JPH0331225B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、液体クロマトグラフイにおけるグラ
ジエント装置に係り、特に略１ml／分以下の流量
において実施させるセミ・ミクロ高速液体クロマ
トグラフイにおいて、相異な溶液の濃度が経時的
に変化する溶離液を効果的に調整し得る装置に関
するものである。 近年、化学、生物、医学等の分野において、注
目を浴びている分離、分析手段の一つとしての液
体クロマトグラフイにおいては、分離カラムから
目的とする物質を効果的に溶出せしめるために、
溶離液として一種類の溶媒より、相異なる２種或
いはそれ以上の溶媒を溶いる手法が採用されてき
ており、特にその一つとして、相異なる溶媒を混
合せしめ、且つその混合比率を経時的に変化せし
めて分離カラムに供給する勾配溶出（グラジエン
ト）法が注目を浴びている。また、一方では、か
かる液体クロマトグラフイは、その用途上の要請
から、50Kg／cm²以上の、更には100Kg／cm²を超え
る高圧下で溶離液を迅速に分離カラムに流して、
微量の試料を効果的に高速分離せしめる高速液体
クロマトグラフイ（HPLC）として開発されてき
ている。 ところで、このような液体クロマトグラフイ、
特に高速液体クロマトグラフイにおける勾配溶出
を行うために従来から用いられているグラジエン
ト装置には、高圧混合型のものと低圧混合型のも
のとがあるが、これらは何れも溶離液流量がほぼ
１ml／分以上の場合を対象とするものであつて、
セミ・ミクロ高速液体クロマトグラフイのよう
に、溶離液流量が１ml／分以下、更には300μ
／分以下（の場合には、何れのタイプの装置に
おいても実用にならないほど大きな問題を生ずる
こととなる。 すなわち、高速混合側の場合には、例えば特公
昭50−19959号公報等に示されている如く、２台
のポンプの流量比を変化させて勾配溶出を行うも
のであるが、この方式では溶媒混合比が大きい場
合、例えば100μ／分で99：１の混合比を採用
するとき、ポンプの流量比は99μ／分：1μ／
分となり、このため超低流量を正確に送液するポ
ンプが必要となるのであつて、これは技術的には
非常に困難なことから、システムとしては経済的
ではなかつたのである。 また、他法の低圧混合型と装置においては、例
えば特公昭56−33664号公報等に示される如く、
１台のポンプと混合用比例バルブを使用して勾配
溶出を行うものであるが、かかる混合用比例バル
ブからポンプを含めたデツド・ボリユームは可及
的に小さく為され得たとしても、２〜３ml程度の
存在は避けられず、このままではグラジエントプ
ログラムを開始してから分離カラムにプログラム
された混合溶媒が達するまでに、20〜30分も時間
がかかることとなることから、全く実用的ではな
かつたのである。しかも、この種のタイプのデツ
ト・ボリユームを実用上許容し得る２〜３分の遅
れに対応する200〜300μ以下とすることは、そ
れで用いられるポンプの構造上極めて困難である
のであり、またポンプのワンストローク当りの吸
引量が50〜150μであることを考えると、スム
ーズなグラジエント曲線が描かれるように２種の
溶媒を混合することは、不可能であつたのであ
る。けだし、比例バルブでグラジエント混合させ
る溶媒は、ポンプに50〜150μの分だけ溜め込
まれて徐々に送液されることになるので、実際に
は滑らかなグラジエント曲線を描くのではなく
て、50〜150μ毎のステツプ状のグラジエント
曲線を与えることとなるからである。 また、特公昭54−20157号公報には、移動相
（溶離液の吐出流量が約10μ／分程度或はそれ
