JPH0335782A - Ｔ１１仲介ｔ細胞活性化を阻害する可溶性ｔ１１タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒ１−Ｔｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメイン
の部分に相当する可溶性ペプチドに関する。 前記ペプチドはＴｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害できる。 Ｔリンパ球は、本来、ヒツジ赤血球（Ｓ　ＲＢ　Ｃ）と
自発的な凝集体を形成する能力によって同定された［プ
レイ７（Ｂｒａｉｎ）ら（１９７０）クリニカル・アン
ド・イクスペリメンタル・イムノロジー（ＣＩｉｎ、Ｅ
ｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）６　：　６８１−６８８　；
コンブス（Ｃｏｍｍｂｓ）ら（１９７０）インターナシ
ョナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・ア
ゲライド・イムノロジー（Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅ
ｒｇｙＡｐｐ　１．Ｉｍｍｕｎｏ　＋、）３９　：　６
５８−６６３；レイ（Ｌａｙ）ら（１９７１）ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２３０＝５３１−５３
３１゜この細胞−細胞の相互作用を仲介する分子は、５
０ｋＤａのＴリンパ球（Ｔ細胞）特異的Ｔｌ１（ＣＤ２
）表面糖タンパク質

【ノ）ワード（）（ａｗａｒｄ）ら
（１９８１）ジャーナル・オプ・イムノロジー（Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、）上６：２−１１７−２１２２：カマウ
ン（Ｋａｍｏｕｎ）ら（１９８１）ジャーナル・オブ・
イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１２７：９８７
−９９１：バービ（Ｖｅｒｂｉ）ら（１９８２）ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）±２：８１−８６：バーナード（
Ｂｅｒ、ｎａｒｄ）（１９８２）ジャーナル・オブ・イ
クスベリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、
）１５５　：　ｌ　３１７−１３３３；メウエル（Ｍｅ
ｕｅｒ）ら（１９８４）細胞（Ｃｅ　ｌ　１）３６　：
　８９７−９０６］およびリンパ球機能関連抗原（ＬＦ
Ａ−３）と呼ばれる、広く分布する膜タンパク質【ゲス
チン（Ｄｕｓｔｉｎ）ら（１９８７）ジャーナル・オプ
・イクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ。 Ｍｅｄ、）ｌ　６５　：　６７７−６９２１であり、そ
の構造的相同体（ＴＩＩＴＳ）は５ＲＢＣ上で高いレベ
ルで発現される【フニグ（Ｍｕ　ｎ　ｉ　ｇ）−ら（１
９８６）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１６：１６１５−
１６２１１゜Ｔｌｌの付着の機能は、生理学的Ｔ細胞の
応答の間起こる必要な細胞−細胞相互作用を促進する。 Ｔ細胞の付着（すなわち、ＣＤ２−ＬＦＡ−３の相互作
用）を妨げることによって、抗Ｔ　ｌ　ｌ　Ｉと呼ばれ
る、Ｔｌｌ上のエピトープに対して向けられたモノクロ
ーナル抗体【メウエル（Ｍｅｕｅｒ）ら（１９８４）細
胞（Ｃｅ　ｌ　＋）３６　：　８９７−９０６１　は、
Ｔリンパ球−５ＢＲＣロゼツトの形成を阻害し、Ｔリン
パ球の活性化を妨害し、そして胸腺細胞−チミンの上皮
の相互作用を崩壊する〔シャク（Ｓｈａｗ）らネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）（０：／トン）３２３　：　２６２
−２５４　；ボルガー（Ｖｏｌｌｇｅｔ）らジャーナル
・オプ・イムノロジー（Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏ　１．）１３８　：　３５８−３６３］。 対照的に、抗Ｔｌｌ！およびＴｌ１ｓと呼ぶ、２つの他
の抗Ｔｌｌ抗体は、Ｔｌｌ仲介付着を妨害しないが、協
力して、抗原独立的Ｔリンパ球活性化に導く　［メウエ
ル（Ｍｅｕｅｒ）ら（１９８４）細胞（Ｃｅ　１１）３
６　：　８９７−９０６］。 ヒトＴｌｌの一次構造は、タンパク質のマイクロシーフ
ェンシング（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）および
ｃＤＮＡのクローニングによって説明された【セイレ（
Ｓａｙｒｅ）ら（１９８７）プロシーデインゲス・オブ
・ナシ冒ナル・アカデミ−・オプ・サイ乎ンシズ（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ。 １、Ａｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８４：２９４１−２
９４５；セラエル（Ｓｅｗｓ　Ｉ　Ｉ）ら（１９８６）
プロシーデインゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・
オプ・サイエンシズ（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ　。 Ｎａｔｏｌ、Ａｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８３：８７
１８−８７２２　；シード（Ｓｅｅｄ）ら（１９８７）
プロシーデインゲス・オブーナシ冒ナル・アカデミ−・
オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｏｌ、Ａｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８４：３３
６５−３３６９１　、ｃＤＮＡ配列によって推定された
タンパク質は、次の３つのセグメントから構成されてい
る：（ｉ）細胞外セグメント、これは分子の半分より多
くを説明し、モしてＴ４、Ｔ細胞表面糖タンパク質を包
含する免疫グロブリ超遺伝子の膜に対して制限された相
同性を有するのみである［セイレ（Ｓａｙｒｅ）ら（１
９８７）プロシーデインゲス・オブ・ナシ覆ナル◆アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　
ｏ　１゜Ａｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８４：２９４１
−２９４５；セラエル（Ｓｅｗｅ　１１）ら（１９８６
）プロシーデインゲス・オブ◆ナショナル・アカデミ−
・オプ・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａｔｏｌ、Ａ　
ｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８３：８７１８−８７２２
：シード（Ｓ　ｅ　ｅ　ｄ）ら（１９８７）プロシーデ
インゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイ
エンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｏｌ、　Ａ　ｃ　ａ　
。 ５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８４：３３６５−３３６９］　　
；（ｉｉ）単一の特徴的な疎水性トランスメンブレン（
ｔ　ｒａｎｓｍａｍｂｒａｎａ）セグメント：および（
ｉｉｉ）プロリンおよび塩基性アミノ酸残基に富んだ１
１７アミノ細胞質ドメイン。さらに、Ｔｌｌのネズミお
よびラット同等体をエンコ−ドする（ｅｎｃｏｄ　ｊｎ
