JPS593258A - 液体クロマトグラフイにおけるグラジエント装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体クロマトグラフィにおけるグラジェント装
置に係り、特に略１πｌ／分以下の流量において実施さ
れるセミ・ミクロ高速液体クロマトグラフィにおいて、
相異なる溶媒の濃度が経時的に変化する溶離液を効果的
に調製し得る装置に関するものである。

近年、化学、生物、医学等の分野において、注目を浴び
ている分離、分析手段の一つとしての液体クロマトグラ
フィにおいては、分離カラムから目的とする物質を効果
的に溶出せしめるために、溶離液として１種類の溶媒よ
り、相異なる２種或いはそれ以上の溶媒を用いる手法が
採用されてきており、特にその一つとして、相異なる溶
媒を混合せしめ、且つその混合比率を経時的に変化せし
めて分離カラムに供給する勾配溶出（グラジェント）法
が注目を浴びている。また、一方では、かかる液体クロ
マトグラフィは、その用途上の要請から、５Ｑｋｇ／ｃ
ｎ１以上の、更には１００ｋｇ／ｃｎｔを越える高圧下
で溶離液を迅速に分離カラムに流して、微量の試料を効
果的に高速分離せしめる高速液体クロマトグラフィ（Ｉ
（Ｐ　ＬＯ）として開発されてきている。

ところで、このような液体クロマトグラフィ、特に高速
液体クロマトグラフィにおける勾配溶出を行うために従
来から用いられているグラジェント装置には、高圧混合
型のものと低圧混合型のものとがあるが、これらは何れ
も溶離液流量がほぼ１πｔ／分以上の場合を対象とする
ものであって、セミ・ミクロ高速液体クロマトグラフィ
のように、溶離液流量が１ｍ１１分以下、更には３００
／ｌｌ／分以下の場合には、何れのタイプの装置におい
ても実用にならないほど大きな問題を生ずることとなる
。

すなわち、高圧混合型の場合には、例えば特公昭５０−
１９９５９号公報等に示されている如く、２台のポンプ
の流量比を変化させて勾配溶出を行うものであるが、こ
の方式で・は溶媒混合比が大きい場合、例えば１００μ
ｌ／分で９９：１の混合比を採用するとき、ポンプの流
量比は９９μｌ／分：１ｐｌ／分となり、このため超低
流量を正確に送液するポンプが必要となるのであって、
これは技術的には非常に困難なことであり、且つまた２
台のポンプが必要ということから、システムとしては経
済的ではなかったのである。

また、他方の低圧混合型の装置においては、例えば特公
昭５６−３８６６４号公報等に示される如く、１台のポ
ンプと混合用比例バルブを使用して勾配溶出を行うもの
であるが、かかる混合用比例バルブからポンプを含めた
デッド・ボリュームは可及的に小さく為され得たとして
も、２〜８ｙｎｌ５− 程度の存在は避けられず、このままではグラジェントフ
ログラムを開始してから分離カラムにプログラムされた
混合溶媒が達するまでに２０〜３０分も時間がかかるこ
ととなることから、全く実用的ではなかったのである。

しかも、この種のタイプのデッド・ボリュームを実用」
二許容し得る２〜３分の遅れに対応する２００〜３００
μｌ以下とすることは、そこで用いられるポンプの構造
」二極めて困難であるのであり、またポンプのワンスト
ローク当りの吸入量が５０〜１５０７１１であることを
考えるとスムーズなグラジェント曲線カ描かれるように
２種の溶媒を混合することは不可能であったのである。

けだし、比例バルブでグラジェント混合される溶媒は、
ポンプに５０〜１５０μｌの分だけ溜め込まれて徐々に
送液されることとなるので、実際には滑らかなグラジェ
ント曲線を描くのではなくて、５０〜１５０μβ毎のス
テップ状のグラジェント曲線を与えることとなるからで
ある。

