JPH0335794A - ＴＧＦ―β１／β２：新規キメラ変換成長因子―ベータ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＴＣＦ−β１／β２と称される新規変換成長
因子ベータ、ＴＧＦ−β１／β２をコードするヌクレオ
チド配列及び発現ベクター、及びＴＧＦ−βｌ／β２の
製造方法に関するものである。キメラＴＧＦ−β１／β
２前駆体遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフ
ヱクシジンされたＣ、ＩＩＯ細胞によるＴＧＦ−βｌ／
β２の生産及び分泌により本発明は実証される。キメラ
遺伝子産物はＴＧＦ−β１生物活性を有する。

〔従来の技術〕

変換成長因子−ベータ　（ＴＧＦ−β）は、最近記述さ
れている細胞分化及び増殖を制御する一群のポリベプチ
ド類の一員である。この−群の他のものには、Ｍｕｌｌ
ｅｒの阻害物質（Ｃａ　ｔｅら、１９８６．　Ｃｅ１１
４５　：６８５−６９８）、インヒビンｇ　（Ｍａｓｏ
ｎ　ら、１９８５゜Ｎａｔｕｒｅ　３１８：　６５９−
６６３）及びドロソフィラ　（叶ｏｓｏ−ｐｈｉｒａ）
の１５倍（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）遺伝子複
合体の転写物から推定されるタンパク質（Ｐａｄｇｅｔ
ｔら、■９８７、　Ｎａｔｕｒｅ　　３２５：８ｌ−８
４）がある。

４タイプのＴＧＦ−βが同定され、ＴＧＦ−β１　、Ｔ
ＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１，２及びＴＧＦ−β３と命名
されている。最初に記載したタイプ、ＴＧＦ−βｌは、
分子量１３．０００を有しジスルフィド結合した２個の
同一なサブユニットからなる（Ａｓｓｏｉａｎ　ら、１
９８３．　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８：７１５５−７１６０
　；　Ｆｒｏｌｉｋら、１９８３゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：　３６
７６−３６８０　；Ｆｒｏｌｉｋら、１９８４．　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０　：　１０９９５−
１１０００）。これは、胎盤（Ｆｒｏｌｉｋら、１９８
３．　Ｎａｔｕｒｅ３２５：８ｌ−８４）　、血小板（
Ｃｈｉｌｄｓら、１９８２＋　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：５３
１２−５３１６　；　Ａｓ５ｏｉａｎら、１９８３．　
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５８：７１５５−７
１６０）　、腎１Ｉｉ（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ら、１９８３
．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２　：　５６９２−
５６９８）、及び脱石灰化骨（Ｓｅｙｅｄｉｎら、１９
８５．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１
１９−１２３）を含む数種の組織源から精製されている
。ヒト（Ｄｅｒｙｎｃｋら、１９８５、　Ｎａｔｕｒｅ
　３１６：７０１−７０５）　、マウス（Ｄｅｒｙｎｃ
ｋら、１９８６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２
６１：４３７７−４３７９）　、及びサル（Ｓｈａｒｐ
ｌｅｓら、１９Ｂ？、　ＤＮＡ　６　：２３９−２４４
）のＴＧＰ−βｌをコードするｃＤＮＡクローンが単離
されている。ＴＧＦ−βｌは大きな前駆体ポリペプチド
゛として台底され、そのカルボキシ末端が切断されて成
熟ＴＧＦ−β単量体を生成することを、これらのクロー
ンのＤＮＡ配列分析は示している。上記起源全てに由来
するＴＧＦ−βｌ前駆体タンパク質の全体にわたって強
い配列相同性が見いだされた。

ｌ０％血清及び上皮成長因子の存在下において、ＴＧＦ
−β１は正常ラット腎ＷｔｕＭ維芽細胞の固定源非依存
性成育を促進しくＲｏｂｅｒｔｓら、１９８１．　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＩＪＳＡ　
　７８；５３３９−５３４３　　ＨＲｏｂｅｒｔｓら、
１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ　２９５：４１７−４１９　
；　Ｔｗａｒｄｚｉｋ　　ら、１９８５、　Ｊ、　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２８：２８９−２９７）　
、１０％血清のみの存在下においては、ＡＫＲ−２Ｂ繊
維芽細胞のコロニー形成を誘導する能力を持つ（Ｔｕｃ
ｋｅｒら、１９８３、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３
：１５１Ｂ−１５８６）　、また、ＴＧＦ−β１は胎児
性ラット筋間葉細胞の分化および軟骨特異的巨大分子の
生成を引き起こすことも示されている（Ｓｅｙｅｄｉｎ
ら、１９８６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆａ、　２
６１：５６９３−５６９５）。

その細胞増殖に対する効果とは対照的に、ヒト血小板か
ら精製されたＴＧＦ−β１は、培養においである種の細
胞の成育を阻害することが示されている（Ｔａｃｋｅｒ
ら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２６：７０５−７０
７）。また、ＴＧＦ−βｌは数種類のヒト腫瘍細胞株の
成育を阻害することも示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら
、１９８５゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１１９−１２３）。このＴＧＦ
−βｌの阻害／促進作用は、細胞の種類や細胞の生理学
的状態を含む数個の因子に依存するであろう　（総説と
しては、５ｐｏｒｎ　ら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ２
２３　：　５３２−５３４を参照〉。

ＴＧＦ−βｌと同様にＴＧＦ−β２は、ジスルフィド結
合した２個の同一な１３．０００ドルトンのサブユニッ
トからなる、分子１ｆｉ２６．ｏｏＯのポリペプチドで
あり（Ｃｈｉｅｆｅｔｚら、１９８７．　Ｃｅ１ｌ　４
８：４０９−４１５　；　Ｉｋｅｄａら、１９８７．　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｅｙ　２６：２４０６−２４１０
）、ウシ脱石灰化骨（Ｓｅｙｅｄｉｎら、１９８７．　
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１９４６−１
９４９）、ブタ血小板（Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、１９８７
．Ｃｅ１１４８：４０９−４１５）、ヒト前立腺癌細胞
株ＰＣ−３（Ｉｋｅｄａら、　１９８７．　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　２６：２４０６−２４１０）、および
ヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｗｒａｎｎら、１９８７．
　Ｅ旧０６　：１６３３−１６３６）から単離されてい
る。ヒト及びザルＴ　Ｇ、Ｆ−β２をコードするｃＤＮ
Ａクローンが、単離されているＣＭａｄ　１ｓｏｎら、
１９８８．　ＤＮＡ　７：ｌ−８ＨＷｅｂｂら、１９８
８、　ＤＮＡ　７：４９３−４９７）、そのｍＲＮ＾が
スプライシングにより生ずるであろう２種類のより大き
な前駆体ポリペプチドの一つから、切断される　（Ｗｅ
ｂｂら、１９８Ｂ、　ＤＮＡ　’７：４９３−４９７）
。

ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２は、その成熟領域におい
て７１％のアミノ酸配列が同一であり、その前駆体構造
においては、４１％が同一であった。最近アミノ酸配列
がｃＤＮＡクローンより推定されたＴＧＦ−β３は、Ｔ
ＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の成熟単量体に対して約８
０％の相同性を有するＣ−末端の１１２個のアミノ酸配
列を含むものと思われる（Ｄｉｊｋｅら、１９８８゜Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
　８５：４７１５−４７１９）。