以下の、流量の極めて少ない領域で行われるマイ
クロ高速液体クロマトグラフイに用いられる勾配
溶出方式として、所定の勾配管内に所定の濃度勾
配をもつた溶離液を収容せしめた後、かかる勾配
管を分離カラムに接続せしめて、該勾配管内に保
持されている、濃度勾配を有する溶離液を、該カ
ラムに供給しようとするバツチ式手法が明らかに
されているが、このような方式は流量の少ないマ
イクロ高速液体クロマトグラフイでは可能である
ものの、それよりも多量の流量、換言すれば溶離
液量の必要なセミ・ミクロ高速液体クロマトグラ
フイでは技術的にみて非常に困難であり、また溶
離液の濃度勾配の正確性に問題を生じ、しかも勾
配管内に所定の濃度勾配を有する溶離液を収容す
るための時間が必要となり、これが分析時間が長
くなる問題を派生し、更に、勾配管と分離カラム
等との接続、分離操作を頻繁に行わなければなら
ないことから、操作が極めて面倒となる問題も内
在しているのである。 ここにおいて、本発明は、かかる事情に鑑みて
為されたものであつて、その目的とするところ
は、液体クロマトグラフイにおけるグラジエント
装置、特に、セミ・ミクロの領域における液体ク
ロマトグラフイのためのグラジエント装置を提供
することにある。 また、本発明の目的は、相異なる溶媒の混合率
を経時的に変化せしめて、所定の液体クロマトグ
ラフイ装置の分離カラムに連続的に供給し得る、
簡単な構造のグラジエント装置を経済的に、安価
に提供することにある。 そして、これらの目的を達成するために、本発
明に係るグラジエント装置は、(a)グラジエント開
始時の開始溶媒を収容する第一の貯槽と、(b)グラ
ジエント終了時の終了溶媒を収容する第二の貯槽
と、(c)前記第一及び第二の貯槽から、それぞれ開
始溶媒及び終了溶媒を吸引し、所定の液体クロマ
トグラフイ装置の分離カラムに接続された流路に
略10μ〜１ml／分の割合で吐出せしめ、分離カ
ラム側に送液するポンプ手段と、(d)該ポンプ手段
の上流側の流路に設けられ、該ポンプ手段によつ
て前記第一及び第二の貯槽から吸引される開始溶
媒及び終了溶媒のうち何れか一方のみを該ポンプ
手段に導くように切り換える切換バルブ手段と、
(e)該切換バルブ手段よりも下流側で、且つ前記ポ
ンプ手段の上流側若しくは下流側の流路上に設け
られ、収容された前記開始溶媒に対して前記終了
溶媒を混合せしめて経時的に濃度変化する溶離液
を形成する、撹拌機構と共に、内容積を変化せし
め得る容量可変機構を備えた溶離液溜とを、含む
ことを特徴とするものである。 従つて、かくの如き本発明によれば、溶離液溜
に予め開始溶媒が収容され、これがポンプ手段に
よつて供給させる終了溶媒の継続的な導入によつ
て順次希釈されることによつて、経時的に濃度変
化する溶離液と為され、そしてこの溶離液が連続
的に流路を通じて液体クロマトグラフイ装置の分
離カラムに給送されるようになるため、極めて簡
単に所定の濃度勾配の溶離液を作製することが可
能となるのであり、またかかる溶離液の調製が連
続的に行い得ることとなつたのである。しかも、
かかる溶離液溜における溶離液の形成が、単に切
換バルブ手段による流路の切換操作によつて簡単
に行われ得るため、構造上は勿論、操作上におい
ても著しく単純化され得たのであり、また分離カ
ラムへの溶離液の供給流量が略１ml／分以下、好
ましくは300μ／分以下の量となるセミ・ミク
ロ高速液体クロマトグラフイにおいても、その勾
配溶出操作を連続的に行い得ることとなつたので
ある。更に、本発明によれば、セミ・ミクロ高速
液体クロマトグラフイにおいて、１つのポンプを
用いてグラジエント溶出手法が可能となることは
勿論、切換バルブ手段による切り換えによつて、
