JPH0332357B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化複合酵素組成物に関するもので
あり、さらに詳しくは酵素電極用固定化複合酵素
膜と安定化剤を含む緩衝液に関するものである。 周知の如く、酵素は基質特異性が高く、温和な
反応条件で反応を行なわしめることができるとい
う長所を有する反面、熱や酸化により変性を受け
易い不安定な物質である。そのため、ほとんどの
酵素または酵素を含む試薬はその酵素に適した安
定化剤や活性化剤を用いて安定化されている。例
えばエチレンジアミン四酢酸（以下EDTAと略
す）、牛血清アルブミン、グリシン、メルカプト
エタノール、ジチオスライトール、還元型グルタ
チオン、グリセロール、カテコールアミン、
NADH、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、鉛イ
オン、ノニオン系活性剤等が安定化剤または活性
剤として用いられている。 しかし、異なる酵素特性を有する酵素２種以上
を同時に同じ反応系で用いるとき、これらの酵素
を同時に安定化することは難しい。例えば活性点
に金属を必要とする酵素と金属イオンで阻害を受
ける酵素を同時に安定化することは難しい。また
活性点にスルフヒドリル基を有する酵素を安定化
するためには酵素の酸化による失活を防護する目
的で、メルカプトエタノール、ジチオスライトー
ル、還元型グルタチオン等の酵素と同じスルフヒ
ドリル基を有する化合物が一般によく用いられて
いる。 ところが、これらの安定化剤は化合物そのもの
が不安定で長時間にわたる効果が期待できないば
かりか、過酸化水素を検知物質として利用する酵
素比色法あるいは酵素電極法では、これらの還元
性物質と過酸化水素が反応して測定を妨害したり
電極表面で酸化されて電極を汚染して感度を低下
させるという大きな欠点がある。また固定化技術
によつて酵素を安定化させることができるが、一
層安定に、そして耐久性を付与するために、固定
化酵素に対しても安定化剤や活性化剤を用いるこ
とが要求されている。 本発明者等は異なる酵素特性を有する酵素２種
以上を固定化してなる固定化複合酵素を長期間安
定に保持する目的で種々鋭意検討したところ、安
定化剤として金属キレート剤および還元剤を含む
緩衝液を使用することを見出し、本発明に到達し
た。 すなわち本発明は金属キレート剤および還元剤
を含む緩衝液と固定化複合酵素からなる固定化複
合酵素組成物である。 本発明では金属キレート剤および還元剤を含む
緩衝液を使用することにより、２種以上の酵素を
固定化してなる固定化複合酵素、特に酵素電極用
固定化複合酵素膜を安定に長期間保持できる。ま
た、複合酵素としてクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザ
ルコシンオキシターゼの３種の酵素を使用する
例、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザル
コシンオキシターゼの２種類の酵素を使用す例に
おいて、その効果は大きく、クレアチニンおよび
クレアチンを精度よく、簡便に、しかも長期間安
定に測定を行なうことができる。 本発明の安定化剤は電極反応を妨害したり、電
極を汚染しない特徴を有する。 本発明に用いる金属キレート剤としては、例え
ばマンガン、コバルト、マグネシウム、亜鉛、ニ
ツケル、カルシウム、鉄、バリウム、鉛、カドミ
ウム等のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の
部分塩などがある。 本発明に用いる還元剤としては、例えば亜リン
酸、次亜リン酸あるいはこれらの塩やエステルが
挙げられる。具体的には亜リン酸、亜リン酸ナト
リウム、亜リン酸モノエチルエステル、亜リン酸
ジエチルエステル、次亜リン酸、次亜リン酸ナト
リウム等が挙げられる。 金属キレート剤あるいは還元剤は２種以上併用
してもよい。 本発明に用いる緩衝液は、用いる酵素により、
種々異なるものであるが、例えばリン酸バツフア
ー、アセテートバツフアー、ホウ酸バツフアー、
トリスバツフアー等が使用できる。 上記金属キレート剤および還元剤は本発明の固
定化複合酵素と混合してから、緩衝液と混合して
もよい。また固定化複合酵素を有する系に、上記
金属キレート剤および還元剤を含む緩衝液が存在
すれば、該系は本発明の固定化複合酵素組成物に
包合される。 金属キレート剤の含有量は緩衝液に対して0.1
ｍＭ以上が適当である。好ましくは１〜10ｍＭで
ある。0.1ｍＭより少ないと、酵素の活性化に必