ＴＧＦ−β１，２は、ジスルフィド結合によって結合し
た一つのβ１及びβ２からなる異種二量体形態である　
（Ｃｈｉｅｆｅｔｚら、１９８７．　Ｃｅ１ｌ　４８：
４０９−４１５）。

（１）　ＴＧＦ−１の　　　プロセシングヒト、薩歯類
、及びサル起源からのＴＧＦ−β１の前駆体領域のアミ
ノ部分が、高度の相同性を示しくＤｅｒｙｎｃｋら、１
９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１６：７０１−７０５；Ｄ
ｅｒｙｎｃｋら、１９８６．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
２６１：４３７７−４３７９　；　５ｈａｒｐｌｅｓら
、１９８７．　ＯＮ＾６　：　２３９−２４４）、重要
な生物学的機能が、該分子のこの部分と関連しているこ
とを示唆する。ＴＧＦ−β１前駆体のこの部分がグリコ
ジル化され、リン酸化されていることを明確に示した最
近の研究は、この主張を支持するが、これはもし特定の
機能のためでないならば、このような二次的修飾を行う
という労力を細胞が費やすとは考えられないためである
　（Ｂｒｕｎｎｅｒら、１９８Ｂ、　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：２２２９−２２３２）。

このような修飾は前駆体の二量体化のために、またはそ
の移動を細胞の外へ方向付けるために重要であろう。前
駆体のグリコジル化が成熟ＴＧＦ−β１の細胞外への輸
送に関わっていることを示唆する証拠がある（Ｐｕｒｃ
ｈｉ。

ら、１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｌＩ＋、　
２６３：１４２１Ｌ１４２１５）。

サルＴＧＦ−β１を発現するＣＨＯ細胞において、プロ
セシングに関わる中間前駆体複合体か、または発現にお
ける人為的産物のいずれかであると思われるものの存在
が報告されている（ＧｅｎｔｒＶら、１９８Ｂ、　Ｍｏ
１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：４１６２−４１６
８　ＨＧｅｎｔｒｙ　ら、１９８７、　Ｍｏ１．　Ｃｅ
１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　７：３４１８−３４２７）　、こ
れらの研究は、トランスフェクションされたｃｌｌｏ１
１Ｉ胞により合成されるＴＣＰ−βｌが、ジスルフィド
結合により相互に結合したプローＴＧＦ−β１、或ｑ４
　Ｔ　Ｇ　Ｆβ１、及び前駆体のプロ領域からなること
を明らかにした。このようなジスルフィド結合した前駆
体複合体は、単離した潜在型ＴＧＦ〜β１にも見られた
　（Ｍｉｙａｚａｎｏら、１９８ＥＬ　Ｊ、Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｕｐｐｌ。

１２（Ａ）：２００；　Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら、１９８
７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

５ｕｐｐ１．１１（Ａ）：４６）。

Ｇｅｎ　ｔｒｙら　（Ｇｅｎｔｒｙら、１９８８＋　Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、。

８：４１６２−４１６８）は、トランスフェクションＣ
ＨＯ細胞におけるプレープローＴＧＦ−β１のプロセシ
ングについて以下のようなスキームを提案した。言及さ
れたアミノ酸位置番号は公刊されたサルＴＣＰ−β１配
列に由来する　（Ｓｈａｒｐｌｅｓら、１９８７．　Ｏ
Ｎ＾６：２３９−２４４）。この提案されたスキームに
よると、その第一段階は、Ｇｌｙ−２９／　Ｌｅｕ−３
０ペプチド結合でのシグナルペプチド切断に関わる。こ
の切断事象は前駆体が粗面小胞体膜を通過する間に同時
翻訳的に起こる可能性が最も高い（Ｂｌｏｂｅｌおよび
Ｄｏｂｂｅｒｓ　ｔｅ　ｉｎ　。

１９７５、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６７：８
３５−８５１　：　Ｗａｌｔｅｒら、１９８４、　Ｃｅ
１ｌ　３８：５−８）。シグナルペプチドの切断に続い
て、コアグリコジル化ユニット（Ｒｏｔｈｍａｎら、。

１９７Ｂ、Ｃｅ１１１５：１４４７−１４５４）が、Ａ
ｓｎ−８２、Ａｓｎ−１３６、Ａｓｎ−１７６に位置す
る三箇所の推定Ｎ−グリコジル化部位のそれぞれで、ブ
ロー↑ＧＦ−β１に付加される。ついでコアグリコジル
化プローＴＧＦ−βｌは、ゴルジ体を通過しながら引き
続いてプロセシングを受け、リン酸化糖タンパク質含有
複合体、シアル酸のついたオリゴ糖を生成する。台底及
び通過の際のいくつかの段階で、二塩基性残基でのタン
パク質加水分解的切断及びジスルフィド異性化反応が起
こり、成熟ＴＧＦ−β１を放出する。

最近の別の研究において、ＴＧＦ−β１前駆体中にマン
ノース−６−リン酸が同定された。リン酸化されたｔａ
ｇ似体、マンノース−６−リン酸は、標的輸送及びリソ
ソーム酵素の細胞間交換に機能的役割を演じていると思
われる（ｖｏｎ　Ｆｉｇｕｒａ、　１９８６＋Ａｎｎ、
　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋。５５　：１６７−１９
３）。リソソーム酵素のマンノース−６−リン酸残基を
認識する特異的レセプターが同定されており、輸送系の
必須構成要素である。マンノース−６−リン酸を含む分
泌リソソームタンパク質が組織培養培地の順化培地中に
同定されている（ＧａｌおよびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、　
１９８６＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１：　１
７６０−１７６５ｓ　Ｃａｐｏｎｙら、１９８１Ｊ、Ｃ
ｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０４：２５３−２６２　；　Ｂ
ａｕｍｂａｃｈ　ら、１９８４゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：２９
８５−２９８９；ＳａｈａｇｉａｎおよびＧｏｔｔｅｓ
ｍａｎ＋　１９８２＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５７：１１１４５−１１１５０）、　ＴＣＦ−β１前
駆体のマンノース−６−リン酸残基が、成熟ＴＧＦ−β
１を生成させるタンパク質加水分解的プロセシングのた
めに、プローＴＧＦ−β１をリソソームに方向付けるこ
とが考えられる。あるいは、マンノース−６−リン酸残
基は、切断されたＴＧＦ−β１前駆体を分解のためにリ
ソソームに標的輸送する機能を持つのかも知れない。

〔発明の要約］ 本発明は、発現調節因子により制御されるＴＧＦ−β１
／β２前駆体コード配列を含む組換えＤＮＡヘクターで
トランスフェクションされた真核宿主細胞による、ＴＧ
Ｆ−βｌ／β２と称される新規キメラＴＧＦ−βの大量
生産に関するものである。サルＴＧＦβ１　ｃＤＮＡ　
（Ｓｈａｒｐｌｅｓら、１９８７．　ＤＮＡ６：２３９
−２４４）は修飾され、成熟ＴＧＦ−β１配列の９−１
３．１７．１９．２５及び２６番のアミノ酸残基をコー
ドするヌクレオチドが、成熟ＴＧＦ−β２構造の対応ア
ミノ酸をコードするヌクレオチドに変化していた。サル
のコドンの規則性は維持された。