溶離液溜には開始溶媒並びに終了溶媒が任意に導
入され得ることとなり、グラジエント分析操作の
スタートと分析終了後の開始溶媒への溶離液の置
換が容易に行われ得て、その操作性が著しく向上
させ得ることとなつたのであり、また経時的に濃
度勾配を有する溶離液の調製サイクルを繰り返し
自動的に行い得て、勾配溶出操作を連続的に実施
することが可能となつたのである。 以下、本発明を更に具体的に明らかにするため
に、図面に基づいて、本発明の実施例を詳細に説
明することとする。 まず、第１図において、２は第一の貯槽であ
り、その内部に所定の開始溶媒Ａが収容されてい
る。また、第二の貯槽４内には終了溶媒Ｂが収容
されている。そして、これら二つの貯槽２，４
は、それぞれ流路６，８を介して切換バルブ機構
である三方バルブ１０にそれぞれ接続されてお
り、そして、該三方バルブ１０が流路１２を介し
て定吐出量タイプのポンプ１４の吸引側に接続さ
れているのである。従つて、かかるポンプ１４の
吸引によつて、第一の貯槽２及び第二の貯槽４内
にそれぞれ収容された開始溶媒Ａ及び終了溶媒Ｂ
は、流路６，８を通じてそれぞれ三方バルブ１０
に導かれるが、かかる三方バルブ１０によつて、
それら二つの溶媒のうち一方のみが選択され、そ
して流路１２を通じてポンプ１４に導かれ、そし
て液体クロマトグラフイ装置の分離カラム１６に
接続された流路１８に吐出せしめられるようにな
つている。 かかるポンプ１４の吐出流路１８上には、溶離
液溜２０が設けられている。そして、この溶離液
溜２０は、その下部にマグネイツクスターラ２２
を有している。なお、このマグネイツクスターラ
２２は、よく知られているように、溶離液溜２０
内に収容された撹拌子２４を溶離液溜２０の外部
に設置された電磁駆動部２６によつて回転せしめ
られることにより、該溶離液溜２０内の液体の撹
拌を行うものである。また、この溶離液溜２０の
上部には、第２図に示される如く、容量可変機構
としてのピストン２８が、液密に摺接移動し得る
ように設けられており、そして該ピストン２８の
ナツト３０に体する相対的な回転によつて、溶離
液溜２０内の容積を任意に変え得るようになつて
いる。 更に、かかる溶離液溜２０に対して下流側とな
る流路１８上には、必要に応じて第２、第３の溶
離液溜２０′……２０ⁿが直列に設けられ、そして
前例と同様にマグネイツクスターラ２２′……２
２ⁿが設けられ、それぞれの溶離液溜内に流入す
る溶離液を該溶離液溜内に存在する溶離液と混合
撹拌せしめ、均一化するように構成されている。 なお、かかる溶離液溜２０の下流側の流路１８
部分には、ドレイン流路３２が接続されており、
該ドレイン流路３２上にパルブ３４が設けられる
一方、分離カラム１６６の直前の流路１８上に
は、公知の如く液体クロマトグラフイ装置の試料
注入器３６が設けられている。 従つて、かかる構成のグラジエント装置にあつ
ては、勾配溶出に先立つて、先ず溶離液溜２０内
に第一の貯槽２内の開始溶媒Ａが供給され、収容
されることとなる。この操作のためには、三方バ
ルブ１０の切り換えによつて流路６と流路１２が
連通せしめられることにより、ポンプ１４の吸引
作用によつて該第一の貯槽２内の開始溶媒Ａが吸
引され、そして吐出流路である流路１８に吐出せ
しめられることによつて、該流路１８上に設けら
れた溶離液溜２０内に供給させることとなり、ま
たかかる溶離液溜２０の液体、すなわち先の分析
サイクル終了時の溶離液である終了溶媒Ｂはそれ
によつて押し出されてドレイン流路３２、バルブ
３４を通じて排出させることとなるのである。こ
のようなドレイン流路３２、バルブ３４の配置