要な金属濃度が不足したり、水銀、銀、銅等の活
性を阻害する金属を不活化させるだけのキレート
能力が不足する。また10ｍＭ以上では、すでに十
分量である。 還元剤の含有量は緩衝液に対して0.1〜20ｍＭ
（最終濃度）が適当である。好ましくは0.5〜５ｍ
Ｍである。0.1ｍＭより少ないと、酸化による固
定化複合酵素の失活を防止するだけの還元力が不
足する。また20ｍＭを越えると、電極反応を妨害
して測定感度を低下させる場合がある。 本発明の固定化複合酵素とは、担体に固定化し
てなる２種以上の酵素を意味する。 担体としては例えば、セルロースアセテート、
ポリスチレン、コラーゲン、キトサン、ポリアク
リルアミド、多孔性ガラスビーズなどがある。 その形状としては粉末、溶液、ビーズ、繊維、
チユーブ、中空糸、膜あるいは加工成形品などが
ある。 酵素としては例えばクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよび
ザルコシンオキシダーゼからなる３酵素系、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオ
キシダーゼからなる２酵素系、コレステロールエ
ステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼか
らなる２酵素系、α−グルコシダーゼおよびグル
コースオキシダーゼからなる２酵素系、アセチル
コエンザイムＡシンセターゼおよびアセチルコエ
ンザイムＡオキシダーゼからなる２酵素系、グリ
セロキナーゼおよびグリセロ−３−リン酸オキシ
ダーゼからなる２酵素系などがある。 担体に２種以上の酵素を固定化させる方法は特
に制限されるものではなく、例えばグルタルアル
デヒド等の２官能性試薬による架橋法、ゼラチン
やキトサン等を用いる包括法あるいはアミノ基や
アルデヒド基を有する担体への共有結合法等があ
る。 本発明の固定化複合酵素組成物は安定剤として
金属キレート剤および還元剤を使用することによ
り、２種以上の酵素を固定化してなる固定化複合
酵素の酵素活性を大幅に失することなく、長期間
安定に保持することが可能である。本発明の固定
化複合酵素組成物を使用して、体液中の種々の成
分、クレアチニン、クレアチン、コレステロー
ル、マルトース、α−アミラーゼ、不飽和脂肪
酸、中性脂肪等を正確に精度よく、長期間にわた
つて測定することができる。 次に複合酵素としてクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼ（以下CNと略記する）、クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ（以下CIと略記する）および
ザルコシンオキシダーゼ（以下SOと略記する）
あるいはCIおよびSOを用いて、クレアチニンあ
るいはクレアチンを測定する場合について詳述す
る。 CN、CIおよびSOの各酵素は下記反応を触媒す
る。 クレアチニン＋H₂OCN クレアチン クレアチン＋H₂OCI ―――→ ザルコシン＋尿素 ザルコシン＋O₂＋H₂O₂CO ―――→ H₂O₂ ＋グリシン＋ホルムアルデヒド CN、CIおよびSOの三酵素を固定化してなる系
では過酸化水素を検知物質として比色法あるいは
電極法によつて測定し、試料中のクレアチニンと
クレアチンの総量を測定できる。 CIおよびSOの二酵素を固定化してなる系では、
過酸化水素を検知物質として比色法あるいは電極
法によつて測定し、試料中のクレアチン量を測定
できる。 クレアチニンの量はCN、CIおよびSO系にて測
定したクレアチニンとクレアチンの総量から、
CIおよびSO系にて測定したクレアチンの量を差
し引くことにより求める。 上記酵素を担体固定化した固定化複合酵素の具
体的形状は例えば粉末状、溶液状、ビーズ状、セ
ンイ状、チユーブ状、中空糸状、膜状もしくはこ
れらを加工成形した成形品等がある。比色法では
ビーズ状固定化複合酵素をカラムに充填したもの
あるいはチユーブ状固定化複合酵素を使用するこ
とが好都合であり、酵素電極法ではこの他に、膜
状固定化複合酵素を電極と一体化して用いること
が好都合である。 測定システムの一例を図面でもつて示す。 第１図は固定化複合酵素を用いた酵素比色法に
よるクレアチニン、クレアチン測定のフローダイ
ヤグラムである。図中、１は安定剤を含む緩衝
液、２は試料、３は呈色試薬、４は呈色試薬
、５は四方バルグ、６は固定化複合酵素、７
は固定化複合酵素、８はミキシングコイルを示
す。 第２図は酵素電極法のフローダイヤグラムであ
る。図中、１は安定剤を含む緩衝液、２は試料、
