【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は固定化複合酵素組成物に関するもので
あり、さらに詳しくは酵素電極用固定化複合酵素
膜と安定化剤を含む緩衝液に関するものである。
周知の如く、酵素は基質特異性が高く、温和な
反応条件で反応を行なわしめることができるとい
う長所を有する反面、熱や酸化により変性を受け
易い不安定な物質である。そのため、ほとんどの
酵素または酵素を含む試薬はその酵素に適した安
定化剤や活性化剤を用いて安定化されている。例
えばエチレンジアミン四酢酸（以下EDTAと略
す）、牛血清アルブミン、グリシン、メルカプト
エタノール、ジチオスライトール、還元型グルタ
チオン、グリセロール、カテコールアミン、
NADH、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、鉛イ
オン、ノニオン系活性剤等が安定化剤または活性
剤として用いられている。
しかし、異なる酵素特性を有する酵素２種以上
を同時に同じ反応系で用いるとき、これらの酵素
を同時に安定化することは難しい。例えば活性点
に金属を必要とする酵素と金属イオンで阻害を受
ける酵素を同時に安定化することは難しい。また
活性点にスルフヒドリル基を有する酵素を安定化
するためには酵素の酸化による失活を防護する目
的で、メルカプトエタノール、ジチオスライトー
ル、還元型グルタチオン等の酵素と同じスルフヒ
ドリル基を有する化合物が一般によく用いられて
いる。
ところが、これらの安定化剤は化合物そのもの
が不安定で長時間にわたる効果が期待できないば
かりか、過酸化水素を検知物質として利用する酵
素比色法あるいは酵素電極法では、これらの還元
性物質と過酸化水素が反応して測定を妨害したり
電極表面で酸化されて電極を汚染して感度を低下
させるという大きな欠点がある。また固定化技術
によつて酵素を安定化させることができるが、一
層安定に、そして耐久性を付与するために、固定
化酵素に対しても安定化剤や活性化剤を用いるこ
とが要求されている。
本発明者等は異なる酵素特性を有する酵素２種
以上を固定化してなる固定化複合酵素を長期間安
定に保持する目的で種々鋭意検討したところ、安
定化剤として金属キレート剤および還元剤を含む
緩衝液を使用することを見出し、本発明に到達し
た。
すなわち本発明は金属キレート剤および還元剤
を含む緩衝液と固定化複合酵素からなる固定化複
合酵素組成物である。
本発明では金属キレート剤および還元剤を含む
緩衝液を使用することにより、２種以上の酵素を
固定化してなる固定化複合酵素、特に酵素電極用
固定化複合酵素膜を安定に長期間保持できる。ま
た、複合酵素としてクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザ
ルコシンオキシターゼの３種の酵素を使用する
例、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザル
コシンオキシターゼの２種類の酵素を使用す例に
おいて、その効果は大きく、クレアチニンおよび
クレアチンを精度よく、簡便に、しかも長期間安
定に測定を行なうことができる。
本発明の安定化剤は電極反応を妨害したり、電
極を汚染しない特徴を有する。
本発明に用いる金属キレート剤としては、例え
ばマンガン、コバルト、マグネシウム、亜鉛、ニ
ツケル、カルシウム、鉄、バリウム、鉛、カドミ
ウム等のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の
部分塩などがある。
本発明に用いる還元剤としては、例えば亜リン
酸、次亜リン酸あるいはこれらの塩やエステルが
挙げられる。具体的には亜リン酸、亜リン酸ナト
リウム、亜リン酸モノエチルエステル、亜リン酸
ジエチルエステル、次亜リン酸、次亜リン酸ナト
リウム等が挙げられる。
金属キレート剤あるいは還元剤は２種以上併用
してもよい。
本発明に用いる緩衝液は、用いる酵素により、
種々異なるものであるが、例えばリン酸バツフア
ー、アセテートバツフアー、ホウ酸バツフアー、
トリスバツフアー等が使用できる。
上記金属キレート剤および還元剤は本発明の固
定化複合酵素と混合してから、緩衝液と混合して
もよい。また固定化複合酵素を有する系に、上記
金属キレート剤および還元剤を含む緩衝液が存在
すれば、該系は本発明の固定化複合酵素組成物に
包合される。
金属キレート剤の含有量は緩衝液に対して0.1
ｍＭ以上が適当である。好ましくは１〜10ｍＭで
ある。0.1ｍＭより少ないと、酵素の活性化に必
要な金属濃度が不足したり、水銀、銀、銅等の活
性を阻害する金属を不活化させるだけのキレート
能力が不足する。また10ｍＭ以上では、すでに十
分量である。
還元剤の含有量は緩衝液に対して0.1〜20ｍＭ
（最終濃度）が適当である。好ましくは0.5〜５ｍ
Ｍである。0.1ｍＭより少ないと、酸化による固
定化複合酵素の失活を防止するだけの還元力が不
足する。また20ｍＭを越えると、電極反応を妨害
して測定感度を低下させる場合がある。
本発明の固定化複合酵素とは、担体に固定化し
てなる２種以上の酵素を意味する。
担体としては例えば、セルロースアセテート、
ポリスチレン、コラーゲン、キトサン、ポリアク
リルアミド、多孔性ガラスビーズなどがある。
その形状としては粉末、溶液、ビーズ、繊維、
チユーブ、中空糸、膜あるいは加工成形品などが
ある。
酵素としては例えばクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよび
ザルコシンオキシダーゼからなる３酵素系、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオ
キシダーゼからなる２酵素系、コレステロールエ
ステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼか
らなる２酵素系、α−グルコシダーゼおよびグル
コースオキシダーゼからなる２酵素系、アセチル
コエンザイムＡシンセターゼおよびアセチルコエ
ンザイムＡオキシダーゼからなる２酵素系、グリ
セロキナーゼおよびグリセロ−３−リン酸オキシ
ダーゼからなる２酵素系などがある。
担体に２種以上の酵素を固定化させる方法は特
に制限されるものではなく、例えばグルタルアル
デヒド等の２官能性試薬による架橋法、ゼラチン
やキトサン等を用いる包括法あるいはアミノ基や
アルデヒド基を有する担体への共有結合法等があ
る。
本発明の固定化複合酵素組成物は安定剤として
金属キレート剤および還元剤を使用することによ
り、２種以上の酵素を固定化してなる固定化複合
酵素の酵素活性を大幅に失することなく、長期間
安定に保持することが可能である。本発明の固定
化複合酵素組成物を使用して、体液中の種々の成
分、クレアチニン、クレアチン、コレステロー
ル、マルトース、α−アミラーゼ、不飽和脂肪
酸、中性脂肪等を正確に精度よく、長期間にわた
つて測定することができる。
次に複合酵素としてクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼ（以下CNと略記する）、クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ（以下CIと略記する）および
ザルコシンオキシダーゼ（以下SOと略記する）
あるいはCIおよびSOを用いて、クレアチニンあ
るいはクレアチンを測定する場合について詳述す
る。
CN、CIおよびSOの各酵素は下記反応を触媒す
る。
クレアチニン＋H2OCN
クレアチン
クレアチン＋H2OCI
―――→