は、分離カラム１６内を液体が高流量で流通せし
められ得ないところから、溶離液溜２０の液体の
排出作業において極めて有効であり、これによつ
て分析時間を著しく短縮せしめるのである。 そして、かかる溶離液溜２０に開始溶媒Ａが充
填されると、次に三方バルブ１０が切り換えら
れ、これによつて流路８と流路１２とが流通せし
められて、貯槽４内の終了溶媒Ｂがポンプ１４の
吸引、吐出作動によつて流路１８内に導かれ、そ
して溶離液溜２０内に流入せしめられるのであ
る。また、この流入する終了溶媒Ｂによつて、該
溶離液溜２０内の開始溶媒Ａは漸次希釈されるよ
うになるのであり、そしてマグネイツクスターラ
２２による撹拌作用によつて経時的に濃度変化す
る均一な溶離液と為されて、分離カラム１６に送
液されるのである。 なお、かかる溶離液溜２０内で形成される溶離
液の濃度は、該溶離液溜２０に流入する終了溶媒
Ｂの流入量、換言すればポンプ１４の吐出流量や
溶離液溜２０内の容積に影響させるものである
が、何れにしても時間の経過に従つて開始溶媒の
組成から終了溶媒の組成に漸次変化せしめられ得
るのである。そして、形成される溶離液の濃度勾
配の傾斜を制御するために、第２図の如き溶離液
溜２０内の容積を変化せしめ得るような容量可変
機構２８，３０が設けられているのである。尤
も、かかる容量可変機構のピストン２８の位置を
固定してポンプ１４を、定吐出量ポンプから可変
吐出量ポンプに変えて、溶離液濃度の勾配傾斜を
制御するようにすることも可能である。また、第
１図に示されるように、溶離液２０の複数を直列
に接続することにより、形成される溶離液のグラ
ジエント曲線は、更に種々変化せしめられ得るこ
ととなる。 そして、このようにして溶離液溜２０内で形成
される溶離液は、流路１８を通じて分離カラム１
６へと送液させることとなるのである。なお、流
路１８を通じて送液させる経時的に濃度変化する
溶離液は、よく知られているように、試料注入器
３６を通じて導入された試料を分離カラム１６内
で展開し、それぞれの成分に分離せしめた後、そ
の分離成分が所定の検出器にて検出されることと
なる。 このように、かかる構成のグラジエント装置に
よれば、溶離液溜２０で形成される経時的に濃度
勾配を有する溶離液が、単に三方バルブ１０の切
り換えのみによつて、極めて簡単に形成され得る
こととなつたのであり、これによつて略10μ乃
至１ml／分、特に300μ／分以下のセミ・ミク
ロの領域における高速液体クロマトグラフイにお
ける勾配溶出操作の実施を効果的に為し得ること
となり、以てその実用化が可能となつたのであ
る。 しかも、勾配溶液の調製が、従来の如く二つの
ポンプを利用したり、或いは比例バルブを使用し
たりする方式とは異なり、単に溶離液溜２０内へ
の終了溶媒Ｂの流入のみによつて効果的に形成さ
れることとなるため、単にポンプ１４の一台のみ
の使用で済む効果に加えて、装置的にも簡単な構
造と為し得たのである。 また、かくと如き構造の実施例によれば、溶離
液の調製操作は、単に終了溶媒Ｂを該溶離液溜２
０内に流入せしめれば足りるため、ポンプ１４等
におけるデツドボリユームの存在をほとんど無視
することが可能である。 更に、上例の装置によれば、単に三方バルブ１
０の切り換えのみによつて、溶離液溜２０内には
第一の貯槽２内の開始溶媒Ａや第二の貯槽４内の
終了溶媒Ｂが任意に導入され得るので、グラジエ
ント分析のスタートと分析終了後の開始溶媒Ａへ
の溶離液の置換が容易に行われ得、操作性の向上
が達成されると共に、勾配溶出操作を自動的に且
つ連続的に行い得る大きな特徴も有しているので
ある。特に、分離カラム１６内の溶媒（溶離液）
が開始溶媒Ａから終了溶媒Ｂへとスムーズに変化