また、特公昭５４−２０１５７号公報には、移６− 動用（溶離液）の吐出流速が約１０ｔｔ（１／分程度或
はそれ以下の、流計の極めて少ない領域で行われるマイ
クロ高速液体クロマトグラフィに用いられる勾配溶出方
式として、所定の勾配管内に所定の濃度勾配をもった溶
離液を収容せしめた後、かかる勾配管を分離カラムに接
続せしめて、該勾配管内に保持されている、濃度勾配を
有する溶離液を該カラムに供給しようとするバッチ式手
法が明らかにされているが、このような方式は流量の少
ないマイクロ高速液体クロマトグラフィでは可能である
ものの、それよりも多量の流量、換言すれば溶離液量の
必要なセミ・ミクロ高速液体クロマトグラフィでは技術
的にみて非常に困難であり、また溶離液の濃度勾配の正
確性に問題を生じ、しかも勾配管内に所定の濃度勾配を
有する溶離液を収容するための時間が必要となり、これ
が分析時間が長くなる問題を派生し、更に、勾配管と分
離カラム等との接続、分離操作を頻繁に行わなければな
らないことから、操作が極めて面倒となる問題も内在し
ているのである。

ここにおいて、本発明は、かかる事情に鑑みて為された
ものであって、その目的とするところは、液体クロマト
グラフィにおけるグラジェント装置、特にセミ・ミクロ
の領域における液体クロマトグラフィのためのグラジェ
ント装置を提供することにある。

また、本発明の目的は、相異なる溶媒の混合率を経時的
に変化せしめて所定の液体クロマトグラフィ装置の分離
カラムに連続的に供給し得る、簡単な構造のグラジェン
ト装置を経済的に、安価に提供することにある。

そして、これらの目的を達成するために、本発明に係る
グラジェント装置は、（ａ）グラジェント開始時の開始
溶媒を導く第一〇流路と、（１〕）グラジェント終了時
の終了溶媒をその貯槽より導く第二の流路と、（Ｃ）該
第二の流路上に設けられた、前記終了溶媒を送液ぜしぬ
るためのポンプ手段と、（ｄ）前記第−及び第二〇流路
の下流側に設けられ、それらの何れかに接続される第三
の流路と、（０）該第三の流路−Ｌに設けられ、１■容
された前記開始溶媒に対して前記終了溶媒を混入せしめ
て経時的に濃度変化する溶離液を形成する、攪拌機構並
びに容量可変機構を備えた溶離液溜と、（ｆ）前記第三
〇流路の下流側に設けられ、該第三〇流路または前記第
二〇流路の何れかに接続されてそれら流路を通じて導か
れた液体を液体クロマトグラフィ装置の分離カラムに導
く第四〇流路と、（ｇ）前記第一の流路と第三の流路を
接続すると同時に、前記第二の流路と第四〇流路との接
続を行なう接続操作と；前記第二〇流路と第三〇流路を
接続すると同時に、前記第三の流路と第四の流路との接
続を行なう接続操作とを；選択的に為し得る切換バルブ
機構とを、含むことを特徴とするものである。

従って、かくの如き本発明によれば、溶離液溜に予め開
始溶媒が収容され、これがポンプ手段によって供給され
る終了溶媒の継続的な導入によって順次稀釈されること
によって、経時的に濃度変化する溶離液と為され、そし
てこの溶離、液が連続的に流路を通じて液体クロマトグ
ラフィ装置の分離カラムに給送されるようになるため、
極めて簡　９− 単に所定の濃度勾配の溶離液を作製することが可能とな
るのであり、またかかる溶離液の調製が連続的に行い得
ることとなったのである。しかも、かかる溶離液溜にお
ける溶離液の形成が、単に切換バルブ手段による流路の
切換操作によって簡単に行われ得るため、構造上は勿論
、操作上においても著しく単純化され得たのであり、ま
た分離カラムへの溶離液の供給流量が略１ｍ１７分以下
、好ましくは３００μｌ／分以下の量となるセミ・ミク
ロ高速液体クロマトグラフィにおいても、その勾配溶出
操作を連続的に行い得ることとなったのである。更に、
本発明によれば、切換バルブ手段による流路の切換えに
よって、溶離液溜には開始溶媒並びに終了溶媒が任意に
導入され得るので、経時的に濃度勾配を有する溶離液の
調製サイクルを繰り返し自動的に行い得て、勾配溶出操
作を連続的に実施することが可能となったのである。