サルウィルス（ＳＶ４０）発現調節因子の調節制御下で
キメラＴＧＦ−β１／β２前駆体をコードする発現ベク
ターを構築し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＩＯ
）　ＩＩＩ胞にトランスフェクションするために使用し
た。高レベルのＴＧＦ−β１／β２を合成、分泌するＣ
ＨＯトランスフェクシントを得た。ＴＧＦ−βｌ／β２
発現はメトトレキセートによって増幅され、増殖したト
ランスフェクシントは１ｍｇ／Ｌもの成熟ＴＧＦ−βｌ
／β２を分泌した。Ｃｌｌ０トランスフェクタントの順
化培地の酸性化により、最高レベルの生物活性ＴＧＰ−
β１／β２が生じた。トランスフェクションＣＨＯ細胞
により分泌された高レベルのｒＧＦ−βｌ／β２は、キ
メラ前駆体タンパク質のタンパク質加水分解的プロセシ
ングにおける並外れた効率に起因する。このような増加
したプロセシング効率はまた、成熟ＴＧＦ−β構造のア
ミノ末端ドメインにおけるＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β
２アミノ酸配列の出願人らの組合せによって影響される
構造上の特質に起因している。

〔発明の説明〕

本発明は、ＴＧＦ−β１／β２、ＴＧＦ−βｌ／β２及
びＴＧＦ−β１／β２前駆体をコードするヌクレオチド
配列、およびｍ換えＤＮＡ法によるＴＧＦ−β１／β２
の生産に関するものである。↑ＧＦ−β１／β２、新規
キメラ変換成長因子−βは、ＴＧＰ−β１生物活性測定
に用いた標準アッセイにおいて生物学的に活性であり、
ＴＧＦ−βｌ−特異的抗体との免疫反応性を示す。構造
的にはＴＧＦ−βｌ及びＴＧＦ−β２アミノ酸配列の組
合せからなるキメラである本発明のＴＧＦ−β１／β２
は、新規生物活性を担うことが期待され、その生物活性
の一部はその親分子の示す活性と類似するかまたはほと
んど同一であろうが、他はＴＧＦ−β１／β２に独特で
あるかもしれないトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２の
生物活性と類似の、あるいはほとんど同一の生物活性に
関しては、この新因子は、相応する生物学的応答を誘導
するもっと効果的な手段を提供するかもしれず、その使
用は、従って、ＴＧＦ−β類について考えられる様々な
臨床応用においてＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２に変わ
りうる望ましい方法となり得よう。このような応用には
、細胞増殖及び分化の誘導または促進、および細胞分裂
の阻害が含まれるがこれに限定されるものではない。こ
のように、ＴＧＦ−βｌ／β２は例えば癌治療や癒傷促
進に使途を見いだすであろう。

本発明の方法は単に説明のために以下のような段階に分
けられる；　（ａ）　ＴＧＰ−βｌ／β２前駆体のコー
ド配列の生成ｉ　（ｂ）　ＴにＩ？−β１／β２コート
配列の発現を指示する発現ベクターの構築；　（Ｃ）　
該遺伝子を複製、発現し、該遺伝子産物をプロセシング
する能力を有し、ＴＧＦ−βｌ／β２の成５４１）型、
及び／またはＴＧＦ−βｌ／β２前駆体を生成する適当
な宿主細胞へのトランスフェクション；および（ｄ）　
ＴＧＦ〜β１／β２前駆体及び成熟、生物活性’ｌ’　
ＧＦ−β１／β２の同定及び精製。

ひとたびトランスフェクシントが高しヘルのＴＧＦ−β
１／β２前駆体及び／または成熟ＴＧＦ−βｌ／β２を
発現することが認識されれば、発明の方法の実施は、該
クローンの増殖及び発現された遺伝子産物の単離を必要
とする。

ここに本発明の方法を下記の例を用いて明らかに示す。

すなわちその例において、サルＴＧＦ−βｌ前駆体ｃＤ
ＮＡ　（Ｓｈａｒｐｌｅｓら、１９Ｂ？、　ＤＮＡ　Ｇ
：２３９−２４４）を修飾し、成熟サルＴＧＦ−β１の
９−１３．１７．１９．２５及び２６番のアミノ酸残基
をコードするヌクレオチドを成熟ＴＧＦ−β２構造にお
ける対応するアよノ酸をコードするヌクレオチドに変化
させたが、サルコドンの規則性は維持されている。次い
で、その結果得られたキメラＴＧＦ−β１／β２前駆体
コード配列を、成熟ＴＧＦ−β１／β２産物の台底を指
示する能力を持つ発現ベクターの構築に使用する。

様々な角度からみた本発明の方法は、以下の小項目及び
それに続〈実施例においてより詳細に記述される。

（１）キメーＴＧＦ−１２コー′　　のキメラＴＧＦ−
β１／β２のヌクレオチドコード配列を第１図に記述し
ている。発明の方法の実施において、このヌクレオチド
配列またはそれと機能的に等価なものを、ＴＣＰ−βｌ
／β２産物の発現を指示するであろう組換え分子を生成
させるために使用できる。ヌクレオチドコード配列の縮
退のため、第１図に記述した以外のＤＮＡ配列も、本発
明の実°施に際して使用できる。第１図のヌクレオチド
配列のこのような変更には、様々なヌクレオチド残基の
欠失、付加、または置換があり、これにより同一のまた
は機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる
。遺伝子は配列内アミノ酸残基の欠失、付加または置換
を含んでいてもよく、生物活性な産物を生成する表に現
れない変化を生じる。このようなアミノ酸置換は、関連
する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性及び／
または両親媒性の類似に基づいて行われうる。たとえば
負荷電アミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸があ
る；正荷電７５ノ酸にはリジン及びアルギニンがある；
類似した親水性を有し、非荷電極性の側鎖あるいは非極
性側鎖を有するアミノ酸には以下のものがある；ロイシ
ン、イソロイシン、バリンニゲリシン、アラニン；アス
パラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニル
アラニン、チロシン。

サルＴＧＦ−βｌのヌクレオチド配列はサル細胞源から
得ることができる（Ｓｈａｒｐｌｅｓら、１９８７．　
ＤＮＡ６：２３９−２４４）。第１図におけるキメラＴ
ＧＦ−β１／β２のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ制限酵
素、合成オリゴヌクレオチド、及びＤＮＡリガーゼの使
用を含むがこれに限定されない当分野に公知の方法によ
り調製することができる。あるいは、第１図のコード配
列を、当分野に周知の化学的方法を用いて、全合成また
は部分合成することができる。

発明の特定の実施態様においては、サルＴＣＰ−β１の
コード配列はアフリカミトリザル細胞株、ＢＢＣ−４０
（Ｓｈａｒｐｌｅｓら、１９８７．上記）から得られた
全長を有するｃＤＮ＾ＤＮＡンから得ることができる。

次いで、第１図に記述されたキメラＴＧＦ−βＩ／β２
のコード配列は、遺伝子構築技術を用いて、成７４ｊＴ
ＧＦ−（／　１　（７）　７　ミ／酸残基番号９．１０
．　ＩＩ、１２．１３．１７．１９．２５及び２６のコ
ード配列を除去し、成熟ＴＧＦ−β２分子（Ｍａｄｉｓ
ｅｎら、１９８Ｂ、　ＤＮＡ　７：１−８）のアミノ酸
残基番号９．１０５ｉｔ、１２．１３．１７．１９．２
５及び２６のコード配列に置き換えることによってサル
ＴＧＦ−βｌ配列から誘導される。

