JPH0336520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血清中の総ビリルビンを酵素的に
定量する方法及びその定量用試薬組成物に関す
る。 更に詳しくはビリルビンオキシダーゼと反応促
進物質とを併用してヒト血清中総ビリルビンを定
量する方法及びその定量用試薬組成物に関する。 血清中に存在しているビリルビンの測定は高度
な臨床的意義を有しており、例えば黄疸等の鑑別
に利用されている。 〔従来の技術〕 従来、ビリルビンの定量法としてはビリルビン
とジアゾ試薬が反応して生ずるアゾビリルビンの
紅色を比色定量する方法（金井 泉：臨床検査法
提要、第28版、金原出版、ページＸ−24、昭和
53年）などの化学的方法が主として用いられてい
るが、この方法はジアゾ試薬がビリルビン以外の
血清成分と反応するため正確性に欠ける問題点が
ある。又、特開昭54−151193号公報にはアガリカ
スピスポラス菌の生産するビリルビンに性を有す
る酵素組成物を用いるビリルビンの測定法が開示
されているが、しかしながら、該測定法は試薬ビ
リルビンを基準として用いているのみでありヒト
血清中に存在する直接型、間接型いずれのビリル
ビンに作用するのかについては全く記載がない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明者等はこれらの現状に鑑み、鋭意研究を
続けた結果、酵素法によるヒト血清中の総ビリル
ビンの定量法を確立した。即ち本発明はビリルビ
ンオキシダーゼと反応促進物質を併用し、ヒト血
清中の総ビリルビンを定量する方法並ぶにその試
薬組成物に関する。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 以下本発明の定量法及び定量用組成物につき詳
細に説明する。ビリルビンの生体液中での存在は
グルクロン酸等と結合した直接型ビリルビン及び
アルブミンと結合した間接型ビリルビンに大別さ
れる（これらを総じて本明細書では総ビリルビン
と称する。）。総ビリルビンの定量はミロセシウム
属、コプリナス属菌の産生するビリルビンオキシ
ダーゼと反応促進物質との併用によつて生ずる直
接型及び間接型ビリルビンの減少を測定すること
により可能である。 ミロセシウム属菌の生産するビリルビンオキシ
ダーゼNS−１はその酵素化学的性質が特開昭60
−12032号に記載されていることから明らかのよ
うにアルブミンと結合した間接型ビリルビンには
作用しないが総ビリルビンを定量するには直接
型、間接型などのすべてのビリルビンを測定する
必要がある。そこで本発明者らはビリルビンオキ
シダーゼNS−１による総ビリルビンの定量法に
ついて研究した結果、意外にも界面活性剤、芳香
族カルボン酸、サルフア剤及びプロテアーゼの１
種又は２種以上を反応系に共存させることによ
り、間接型ビリルビンに作用して総ビリルビンの
定量が可能となることを見出した。これら添加剤
がどのような作用をもつているか明らかでない
が、いずれにしてもビリルビンオキシダーゼNS
−１と間接型ビリルビンの反応を促進させる働き
がある。従つてここではこれら添加剤を反応促進
物質という。これら反応促進物質の具体的な例と
しては、界面活性剤として、シヨ糖脂肪酸エステ
ル、胆汁酸、胆汁酸塩、ドデシル硫酸塩、ｐ−ト
ルエンスルホン酸、セチルピリジイニウムクロラ
イド、ノニルフエノールエトキシレート系、ポリ
オキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物系
など、芳香族カルボン酸としてはサリチル酸、ス
ルホリチル酸など、サルフア剤としてはスルフア
ニルアミド、アセトスルフアミンナトリウムな
ど、プロテアーゼとしてはプロナーゼＰ（科研化
学製）などがあげられる。 これら反応促進物質の効果を第１表に示す。即
ち、下記組成の反応液を37℃で反応させ、反応開
始後３分間の440nｍの吸収の減少を測定し、こ
れを１分間当りに補正した値を同表に示した。な
お基質として用いた間接型ビリルビンはデイド社
製のビリルビンコントロールである。 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンコントロール（20mg／dl） 20μ ビリルビンオキシダーゼNS−１（15u／ml）
20μ 反応促進物質（10％水溶液）（ただしプロナーゼ
Ｐは0.1％水溶液） 50μ

【表】 第１表からわかるように、反応促進物質として
特に好ましいのはコール酸ナトリウム、ドデシル
硫酸ナトリウム、サリチル酸である。これら反応
促進物質の反応液中での好適な濃度は、ドデシル
硫酸ナトリウム及びコール酸ナトリウムを例とし
て説明すると、第２表に示す通りである。なお方
法は前記第１表の方法に準じて行つた。