以下、本発明を更に具体的に明らかにするために、図面
に基づいて、本発明の実施例を詳細に説明することとす
る。

１０− まず、第１図において、２はポンプシリンジであり、そ
の内部に所定の開始溶媒Ａが収容されている。そして、
かかるポンプシリンジ２のピストン作動によって、開始
溶媒流路（第一〇流路）４を通じてかかる開始溶媒Ａが
給送されるようになっている。また、貯槽６に収容され
た終了溶媒Ｂは、終了溶媒流路（第二の流路）８を通じ
て該流路８上に設けられた定吐出量タイプのポンプ１０
によって給送されるようになっている。そして、これら
開始溶媒流路４並びに終了溶媒流路８は、切換バルブ機
構である６方バルブ１２の各ボートに接続され、またこ
の６方バルブの他の２つのボートに上流側端と下流側端
がそれぞれ接続されてループを形成する溶離液形成流路
（第三〇流路）１４が設けられている。

かかる６方バルブ１２に対してループを為ず溶離液形成
流路１４」二には、溶離液溜１６が設けられている。こ
の溶離液溜１６は、その下部にマグネテイツクスターラ
１８を有している。なお、このマグネテイツクスターラ
１８は、よく知られているように、溶離液溜１６内に収
容された撹拌子離液溜１６内の液体の攪拌を行うもので
ある。また、この溶離液溜１６の上部には、容量可変機
構としてのピストン２４が液密に摺接移動し得るように
設けられており、そして該ピストン２４がナツト２６に
対する相４１的な回転によって溶離液溜１６内の容積を
任意に変え得るようになっている。

更に、６方バルブ１２の一つのボートに対して、溶離液
給送路（第四〇流路）２８が接続され、そして該給送路
２８の下流側には、公知のように液体クロマｉ・グラフ
ィ装置の試料注入器３０、分離カラム３２、更には検出
器３４が順次接続されているのである。

なお、６方バルブ１２の環状に配置された６個のボート
３６，３８，４０，４２，４４．４６には、終了溶媒流
路８．溶離液給送路２８．溶離液形成流路１４の下流端
、ドレイン流路４８．開始溶媒流路４．溶離液形成流路
１４の上流端がそれぞれ環状となるように接続され、取
手５０の実線位置と破線位置との間の回動移動によって
、各ボートの何れもが隣り合う両側のボートの何れかに
接続されるようになっている。即ち、図示の如く取手５
０が実線位置の場合には、実線に示される如きポート間
（３６と４６．３８と４０．４２と４４）の接続が為さ
れるのであり、破線位置の場合には、破線にて示される
如きボート間（３６と３８．４０と４２．４４と４６）
の接続が為されるのである。

したがって、かかる構成のグラジェント装置にあっては
、勾配溶出に先だって、先ず溶離液溜１６内にポンプシ
リンジ２内の開始溶媒Ａが供給され、収容されることと
なる。この操作のためには、６方バルブ１２の取手５０
が破線位置に移動させられることにより、開始溶媒流路
４が接続されたボート４４と溶離液形成流路１４の上流
端に接続されたボート４６とが接続される一方、かかる
溶離液形成流路１４の下流側端に接続されたボート４０
が、ドレイン流路４８に接続されたボート４２１３− に対して接続せしめられるのであり、これによってポン
プシリンジ２内の開始溶媒Ａは、該ポンプシリンジ２の
ピストンの作動によって、開始溶媒流路４．６方バルブ
１２、溶離液形成流路１４を通じて溶離液溜１６内に供
給され、またかかる溶離液溜１６内の溶媒は、それによ
って押し出されてドレイン流路４８を通じて排出される
こととなるのである。また、かかる６方バルブ１２の切
換操作によって、終了溶媒流路８が接続されたボート３
６と溶離液給送路２８が接続されたボート３８とが連通
せしめられることとなるので、ポンプ１０の駆動によっ
て貯槽６内の終了溶媒Ｂが、分離カラム３２に送液され
、該分離カラム３２内に充填された充填剤等がかかる終
了溶媒Ｂによって洗浄されることとなる。