ザルコシン＋尿素
ザルコシン＋O2＋H2O2CO
―――→
H2O2
＋グリシン＋ホルムアルデヒド
CN、CIおよびSOの三酵素を固定化してなる系
では過酸化水素を検知物質として比色法あるいは
電極法によつて測定し、試料中のクレアチニンと
クレアチンの総量を測定できる。
CIおよびSOの二酵素を固定化してなる系では、
過酸化水素を検知物質として比色法あるいは電極
法によつて測定し、試料中のクレアチン量を測定
できる。
クレアチニンの量はCN、CIおよびSO系にて測
定したクレアチニンとクレアチンの総量から、
CIおよびSO系にて測定したクレアチンの量を差
し引くことにより求める。
上記酵素を担体固定化した固定化複合酵素の具
体的形状は例えば粉末状、溶液状、ビーズ状、セ
ンイ状、チユーブ状、中空糸状、膜状もしくはこ
れらを加工成形した成形品等がある。比色法では
ビーズ状固定化複合酵素をカラムに充填したもの
あるいはチユーブ状固定化複合酵素を使用するこ
とが好都合であり、酵素電極法ではこの他に、膜
状固定化複合酵素を電極と一体化して用いること
が好都合である。
測定システムの一例を図面でもつて示す。
第１図は固定化複合酵素を用いた酵素比色法に
よるクレアチニン、クレアチン測定のフローダイ
ヤグラムである。図中、１は安定剤を含む緩衝
液、２は試料、３は呈色試薬、４は呈色試薬
、５は四方バルグ、６は固定化複合酵素、７
は固定化複合酵素、８はミキシングコイルを示
す。
第２図は酵素電極法のフローダイヤグラムであ
る。図中、１は安定剤を含む緩衝液、２は試料、
３は三方バルグ、４，５は過酸化水素電極、６は
固定化複合酵素、７は固定化複合酵素、８は
アンプ、９は演算システムを示す。
第１図および第２図において、固定化複合酵素
の系ではクレアチニンとクレアチンの総量を、
そして固定化複合酵素の系ではクレアチンの量
を吸光度または電流値として連続的に検知し、演
算により試料中のクレアチニン値とクレアチン値
とを同時に測定することができる。
測定システムはフローシステムに限定されるも
のではなく、特に全血サンプルを用いる時はセミ
フローシステム、デイスクリートシステム、バツ
チシステム等が好都合な場合もある。
本発明の固定化複合酵素組成物を使用する臨床
分析では、少量のサンプルで血液、尿、その他の
体液中に含まれる微量のクレアチニン、クレアチ
ンを同時に短時間で精度よく長期間安定に耐久性
よく、経済的に測定することが可能となつた。次
に実施例によつて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明は、これらによつて何んら限定される
ものではない。
実施例 １
平均膜厚5.3μｍの非対称構造をもつアセチルセ
ルロース膜の多孔質側を上にして、ガラス板で水
平に保持した。CN（東洋紡績製）1000単位、CI
（東洋紡績製）105単位、SO（盛進製薬製）38単位
および牛血清アルブミン（アーマー ケミカル
製）５mgを50ｍＭリン酸カリウムバツフアー（PH
7.5）150μに溶解した。５分間、氷冷後氷冷し
た４％グルタルアルデヒド水溶液50μを加えて
十分混合した。この酵素溶液をアセチルセルロー
ス膜の多孔質側の15cm2に流延した。４℃で60分
間、ゲル化させた後、1Mグリシンを含む50ｍＭ
リン酸カリウムバツフアーに室温で16時間浸漬し
た。多孔層側に多孔性ポリカーボネート膜をラミ
ネートして４℃で風乾した。CN活性0.60単位／
cm2、CI活性0.09単位／cm2、SO活性0.015単位／cm2
を有する固定化複合酵素膜を得た。全く同様に
して、CI、SOの２種類の酵素を用いて、CI活性
0.12単位／cm2、SO活性0.019単位／cm2を有する固
定化複合酵素膜を得た。
２種類の固定化複合酵素膜およびを各々ク
ラーク型過酸化水素電極と組合せて酵素電極を構
成した。５ｍＭ EDTA・2Na・Mg、１ｍＭ次
亜リン酸ナトリウム、および0.2ｍＭアジ化ナト
リウムを含む50ｍＭリン酸カリウムバツフアーを
用いて、32℃、PH7.5の条件でデイスクリート方
式により、市販管理血清バリデートおよびバリデ
ートＡ中のクレアチニンおよびクレアチン値の測
定に供した。セル容量は0.5mlそして検体量は25μ
であつた。検体をマイクロシリンジで注入し、
固定化複合酵素の一連の反応でクレアチニンまた
はクレアチンから生成する過酸化水素の酸化電流
を検知して、クレアチニンおよびクレアチン値を
計算して求めた。結果を第１表に示す。同じ測定
系において、固定化複合酵素膜を用いて、繰返
し測定に対する各々の酵素活性の耐久性を調べた
結果を第３図に示す。11日間にわたり500検体の
血清中の総クレアチニン測定後も固定化複合酵素
は安定でCN、CIおよびSOの相対活性は初期活性
の各々83％、91％、105％を保持した。
The present invention relates to an immobilized composite enzyme composition, and more particularly to a buffer solution containing an immobilized composite enzyme membrane for enzyme electrodes and a stabilizer. As is well known, although enzymes have the advantage of having high substrate specificity and being able to carry out reactions under mild reaction conditions, they are unstable substances that are easily denatured by heat and oxidation. Therefore, most enzymes or reagents containing enzymes are stabilized using stabilizers or activators suitable for the enzyme. For example, ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as EDTA), bovine serum albumin, glycine, mercaptoethanol, dithiothreitol, reduced glutathione, glycerol, catecholamines,