（２）キ　−ＴＧＦ−コー さＩＪＬ二坐盪築 生物学的に活性な７ｉ！熟ＴＧＦ−β１／β２を発現さ
せるためには、高レベルの転写及び翻訳のみならず、遺
伝子産物の正確なプロセシングを考慮にいれた発現ベク
ター宿主系が選択されるべきである。

このことは特に発現構築物においてキメラＴＧＦβ１／
β２前駆体のコード配列全体を使用するときに重要であ
るが、これは、ＴＧＦ〜βｌやＴＧＦ−β２同様成熟キ
メラＴＧＦ−β１／β２が、細胞で生起するプロセシン
グによって前駆体分子または分子複合体から放出される
と信じられているためである。

さらに、産物の分泌に備えた発現／宿主細胞系が望まし
い。

とりわけ、成熟ＴＧＦ−βｌ／β２は、成熟ＴＧＦβｌ
及びＴＧＦ−β２を形成させるプロセシングと類似であ
ると信じられる細胞のプロセシング事象によって形成さ
れるサブユニット当り１１２個のアミノ酸からなるジス
ルフィド結合したホモ二量体であると思われる。ＴＧＦ
−β１／β２前駆体は３箇所のＮ−グリコジル化可能部
位をそのプロ領域に有している　（Ｓｔ＋ａｒｐｌｅｓ
ら、１９８７．　ＤＮＡ　６；２３９−２４４）。

ＴＧＦ−βｌに関する研究は、ＴＧＦ−β１のプロドメ
インにおけるＮ−グリコジル化及びリン酸化がトランス
フェクションされたＣＨＯ細胞内で起きることを確認し
ており、前駆体の重要な機能的役割を成熟分子の細胞で
の合成、及び放出または分泌に関係付ける（Ｂｒｕｎｎ
ｅｒら、１９８８．　Ｍｏ［、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、８
：２２２９−２２３２）、また、ＴＧＦ−β１前駆体に
おけるマンノース−６−リン酸の存在も、前駆体が独立
した機能的活性を有するとの仮説を支持する（Ｐｕｒｃ
ｈｉ。

ら、１９８Ｂ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２３
６：１４２１１−１４２１５）。

キメラＴＧＦ−β１／β２前駆体がサルＴＧＦ−βｌプ
ロドメインを含むため、出願人らは、ＴＧＦ−β１／β
２前駆体が機能的に活性であり、成熟ＴＧＦ−β１／β
２分子の正確なプロセシングにとって重要である可能性
が高いと考えている。したがって、発現系に使用した宿
主細胞の、キメラＴＧＦ−βｌ／β２を正確に発現させ
プロセシングする能力は、成熟、生物活性産物の生産に
重要である。

ここに記載する特別の実施態様において、或塾生物活性
ＴＧＦ−β１／β２は、チャイニーズハムスター卵１（
Ｃ１１０）宿主細胞系においてサルウィルス４０　（Ｓ
Ｖ４０）発現制御要素を用い、成功裡に生産される。し
かしながら、当業者は、様々な他の動物の宿主／発現ベ
クター系（すなわち適当な宿主細胞内でＴＧＦ−βｌ／
β２コ一ド配列の複製、転写及び翻訳を指示するための
必要要素を含有するベクター）を同じように良好に利用
することができる。

これらは、ウィルス発現ベクター／１ｒ１１ｉ乳頌宿主
細胞（例えば、シトメガロウイルス、ワタシニアウイル
ス、アゾノウ・イルス、その地回種類のもの）；昆虫ウ
ィルス発現ベクター／昆虫細胞系（例えば、バクロウィ
ルス）；または哺乳類細胞のゲノムから誘導された非ウ
ィルス性プロモーター発現系（例えばマウスメタロチオ
ネインプロモーター）を含むがこれに限定されない。

これらのベクターの発現要素はその強度及び特異性にお
いて変化する。使用する宿主／ベクター系に依存して、
多くの適当な転写及び翻訳要素のうちのどれでも一つを
使用することができる。例えば咄乳動吻細胞系内でのク
ローニングの場合には、哺乳類細胞のゲノムから（例え
ばマウスメタロチオネインプロモーター）またはこれら
の細胞内で成育可能なウィルスから（例えばワタシニア
ウイルス７．５にプロモーター）単離されたプロモータ
ーが使用できる。組換えＤＮＡまたは合成技術により製
造されたプロモーターもまた、挿入配列の転写のために
使用することができる。

特定の開始シグナルもまた、挿入されたタンパク質コー
ド配列の十分な翻訳のために必要である。

これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を
含む。例えばＴＧＦ−β１／β２コード配列部分のみが
挿入された場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外的翻訳
制御シグナルが与えられなければならない。全挿入物の
翻訳を確実に行うためには、開始コドンはＴＧＦ−β１
／β２コード配列の読み枠と一致しなければならない。

これらの外的翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然
及び合成の様々な起源のものであってよい。発現効率は
、転写減衰配列、エンハンサ−等の含有により増強され
うる。

ＴＧＦ−β１／β２コード配列及び適切な転写／翻訳制
御シグナルを含む発現ベクターを構築するために、先に
記載したＤＮＡ断片をベクター中に挿入するためのあら
ゆる方法が使用できる。これらの方法は、インビトロ組
換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え（遺伝子
！ｆＪｉＩＡえ）を含んでよい。

例えば、発現ベクターとしてアデノウィルスを使用する
場合には、ＴＧＦ−βＩ／β２コード配列は、アデノウ
ィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後方ブロモ−クー
及び３分節系リーダー配列に連結される。次いで、該キ
メラ遺伝子を、アデノウィルスのゲノム中に、インビト
ロまたはインビボ組換えによって挿入することができる
。該ウィルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅｌまた
はＣ３）への挿入は、感染宿主内において生存可能で、
キメラＴＧＦ−βｌ／β２の発現能を有する組換えウィ
ルスを生しるであろう。同様にして、ワタシニア７．５
にプロモーターも用いられる。

ＴＧＦ−β１／β２発現のために用いられる別の発現系
は、昆虫系である。このような系の一つにおいて、オー
トグーフッカ１フオルニ力（Ａｕｔｏ　ｒａ　ｈａｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリヘドロシスウィルス（へｃ
ＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるベクターとして用
いられる。該ウィルスは、スボドプーーフルジベルＳ　
ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ）細胞内で増
殖する。

ＴＧＦ−β１／β２コード配列を、該ウィルスの非必須
領域（例えばポリヘトリン遺伝子）中にクローン化し、
ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリへドリンプロモー
ター）の制御下に置くことができる。

ＴＧＦ−β１／β２コード配列の好結果の挿入は、ポリ
ヘトリン遺伝子の不活化及び非閉塞組換えウィルス　（
すなわち、ポリヘトリン遺伝子によりコートされるタン
パク質性外皮を欠失したウィルス）の生成をもたらす。

次いで、これらの組換えウィルスは、挿入遺伝子を発現
する。；＜ｆｆｌ　Ｆ７□１芝ｊし欠乏ヱ土ｌ細胞を感
染させるために使用される。

さらに、該挿入配列の発現を調節する、または該遺伝子
産物を特定の望ましい様式で修飾及びプロセシングする
宿主細胞株が選択される。ある種のプロモーターによる
発現を、ある種の誘導因子の存在下で上昇させることが
できる（たとえば、メクロチオネインプロモーターに対
する亜鉛及びカドミウムイオン）。従って、遺伝的に操
作されたＴＧＦ−βｌ／β２の発現を制御することがで
きる。