する状態は、第３図から明白に認められるところ
である。すなわち、第３図において、開始溶媒Ａ
から終了溶媒Ｂへの濃度変化に対する理論曲線４
０に対して、実際の測定曲線４２は極めて類似し
たカーブを描いているのである。なお、実験は、
1.8mlの内容積を有する溶離液溜２０の一個を用
い、100μ／分の流速にて行われたものである。 また、第４図に示したグラフは、溶離液溜２０
を一個用いて得られるグラジエント曲線４４と、
溶離液溜２０を二個用いて得られるグラジエント
曲線４６とをそれぞれ示しているが、それより明
らかなように、溶離液溜を二個用いた場合におい
ては、その一個の使用の場合に比して、特徴ある
曲線を描き、そしてそのような溶離液溜２０を更
に３段、４段と増加せしめることにより、各種の
グラジエント曲線を実現することが容易となるの
である。なお、グラジエント曲線４４の測定は、
1.8mlの内容積の溶離液溜一個を用い、流速100μ
／分で行われ、またグラジエント曲線４６の測
定は二個の溶離液溜を用い、上流側の溶離液溜の
内容積を0.75mlとし、下流側の溶離液溜の内容積
を1.05mlとするとともに、流速100μ／分で行わ
れたものである。 更に、第５図は、かかる実施例の装置を用いて
得られた、ａ；ナフタレン、ｂ；ビフエニル、
ｃ；フルオレン、ｄ；アントラセン、ｅ；ピレ
ン、ｆ；トリフエニレン、ｇ；クリセン、ｈ；ベ
ンツピレンを含む試料のクロマトグラムであり、
またその分析結果は下記第１表の通りである。

【表】

【表】 なお、液体クロマトグラフイ測定条件は以下の
通りである。 流量；150μ／分 分離用カラム；μS−FINEPAK SIL C18〔日本分
光工業(株)製：オクタデシル基を化学結合したシ
リカゲル〕を充填した内径1.5mm、長さ250mmの
もの。 紫外分光検出器；JASCO UVIDEC−100−
〔日本分光工業(株)製〕 開始溶媒Ａ；CH₃CN／H₂O（50／50） 検出波長；254nｍ 終了溶媒Ｂ；CH₃CN（100） 溶離液溜２０の容積；1.77ml 第５図並びに上記第１表の結果から明らかなよ
うに、本発明に従う装置によつて、優れた分離能
が得られ、また優れた再現性が達成されることが
明瞭に理解されるのである。 更にまた、第６図には、漢方風邪薬について本
発明に従う装置にてグラジエント溶出分析を行な
つて得られたクロマトグラムが示されており、そ
の測定条件は以下の通りである。 流量；150μ／分 分離用カラム；μS−FINEPAK SIL C18〔日本分
光工業(株)製：オクタデシル基を化学結合したシ
リカゲル〕を充填した内径1.5mm、長さ250mmの
もの。 紫外分光検出器；JASCO UVIDEC−100−
〔日本分光工業(株)製〕 検出波長；254nｍ 開始溶媒Ａ；0.1％ H₃PO₄ 水溶液 終了溶媒Ｂ；CH₃CN／0.2％H₃PO₄ 水溶液
（50／50） 溶離液溜２０の容積；1.77ml 第６図のクロマトグラムから明らかなように、
複雑な構造の各種の成分を有する漢方風邪薬であ
つても、それらの各成分が良好が分離されている
のである。 また、第７図には、第１図に示すグラジエント
装置とは異なる本発明の他の実施例が示されてい
る。そこでは、第１図の装置におけるポンプ１４
が溶離液溜２０の下流側に配置されているのであ
る。換言すれば、三方バルブ１０とポンプ１４と
をつなぐ流路１２上に溶離液溜２０が配置されて
いるのである。このように、溶離液溜２０を介し
て、ポンプ１４の吸引作用をそれぞれの貯槽２，
４内に収容された開始溶媒Ａ、終了溶媒Ｂに及ぼ
しめ、三方バルブ１０の切り換えによつて、その