【表】 第２表から、ドデシル硫酸ナトリウムの場合は
反応液中で0.05〜0.1％の濃度が、又コール酸ナ
トリウムの場合は0.5〜0.7％の濃度が好適である
ことがわかる。 更に本発明の方法においてビリルビンオキシダ
ーゼによる総ビリルビン定量を実用的に有利に行
うための手段として反応促進物質の添加が起源を
異にするビリルビンオキシダーゼでも効果がある
か否か検討するため、前記ミロセシウム属菌の産
生するビリルビンオキシダーゼに反応促進物質を
併用する方法に加え、コプリナス属菌の生産する
ビリルビンオキシダーゼに反応促進剤を併用し
た。この結果、コプリナス属菌の生産するビリル
ビンオキシダーゼを用いた総ビリルビンの定量法
は反応促進物質はなくても反応するが、より反応
をすみやかに行うために添加するのが望ましいこ
とが判明した。即ち反応促進物質の併用効果はい
ずれの起源のビリルビンオキシダーゼでも認めら
れた。 次に、本発明の方法に使用するビリルビン定量
用試薬組成物について説明する。試薬組成物に含
まれる酵素量はビリルビンオキシダーゼ活性とし
てビリルビンオキシダーゼは0.01mu／ml〜20u／
mlが使用できる。そのうち最も好ましいのは0.01
〜10u／ml（反応液中）である。反応促進物質は
例えばドデシル硫酸ナトリウムの場合は反応液中
で0.02〜0.2％、好ましくは0.05〜0.1％、コール
酸ナトリウムの場合は同じく、0.1〜1.0％、好ま
しくは0.5〜0.7％である。その他緩衝液、酵素の
安定剤などは必要に応じて加えればよい。 以下、酵素の活性測定法、試験例並びに実施例
を説明する。 ビリルビンオキシダーゼ活性測定法 エチレンジアミン四酢酸１ｍＭを含む0.2M−
トリス塩酸緩衝液（PH8.4）250mlに試薬ビリルビ
ン（和光純薬製）５mgを溶解し、この２mlと酵素
液0.2mlを37℃で反応させ440nｍの吸光度の減少
を測定する。１分間に１マイクロモルのビリルビ
ンを酸化する酵素量を１単位とする。 試験例 １ ビリルビンオキシダーゼNS−１の調製 ミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium
verrucaria）MT−１（FERM−BP No.653）株
をグルコース・ジヤガイモ培地に培養し、ビリル
ビンオキシダーゼNS−１を含む培養液を得た。
該培養液を順次硫安分析、透析、活性炭処理、
QAE−セフアデツクスＡ−50カラムクロマトグ
ラフイー、限外ろ過及びセフアデツクスＧ−100
カラムクロマトグラフイーを行い精製ビリルビン
オキシダーゼNS−１を得た。本標品はポリアク
リルアミドゲルデイスク電気泳動的に単一であつ
た。 試験例 ２ コプリナス属菌の産するビリルビンオキシダー
ゼの調製 コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）
IFO8371株をポテト・グルコース培地に培養し、
該培養液を順次、硫安分析、透析、DEAE−セル
ロースカラムクロマトグラフイー、DEAE−セフ
アロースカラムクロマトグラフイー、限外ろ過、
セフアデツクスＧ−100カラムクロマトグラフイ
ーを行い精製ビリルビンオキシダーゼを得た。本
酵素は至適温度が30℃付近にあり、等電点は3.8
である。そしてその他の酵素化学的性質はミロセ
シウム属菌産生のビリルビンオキシダーゼNS−
１に似ている。 試験例 ３ コプリナス属菌の産するビリルビンオキシダー
ゼを用いる総ビリルビン測定におけるコール酸
ナトリウムの効果 下記組成(1)及び(2)の反応液を37℃で反応させ、
反応後の格時間（分）における440nｍの吸収の
減少を測定した。 その結果は第２図に示される。 反応液(1) 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0） 3.0ml コプリナス属菌のビリルビンオキシダーゼ
0.15単位 コール酸ナトリウム 0.6％ 血 清 100μｍ 反応液(2) 反応液(1)よりコール酸ナトリウムを除いたもの
を使用。 第２図より明らかのようにコール酸ナトリウム
の存在下で反応促進効果が認められる。 試験例 ４ 各種酵素の基質特異性 本発明のビリルビンオキシダーゼの基質特異性
を測定した。酵素は試験例１〜２で調製したビリ
ルビンオキシダーゼNS−１（Ａと略称、以下同
様）、コプリナス属菌の生産するビリルビンオキ
シダーゼＢを用いた。第３表に示した７ｍＭ濃度
の各種基質（ビリルビンは非抱合非結合型のもの
を使用）と上記酵素の一定量とを37℃で反応させ
酵素活性を測定した。結果を第３表に示す。同表
には各基質に対する最高の活性を示す酵素を100
とした相対活性で表示した。

〔発明の効果〕

本発明によりビリルビンオキシダーゼを用いた
酵素法による総ビリルビンの測定法が初めて完成
されたのであり、これにより、日常の臨床検査に
おける黄疸等の診断が容易になつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用する酵素をビリルビンに
作用させたときの吸収パターンの変化を表わすも
のである。第２図はコプリナス属菌の産するビリ
ルビンオキシダーゼを用いる 総ビリルビン測定
におけるコール酸ナトリウムの反応促進効果を示
すものであり、第３図はビリルビンの検量線を表
わす図である。第４図は本発明の試薬組成物中の
ビリルビンオキシダーゼNS−１の量と反応速度
を表わす図である。第５図及び第６図は本発明の
方法とジアゾ法による血清中総ビリルビンの定量
結果の関係をそれぞれ表わす図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト血清にビリルビンオキシダーゼと界面活
   性剤、芳香族カルボン酸、サルフア剤及びプロテ
   アーゼよりなる群から選ばれる１種又は２種以上
   の反応促進物質とを併用して作用させ、ヒト血清
   中のビリルビンの変化を光学的に測定することを
   特徴とするヒト血清総ビリルビンの定量法。 ２ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属又
   はコプリナス属に属する菌株の産生する酵素であ
   る特許請求の範囲第１項記載のヒト血清総ビリル
   ビンの定量法。 ３ ビリルビンオキシダーゼと界面活性剤、芳香
   族カルボン酸、サルフア剤及びプロテアーゼより
   なる群から選ばれる１種又は２種以上の反応促進
   物質とを含んでなるヒト血清総ビリルビン定量用
   試薬組成物。 ４ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属又
   はコプリナス属に属する菌株の産生する酵素であ
   る特許請求の範囲第３項記載の定量用試薬組成
   物。