ｇ）ｃＤＮＡは、クローニングされ、そして〉５０％ア
ミノ酸配列配同一性を示すことが配列決定された［フラ
イトン（Ｃ１ａｙｔｏｎ）ら（１９８７）ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、）上ヱ：１３６７−１３７０；セウエ
ル（Ｓｗｅ　１１）ら（１９８７）ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ。 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１７：１０１５−１０２０；ウ
ィリアムス（Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍｓ）ら（１９８７）
ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（
Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）１６５　：　３６８−３８０　
：フライトン（Ｃ１ａｙｔｏｎ）ら（１９８８）ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１
４０：３６１７　３６２１］。 本発明は、ヒトＴｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメインの
部分に相当する可溶性ペプチドに関する。 前記ペプチドは、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化１１−ｍ
ｅｄｉｔａｔｅｄ　　Ｔ−ｃｅｌｌ　　ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ）を阻害できる。本発明の可溶性ペプチドは、ヒ
トＴｉｔの細胞外ドメインのアミノ末端アミノ酸配列に
相当する。とくに、可溶性ペプチドは、Ｔｌｌｌｌ仲介
脳細胞活性化害できるヒトＴｌｌの細胞外ドメインのア
ミノ末端部分またはその断片に相当する、約１００アミ
ノ酸残基からなる。本発明の可溶性ペプチドは、酵素の
断片化、ペプチド合皮、または組み換えＤＮＡ技術によ
ってつくることができる。それらは、抗原の活性化に依
存するＴ細胞の機能を遮断するために使用できる。 本発明は、ヒトＴｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメインの
部分に相当し、そしてＴｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害で
きる、アミノ酸配列からなる可溶性ペプチドに関する。 本発明のペプチドは、水性媒質中に可溶性である。 １つの実施態様において、可溶性のヒ１−Ｔｌｌペプチ
ドはヒトＴｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメインの断片で
ある。この断片は、Ｔ１１仲介Ｔ細胞活性化を阻害でき
るＴｌｌ細胞外ドメインの任意の部分であることができ
る。好ましい実施態様において、可溶性ペプチドはヒト
Ｔｌｌの細胞外ドメインのアミノ末端部分に相当し、そ
して長さが約１００アミノ酸である。好ましくは、ペプ
チドは次のアミノ酸配列を有する： ＮＨ。 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐｌｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｐ２１　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　
Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　［１ｅ３１
　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａ、５ｐ４１　Ｌｙｓ　Ｌｙ
ｓ　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ
　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ５１　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ
　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ
　　Ｔｈｒ　　丁ｙｒ６１　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　
Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｂｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ｌ
１ｅ７］　　Ｌｙｓ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　
　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　
　ｌ１ｅ８１　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ口ｅ　
Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ９１　Ｌｙｓ
　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　
Ｐｈａ　Ａｓｐ　ＬａｕＯＯＨ この長さが約１００アミノ酸残基の可溶性ペプチドは、
ＴＩｌ＋ｊｔよびＴ　ｌ　ｌ　ｘのエピトープをエンコ
ードするＴｌｌの細胞外ドメインの部分、ならびに機能
的ＬＦＡ−３結合性ドメインからなる。 Ｔ　ｌ　１　ｌおよびＴ　ｌ　ｌ　２のエピトープは可
溶性ペプチド上に局在化している。Ｔ１１１およびＴｌ
ｌ□エピトープは、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害する
ために必要である抗原決定基である。 上のアミノ酸配列は、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害で
きるＴｌｌの天然に産出する細胞外ドメインの部分に相
当する。本発明に含まれるアミノ酸配列は、Ｔｌｌｌｌ
仲介脳細胞活性化害できるタンパク質をエンコードする
類似または相同配列を包含する。さらに、ペプチドの構
造は、配列中の１または２以上の酸残基の欠失、付加、
逆位、挿入または置換によって修飾して、Ｔｌｌｌｌ仲
介脳細胞活性化害するペプチドを生皮することができる
。ペプチドの性質、すなわち、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活
性化害するペプチドの能力、を低下させないで、上のア
ミノ酸配列のすべてのこのような修飾は、本発明に包含
される。天然に起こるアレルの変更および修飾は、変更
がＴｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害するペプチドの能力を
実質的に減少しない限り、本発明の範囲内に包含される
。 本発明は、また、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害できる
ヒトＴｌｌの細胞外ドメインの部分に相当する可溶性ヒ
トＴｌｌペプチドをエンコードするＤＮＡ配列、とくに
上に示した１００アミノ酸配列またはその実質的な解胱
同等体に関する。ＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの欠失、
挿入または置換によって修飾して、約１００アミノ酸残
基の上のペプチドと実質的に同じ性質を示す。ＤＮＡ配
列のすべてのこのような修飾は、ＤＮＡ配列がＴ１１仲
介Ｔ細胞活佳化を阻害できる可溶性ペプチドをエンコー
ドするかぎり、本発明の範囲内に入る。本発明のＤＮＡ