NADH, calcium ions, magnesium ions, potassium ions, ammonium ions, lead ions, nonionic activators, and the like are used as stabilizers or activators. However, when two or more enzymes with different enzymatic properties are used simultaneously in the same reaction system, it is difficult to stabilize these enzymes at the same time. For example, it is difficult to simultaneously stabilize an enzyme that requires a metal at its active site and an enzyme that is inhibited by metal ions. In order to stabilize enzymes that have sulfhydryl groups at their active sites, compounds that have the same sulfhydryl groups as enzymes, such as mercaptoethanol, dithiothreitol, and reduced glutathione, are generally used to protect enzymes from deactivation due to oxidation. Often used. However, the compounds of these stabilizers themselves are unstable and cannot be expected to be effective over a long period of time, and in the enzyme colorimetric method or enzyme electrode method, which uses hydrogen peroxide as a detection substance, there is a possibility that they will not interact with these reducing substances. A major drawback is that hydrogen oxide reacts and interferes with the measurement, or is oxidized on the electrode surface, contaminating the electrode and reducing sensitivity. Although enzymes can be stabilized using immobilization techniques, it is necessary to use stabilizers and activators for immobilized enzymes in order to make them even more stable and durable. ing. The present inventors conducted various studies with the aim of stably maintaining an immobilized complex enzyme for a long period of time, which is formed by immobilizing two or more enzymes with different enzyme properties, and found that the stabilizer contains a metal chelating agent and a reducing agent. The present invention was achieved by discovering the use of a buffer solution. That is, the present invention is an immobilized composite enzyme composition comprising a buffer containing a metal chelating agent and a reducing agent, and an immobilized composite enzyme. In the present invention, by using a buffer containing a metal chelating agent and a reducing agent, an immobilized composite enzyme formed by immobilizing two or more enzymes, especially an immobilized composite enzyme membrane for enzyme electrodes, can be stably maintained for a long period of time. . In addition, in examples where three types of enzymes, creatinine amidohydrolase, creatine amidinohydrolase, and sarcosine oxidase, are used as a composite enzyme, and cases where two types of enzymes, creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase, are used, the effect is large, and creatinine and creatine can be measured accurately, easily, and stably over a long period of time. The stabilizer of the present invention has the characteristic of not interfering with electrode reactions or contaminating the electrode. Examples of the metal chelating agent used in the present invention include partial salts of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) such as manganese, cobalt, magnesium, zinc, nickel, calcium, iron, barium, lead, and cadmium. Examples of the reducing agent used in the present invention include phosphorous acid, hypophosphorous acid, and salts and esters thereof. Specific examples include phosphorous acid, sodium phosphite, phosphorous acid monoethyl ester, phosphorous acid diethyl ester, hypophosphorous acid, and sodium hypophosphite. Two or more metal chelating agents or reducing agents may be used in combination. The buffer solution used in the present invention may vary depending on the enzyme used.
Although they are different, for example, phosphate buffers, acetate buffers, boric acid buffers,
