
、システィン残基はおそらく分子内のジスルフィド架橋
結合を形成していると考えられる。

実施例２　ウミボタルルシフェラーゼを含有スる発現ベ
クターの構築 完全長のウミボタルルシフェラーゼのｃＤＮＡをラウス
肉腫ウィルスのロングターミナルリピートのプロモータ
ーの下に置いて発現ベクターを構築した。即ち、ウミボ
タルルシフェラーゼｃＤＮＡの５°末端および３°末端
に、それぞれＨｉｎｄＩ［およびＢｇｌ　ＩＩリンカ−
（宝酒造）を連結した。Ｄｒ。

Ｓ　、　Ｓ　ｕｂｒａｍａｎｉから得たホタルルシフェ
ラーゼをコードするプラスミドｐＲ３ＶＬ［ドウエツト
（ｄｅＷｅｔ、　Ｊ　、　Ｒ，）　ら、Ｍｏｌ、　Ｃｅ
ｌ　１．　Ｂ　ｉｏｌ、　　７．　７２５−７３断して
得た線状プラスミドと、上記ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩ［
およびＢｇｌ　ＩＩ断片とを連結することにより、ホタ
ルルシフェラーゼｃＤＮＡの代わりにウミボタルルシフ
ェラーゼｃＤＮＡを含有するＨｉｎｄｌ［−ＢｇｌＩ［
断片を含有する発現プラスミドｐＲＳＶＶＬを得た。こ
のプラスミドで形質転換した大腸菌、Ｅ　５ｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐＲＳ　Ｖ　Ｖ　Ｌは工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている（受託臼：平成
元年６月１５日、受託番号：ＦＥＲＭｐ−ｔ０７８２）
。

実施例３　プラスミドｐＲＳＶＶＬにょるｃ。

Ｓ細胞のトランスフェクフーＩンおよびウミボタルルシ
フェラーゼの発現 １、　　）ランスフェクション １０ｃｙのペトリ皿に入れた１０％ウシ胎児血清（）（
ｙｃｌｏｎｅ）を含有するダルベツコ（Ｄ　ｕｌｂｅｃ
ｃｏ）の改良イーグル培地（日永）ｌｏｚｇにサルＣＯ
３細胞［グルラマン（ＧｌｕｚＩＩｌａｎ、Ｙ、、　　
Ｃｅ１ｌ　２３．１７５−１８２゜１９８１：ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５０］を播いた（７Ｘ１０８）。この細胞を
、リン酸カルシウム法［グラハム（Ｇ　ｒａｈａｍ、　
Ｆ　、　Ｌ、　）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．４５６
−４６７、　１９７３およびヴイグラー（Ｗｉｇｌｅｒ
、　Ｍ、　）ら、Ｃｅ１１１４、７２５−７３１．１９
７８］を用い、実施例２で調製したプラスミドｐＲ８Ｖ
ｖＬ　ＤＮＡ　１ｏμ９でトランスフェクトした。４８
時間インキュベートした後、培地を回収し、細胞を収穫
した。次いで、細胞を凍結および解凍を繰り返した後、
遠心分離することによって細胞抽出物を調製した（ｄｅ
Ｗｅｔ、　Ｊ　。

Ｒ１ら、前掲）。

２、ウミボタルルシフェラーゼ活性の測定１、で調製し
た細胞抽出物および培地のウミボタルルシフェラーゼ活
性を、ウミホタルルシフェリンを基質として測定した。

容ｆｆ１２０＋＋２のシンチレーションバイアル中、上
記１、で得た培地あるいは細胞抽出物を、２００ｍＭ　
Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７、６）により希釈して全１
を１．５ｘｅとし、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｈａｓｔｉｎｇ
ｓ光度計に入れた［ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｇ
、Ｗ、）ら、Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、　３９．
２４３−２５０．１９７１］。他方、ツジの方法［Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（５７，３６４−３７２
，１９７８）］に従って調製したウミホタルルシフェリ
ンを２００Ｊ！Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８
）に溶解（−／ａ度５０ｎＭ）Ｌ、その１．５１ｆ２を
シンチレーションバイアルに注入した。ルシフェリンを
注入する直前に光度計のシャッターを開放し、注入した
点を０ｍ１ｎとし、１．５＋＋ｉｎ後にシャッターを閉
じ、その間の発光を記録した。