配列は、化学的に、あるいは組み換えＤＮＡ技術によっ
て合皮することができる。 本発明は、さらに、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害でき
るヒトＴｌｌの細胞外ドメインの部分に相当する可溶性
ヒトＴｌｌペプチドをエンコードするＤＮＡ配列からな
る発現ベクターに関する。 好ましくは、発現ベクターは、細胞外Ｔｌｌドメインの
アミノ末端部分に相当する約１００アミノ酸残基のペプ
チドをエンコードするＤＮＡ配列からなる。ペプチドの
性質を本質的に低下させないで、アミノ酸残基が欠失、
挿入または置換されている、ペプチドの修飾は、本発明
に包含される。 本発明は、さらに、上の発現ベクターで形質転換された
細胞に関する。 本発明の可溶性ペプチドは、ヒトＴｌｌ糖タンパク質ま
たはその部分のトリプシンの断片化により、ペプチドの
合皮または組み換えＤＮＡ技術によりつくることができ
る。好ましくは、可溶性Ｔ１１ペプチドは、Ｔｌｌｌｌ
仲介脳細胞活性化害できるペプチド配列をエンコードす
るＤＮＡ　（例えば、Ｔｌｌの細胞外ドメインの所望の
アミノ末端部分を表わすＴｌｌのＤＮＡ）を、発現ベク
ター中に挿入することによって生成されるであろう。 次いで、形質転換された細胞は、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞
活性化害できる細胞外ドメインの部分に相当する可溶性
ヒトＴｌｌペプチドを発現する。本発明の可溶性ペプチ
ドを合皮するための遺伝子工学の技術に加えて、可溶性
ペプチドは化学的タンパク質合戒の手順によって直接合
成できる。例えば、約１００アミノ酸配列または修飾さ
れたその同等体は、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ）の固相手順によって合皮できる。 本発明は、さらに、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞活性化害でき
るヒトＴｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメインの部分に相
当するアミノ酸配列からなる可溶性ペプチドを、患者に
投与する工程からなる、Ｔ１１仲介Ｔ細胞活性化を阻害
する方法に関する。 好ましくは、可溶性ペプチドは、Ｔｌｌｌｌ仲介脳細胞
活性化害できるヒトＴｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメイ
ンアミノ末端部分またはその断片に相当する約１００ア
ミノ酸残基の配列からなる。 この方法の１つの実施態様において、可溶性ペプチドは
静脈内に投与できる。 本発明の可溶性Ｔｌｌペプチドは、一般に、表面構造の
相同の組（ｓｅｔ）を発現するヒトリンパ球およびヒト
赤血球に結合するであろう。可溶性ペプチドは、また、
ヒトリンパ球の表面上に天然に存在するＴｌｌと競合す
ることができ、こうしてリンパ球の、その標的細胞（リ
ンパ球が細胞溶解性細胞であるとき）と接触する能力、
あるいはリンパ球の増殖に必要な細胞対細胞の接触を許
すＴｌｌ結合構造体を有するマクロファージと接触する
能力を妨害する。リンパ球の増殖または細胞毒性のエフ
ェクターの機能を阻害する能力について可溶性ペプチド
を試験するために、可溶性ペプチドをミトゲンによる刺
激の前にリンパ球と接触させ、増殖の程度を、標準の技
術の使用して、測定し、そして結果を可溶性ペプチドを
使用しない対照と比較する。 本発明の可溶性ペプチドは、Ｔ１１表面糖タンパク質が
多くのヒトＴ細胞の悪性疾患、例えば、Ｔ細胞白血病お
よびリンパ腫の表面において発現される、種々の診断的
および治療的用途において使用できる。さらに、自己免
疫病、例えば、慢性関節リウマチおよびシステミック・
ルプス・エルトマトシス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　　Ｌｕｐ
ｕｓＥｒｔｈｏｍａｔｏｓｉｓ）（ＳＬＥ）は、血液お
よびリンパ中の多数のＴｌｌ支持Ｔ細胞の存在によって
特徴づけられる。これらの病気の状態における急速な細
胞のターンオーバー（ｔｕｒｎ。 ｖｅｒ）は、Ｔｌ１分子を血液の流れの中に脱落させる
ことがある。 本発明のＴｌｌ可溶性ペプチドは、慣用技術に従い、免
疫原として使用して、ポリクローナルまたはモノクロー
ナルの抗Ｔｌｌ抗体を生皮することができる。これらの
抗体は、任意の慣用の標識、例えば、放射性同位元素で
標識し、慣用のイムノアッセイ法において使用して血清
Ｔｌｌレベルを測定し、こうしてＴ細胞に関連する病気
を有する患者を監視することができる。とくに感受性の
ＥＬＩＳＡ型アッセイは、サンドイッチのフォーマット
において、各々がＴｌｌの表面上の異なる抗原決定基に
対する、２つの抗Ｔｌｌ抗体を使用するであろう。 本発明の可溶性ペプチドを使用できる病気の状態は、免
疫の応答の増幅において重要な役割を演する、過剰のＴ
細胞の活性化を生ずる免疫系の望ましくない活性によっ
て特徴づけられる医学的状態を包含する。これらの状態
は、次のものを包含する：　ＳＬＥ　、若手型糖尿病；
多発性硬化症；アレルギー状態：炎症状態、例えば、浮
腫、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸病、およびコーン病；お
よび同種移植拒絶（例えば、移植された心臓または腎臓
の拒絶）。可溶性Ｔｌｌペプチドは、表面に拘束された
Ｔｌｌと、標的細胞上のその配位子と競くく 争し、こうして免疫の応答の増幅を減少させる。 製薬学的に許容されうる担体、例えば、生理的塩類溶液
と混合した可溶性Ｔｌｌペプチドは、ヒト患者に、有効
量、例えば、２０μｇ〜５００μｇ／　ｋ　ｇ体重で静
脈内投与される。好ましくは、製薬学的に許容されうる
担体と混合した可溶性ペプチドは、Ｔｌｌの細胞外ドメ
インのアミノ末端部分に相当する約１００アミノ酸残基
からなる。ある状態について、可溶性Ｔｌｌペプチドは
、最も必要な部位に直接投与することができる；例えば
、可溶性Ｔｌｌペプチドは、慢性関節リウマチに悩むヒ
ト患者の炎症の関節に直接注射することができる。 本発明を、さらに、次の実施例によって説明する。 実施例 実施例において使用する、用語Ｔ１１．は、ここにおい
て、Ｔｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメイン全体をエンコ
ードするアミノ酸配列を有する可溶性タンパク質である
と定義される。’ｒｔｉｓタンパク質は、また、Ｔｌｌ
タンパク質の可溶化を妨害しないトランスメンブレン（
ｔｙａｎｓｕｍａｍｂｒａｎｅ）の部分を含有すること
がある。 参照、レインヘルツ（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ）による、米国
特許出願第９３２．８７１号、１９８６年１１月１８日
提出、その教示をここに引用によって加える。 Ｔｌｌ　　ｃＤＮＡ　　ＰＨ１［これはこのＤＮＡの起
源であった］をＰｓｔＩおよびＰｖｕ　Ｉ　Ｉで消化し
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いでシチ
ジンを含有するオリゴヌクレオチド、ＣＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＴＡＧｌに結合して、位置１７８においてセリン
のための最後のヌクレオチド、およびＧＧＡＴＣＣ（Ｂ
ａｍＨＩ認識配列）を再構成した。次いで、プラスミド
の調製物をＢａｍＨＩで消化し、そして切頭Ｔｌｌ　　
ｃＤＮＡ断片をゲル精製によって分離した。次いで、ｃ
ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ消化したｐＡｃ　３７３ベクタ
ーとＢａｍＨＩＬ、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｔａ　　