Tris buffer etc. can be used. The metal chelating agent and reducing agent may be mixed with the immobilized complex enzyme of the present invention and then mixed with the buffer solution. Furthermore, if a buffer containing the metal chelating agent and reducing agent is present in a system having an immobilized composite enzyme, the system is included in the immobilized composite enzyme composition of the present invention. The content of metal chelating agent is 0.1 relative to the buffer solution.
A value of mM or more is appropriate. Preferably it is 1-10mM. If it is less than 0.1 mM, the metal concentration necessary for enzyme activation will be insufficient, or the chelating ability will be insufficient to inactivate metals that inhibit activity, such as mercury, silver, and copper. Moreover, 10mM or more is already a sufficient amount. The content of reducing agent is 0.1-20mM relative to the buffer solution.
(final concentration) is appropriate. Preferably 0.5-5m
It is M. When the amount is less than 0.1 mM, the reducing power to prevent the immobilized complex enzyme from being inactivated due to oxidation is insufficient. Moreover, if it exceeds 20mM, it may interfere with the electrode reaction and reduce the measurement sensitivity. The immobilized complex enzyme of the present invention refers to two or more enzymes immobilized on a carrier. Examples of carriers include cellulose acetate,
Examples include polystyrene, collagen, chitosan, polyacrylamide, and porous glass beads. Its forms include powder, solution, beads, fiber,
These include tubes, hollow fibers, membranes, and processed molded products. Enzymes include, for example, a three-enzyme system consisting of creatinine amidohydrolase, creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase, a two-enzyme system consisting of creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase, a two-enzyme system consisting of cholesterol esterase and cholesterol oxidase, α-glucosidase and glucose. These include a two-enzyme system consisting of oxidase, a two-enzyme system consisting of acetyl coenzyme A synthetase and acetyl coenzyme A oxidase, and a two-enzyme system consisting of glycerokinase and glycero-3-phosphate oxidase. The method of immobilizing two or more enzymes on a carrier is not particularly limited, and examples include a crosslinking method using a bifunctional reagent such as glutaraldehyde, an entrapping method using gelatin, chitosan, etc., or a method containing an amino group or an aldehyde group. There are methods such as covalent bonding to a carrier. The immobilized complex enzyme composition of the present invention uses a metal chelating agent and a reducing agent as stabilizers, so that the immobilized complex enzyme, which is formed by immobilizing two or more enzymes, does not significantly lose its enzymatic activity. It is possible to maintain it stably for a long period of time. Using the immobilized complex enzyme composition of the present invention, various components in body fluids, such as creatinine, creatine, cholesterol, maltose, α-amylase, unsaturated fatty acids, and neutral fats, can be measured accurately and accurately for a long period of time. can be measured across the board. Next, the complex enzymes are creatinine amidohydrolase (hereinafter abbreviated as CN), creatine amidinohydrolase (hereinafter abbreviated as CI), and sarcosine oxidase (hereinafter abbreviated as SO).