このことは、クローン化された外来遺伝子のタンパク質
産物が、宿主細胞にとって致命的である場合に重要であ
る。さらに、グリコジル化のような翻訳後の修飾、及び
タンパク質産物のタンパク質加水分解的切断のようなプ
ロセシング過程は、タンパク質の機能化にとって重要で
ある。様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセ
シング及び修飾のための、特徴的かつ特異的な機構を有
している。発現される外来タンパク質の正しい修飾及び
プロセシングを確実にするために、適切な細胞系または
宿主系を選択することができる。

発明の特定の実施態様においては、５Ｖ４０３１’Ａ］
節配列の制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子（ｄｈｆｒ）と縦列にＴＧＦ−β１／β２コード配列
を含む発現ベクターが構築され、ｄｈｆｒ−欠失Ｃｌｌ
０細胞にトランスフェクションするために用いられる。

ｄｈｆｒ表現型を発現するＣＨＯ）ランスフエクタント
が、選択培地での増殖により分離された。ＴＧＦ−β１
／β２の発現レベルを増加させるために、増幅されたレ
ベルのＴＧＦ−β１／β２　ｍＲＮＡを転写するクロー
ンを分離する目的で、トランスフェクシントを濃度を上
昇させたメトトレキセートにさらしてもよい。ＴＧＦ−
β１／β２　ｍＲＮＡ　レベルは、増幅の様々な段階で
、溶液ハイブリッド形成（Ｕｈｌｅｒら、１９８６＋　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ
、Ａ、８３：１３００−１３０４）によって検定できる
。

ＴＧＦ−βｌ／β２コ一ド配列を含み、生物学的に活性
な成熟産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一
般的アプローチによって同定される；（ａ）　　ＤＮＡ
−ＤＮＡ　ハイフ゛す・ンド形成；＜ｂ）マーカー遺伝
子機能の存在または不在；（Ｃ）宿主細胞内のＴＧＦ−
β１／β２　ｍＲＮＡ転写物の発現により測定される転
写レベルの評価；および（ｄ）イムノアツセイおよび最
終的にはその生物活性で測定される成熟遺伝子産物の検
出。

第１のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入され
たＴＧＦ−βＩ／β２コード配列の存在は、第１図に概
略を示したＴＧＦ−βｌ／β２コ一ド配列に相同なヌク
レオチド配列、あるいはその一部分または誘導体からな
るプローブを用いたＤＮＡ　−ＤＮＡハイブリッド形戒
形成り検出できる。

第２のアプローチにおいては、組換え発現ベクター／宿
主系は、ある種の“マーカー”遺伝子機能（例えば、チ
ミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート
耐性、形質転換表現型、バクロウィルスにおける閉塞体
形成など）の存在または不在に基づいて同定され、選択
される。例えハＴ　Ｇ　Ｆ−β１／β２コード配列がベ
クターのマーカー遺伝子中に挿入された場合には、ＴＧ
Ｆ−β工／β２コード配列を含む組換え体を、マーカー
遺伝子機能の不在により同定することができる。別法と
して、ＴＧＦ−β■／β２コード配列の発現制御に使用
される同一のまたは異なったプロモーターの制御下に、
マーカー遺伝子を↑ＧＦ−βｌ／β２配列に縦列に位置
させることができる。誘導または選択に対応するマーカ
ーの発現は、ＴＧＰ−β１／β２コード配列の発現を示
している。

第３のアプローチにおいては、ＴＧＦ−βＩ／β２コー
ド領域の転写活性を、ハイブリッド形成により評価する
ことができる。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは、ＴＧ
Ｆ−β１／β２コード配列またはその特定の部分に相同
なプローブを用いたノーザンプロットにより単離及び分
析される。別法として、宿主細胞の全核酸を抽出し、こ
のようなプローブに対するハイブリッド形成により検定
してもよい。

第４のアプローチにおいて、成熟タンパク質産物を、免
疫学的に、例えばウェスタンプロットや、イムノブロッ
ティング、放射免疫沈澱、酵素結合イムノアッセイとい
ったイムノアッセイなどにより評価することができる。

しかしながら、発現系の成功についての最終的な試験は
、生物学的に活性なＴＧＦ−β１／β２遺伝子産物の検
出に関するものである。宿主細胞が遺伝子産物を分泌す
る場合には、培養トランスフェクタント宿主細胞から得
られる無細胞培地が、ＴＧＦ〜βｌ／β２活性について
検定される。遺伝子産物が分泌されない場合には、この
ような活性について細胞溶解物を検定することができる
。いずれの場合にも、ここに記載された成長阻害アッセ
イなどの生物学的検定法が使用できる。

ひとたび或ＰＴＧＦ−βｌ／β２を高水準で生産するク
ローンが同定されれば、該クローンを増殖させて、当分
野で周知の技術を使用して＋ｆｊ製することができる。

このような方法には、イムノアフィニティ精製、高速液
体クロマｌ−グラフィーを含むクロマトグラフィーの手
法等がある。

実施例１ 成熟ＴＧＦ−β１配列のアミノ酸９．１０、ＩＬ　１２
．１３．１７．１９．２５及び２６を成熟ＴＧＦ−β２
配列の対応するアミノ酸で置き換えたＴＧＦ−β１前駆
体をコードする組換えプラスミドを構築した。詳述する
と、成熟ＴＧＦ−βｔのアミノ酸９　（セリン）はアル
ギニンによって置き換えられた、１０番のアミノ酸（セ
リン）はアスパラギンによって置き換えられた、１１番
のアミノ酸（スレオニン）はバリンによって置き換えら
れた、１２番のアミノ酸（グルタ藁ン酸）はグルタミン
によって置き換えられた、１３番のアミノ酸（リジン）
はアスパラギン酸によって置き換えられた、１７番のア
ミノ酸（バリン）はロイシンによって置き換えられた、
１９番のアミノ酸（グルタミン）はプロリンによって置
き換えられた、２５番のアミノ酸（アルギニン）はリジ
ンによって置き換えられた、２６番のアミノ酸（リジン
）はアルギニンによって置き換えられた。ＣＨＯ細胞に
トランスフェクションするために該構築物を用いた。

成熟、生物活性キメラＴＧＦ−β１／β２を生成、分泌
するトランスフェクシントを単離した。

（１）杜牲反逝去扶 （１，１）　ＤＮＡ　　’″ンスフエジョン１０ｈｄｈ
ｆｒ−欠失ＣＨＯ細胞を１００開培養皿に接種しておよ
そ２４時間後に、該培養物に、ｌｕｇのＮｄｅ　ｌ線状
化ｐ５β／ｄｈｆｒプラスミドおよびキャリアーとして
１９μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡを、リン酸カルシウム沈澱
（Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら、１９７！Ｌ　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：１３７３
−１３７６）として、トランスフェクションした。概説
すると、２０ｕｇのプラスミド及びキャリアーＤＮＡを
１　ｒｒｄｌの２５０ｍＭ　滅菌塩化カルシウムに添加
した。３′！；ＤＮＡ溶液（１ｍｆりを２　ＸＨＥＰＥ
Ｓ溶液（２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、　５０ｍＭ　ＨＥＰＥ
Ｓ、　１．５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，１）の１
　ｒｔｔｌに小量ずつ添加し、該混合液を３０分間氷上
に放置した。次いで沈澱を、１０−〇Ｆ１２培地を含む
細胞上に分散して滴下した。３７°Ｃ４時間インキュヘ
ーション後、培地を除去し、室温で９０秒間、２５％グ
リセＬ１−ルを含むＦ１２培地１０　ｍ（ｌと交換した
。細胞を２０ｍ１のＦ１２培地で−回すすぎ、非選択Ｆ
１２培地（２０ｍＲ）中で、さらに４８時間インキュベ
ートした。　ｄｈｆｒ発現トランスフェクタントの選択
は、培地をＩＯ％透析済みウシ胎児血清（ＦＢＳ）　（
Ｇｉｂｃｏ）及び１５０μｇ／ｍｊ！Ｌプロリンを添加
したＤＭＩＥＭと交換することによって行われた。該選
択培地で１０−１４日細胞を培養した後、コロニーが観
察された。