ｃｏｌｉ　　ＤＨ５細胞を形質転換するために使用した
。組み換えクローンを分離し、モして構成を制限エンド
ヌクレアーゼのマツピングおよびＭ１３配列決定によっ
て確証した。オリゴヌクレオチドの合皮は、標準のシア
ノエチルホスホルアミダイト化学を用いた。Ｔ１１．配
列のオウトグラファ督カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核のポリへドロシス（
ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｏｓｉｓ）ウィルス（ＡｃＮＰＶ）
中の転移は、記載されているようなものであった［スミ
ス（Ｓ専１ｔｈ）ら（１９８５）プロシーデインゲス・
オプ・ナシ−ナル・アカデミ−・オプ◆サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｏｌ。 Ａｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８２：８４０４−８４０
８：ハッセイ（Ｈｕｓｅｙ）らネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（ロンドン）３３１：７８−８１】。Ｔｌ　１．の

【３・Ｓ】メチオニン標識つけおよび大規模の精製は、
記載されているようなものであった〔ハッセイ（Ｈｕｓ
ｅｙ）らネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３３
１：７８−８１］が、アンイーゲル（Ａｆ　ｆ　ｉ　−
Ｇｅ　１１）に結合した抗Ｔ１１．（３Ｔ４−８８５）
を使用した。 トリプシンの発酵 ７０ミリモルのグリシン／２４０ミリモルのトリス−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ８，０）中の精製したＴ１１、（２００μｇ
／ｍｌ）を、栓をした管内のジチオスレイトールを６ミ
リモルの最終濃度に室温において３０分間添加し、次い
で暗所において２１ミリモルのヨウドアセトアミドで３
０分間アミドメチル化した。次いで、氷上において、試
料をＣａｃｌ、中で４ミリモルにし、モしてＬ−１−ト
シルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン処
理したトリプシンを添加してタンパク質／酵素比を５０
０　：　１　（ｗｔ／ｗｔ）とした。０分の試料を取り
出し、Ｎ’ａＤｏｄＳＯ，試料緩衝液と混合し、そして
残りの消化混合物を１０分および３５分に取り出し、そ
してＮａＤｏｄＳＯ，試料緩衝液とＮａＤｏｄＳＯａ／
ＰＡＧＥのために混合した。 調製用高性能液体クロマトグラフ４−（ＨＰＬＣ）ＨＰ
ＬＣ分析のため、精製した’ｒｌ　ｌ５（１１０μｇ）
をおだやかな還元およびアミドメチル化に付し、次いで
１０分間マイクロ遠心した。試料（３００／Ｊ（１）を
ＴＳＫ　　Ｇ３０００　　ＳＷカラム（７，５Ｘ６００
ｍｍ）に適用した。材料を０゜２モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，５）中で０．５ｍｌ／分で、ダイオ
ード列の検出モニターを装備したヘラレット−パラカー
ド（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ）１０９０液体ク
ロマトグラフィーを使用して溶離した。分１１（０，５
ｍ１）を集め、引き続いて非還元性ＮａＤｏｄＳＯ，／
ＰＡＧＥによって分析した。 還元およびアルキル化したＴ　ｌ　ｌ　ｓを等張リン酸
塩緩衝化生理的塩類溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に透析した。 次いで、この材料（５００μｇｓ２．１４Ｉ１ｇ／　ｍ
　Ｉ　）を、３７つにおいて、Ｌ−１−）シルアミド−
２−フェニルエチルクロロメチルケトン処理したトリプ
シン（ｌｐｇ）で６０分間消化した。 消化をダイズトリプシン阻害剤（ｌｐｇ）の添加により
停止し、そしてマイクロ遠心した試料を前述のようにＨ
ＰＬＣにかけた。分子量のマーカーを同一条件下にシリ
カゲルのクロマトグラフィーにかけた【モノクローナル
マウスＩｇＧ（１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（
６９ｋ　Ｄ　ａ　）、オバルブミン（４６ｋＤａ）、炭
酸アンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、およびサイトクロー
ムＣ（１２，４ｋＤａ）］。 ０．２モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６゜５）中
のトリプシン消化Ｔ　ｌ　１　ｓから誘導したピークＩ
Ｉ（参照、第３Ｃ図）から精製した材料（３０μｇ）を
、前もって決定した量の１モルの添加によってｐＨ８，
２に調節した。次いで、試料（４４０μａ）を、１ｍＣ
１の新しく乾燥した１！Ｊ標識ポルトン−ハンター（Ｂ
ｏｌｔｏｎ−Ｈｕ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒ）試薬［ニュー・イ
ングランド・二ニークリアー（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ）、４４００Ｃｉ／ミリモル；　
ｌ　ｃ　Ｉ”　３７ＧＢｑ）を含有するバイアル中に４
℃において１５分間入れた。１モルのトリス−ＭＣＩ（
１）Ｈ７，６）のアリコート（１５μ１１）を混合物に
添加し、次いでこの混合物を４℃において２ｋＤａのカ
ットオフの透析管中で透析し、そしてさらにゼラチン（
１ｍｇ／ｍｌ）および０．０５％１７）７ジ化ナトリウ
ムを含有するＰＢＳと平衡化した５ｍｌのバイオ−ゲル
Ｐ−２（２００−４００メツシユ）で脱塩した。放射線
標識つけした断片を、プロティンＡ−セファローズ（Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合したモノクローナル抗体（３
Ｔ４８Ｂ５および１ｏｌｄ２４ｃ１）の混合物で４℃に
おいて１６時間免疫沈澱させた。ビーズを４回ｌＯミリ
モルのトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ６，８）洗浄し、放射
線標識断片をＯ３１モルのグリシン塩酸塩（ｐＨ２，０
）で溶離し、直ちに０．２体積の１モルのトリス−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ７，６）で中和し、次いで無関係の担体ペプ
チド（ｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）と混合した。日常的
には合計の放射線標識断片の２０−２５％を免疫沈澱し
た。精製した放射線標識断片を免疫沈澱した。精製した
放射線標識断片をエンドグリコシダーゼＦ［ニュー・イ
ングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ）］で、ルエシ＋−（Ｌｕｅｓｈ
ｅｒ）およびブロン（Ｂ　ｒ　ｏ　ｎ　）　％ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１
３４：１０８５−１０８９　（１９８５）に記載される
ようにして、脱グリコジルし、モして１５％のポリアク
リルアミドゲルのＮａＤｏｄＳＯａ／ＰＡＧＥにかけた
。 ロゼツト−阻害アッセイ ジャー力）（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、懸濁培養のための
最小必須培地および２％（ｖｏｌ／ｖ。 ｌ）の胎児仔つシ血清史洗浄媒質）中で洗浄し、モして
１０’／ｍ＋で再懸濁させた。５ＲＢＣをバンク（ｈ　
ａ　ｎ　ｋ）の釣り合わせｔ；生理的塩類溶液で２回洗
浄し、そして洗浄媒質中に５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に再