そして、かかる溶離液溜１６内に開始溶媒人が充填され
ると、次に６方バルブ１２の取手５０はその破線位置か
ら実線位置まで回動せしめられ、これによってボート３
６とボート４６が連通せしめられて、貯槽６内の溶媒Ｂ
がポンプ１０の吸引１４− 吐出作動によって終了溶媒流路８から溶離液形成流路１
４に導かれ、溶離液溜１６内に流入せしめられるのであ
る。そして、この流入する終了溶媒Ｂによって、該溶離
液溜１６内の開始溶媒Ａは漸次稀釈されるようになるの
であり、そしてマグネテイツクスターラ１８による攪拌
作用によって、経時的に濃度変化する均一な溶離液と為
されて、連通されたボート４０からボート３８を通って
溶離液給送路２８に導かれ、そして分離カラム３２に送
液されるのである。

なお、かかる溶離液溜１６内で形成される溶離液のグラ
ジェント曲線は、下式にて与えられることとなる。

ｔ ■Ｏ Ｃ（も）＝　Ｃ（−（Ｃｃ　　−Ｃ；　　）　　・　ｅ
但し、Ｃ（１・）：形成される溶離液のｔ時間後の濃度 Ｃ１：溶離液溜１６内の初期濃度、換言すれば開始溶媒
Ａの濃度 Ｃ「　：溶離液溜１６に流入せしめられる終了溶媒Ｂの
濃度 ■０　　：溶離液溜１６の容積 Ｑ　　：ポンプ１０の吐出流量 従って、１・時間後に形成される溶離液の濃度ＣＣｔ’
ｌはＱ　／　Ｖ　ｏ　　に比例することとなるのである
。

換言すればかかるＱ／Ｖｏ　　によって溶離液の勾配の
傾斜が制御可能とｔ「るのであり、このため上例におい
ては、かかる溶離液溜の容積■０を変化せしめ得るよう
に容量可変機構（２４，２６）が設けられているのであ
る。尤も、容量可変機構のピストン２４の位置を固定し
て、終了溶媒Ｂを給送するポンプ１０を定吐出量タイプ
のポンプから可変吐出量のポンプに変えることにより、
形成される溶離液の勾配傾斜を制御するようにすること
も可能である。

そして、このようにして溶離液溜１６内で形成される溶
離液は、連通せしめられたボート４０から３８を通じて
溶離液給送路２８内に導かれ、分離カラム３２へと送液
されることとなる。なお、開始溶媒流路４に接続された
６方バルブ１２のボー１・４４は、ドレイン流路４８に
接続されたボート４２と接続されるようになるが、ポン
プシリンジ２が作動させられていないので、該シリンジ
２内の開始溶媒Ａがドレイン流路４８に排出されるよう
なことはないのである。また、かかる溶離液給送路２８
を通じて送液される経時的に濃度変化する溶離液は、よ
く知られているように、試料注入器３０を通じて導入さ
れた試料を分離カラム３２内で展開し、それぞれの成分
に分離せしめた後、検出器３４に導かれ、そこで各成分
の検出を行なうようになっている。

このように、かかる構成のグラジェント装置によれば、
溶離液溜１６内で形成される、経時的に濃度勾配を有す
る溶離液が、単に６方バルブ１２の切換えのみによって
、極めて簡単に形成され得ることとなったのであり、こ
れによってほぼ１０１１ｅ乃至１ｍ１１分、特に３００
μｌ／分以下の七ミ・ミクロの領域における高速液体ク
ロマトグラフィにおける勾配溶出操作の実施を効果的に
為し得ることとなり、以てその実用化が可能となった１
７− のである。

しかも、勾配溶離液の調製が、従来の如く、二つのポン
プを利用したり、或いは比例バルブを使用したりする方
式とは異なり、単に溶離液溜１６内への終了溶媒Ｂの流
入のみによって効果的に行なわれることとなるため、単
にポンプ１０の１台のみの使用で済む効果に加えて、装
置的にも簡屯な構造と為し得たのである。