（１，２）メ　　レキセー　　　　　のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ｄｈｆｒ）増幅細胞は、基本的には（Ｇａ
ｓｓｅｒ、　Ｃ，Ｓ、およびＳｃｈｉｍｋｅ、　Ｒ。

Ｔ、、１９８６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２
６１：６９３Ｂ−６９４６）の記載にしたがってはじめ
のトランスフェクシントから誘導された。増殖後１０Ｓ
細胞が、１００ｍｍ培養皿に接種され、メトトレキセー
ト濃度の上昇（ＬＯＯｎＭ　；５００ｎＭ　；　２，５
００ｎＭ　；　ｔｏ、０００ｎＭ　　；　　２０．ＯＯ
ＯｎＭ）に適応させた。メトトレキセートの初発温度は
１１００ｎであった。目にみえるコロニーを含む平板を
トリプシン処理し、少なくともさらに２回の１：５細胞
継代の間、上記濃度のメトトレキセートに適応させた。

次いで、細胞（１０６）をつぎに高い濃度のメトトレキ
セートを含む１００ｎｕ＋＋　１＠養皿に接種した。

目にみえるコロニーを有する培養皿を再びトリプシン処
理し、培地を含むメトトレキセート中で適応させた。細
胞は、増幅の様々な段階で、４０％ＦＢＳ、１０％ジメ
チルスルフオキシドおよび５０％ＤＭＥＭ含有培地中で
凍結保存された。この凍結培地にはメトトレキセート・
は含まれない。

（１，３）底遣韮圓に乞ム１± ミンク肺上皮細胞、ＭｖｌＬｕ（寄託番号ＣＣＬ−６４
゜アメリカンタイプカルチャーコレクション）、はＴＧ
Ｆ−βに対してきわめて感受性であるが、これを成育阻
害アッセイに使用した。ア・ンセイは、ｆ）ＮＡ合合成
評価するためにチミジンアナログ５“−［１５■］ヨー
ド２″デオキシウリジン（”ｒｄｕ）を使用して行った
。活性の１ユニツトは、１ｓ１ｄＵの取り込みを非処理
ＣＣＬ−６４細胞と比較して５０％阻害するのに必要な
星と定義した。

活性ＴＧＦ−βｌ／β２の分泌についてトランスフェク
ションされた細胞を検定するために、気血清上清を細胞
の集密培養の一つの２４時間集団から集め、大容量の０
．２Ｍ酢酸に対して透析した。試料はアッセイのために
滅菌完全培地に希釈した。

（１，４）ペプチド配列　び−“　−・−ペプチドは固
相法によりベックマン９９０装置で合成され、すでに記
載されたように（Ｇｅｎｔｒｙ、　Ｌ。

Ｅ、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　
２５８：１１２１９−１１２２８　；Ｇｅｎｔｒｙ＋　
Ｌ、Ｅ、およびＬａｗｔｏｎ＋　Ａ、＋１９８６．　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ１５２：４２１−４３１）、樹脂から溶
離された。精製は調製用高速液体クロマトグラフィーで
行った。ペプチドの構造はアミノ酸分析によって確認さ
れた。

合成ペプチドはシスティン残基を介してウシガンマグロ
ブリンに複合された。カップリング反応は、基本的に記
載（Ｇｅｎｔｒｙ、　［Ｅ、およびＬａｗｔｏｎ。

Ａ、　、　１９８６．上記）の通り行われた。ペプチド
の複合効率は、ガンマグロブリン分子当り共有結合した
ペプチドが８から２６分子までの範囲であった。

フロイント完全アジュバント中に乳化させたペプチド複
合体（ペプチド１００μｇ当量）は、ニューシーラント
シロウサギに、皮下接種および皮肉接種を組み合わせて
３箇所から６箇所で注入された。追加接種は２−３週間
間隔で投与した。追加接種の後７−１４日で、採血した
。

ＴＧＦ−β１分子内のペプチド配列に向って指向する抗
ペプチド抗体は、免疫源として合成ペプチドを用いウサ
ギで作成された（Ｇｅｎ　ｔｒｙら、１９８７．　Ｍｏ
ｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：３４１８−３４２７）　
、該抗体のうちの一つ（抗−ＴＧＦ−β１　！６９−３
８１）はＴＧＦ−β成長因子の成熟型に存在するエピト
ープに向けられていた。

他の二つの抗体（抗−ＴＧＦ−βＩ　ｌ１ｌ−９４およ
び抗−ＴＧＦ−β１２□Ｓ−２ｆｆ６）は前駆体特異的
であり、ＴＧＦ−βｌの前駆体分子内にのみ存在するペ
プチド配列に向けられている。

（１，５）イムノプロ・・−ング タンパク質は、７．５％−１７，５％直直線度勾配５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で分画し、非修飾ニトロ
セルロース（０，４５μｍ　：　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
および５ｃｈｕｅｌｌ）に、４°Ｃ１２４Ｖ、１時間で
転移させた（ＢｕｒｎｅＬＬｅ、　Ｗ、Ｎ、、１９８１
＋　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２：１９５−２
０３）。ニトロセルロースの余剰の結合能力は、０．２
％ＮＰ−４０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で２
．５％ＢＬＯＴＴＯ（Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｄ、　Ａ、ら
、１９８４．　ＧｅｎｅＡｎａｌ、　Ｔｅｃｈｎ、　ｌ
：３−８）とインキュベートすることによってブロック
した。２．５％ＢＬＯＴＴＯ中ｌ：７５希釈のウサギ抗
血清を、ブロックされたニトロセルロースシートと共に
室温で２時間インキュベートした。２．５％ＢＬＯＴＴ
Ｏ中で５分間洗浄５回によって余分な抗体を洗い流した
後、該二トロセルロースシートは、２．５％ＢＬＯＴＴ
Ｏ中１　：　５００に希釈されたアルカリフォスファタ
ーゼ結合プロティンＡと共にインキュベートした。１時
間インキュベートした後、該ニトロセルロースシートは
０．２％ＮＰ−４０を含むＰＢＳ（５分間洗浄）で５回
洗浄し、展開された　（Ｌｅａｒｙ　ら、１９８３．　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：４０４５−４０４９）
。