毛懸濁させた。１０μａの５ＲＢＣを１２かける７５ｍ
ｍのプラスチック管中に入れ、５０μａの洗浄媒質、オ
バルプミン（７２−３１２℃ｇ／ｍｌ）、またはｌ　５
ｋＤａのためＴｌｌ５断片（７２−３１２℃ｇ／ｍｌ）
を添加し、そして４℃において３０分間インキュベーシ
ョンした。引き続いて、２０μＱのジャーカド細胞を添
加し、５分間インキュベーションし、８００ｒｐｍでソ
ルバル（Ｓｏｒｖａ　Ｉ　Ｉ）ＲＴ６０００中で遠心し
、そして４℃において１時間インキュベージａンした。 細胞混合物を穏やかに再懸濁し、カバースリップをもつ
ガラススライド上に取り付け、そしてロゼツトの形成を
ツアイス（ＺｅｉｓＳ）の光学顕微鏡でアッセイした。 ５ＲＢＣは３−５μｍの直径であった。 可溶性組み換えＴｌ１分子の生成および特徴づけ分泌さ
れた形態のＴｌ１分子を生成するため、ＰＢ２　　ｃＤ
ＮＡ　［セイレ（Ｓｅｉｒｅ）ら（１９８７）プロシー
デインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｏｌ、Ａｃａ、５ｃｌ）、ＵＳＡ　　８４：２９
４１−２９４５］を第２図に記載するように切頭し、そ
して成熟細胞外セグメントの予測した１８５アミノ酸が
保存されるように、合皮リンカーに結合した（第１Ａ図
および第２Ａ図）。ｐＡｃ３７３転移ベクター中にクロ
ーニングした後、切頭Ｔｌｌ　　ｃＤＮＡ構戊体構成相
同組み換えによってＡｃＮＰＶゲノム中に組み込んだ［
スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９８５）プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｏｌ＋Ａｃａ、５ｃｉ）＋ＵＳＡ
　　８２：８４０４−８４０８；７ツセイ（Ｈｕｓｓｅ
ｙ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３３
１　：　７８−８１１゜純粋な組み換え体バクロウィル
ス、ＴＩ　Ｉｓ　　ＡｃＮＰＶと呼ぶ、を使用して、ス
ボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　　
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ＳＦ９）細胞を感染させた。 ＳＦ９細胞を、Ｔｌ　ｉｓ　　ＡｃＮＰＶまタハ野生型
ＡｃＮＰＶで感染させ、次いでアッセイ（Ｈｕｓｓｅｙ
）ら、ネイチャー（Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ）３３１　：
　７８−８１　（１９８８）の方法を使用してｓＩＳメ
チオニン中で培養した。抗Ｔｌｌ、（３７４８Ｂ５）免
疫沈澱の生成物を、ＮａＤｏｄ−ＳＯａ／１２．５％の
アクリルアミドのミニ−スラブ　ゲルでオートラジオグ
ラフィーによって検査した。第２Ｂ図において、レーン
ａおよびｂは、それぞれ、ＴＩ　Ｉｓ　　ＡｃＮＰＶ感
染したおよびＡｃＮＰＶ感染したＳＦ９細胞の上澄み液
から、還元性条件下に、免疫沈殿した物質を示す。レー
ンＣおよびｄは、それぞれ、Ｔ　１１　ｓ　　ＡｃＮＰ
Ｖ感染したおよびＡｃＮＰＶ感染したＳＦ９細胞のリゼ
イトから、非還元性条件下に、免疫沈澱した物質を示す
。レーンｅおよびｆは、それぞれ、Ｔｌ１ｓ　　ＡｃＮ
ＰＶ感染したおよびＡｃＮＰＶ感染したＳＦ９細胞の上
澄み液から、非還元性条件下に、免疫沈澱した物質を示
す。 Ｔｌ１ｓ　　ＡｃＮＰＶ感染ＳＦ９細胞の代謝的放射線
標識つけによって生成された物質の分析は、感染後４８
−７２時間における主要な分泌された生成物がＴ　ｌ　
ｌ　ｓであることを示す（データは示されていない）。 還元性Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４／　Ｐ　ＡＧＥに
より見られる主要な−Ｉｓ標識分泌物質は、代謝的放射
線標識つけ実験において見られるように、分書に劣る二
量体および七ノマーとして移動する（＊２Ｂ図、レーン
ｅ）。還元性条件下に、Ｔｉ１ｌは２８ｋｌ）ａの二重
線であり、微量の２５ｋＤａの二重線が伴い、クーマツ
シー（Ｃｏ。 ｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）ブルーの着色によって、追加の
タンパク質の帯は存在しなかった。 還元し精製した２８ｋＤａの二重線（２００ピコモル）
を、ポリビニリデンジフルオライド膜【ミリポア（Ｍｉ
　１１１ｐｏｒｅ）；孔大きさ、０．４５μｍｌ上に、
マツダイラら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、）２６２　：
　ｌ　００３５−１００３８　（１９８７）の方法によ
って電気プロッティングし、そしてクーマツシー（Ｃｏ
　ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉｅ）ブルー着色物質を、オンライ
ンの１２０Ａフ工ニルスロヒダントイン分析器を装備し
たアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　
Ｂｉ。 ｓｙｓｙｔｅｍｓ）４７０Ａ型ペプチド配列決定装置で
、０３ＲＰＴＨプログラムを使用して、アミノ末端の配
列決定にかけてＴ　ｌ　ｌ　ｓのアミノ末端配列を確認
した。最初の９つのサイクルはＬｙｓ−Ｇｌｕ−１１ｅ
−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｅｈｒの
単一の明瞭な配列を生じ、この物質がＴｌｌ遺伝子の生
成物であることを立証し【サイト（Ｓａｙｒｅ）ら（１
９８７）プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。 １、Ａｃａ、５ｃｉ）−ＵＳＡ　　８４：２９４１−２
９４５；セラエル（Ｓｅｗｅ　１１）ら（１９８６）プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｏｌ、Ａｃａ、５
ｃｉ）−ＵＳＡ　　８４：８７１８−８７２２；シード
（Ｓｅｅｄ）ら（１９８７）プ゛ロシーデインゲス・オ
プ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ。 Ｎａｔｏｌ、Ａｃａ、５ｃｉ）、ＵＳＡ　　８４：３３
６５３３６９１そして、さらに、ＮａＤｏｄＳｏ４／Ｐ
ＡＧＥにより２８ｋＤａに見られる二重線の成分の各々
は同一のポリペプチドの主鎖から成り、多分翻訳後の修
飾の結果互いに異なることを立証した。興味あることに
は、２５ｋＤａにおいて移動する物質を、また、アミノ
末端配列決定したとき、それは上と同一のアミノ末端を
示した。こうして、２５ｋＤａの物質はそのＣ０ＯＨ末
端残基のいくつかを失ったＴ　ｌ　ｌ　ｆｉのアミノ末
端断片を表す。さらに、結果が示すように、バクロウィ
ルスの発現系はＴ　ｌ　ｌ　ｍ前駆体からのシグナルペ
プチドの正しく開裂する能力を有する。わに、ＳＦ９細
胞の１ａ（１０”ＪＩ胞）ニラき〉１ｍｇの分泌された
Ｔｌ　１８を７２時間の培養期間にわたって生成する。 第２Ｃ図は、Ｔｌ１ｓの大規模の調製および精製の分析
を示す。精製したＴ　ｌ　１　ｍのアリコートを、非還
元の（レーンａ）、おだやかに還元しそしてアルキル化
した（レーンｂ）、または完全に還元した（レーンＣ）
形態でミニ−スラブ　ゲルにおいて物質をクーマツシー
（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで着色することによって
検査した。 ＢおよびＣにおいて使用した分子量マーカーは、ホスホ
リラーゼｂ　（９７，４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン
（６９ｋＤａ）、オバルブミン（４６ｋＤａ）　、炭酸
アンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、ラクトグロブリンＡ　