１４Ｃ−ヘキサデカン光を標準として光度測定し、光度
を１秒当たりの光量子数に変換した［ハツシング（Ｈａ
ｓｔｉｎｇｓ　Ｊ、Ｗ、）ら、Ｊ、Ｏｐｔ、Ｓｏｃ、Ａ
ｍ。

５３、１４１０−１４１５．・１９６３コ。その結果、
トランスフェクトされたＣＯ８細胞の細胞抽出物に僅か
なルシフェラーゼ活性が検出された。しかし、ＣＯ８細
胞の培養培地には大量のルシフェラーゼ活性が検出され
たく第４図参照）。この培養培地からの発光は被検培地
の容量に正比例しており、発光は極めて鋭敏であった。

即ち、ウミボタルルシフェラーゼ発現ベクターでトラン
スフェクトされたＣｏｓ細胞の培養培地１０峠から得た
僅か５μＱの試料から、バックグランドよりも明らかに
高いシグナルが検出された。これに対して、ＤＮＡをト
ランスフェクトしていないＣＯ８細胞の培養液がまたは
ｐｓＶＯｃＡＴ［ゴーマン（Ｇ　ｏｒｍａｎ、　Ｃ、Ｍ
、　）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ、　Ｂ　ｉｏｌ、　　２
．　１０４４−１０５１．　１９８２］もしくはｐＲ８
ｖＬ［ドウウェット（ｄｅＷｅｔ、　Ｊ　、　Ｒ，）ら
、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　Ｚ、　７２５−７３
７．１９８７］でトランスフェクトされたＣＯ８細胞の
培地および細胞抽出物からの発光は、第４図記載・の発
光よりも２桁以上弱かった。

以上の結果は、再構成されたｃＤＮＡが完全長のラミボ
タフレルシフェラーゼｃＤＮＡであること、そのｃＤＮ
Ａがタンパク質を分泌するのに必要なシグナル配列をも
コードしていることを示すものである。

［作用］ 本発明のウミボタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ
化合物を用いて所望の宿主内でホタルルシフェラーゼを
発現させることができる。ウミボタルルシフェラーゼと
ウミホタルルシフェリンとの化学発光反応は酸素分子の
みを必要とする単純な反応である。しかし基質特異性が
高く、発光の測定感度は鋭敏である。しかも、実施例に
示すように、本発明の発現ベクターでトランスフェクト
されたＣＯ８細胞は、ウミボタルルシフェラーゼを培養
培地に分泌することから、生成物の回収が極めて容易で
ある。これらの事実は、本発明のウミボタルルシフェラ
ーゼをコードするＤＮＡ化合物の有用性を明確に示すも
のである。従って、本発明のＤＮＡ化合物は生物医学の
分野に限らず、環境を始め、様々な分野で有用と思われ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、精製したウミボタルルシフェラーゼのドデシ
ル硫酸ナトリウム／勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果を表す写真の模写図である。第２図は、ウミボ
タルルシフェラーゼｃＤＮへの制限酵素地図および全長
クローンの構築に用いたクローンの制限酵素地図である
。（ａ）は完全長のウミボタルルシフェラーゼｃＤＮＡ
、（ｂ）はりｏ−ンＶＬ１６、（ｃ）はクローンＶＬ１
３の制限酵素部位を示す制限酵素地図であり、（ｄ）は
クローンＶＬ１６およびＶＬ１８から構築された完全長
ｃＤＮＡの制限酵素地図である。第３図は、ウミボタル
ルシフェラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定
のアミノ酸配列を示す模式図である。第４図は、ＣＯ８
細胞によって合成され分泌されたウミボタルルシフェラ
ーゼの活性の測定結果を示すグラフである。第５図はウ
ミボタルルシフェラーゼ（ａ）とクラゲのエクオリン（
ｂ）アミノ酸配列の相同性を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウミボタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ化合
   物。 ２、請求項１記載のＤＮＡ化合物を含有する発現ベクタ
   ー。 ３、プラスミドｐＲＳＶＶＬである請求項２記載の発現
   ベクター。 ４、請求項２または３記載の発現ベクターを用いて宿主
   細胞をトランスフェクトし、培養することからなるウミ
   ボタルルシフェラーゼの製造方法。