Alternatively, the case of measuring creatinine or creatine using CI and SO will be explained in detail. The CN, CI and SO enzymes catalyze the following reactions. Creatinine + H 2 OCN Creatine Creatine + H 2 OCI ―――→ Sarcosine + Urea Sarcosine + O 2 + H 2 O 2 CO ―――→ H 2 O 2 + Glycine + Formaldehyde A system consisting of immobilized three enzymes: CN, CI, and SO The total amount of creatinine and creatine in a sample can be measured using a colorimetric method or an electrode method using hydrogen peroxide as a detection substance. In a system consisting of immobilized two enzymes, CI and SO,
The amount of creatine in a sample can be measured by colorimetric or electrode methods using hydrogen peroxide as a detection substance. The amount of creatinine is determined from the total amount of creatinine and creatine measured using the CN, CI, and SO systems.
It is determined by subtracting the amount of creatine measured in the CI and SO systems. The specific shape of the immobilized complex enzyme in which the above-mentioned enzyme is immobilized on a carrier includes, for example, powder, solution, beads, fiber, tube, hollow fiber, membrane, or molded products obtained by processing and molding these. In the colorimetric method, it is convenient to use a bead-shaped immobilized complex enzyme packed in a column or a tube-shaped immobilized complex enzyme, and in the enzyme electrode method, it is convenient to use a membrane-shaped immobilized complex enzyme packed in an electrode. It is convenient to use it as a An example of the measurement system is also shown in the drawing. FIG. 1 is a flow diagram for measuring creatinine and creatine by an enzyme colorimetric method using an immobilized complex enzyme. In the figure, 1 is a buffer containing a stabilizer, 2 is a sample, 3 is a color reagent, 4 is a color reagent, 5 is a four-sided bulk, 6 is an immobilized complex enzyme, 7
8 indicates an immobilized complex enzyme, and 8 indicates a mixing coil. FIG. 2 is a flow diagram of the enzyme electrode method. In the figure, 1 is a buffer containing a stabilizer, 2 is a sample,
3 is a three-way bulkhead, 4 and 5 are hydrogen peroxide electrodes, 6 is an immobilized composite enzyme, 7 is an immobilized composite enzyme, 8 is an amplifier, and 9 is a calculation system. In Figures 1 and 2, in the immobilized complex enzyme system, the total amount of creatinine and creatine is
In the immobilized complex enzyme system, the amount of creatine is continuously detected as absorbance or current value, and the creatinine value and creatine value in the sample can be measured simultaneously by calculation. The measurement system is not limited to a flow system; a semi-flow system, discrete system, batch system, etc. may be convenient, especially when using whole blood samples. In clinical analysis using the immobilized complex enzyme composition of the present invention, trace amounts of creatinine and creatine contained in blood, urine, and other body fluids can be simultaneously analyzed in a short time, accurately, stably, and durablely for a long period of time using a small sample. , it became possible to measure it economically. EXAMPLES Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited by these in any way. Example 1 An acetylcellulose membrane having an asymmetric structure with an average thickness of 5.3 μm was held horizontally with a glass plate with the porous side facing upward. CN (manufactured by Toyobo) 1000 units, CI
105 units (manufactured by Toyobo), 38 units of SO (manufactured by Seishin Pharmaceutical) and 5 mg of bovine serum albumin (manufactured by Armor Chemical) were added to 50mM potassium phosphate buffer (PH
7.5) Dissolved in 150μ. After cooling on ice for 5 minutes, 50μ of an ice-cooled 4% glutaraldehyde aqueous solution was added and thoroughly mixed. This enzyme solution was cast onto 15 cm 2 of the porous side of the acetylcellulose membrane. After gelation for 60 minutes at 4°C, 50mM containing 1M glycine
Soaked in potassium phosphate buffer for 16 hours at room temperature. A porous polycarbonate membrane was laminated on the porous layer side and air-dried at 4°C. CN activity 0.60 unit/
cm 2 , CI activity 0.09 unit/cm 2 , SO activity 0.015 unit/cm 2
An immobilized composite enzyme membrane was obtained. In exactly the same way, CI activity was determined using two types of enzymes, CI and SO.