また、かくの如き構成の実施例によれば、溶離液の調製
操作は単に終了溶媒Ｂを該溶離液溜１６内に流入せしめ
れば足りるため、ポンプ１０等におけるデッド・ボリュ
ームの存在を殆んど無視することが出来るのであるので
ある。

更に、上例の装置によれば、単に６方バルブ１２の切換
えのみによって、溶離液溜１６内にはポンプシリンジ２
内の開始溶媒Ａや貯槽６内の終了溶媒Ｂが任意に導入さ
れ得るので、勾配溶出操作を自動的に且つ連続的に行い
得る大きな特徴も有しているのである。

因みに、本装置の効果は次の実験結果からも容１８− 易に認識し得るところである。

即ち、第２図は開始溶媒Ａとして、アセトンを０．０５
％の割合で含むメタノールを用い、また終了溶媒Ｂとし
てメタノールを用いて勾配溶出液を調製したときの濃度
変化、即ちグラジェント曲線を描いたものであるが、グ
ラジェント開始から略５〜６分後から、きれいな連続的
な濃度変化が認められ、しかもラインが安定しているこ
とから、十分に２種の溶媒が混合されているものと判断
されるのである。なお、試料注入（試料注入器３０から
の）はグラジェント開始から適当時間経過後に行うこと
が望ましいことも理解されるのである。

また、第３図には、第１図に示す装置にて芳香族化合物
類の勾配溶出を行なって得られたクロマトグラフィ入）
）の他、定組成の溶離液を用いた場合のそれ（ａ）、　
　（０）が示されている。それらの測定条件は以下の通
りである。

流量ｉ　Ｉ　００　μｌ　／　”１０ 分離用カラム；　／ｌＳ　　ｒ　’　Ｎ　ＥＰ　ＡＫ　
＋　Ｓ　’　Ｌ０１８１日本分光工業＠）製： オクタデシル基を化学結合したシリカ ゲル」を充填した内径１゜５ｍｍ１長さ２５０ｍｍのも
の。

紫外分光検出器、ＪＡ８ＣＯＵＶＩＤＥＣ−１ｏｏ−１
１１［日本分光工業（株）製］。

検出波長・・・２５４　ｎｍ 第３図の結果から明らかなように、本発明に従う装置（
第１図）を用いた勾配溶出操作により、良好な分離能が
得られている。

また、第４図には、第１図に示される如きグラジェント
装置とは異なる本発明の他の実施例が示されている。そ
こでは、第１図の装置における６方バルブ１２に代えて
、二つのバルブ、即ち入側バルブ５２と出側バルブ５４
が溶離液溜■６の前後に設けられている点が、前例とは
大きく異なっている。即ち、入側バルブ５２と出側バル
ブ５４は同時に作動せしめられるものであって、前記６
方バルブ１２と同様に、開始溶媒流路４と溶離液形成流
路１４とを接続すると同時に、終了溶媒流路８と溶離液
給送路２８との接続を行う接続操作と、該終了溶媒流路
８と溶離液形成流路１４とを接続すると同時に、該溶離
液形成流路１４と溶離液給送路２８との接続を行う接続
操作とを選択的に為し得るようになっており、図面では
前者の接続操作を行なった状態が示されている。なお、
ここでは終了溶媒流路８と溶離液給送路２８との接続が
直接的に行われておらず、それらの間に短絡流路５６を
設けて行われている点が前例とはやや異なっている。ま
た、５８はドレイン流路であって、開始溶媒Ａが溶離液
溜１６に供給されているときに、かかる溶離液溜内の他
の液体を排出するために、出側バルブ１４によって該溶
離液溜１６に連通されるように設けられている。

このように、二つの入側バルブ５２と出側バルブ５４を
用いた流路の切換えによっても、前例と同様な効果は達
成されるのである。

なお、本発明は、上述の如き分離カラムへの溶２１− 離液の供給流量を１０μ４〜１ｍ１１分とした場合にお
いて、有利に採用され得るものであるが、また供給流量
の極めて少ない領域、例えば０．０１μｌ／分程度であ
っても適用することが可能である。