３は三方バルグ、４，５は過酸化水素電極、６は
固定化複合酵素、７は固定化複合酵素、８は
アンプ、９は演算システムを示す。 第１図および第２図において、固定化複合酵素
の系ではクレアチニンとクレアチンの総量を、
そして固定化複合酵素の系ではクレアチンの量
を吸光度または電流値として連続的に検知し、演
算により試料中のクレアチニン値とクレアチン値
とを同時に測定することができる。 測定システムはフローシステムに限定されるも
のではなく、特に全血サンプルを用いる時はセミ
フローシステム、デイスクリートシステム、バツ
チシステム等が好都合な場合もある。 本発明の固定化複合酵素組成物を使用する臨床
分析では、少量のサンプルで血液、尿、その他の
体液中に含まれる微量のクレアチニン、クレアチ
ンを同時に短時間で精度よく長期間安定に耐久性
よく、経済的に測定することが可能となつた。次
に実施例によつて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明は、これらによつて何んら限定される
ものではない。 実施例 １ 平均膜厚5.3μｍの非対称構造をもつアセチルセ
ルロース膜の多孔質側を上にして、ガラス板で水
平に保持した。CN（東洋紡績製）1000単位、CI
（東洋紡績製）105単位、SO（盛進製薬製）38単位
および牛血清アルブミン（アーマー ケミカル
製）５mgを50ｍＭリン酸カリウムバツフアー（PH
7.5）150μに溶解した。５分間、氷冷後氷冷し
た４％グルタルアルデヒド水溶液50μを加えて
十分混合した。この酵素溶液をアセチルセルロー
ス膜の多孔質側の15cm²に流延した。４℃で60分
間、ゲル化させた後、1Mグリシンを含む50ｍＭ
リン酸カリウムバツフアーに室温で16時間浸漬し
た。多孔層側に多孔性ポリカーボネート膜をラミ
ネートして４℃で風乾した。CN活性0.60単位／
cm²、CI活性0.09単位／cm²、SO活性0.015単位／cm²
を有する固定化複合酵素膜を得た。全く同様に
して、CI、SOの２種類の酵素を用いて、CI活性
0.12単位／cm²、SO活性0.019単位／cm²を有する固
定化複合酵素膜を得た。 ２種類の固定化複合酵素膜およびを各々ク
ラーク型過酸化水素電極と組合せて酵素電極を構
成した。５ｍＭ EDTA・2Na・Mg、１ｍＭ次
亜リン酸ナトリウム、および0.2ｍＭアジ化ナト
リウムを含む50ｍＭリン酸カリウムバツフアーを
用いて、32℃、PH7.5の条件でデイスクリート方
式により、市販管理血清バリデートおよびバリデ
ートＡ中のクレアチニンおよびクレアチン値の測
定に供した。セル容量は0.5mlそして検体量は25μ
であつた。検体をマイクロシリンジで注入し、
固定化複合酵素の一連の反応でクレアチニンまた
はクレアチンから生成する過酸化水素の酸化電流
を検知して、クレアチニンおよびクレアチン値を
計算して求めた。結果を第１表に示す。同じ測定
系において、固定化複合酵素膜を用いて、繰返
し測定に対する各々の酵素活性の耐久性を調べた
結果を第３図に示す。11日間にわたり500検体の
血清中の総クレアチニン測定後も固定化複合酵素
は安定でCN、CIおよびSOの相対活性は初期活性
の各々83％、91％、105％を保持した。

【表】 比較例 １ 実施例１と同じ固定化複合酵素膜およびを
用いて、0.2ｍＭアジ化ナトリウムと１ｍＭ
EDTAを含む50ｍＭリン酸カリウムバツフアを
実施例１と全く同じシステムに供した。１日後の
固定化複合酵素膜のCN、CIおよびSOの相対活性
は初期活性の各々、2.9％、4.5％、62.0％であり、
長期間にわたり安定にクレアチニン、クレアチン
を測定することは出来なかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の固定化複合酵素を用いて酵素
比色法によつて、クレアチニン、クレアチンを測
定するフローダイヤグラムの一例である。図中１
は本発明の緩衝液２は試料、３は呈色試薬、４
は呈色試薬、５は四方バルブ、６は固定化複合
酵素、７は固定化複合酵素、８はミキシング
コイルである。第２図は同じく酵素電極法による
場合のフローダイヤグラムの一例である。１は本
発明の緩衝液、２は試料、３は三方バルブ、４お
よび５は過酸化水素電極、６は固定化複合酵素膜
、７は固定化複合酵素膜、８はアンプ、９は
演算システムである。第３図は本発明の固定化複
合酵素組成物の測定安定性を示した図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 金属キレート剤および還元剤を含む緩衝液と
   固定化複合酵素からなる固定化複合酵素組成物。