An immobilized composite enzyme membrane having an SO activity of 0.12 units/cm 2 and an SO activity of 0.019 units/cm 2 was obtained. Enzyme electrodes were constructed by combining two types of immobilized composite enzyme membranes with Clark-type hydrogen peroxide electrodes. Commercially controlled serum validation was performed using a discrete method at 32°C and pH 7.5 using a 50mM potassium phosphate buffer containing 5mM EDTA, 2Na, Mg, 1mM sodium hypophosphite, and 0.2mM sodium azide. and creatinine and creatine values in Validate A were measured. Cell capacity is 0.5ml and sample volume is 25μ
It was hot. Inject the sample with a microsyringe,
Creatinine and creatine values were calculated by detecting the oxidation current of hydrogen peroxide generated from creatinine or creatine in a series of reactions using an immobilized complex enzyme. The results are shown in Table 1. FIG. 3 shows the results of examining the durability of each enzyme activity against repeated measurements using the same measurement system using an immobilized composite enzyme membrane. After measuring total creatinine in the serum of 500 samples over 11 days, the immobilized enzyme complex remained stable, and the relative activities of CN, CI, and SO remained at 83%, 91%, and 105% of their initial activities, respectively.
【表】
比較例 １
実施例１と同じ固定化複合酵素膜およびを
用いて、0.2ｍＭアジ化ナトリウムと１ｍＭ
EDTAを含む50ｍＭリン酸カリウムバツフアを
実施例１と全く同じシステムに供した。１日後の
固定化複合酵素膜のCN、CIおよびSOの相対活性
は初期活性の各々、2.9％、4.5％、62.0％であり、
長期間にわたり安定にクレアチニン、クレアチン
を測定することは出来なかつた。[Table] Comparative Example 1 Using the same immobilized composite enzyme membrane and as in Example 1, 0.2mM sodium azide and 1mM
A 50mM potassium phosphate buffer containing EDTA was subjected to exactly the same system as in Example 1. The relative activities of CN, CI, and SO in the immobilized composite enzyme membrane after 1 day were 2.9%, 4.5%, and 62.0% of the initial activity, respectively;
It was not possible to measure creatinine and creatine stably over a long period of time.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は本発明の固定化複合酵素を用いて酵素
比色法によつて、クレアチニン、クレアチンを測
定するフローダイヤグラムの一例である。図中１
は本発明の緩衝液２は試料、３は呈色試薬、４
は呈色試薬、５は四方バルブ、６は固定化複合
酵素、７は固定化複合酵素、８はミキシング
コイルである。第２図は同じく酵素電極法による
場合のフローダイヤグラムの一例である。１は本
発明の緩衝液、２は試料、３は三方バルブ、４お
よび５は過酸化水素電極、６は固定化複合酵素膜
、７は固定化複合酵素膜、８はアンプ、９は
演算システムである。第３図は本発明の固定化複
合酵素組成物の測定安定性を示した図である。
FIG. 1 is an example of a flow diagram for measuring creatinine and creatine by an enzyme colorimetric method using the immobilized complex enzyme of the present invention. 1 in the diagram
Buffer 2 of the present invention is a sample, 3 is a coloring reagent, and 4 is a buffer solution of the present invention.
5 is a coloring reagent, 5 is a four-way valve, 6 is an immobilized complex enzyme, 7 is an immobilized complex enzyme, and 8 is a mixing coil. FIG. 2 is an example of a flow diagram when the enzyme electrode method is also used. 1 is a buffer solution of the present invention, 2 is a sample, 3 is a three-way valve, 4 and 5 are hydrogen peroxide electrodes, 6 is an immobilized composite enzyme membrane, 7 is an immobilized composite enzyme membrane, 8 is an amplifier, and 9 is a calculation system It is. FIG. 3 is a diagram showing the measurement stability of the immobilized complex enzyme composition of the present invention.