キメラＴＧＦ−β１／β２タンパク質の合成をプログラ
ムするプラスミドを以下のように構築した。

ｐＡｃ３７３　（ＭｉｙａｍｏＬｏら、１９８５．　Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：２８６０−２８
６５ＨＭａｄｉｓｅｎら、１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ　１５８：２４８−２５０）から誘導されたバクロウ
ィルスベクターｐＡｃβＴＧＦ−１は、ｐＡｃ６１１　
（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、１９８５．　Ｍｏｆ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：２８６０−２８６５　Ｈ
Ｍａｄｉｓｅｎら、１９８７゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５
８：２４Ｂ−２５０）のＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ部位
にクローン化されたＴＧＦ−β１の１．４Ｋｂ力匹■−
影遼ＲＩコード配列（Ｓｈａｒｐｌｅｓら、１９８７．
　ＤＮＡ６　：２３９−２４４）を含むが、このｐＡｃ
βＴＧＦ−１をＢａｎ＋ＨＩおよびＥｃｏＲ■で消化し
、ＴＧＦ−βｌコード配列の３７５塩基対断片を単離し
た（断片ｌ）。ｐｓｖ　２−βＴＧＰ　　（Ｇｅｎｔｒ
ｙら、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
　７：３４１８−３４２７）を石！およびＥｃｏＲＩで
消化し、３．５Ｋｂ断片を単離した（断片２）。

下記に示す配列を持つ相補的合成ヌクレオチドを、アプ
ライドバイオシステムズ　オリゴヌクレオチドシンセサ
イザーで合或し、アクリルアミドゲルで猜製した。ホス
ファターゼをＴ４キナーゼと共に添加し、等モル澄のリ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。次いで、ア
ニールされた二木鎖合成ＤＮへは、上記断片Ｉｌ＋およ
び“２′に連結された。該連結反応混合液を、Ｅ、ｃｏ
ｌｉを形質転換するために使用し、５βｐＳＶ２　（七
＋ａ−Ｅｃｏ”）を単離した。

−ＣＡＡ　　ＣＡＴ　　ＣＴＧ　　ＣＡＡ　ＡＧＣＴＣ
ＣＣＧＧ　　ＣＡＣＣＧＣＣＧＡ　　ＧＣＣＣＴＧ　　
ＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡ　　ＡＡ
Ｔ　　ＧＴＧ　　ＣＡＧＧＡＴ　ＡＡＴ　ＴＧＣＴＧＣ
ＣＴＡ　ＣＧＴ　　ＣＣＧ　　ＣＴｒ　ＴＡＣＡＴＴ　
　ＧＡＴＴＴＣＡＡＧ　　ＡＧＧ　　ＧＡＴ　　ＣＴＡ
　ＧＧＧ　　ＴＧＧ　ＡＡＡ　ＴＧ　　−３’１ ＧＡＴ　　ＣＣＡ　ＴＴＴ　　ＣＣＡ　　ＣＣＣＴＡＧ
　　ＡＴＣＣＣＴ　ＣＴＴ　　ＧＡＡ　ＡＴＣ５βｐＳ
Ｖ２（ｊＬＬ−Ｅｃｏ”）をＥｃｏＲｌ　テ消化し、フ
レノウ醇素で充填し、ｌ１ｉｎｄｔｌｌで消化して、キ
メラＴＧＦ−βｌ／β２コード配列を含む１．４Ｋｂ断
片を単離した（断片３）、５βｐＳＶ２は、断片３をｐ
ＳＶ２に連結することにより構築され、このｐｓｖ　２
は、ｎｅ。

遺伝子を除去するためにｌ１ｉｎｄｌｌｌおよび石組１
で車前に消化しておいた。

５βｐＳＶ２をＥｃｏＲｌで消化し、フレノウ醇素で充
填し、ル膿１で消化して、２．６にｂの力独Ｉ−シ釧Ｒ
１（平滑）断片を単離し、さらにカ匡！およびＩ’ｖｕ
ｌｌで切断しておいたｐＳＶ２　／ｄｌ＋ｒｒ　ＣＧｅ
ｒｎＬｙら、１９８７゜Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．°Ｂｉｏ
１．７：３７１８−３７２７）に連結した。該連結反応
混合液を、！！、ｃｏ目を形質転換するために使用し、
ｐＩ５β／ｄｈｆｒを単離した。ｐ５β／ｄｈｆｒによ
りコードされるキメラＴＧＦ−β１／β２分子のヌクレ
オチド配列及び推定アミノ酸配列を第１図に示す。

（６，２）　ＣＨＯにお３るＴＧＰ−１２のｐ５β／ｄ
ｈｆｒは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされ、上
記実施例１の（１）に述べたように、単一のクローンが
メトトレキセートによって増幅された。このような増幅
されたクローンの−っ、ＣＨＯ−５β４１．２．５をさ
らなる特徴付けのために選択した。

ＣｌＯ−３β４１，２．５細胞は、２．５μＨメトトレ
キセート中で集密状態に成育された。培地を無血清培地
と交換し、２４時間後に集め、４８時間０．２Ｍ酢酸に
対して透析した。透析された順化培地上清は、上記実施
例１の（１，３）に記述されたように、ＣＣＬ−６４細
胞のＤＮＡ合成阻害によって、生物活性を検定された。

ＣｌＯ−３β４１．２．５細胞は約２■／Ｌの生物活性
キメラＴＧＦ−β１／β２を分泌する（第２図）。

コレらの細胞により分泌されるＴＧＦ−β関連タンバク
質を、上記実施例１の（１，５）に記述されたように成
熟ＴＧＦ−β１に対して向けられた抗−ペプチド抗体を
用いたイムノプロンティングによって分析した。第３図
は、非還元条件下、ＳＯＳ　−ＰＡＧ［Ｅで分析すると
、Ｃ１１０−５β４１，２．５細胞が、９０から１００
キロドルトン及び２４キロドルトンを泳動する免疫反応
性タンパク質を分泌していることを示す（第３　図、レ
ーンｉ）。２４キロドルトンのバンドは成熟ＴＧＦ−β
１／β２二量体を表し、９０から１００キロドルトンの
タンパク質はおそら＜　＋ｉｉｌ駆体配列体配列ルフィ
ド結合した成熟ＴＧＦ−β１／β２を示す（Ｇｅｎｔｒ
ｙら、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
　７：３４１Ｂ−３４２１）。

還元条件下では（第３図、レーン２）、タンパク質の大
部分は１２キロドルトンに泳動し、成熟ＴＧＦ−βｌ／
β２単量体を表す。サルＴＧＦ−βｌ遺伝子をコードす
るプラスミドをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞
中で発現される組換え体タンパク質についての同様の分
析において観察された４５から５５キロドルトンの範囲
の免疫反応性物質が存在しなかったこと（Ｇｅｎｔｒｙ
ら、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、７：３４１Ｂ−３４２７）は、キメラＴＧＦ
−β１／β２がその親分子であるＴＧＦ−β１に比べて
より効率的にタンパク質加水分解的なプロセシングを受
けることを示しており、注目すべきである。さらに、Ｃ
１１０−５β４１，２．５細胞はＴＧＦ−βを発現する
Ｃ１１０細胞に比べて２．５倍の生物活性な成熟タンパ
ク質を分泌する。これらの観察の基礎は現時点では不明
であるが、キメラＴＧＦ−β１／β２前駆体の２次構造
がＴＧＦ−β１の２次構造と著しく異なっており、この
２次構造によってキメラＴＧＦ−βｌ／β２が異なる強
度あるいは性質の分子的プロセシングを受けるものと思
われる。例えば、ＴＧＦ−β１／β２前ＩｎはＴＧＦ−
β１のプロセシングに関与する因子に対してより都合の
よい基質であるかも知れない。