何れがを溶離液溜２０内に導くようにすることに
よつても、前例と同様な効果は達成されるのであ
る。尤も、前例の構造の装置の方が、溶離液溜２
０内での溶離液からの気泡の発生の問題がないこ
とを考えると、その点において有利であると考え
られる。 また、本発明において第一の貯槽２や第二の貯
槽４に収容される開始溶媒Ａや終了溶媒Ｂとして
は、前記例示の実施例からも明らかなように、単
一の溶媒から構成されるもののほか、複数の溶媒
を混合したものであつても何等差支えないのであ
る。 更に、本発明における切換バルブ手段として、
前例では三方バルブ１０を用いたが、これに変え
て、適当な公知のバルブ手段を採用することも可
能であり、更にまたポンプ手段１４としても、公
知の各種のポンプを使用することが可能である
が、特に本願出願人の出願にかかる特願昭52−
78079（特開昭54−12890）等にて提案されている
脈動のないポンプを使用することが特に推奨され
る。 その他、一々列挙はしないが、本発明が当業者
の知識に基づいて種々なる変更・修正等を加えた
形態において実施され得るものであることは言う
までもなく、またそのような実施形態が、本発明
の趣旨を逸脱しない限りにおいて、何れも本発明
の範囲内に含まれることは言うまでもないところ
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従うグラジエント装置を備
えた液体クロマトグラフイ装置の一例を概略的に
示す系統図であり、第２図は第１図の装置におけ
る溶離液溜部分の拡大説明図であり、第３図は第
１図の装置を用いて得られるグラジエント曲線を
示すグラフ、第４図は溶離液溜の個数を変えた場
合におけるグラジエント曲線の形態を示すグラ
フ、第５図及び第６図は、それぞれ第１図の装置
を用いて得られたクロマトグラムの一例を示すも
のであり、第７図は本発明の他の実施例を示す装
置を設けたクロマトグラフイ装置を示す系統図で
ある。 ２：第一の貯槽、４：第二の貯槽、６，８，１
２，１８：流路、１０：三方バルブ、１４：ポン
プ、１６：分離カラム、２０：溶離液溜、２２：
マグネテイツクスターラ、２４：撹拌子、２６：
電磁駆動部、２８：ピストン、３０：ナツト、３
６：試料注入器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グラジエント開始時の開始溶媒を収容する第
   一の貯槽と、 グラジエント終了時の終了溶媒を収容する第二
   の貯槽と、 前記第一及び第二の貯槽から、それぞれ開始溶
   媒及び終了溶媒を吸引し、所定の液体クロマトグ
   ラフイ装置の分離カラムに接続された流路に略
   10μ〜１ml／分の割合で吐出せしめ、分離カラ
   ム側に送液するポンプ手段と、 該ポンプ手段の上流側の流路に設けられ、該ポ
   ンプ手段によつて前記第一及び第二の貯槽から吸
   引される開始溶媒および終了溶媒のうち何れか一
   方のみを該ポンプ手段側に導くように切り換える
   切換バルブ手段と、 該切換バルブ手段よりも下流側で、且つ前記ポ
   ンプ手段の上流側若しくは下流側の流路上に設け
   られ、収容された前記開始溶媒に対して前記終了
   溶媒を混入せしめて経時的に濃度変化する溶離液
   を形成する、撹拌機構と共に、内容積を変化せし
   め得る容量可変機構を備えた溶離液溜とを、 含むことを特徴とする液体クロマトグラフイにお
   けるグラジエント装置。 ２ 前記切換バルブ手段が、三方バルブである特
   許請求の範囲第１項記載の装置。 ３ 前記ポンプ手段が、一定流量の吐出を行う定
   吐出量ポンプである特許請求の範囲第１項記載の
   装置。