Ｃ１８，４ｋＤａ）であった。 第２Ｃ図、レーンｂ１に示すように、おだやかな還元お
よび引き続くアルキル化は二量体のＴＩＩｍを重合する
ために十分であり、ここでこのような魁理は非還元性条
件下に２８ｋＤａのみの物元したおよびアルキル化した
Ｔｌ１ｓを、モノクローナル抗体３ＰＴ２Ｈ９（抗Ｔｉ
１ｌ）、１０Ｉｄ２４Ｃ］　（抗ＴｉｌりまたはＩｍｏ
ｎｏ２Ａ６（抗Ｔｉ１ｌ）とともにインキュベーション
した（データは示されていない）、抗Ｔ１１＋および抗
Ｔ１１．は両者の形態のＴｌ１ｓを免疫沈澱させたが、
抗Ｔｌ１ｓはいずれの形態も免疫沈澱させず、このこと
により示されるように、還元およびアルキル化に無関係
に、Ｔｌ１ｍは追加のＴ１１１エピトープ（３ＰＴ２Ｈ
９）およびＴｌ１ｎエピトープを有するが、Ｔ１１＊エ
ピトープはＴ１１５の還元およびアルキル化の前または
後のいずれにおいても存在しなかった。ＴＩ　Ｉｓのエ
ピトープの不存在は、ヒトタンパク質を生成および処理
する能力をバクロウィルス系がもたない結果でなかった
。なぜなら、ＰＢＩ　　ｃＤＮＡを有するバクロウィル
スによって感染されたＳＦ９細胞における完全な長さの
トランスメンブレンＴｌｌの発現は、Ｔ１１３に対する
抗体と反応するタンパク質を生ずることが示されている
からである。 ［アルカバー（ＡＩｃｏｖｅｒ）ら、ヨーロピアン・ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ。 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、上８　：　３６３−３６７（
１９８８）］。 Ｔ　ｌ　ｌ　ｓの断片化の分析 ７１１３ポリペプチド内の機能的Ｔｌｌエピトープの位
置をより正確に突き止めるために、精製したＴＩ　Ｉｓ
をトリプシンで部分的に消化した。 第３Ａ図は、Ｔｌ１ｓのトリプシン消化を示す。 試料を還元性Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４／　Ｐ　Ａ
　Ｇ　Ｅにより、１５％のアクリルアミドのミニーゲー
スラプ　ゲル中で分析した。レーンａＳ　ｂおよびＣは
、それぞれ、０、ｌＯおよび３５分の消化物である。着
色した帯＞　６０　ｋ　Ｄ　ａは２−メルカプトエタノ
ールから誘導されＩ；非タンパク質人工物である。この
ＴＩ　Ｉｓ調製物は、自然に開裂した断片であり、Ｎａ
ＤｏｄＳＯ，／ポリアクリルアミドゲル上で２５ｋＤａ
において移動する（第３Ａ図、レーンａ）。トリプシン
消化の種々な時間でＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥによて
試料を検査すると、短い消化（５分）後、２５ｋＤａの
物質の量は２ｇｋＤａの物質に関して増加し、そして微
量の１５ｋＤａは明らかであることが示された（データ
は示されていない）。中間の消化（１０分）後、少量の
みの２８ｋＤａ物質が生き残り、そして２５ｋＤａおよ
び１５ｋＤａにおける等量の物質が存在した（第３Ａ図
、レーンｂ）。延長した消化（３５分）後、物質の大部
分は１５ｋＤａに存在する（第３Ａ図、レーンｃ）−２
５ｋＤａおよび１５ｋＤａの断片は、クーマツシー（Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで着色したゲル上で二重線と
して分割された。電気プロッティングおよび引き統＜２
５ｋＤａおよび１５ｋＤａの断片のマイクロシーフェン
シングは、各々について、明瞭な配列、Ｌｙｓ−Ｇ＋ｕ
−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ　１
　ｕ−Ｔｈ　ｒ、を生成する。こうして、両者の断片は
、７１１　ｍ分子のアミノ末端領域から由来する二１５
ｋＤａ断片は、２５ｋＤａよりも、Ｃ０ＯＨ末端におい
て広範に開裂する。 Ｔｔ　ＩｓびのＨＰＬＣ分析および誘導された断片中性
のｐＨの非解離性緩衝液中のおだやかに還元しかつアミ
ドメチル化したＴ　ｌ　ｌ　ｓは、分子篩のＨＰＬＣか
ら６０ｋＤａの種としてトレイリングエツジ（ｔｒａｉ
ｌｉｎｇ　　ｅｄｇｅ）をもつピークで溶離されたが（
第３Ｂ図、ピークＩＩＩ）、調製物はＮａＤｏｄＳＯ４
／ＰＡＧＥにより２８ｋＤａの種および微量の２５ｋＤ
ａの種から戊っていた。６０ｋＤａのＨＰＬＣピークに
おける分画のＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ　（データは
示されていない）は、この物質が２８ｋＤａの種として
移動し、モしてトレイリングエツジにおける物質は２５
ｋＤａの種および２８ｋＤａの種の両者を含有すること
を示した。ピークＩ（排除された物質）およびピークＩ
Ｉからの物質の同様な分析は、両者のピークがオリゴマ
ーの形態の２８ｋＤａ種を含有することを示した。ピー
クＩＶおよびＶからの物質はタンパク質ではなく、多分
低分子量の紫外線吸収物質であったであろう。 こうして、−木調のＴＩ　Ｉｓは非共有結合のホモシマ
ーであるか、あるいは同様な分子質量（ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　ｍａｓｓ）をもつ球状分子のそれより大きい流
体力学的半径をもつ延長した分子である。推定上の非共
有結合のＴ　ｌ　ｌ　＊は、おだやかな還元に引き続く
カルボキシメチル化（これは帯電したカルボキシル基に
より非共有結合の相互作用を不安定化することがある）
および分子篩がけによって、あるいは還元およびアルキ
ル化調製物の０．２モルのグリシン塩酸塩（ｐＨ３，０
）中の分子篩がけによって解重合しなかった。こうして
、存在する場合、Ｔｌｌｓ間の非共有結合の相互作用は
容易には不安定化されず、そして、親和クロマトグラフ
ィー後の直接、精製したＴ１１．の同様な分子篩の検査
によって示されるように、還元およびアルキル化の性質
は不安定化されない。さらに、ＨＰＬＣ分子篩のカラム
上の還元およびアルキル化したＴ１！、から誘導された
トリプシン断片の挙動は、また、驚くべきものである。 延長したトリプシンの消化物の非還元性ＮａＤｏｄＳＯ
ａ／ＰＡＧＥは１つの主要な１５ｋＤａ成分および小さ
い２５ｋＤａの成分を示す（第３Ａ図、レーンＣにおい
て見られるものに等しい）が、篩のカラムの溶離のプロ
フィル（第３Ｃ図）は主要な約３５ｋＤａおよび約１４
ｋＤａのピーク（それぞれ、ビークＩＩおよびＩＩＩ）
および小さい４０ｋＤａのピーク（ピークＩ）から成る
。これらのピークからの物質の非還元性ＮａＤｏ　ｄ　
ＳＯ４／ＰＡＧＥは、４０ｋＤａ　（ピークりおよび３
５ｋＤａ　（ピークＩＩ）の物質が、それぞれ、２５お
よび１５ｋＤａの見掛けの分子質量をもつこと、および
ピークＩＩＩの後に溶離される他の物質が着色したスラ
ブ　ゲル上に現れるには小さすぎるベグチドに完全に崩
壊されていることを示す。 これらのデータから結論されるように、Ｔｌ１ｓを使用
して見られるクロマトグラフィーの挙動はその２５ｋＤ
ａ＊よび１５ｋＤａの断片において維持され、これによ
り組み換えＴ　ｌ　１　＊および多分自然Ｔｌ１分子の
構造が延長されているか、あるいは非共有結合のオリゴ
マー化に向かう素因をもつことを示唆している。この挙
動は自然Ｔ１１の生理学的機能についての関連を有する
かどうかは、立証すべきであるが、有するように見える
。 Ｔｌｌエピトープの分析 ２８ｋＤａのＴ　１１　ｓおよびトリプシン断片の還元
性Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４／　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅお
よび引き続くイムノブロッティングは、モノクローナル
抗体３ＰＴ２Ｈ９によって認識されるＴｉ１ｌエピトー
プを破壊しなかった（データは示されていない）が、抗
モノクローナル抗体３Ｔ４８Ｂ５の結合する能力を事実
破壊し、このことはこれらのＴ１１、エピトープが同一
でないことを説明している。 どのＴｌｌエピトープが１５ｋＤａのアミノ末端トリプ