あるいは、ＴＧＦ−β１／β２の２次構造の性質は、Ｔ
ＧＦ−β１／β２がＴＧＦ−βｌが利用できないような
他のプロセシングの因子あるいは経路と関与できるよう
にしているのかも知れない。

〔微生物の寄託〕

以下のトランスフェクシントがアメリカンタイプカルチ
ャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１−ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、　ＭＤに寄託され、示しである寄託番号を与え
られた。

スンスフェクー乙上　１１表まＶ　　−■Ｃｌｌ０−５
β４１．２．５　ＣＬ　５　　ｐ５β／ｄｈｆｒ　　　
ＣＲＬ−９９５９零発唄は、寄託された細胞系による範
囲、または発明の一局面の一つの例示として意図されこ
こに明示された実施態様による範囲に限定されることは
なく、機能的に等価な如何なるものも本発明の範囲内に
ある。実際、ここに示し記述した以外に様々な改変が、
前述の記述から、当業者にとって明らかになるであろう
。このような改変は、添付の請求の範囲内にあるものと
意図される。

また、ヌクレオチド及びペプチドに付されたあらゆる塩
基対及びアミノ酸残基の番号及びサイズは概数であり説
明の目的のために使用されたと理解される。

【図面の簡単な説明】

第１図２発現プラスミドｐ５β／ｄｈｆｒによりコード
されたＴＧＦ−β１／β２ハイブリツドタンパク質のヌ
クレオチド配列及び推定アミノ酸配列。 第２図、５β４１．２．５細胞由来順化培地の生物活性
。生物活性は、ＣＣＬ−６４Ｓンク肺上皮細胞の成育阻
害アッセイにより測定した。（Ａ）５β４１２．５細胞
により２４時間順化された無血清培地を０．２Ｍ酢酸に
対して透析し、下記実施例Ｉの（１，３）の記載にした
がって検定した。（Ｂ）　ＴＧＦ−βｌの標ｆ威育阻害
曲線。 第３図、５β４１．２．５細胞により分泌されたタンパ
ク質のイムノプロット分析。５β４１，２．５細胞は集
密状態まで成育させた；培地を０．２Ｍ酢酸に対して透
析し、非還元条件（レーン１）または還元条件（レーン
２）のもと、抗ＴＧＰ−β１１６？−：ｌ□を用いたイ
ムノブロッティングにより、実施例１の（１，５）の記
載にしたがって、検定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸番号約２７９からアミノ酸残基番号約３９
   ０までの、実質的に第１図に記述されたアミノ酸配列か
   らなるキメラ変換成長因子−β１／β２。 ２、ヌクレオチド残基番号約８３６からヌクレオチド残
   基番号約１１７０までの、実質的に第１図に記述された
   ヌクレオチド配列からなるキメラ変換成長因子−β１／
   β２をコードするヌクレオチド配列。 ３、ヌクレオチド残基番号約１からヌクレオチド残基番
   号約１１７０までの、実質的に第１図に記述されたヌク
   レオチドコード配列からなるキメラ変換成長因子−β１
   ／β２をコードするヌクレオチド配列。 ４、ヌクレオチド番号約８３６からヌクレオチド番号約
   １１７０までの、実質的に第１図に記述された、キメラ
   変換成長因子−β１／β２のヌクレオチドコード配列を
   含有する細胞。 ５、ヌクレオチド番号約１からヌクレオチド番号約１１
   ７０までの、実質的に第１図に記述された、キメラ変換
   成長因子−β１／β２のヌクレオチドコード配列を含有
   する細胞。 ６、細胞がキメラ変換成長因子−β１／β２を生産する
   ように遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の
   制御のもとに、ヌクレオチド番号約８３６からヌクレオ
   チド番号約１１７０までの、実質的に第１図に記述され
   た、キメラ変換成長因子−β１／β２のヌクレオチドコ
   ード配列を含有する細胞。 ７、細胞がキメラ変換成長因子−β１／β２を生産する
   ように遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の
   制御のもとに、ヌクレオチド番号約１からヌクレオチド
   番号約１１７０までの、実質的に第１０図に記述された
   、キメラ変換成長因子−β１／β２のヌクレオチドコー
   ド配列を含有する細胞。 ８、チャイニーズハムスター卵巣細胞からなる請求項第
   ６項または第７項記載の細胞。 ９、遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列がＳ
   Ｖ４０プロモーターを有してなる請求項第６項または第
   ７項記載の細胞。 １０、第二のヌクレオチド配列がプロモーターおよび選
   択マーカーのコード配列を有してなる請求項第６項また
   は第７項記載の細胞。 １１、該選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼを有
   してなる請求項第１０項記載の細胞。 １２、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託
   され、寄託番号ＣＲＬ−９９５９を有するＣＨＯ−５β
   ４１、２．５ＣＬ５からなる細胞系。 １３、（ａ）宿主細胞がキメラ変換成長因子−β１／β
   ２活性を有するペプチドまたはタンパク質を生産するよ
   うに遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の制
   御のもとに、ヌクレオチド番号約８３６からヌクレオチ
   ド番号約１１７０までの、実質的に第１図に記述された
   、キメラ変換成長因子−β１／β２のヌクレオチドコー
   ド配列を含有する宿主細胞を培養し、 （ｂ）該培養物からキメラ変換成長因子−β１／β２を
   回収すること、 からなるキメラ変換成長因子−β１／β２の製造方法。 １４、（ａ）宿主細胞がキメラ変換成長因子−β１／β
   ２活性を有するペプチドまたはタンパク質を生産するよ
   うに遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の制
   御のもとに、ヌクレオチド番号約１からヌクレオチド番
   号約１１７０までの、実質的に第１図に記述された、キ
   メラ変換成長因子−β１／β２のヌクレオチドコード配
   列を含有する宿主細胞を培養し、 （ｂ）該培養物からキメラ変換成長因子−β１／β２を
   回収すること、 からなるキメラ変換成長因子−β１／β２の製造方法。 １５、該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞を
   有してなる請求項第１３項または第１４項記載の方法。 １６、遺伝子発現を、調節する第二のヌクレオチド配列
   がＳＶ４０プロモーターを有してなる請求項第１３項ま
   たは第１４項記載の方法。 １７、第二のヌクレオチド配列がプロモーターおよび宿
   主細胞に欠失した選択マーカーのコード配列を有してな
   り、その結果キメラ変換成長因子−β１／β２コード配
   列を含む宿主細胞を同定できる、請求項第１３または第
   １４項記載の方法。 １８、該選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼを有
   してなる請求項第１７項記載の細胞。 １９、増幅されたレベルのジヒドロ葉酸レダクターゼお
   よびキメラ変換成長因子−β１／β２のコード配列を包
   含する耐性コロニーを選択するために、該宿主細胞をメ
   トトレキセートにさらすことからなる請求項第１８記載
   の方法。 ２０、（ａ）アメリカンタイプカルチャーコレクション
   に寄託され、寄託番号ＣＲＬ−９９５９を有するトラン
   スフェクタントＣＨＯ−５β４１、２．５ＣＬ５を培養
   し、 （ｂ）該培養物からキメラ変換成長因子−β１／β２を
   回収すること、 からなるキメラ変換成長因子−β１／β２の製造方法。 ２１、該トランスフェクタントがメトトレキセート存在
   下で培養される請求項第２０項記載の方法。