また、開始溶媒Ａや終了溶媒Ｂの組成としては、単一成
分からなるものの他、複数成分からなるものであっても
侮辱差支えない。

更に、その他、本発明には、特許請求の範囲に明らかに
した本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の
知識に基づいて種々なる変更、修正等を加え得ることは
言うまでもないところである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従うグラジェント装置を備えた液体ク
ロマトグラフィ装置の１例を概略的に示す系統図であり
、第２図は第１図の装置を用いて得られたグラジェント
曲線を示すグラフ、第３図（ａ）、　　（ｂ）、　　（
Ｃ）はそれぞれ定組成溶離液、第１図の装置によって形
成された溶離液、及び他の定組成溶離液を用いて勾配溶
出して得られたクロマ２２− トゲラムを示し、第４図は本発明の他の実施例を示す装
置を設けたクロマトグラフィ装置を示す系統図である。 ２：ポンプシリンジ　　４：開始溶媒流路６：貯槽　　
　　　　　８；終了溶媒流路１０：ポンプ　　　　　１
２：６方バルブ１４：溶離液形成流路　１６：溶離液溜
１８：マグネテイツクスターラ ２０：攪拌子　　　　　２２：電磁駆動部２４：ピスト
ン　　　　２６：ナツト ２８：溶離液給送路　　３０：試料注入器３２−分離カ
ラム　　　３４：検出器 ３６．８８，４０，４２，４４，４６　：ボート４８：
　ドレイン流路　　５０：取手 ５２：入側バルブ　　　５４：出側バルブ５６：短絡流
路　　　　５８ニドレイン流路出願人　　日本分光工業
株式会社 ２３− 第１図 第２図 ＯＩｏ　　　　　２０　　　　３０　　ｍ１ｎ０　　　
１０　（ｍｉｎ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）グラジェント開始時の開始溶媒を導く第一〇流路
   と、 グラジェント終了時の終了溶媒をその貯槽より導く第二
   〇流路と、 該第二の流路上に設けられた、前記終了溶媒を送液せし
   めるためのポンプ手段と、 前記第−及び第二〇流路の下流側に設けられ、それらの
   何れかに接続される第三〇流路と、該第三の流路上に設
   けられ、収容された前記開始溶媒に対して前記終了溶媒
   を混入せしめて経時的に濃度変化する溶離液を形成する
   、攪拌機構並びに容量可変機構を備えた溶離液溜と、前
   記第三〇流路の下流側に設けられ、該第三〇流路または
   前記第二〇流路のいずれかに接続されてそれら流路を通
   じて導かれた液体を液体クロマトグラフィ装置の分離カ
   ラムに導く第四〇流路と、 前記第一〇流路と第三〇流路を接続すると同時に、前記
   第二〇流路と第四の流路との接続を行なう接続操作と；
   前記第二〇流路と第三の流路を接続すると同時に、前記
   第三〇流路と第四〇流路との接続を行なう接続操作とを
   ；選択的に為し得る切換パルプ機構とを、 含むことを特徴とする液体クロマトグラフィにおけるグ
   ラジェント装置。
2. （２）前記切換バルブ機構が６方式バルブであり、その
   環状に配置された６個のボートに、前記第二〇流路、第
   四〇流路、第三の流路の下流端、ドレイン流路、第一〇
   流路及び第三の流路の」二流端の順序でそれらが環状に
   接続され、１１．つその切換操作によって各ボートの何
   れもが隣り合う両側のボートの何れかに接続される特許
   請求の範囲第１項記載の装置。
3. （３）前記ポンプ手段が、一定流量の吐出を行なう定吐
   出量ポンプである特許請求の範囲第１項記載の装置。
4. （４）前記開始溶媒を収容、保持したポンプシリンジに
   よって、該開始溶媒が前記第一の流路内に流通ぜしぬら
   れる特許請求の範囲第１項記載の装置。
5. （５）前記ポンプ手段の吐出作動によって、前記第四〇
   流路を通じて略１０μｌ〜１．ｍｌ／分の割合で前記分
   離カラムに送液される特許請求の範囲第１項記載の装置
   。