シン断片上に存在するかを明らかにするために、ピーク
！■の物質（第３Ｃ図）をＨＰＬＣモレキュラシーブの
カラムで精製し、そしてこの物質をポルトン−ハンター
試薬で放射線標識した。Ｊｎ■標識Ｔｌ１ｆｉを免疫沈
澱させる個々のモノクローナル抗体の能力を、Ｎ　ａ　
Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　０４／ＰＡＧＥによってアッセイした
。 第４Ａ図は、１５ｋＤａのトリプシンＴ１１３断片の放
射線標識つけおよび脱グリコジルを示す。 レーンａおよびｂは、それぞれ、グリフシル化した断片
および脱グリコジルした断片を示す。レーンｃ、ｅおよ
びｇは、それぞれ、抗Ｔ１１．（３７４８Ｂ５）、抗Ｔ
１１！（１ｏ１ｄ２４ＣＩ）およびＴｌ　１ｘ（Ｉｒｎ
ｏｎｏ２Ａ８）のモノクローナル抗体によって認識され
る、グリコジル化された断片を示す。レーンｄ、ｆおよ
びｈは、それぞれ、レーンｃ、ｅおよびｇについて記載
したモノクローナル抗体でグリコジル化断片を処理した
後、残る上澄み液中のＴｌ　ｔｓ断片を示す。分子質量
のマーカーおよびＮａＤｏｄＳＯａ／ＰＡＧＥは、第２
＠におけるようなものであり、これにチトクロームｃ　
（１２，４ｋｄａ）およびアプロチニン（６ｋＤａ）を
プラスした。第４Ａ図は抗Ｔｌ　１．（３７４８Ｂ５）
（レーンＣ）および抗Ｔ　１１２　（レーンｅ）は１５
ｋＤａ断片を選択的に免疫沈澱させるが、抗Ｔ　ｌ　１
３　（レーンｇ）はさせないことを示す。エンドグリコ
シダーゼＦの処理は、放射線°標識した１５ｋＤａの物
質の見掛けの分子質量を約１２．５ｋＤａに減少させる
（第４Ａ図、レーンｂ）、これは１５ｋＤａ断片からの
１つの炭水化物の部分の除去と一致する。 この処理はポリペプチドと反応する３Ｔ４８Ｂ５（抗Ｔ
ｌ１ｌ）またはＩｏｌｄ２４Ｃ１（抗Ｔｌｌり抗体の能
力に影響を及ぼさず（データは示されていない）、炭水
化物がこれらの抗体による認識に必要でないことが示さ
れる。 モノクローナル抗体によって定められるＴｌｌ、エピト
ープが１５　ｋ　Ｄ　ａのＴｌ１ｓ）リプシン断片上に
表わされるということが与えられ、そして抗Ｔ　ｌ　１
　ｌ抗体がヒトＴリンパ球との５ＲＢＣロゼツトの形成
を阻害することが示されると、ＨＰＬＣ精製したＴ　ｌ
　１　ｓの１５ｋＤａ断片であるかどうかを決定するこ
とが重要であった。マイクロダラムの量のＴｌ１ｉの１
５ｋＤａ断片とともに予備インキュベージ３ンすると、
ロゼツトの形成は完全に阻害される（第４Ｃ図）。同様
な量の対照のタンパク質（オパルブミン）は、５ＲＢＣ
ロゼツトの形成を阻害できなかった（データは示されて
いない）。 同等な態様 当業者は、日常の実験を越えない実験を用いて、ここに
記載する本発明能力に特定の実施態様と同等な多くの態
様を認識し、あるいは確認することができるであろう。 このような同等な態様は特許請求の範囲内に包含される
ことを意図する。 本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。 １％Ｔ１１仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ糖
タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸
配列からなる可溶性ペプチド。 ２、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ糖
タンパク質の細胞外ドメインのアミノ末端部分またはそ
の断片に相当する約１００アミノ酸残基からなる上記第
１項記載の可溶性ペプチド。 ３、アミノ酸配列： Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｉｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐｌｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｐ２１　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　
Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　１１ｅ３１
　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　ｒｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｔｒｐ
　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ
４１　　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ａｌａ　
Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ５１　　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ｌｙｓ
　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ６１　　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙ
ｓ　　１ｉｅ７１　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　
Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　１ｉｅ８１
　　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌ、ｅ　
Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ９、Ｉ　　
Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　
　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕおよび、前記性質を
本質的に低下させないで、アミノ酸残基が欠失、挿入ま
たは置換されている、前記ペプチドの修飾体からなる上
記第２項記載の可溶性ペプチド。 ４、前記断片はヒ）Ｔｌｌ糖タンパク質の細胞外ドメイ
ンのトリプシン消化によって生皮されている上記第３項
記載の可溶性ペプチド。 ５、前記ペプチド上に局在化したＴ　１１　ｒおよびＴ
ｌ　ｘｔのエビ！・−プからなる上記第３項記載の可溶
性ペプチド。 ６、ＬＦＡ−３結合性ドメインを有する上記第５項記載
の可溶性ペプチド。 ７、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴ１１＄
ｌタンパク質の細胞外ドメインの部分ｌ：相当する可溶
性ペプチドをコードするＤＮＡ配列。 ８、上記第３項記載のアミノ酸配列またはその実質的な
解読同等体をコードするＤＮＡ配列。 ９、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴ１１糖
タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当する可溶性ペ
プチドをコードするＤＮＡ配列からなる発現ベクター １０、前記り、ＮＡ配列は、アミノ酸配列：ＬＳＩ５　
（１１１１１１１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐｌｌ　’Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　ｌｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｅ
ｕ　Ａｓｐ２１１１ｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　１ｉｅ３１　Ａ
ｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｔｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
ｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ４１　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｕ５１　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ６１　
Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｂｒ　Ｌｅｕ　１．ｙｓ　ｌ１ｅ７１　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ
　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　
Ａｓｐ　Ｉｃｅ８１　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓａｒ
　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ９
１　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ
　ｌｉｅ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕおよび、前記性質を
本質的に低下させないで、アミノ酸残基が欠失、挿入ま
たは置換されている、前記ペプチドの修飾体からなる可
溶性ペプチドをコードする発現ベクター １１、上記第１Ｏ項記載の発現ベクターで形質転換され
た細胞。 １２、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ
タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸
配列からなる可溶性ペプチドを、患者に投与する工程か
らなる、Ｔ細胞の活性化を阻害する方法。 １３、前記可溶性ペプチドは、アミノ酸配列：Ｌｙｓ　
Ｇｌｕ　ｌｅｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ］Ｉ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａ
ｓｐ２１１１ｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｍ
ｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ｌ１ｅ３１　Ａｓｐ　
Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ４１　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　
ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｕ５１　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　
Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ６１　Ｌｙｓ
　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　
Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ｌｌ５７１　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ
　ＬＹ９　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　
１ｉｅ８１　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ
　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ９１　　Ｌ
ｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌ
ｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　Ｌｅｕおよび、
前記性質を本質的に低下させないで、アミノ酸残基が欠
失、挿入または置換されている、前記ペプチドの修飾体
からなる、上記第１２項記載の方法。 １′４、前記可溶性ペプチドを静脈内に投与する上記第
１３項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトＴｌｌタンパク質のアミノ酸配列および
エクソンの構成を示す。ｃＤＮＡおよびゲノムのクロー
ンおよび染色体上の１２キロ塩基の遺伝子の５つのエク
ソンに対するその関係から推定された、ヒトＴｌｌのア
ミノ酸配列は、（Ｂ）に与えられている。まＩ；、バク
ロウィルス系において生成された、成熟した、分泌され
た、可溶性の組み換え体Ｔｌ１分子の１７８残基は、イ
タリックのタイプで示されている。 第２図は、バクロウィルスのベクターにおけるアンカー
−マイナス（ａｎｃｈｏ　ｒ−ｍｉ　ｎｕ　５）Ｔｌｌ
　　ＤＮＡの構成および分泌されたＴｌｌの生成を示す
。第２Ａ図は、切頭Ｔｌｌ　　ｃＤＮＡを生成し、そし
てｐＡｃ３７３転移ベクター中にクローニングするため
の、構成のプロトコルを示す。第２Ｂ図は、Ｔ　ｌ　ｌ
　ｓノ［”Ｓ］　メチｆ＝ンの標識っけを示す。第２Ｃ
図は、Ｔ　ｌ　１　ｓの大規模な調製および精製の分析
を示す。 第３Ａ図は、Ｔｌ１ｓのトリプシンの断片化を示す。第
３Ｂ図は、おだやかに還元されかつアルキル化されたＴ
　ｌ　１　ｇペプチドのＨＰＬＣのクロマトグラフを示
す。第３ＣｒＭは、トリプシン断片化され、還元され、
そしてアルキル化されたＴｌｌ、のＨＰＬＣクロマトグ
ラフを示す。 第４Ａ図は、１５ｋＤａのトリプシンのＴｌ１ｓ断片の
放射線標識つけおよび脱グリコジルを示す。 第４Ｂ図は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞に対
する細胞および５ＲＢＣの間のロゼツトの形成を示す。 第４Ｃ図は、精製された１５ｋＤａのトリプシンのＴ　
ｌ　ｌ　ｓ断片によるロゼツトの形成の阻害を示す。 ｔ＝ｌａｍ）（Ｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ糖
   タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸
   配列からなる可溶性ペプチド。 ２、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ糖
   タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当する可溶性ペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列。 ３、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ糖
   タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当する可溶性ペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列からなる発現ベクター。 ４、Ｔｌｌ仲介Ｔ細胞活性化を阻害できるヒトＴｌｌ糖
   タンパク質の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸
   配列からなる可溶性ペプチドを、患者に投与する工程か
   らなる、Ｔ細胞の活性化を阻害する方法。