JPS6233880B2 - - Google Patents
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- JPS6233880B2 JPS6233880B2 JP57127632A JP12763282A JPS6233880B2 JP S6233880 B2 JPS6233880 B2 JP S6233880B2 JP 57127632 A JP57127632 A JP 57127632A JP 12763282 A JP12763282 A JP 12763282A JP S6233880 B2 JPS6233880 B2 JP S6233880B2
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は被検液、特に血液、尿など生体液中の
ビリルビンを酵素的に定量する方法及びその定量
用試薬組成物に関する。具体例としてはミロセシ
ウム属菌の産するビリルビンオキシダーゼによる
直接型ビリルビンを定量する方法、ならびに該菌
株などの産するビリルビンオキシダーゼと界面活
性剤、芳香族カルボン酸、サルフア剤及びプロテ
アーゼよりなる群から選ばれる１種又は２種以上
の反応促進物質（以下単に反応促進物質という）
による総ビリルビンを定量する方法及びそれらの
定量用試薬組成物に関する。 ビリルビンは胆汁中に最も多く存在する色素
で、正常人では血清中に約１mg／dl以下含まれ
る。血清中では主にグルクロン酸と結合した直接
型ビリルビン（抱合型ビリルビン）又はアルブミ
ンと結合した間接型ビリルビン（非抱合型、遊離
型ビリルビン）として存在し、非抱合非結合型の
ビリルビンは生理的PH（PH7.4）では水に不溶性
であるのでほとんど存在しない。尿中では直接型
ビリルビンが主である。 直接型ビリルビン、間接型ビリルビンを分別定
量する意義は、血清、尿など生体液中のビリルビ
ンの増加が何に起因するかを知る上で重要であ
る。すなわち、直接型ビリルビンの増加は肝細胞
障害、肝内胆汁うつ滞、肝外性胆汁うつ滞などが
予想され、間接型ビリルビンの増加はビリルビン
の生成増加、肝処理機能異常などによることが考
えられている。 従来、ビリルビンの分別定量法としては、ビリ
ルビンとジアゾ試薬が反発して生ずるアゾビリル
ビンの紅色を比色定量する方法（金井泉：臨床検
査法提要、第28版、金原出版、ページXII−24、昭
和53年）などの化学的方法が主として用いられて
いる。この方法はジアゾ試薬がビリルビン以外の
血清成分と反応するため正確性に欠けることがあ
る。 又、ビリルビンに反応する酵素の例としては、
ユーロピアジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（Eur.J.Biochem）、第10巻、468〜473ページ
（1969年）に、ギニアピツグのヘモグロビン、チ
トクロームＣ、同じく脳、肝臓、心臓などの組織
中のオキシダーゼ、及びホースラデイシユのパー
オキシダーゼ、牛乳のキサンチンオキシダーゼに
ビリルビン酸化能のあることが記載されている。
これら酵素は、キサンチンオキシダーゼを除いて
過酸化水素の存在により活性化される。反応生成
物に過酸化水素が含まれるか否かは記載がない。
又、特開昭54−151193号公報にはアガリカスビス
ポラス菌の生産するビリルビンに活性を有する酵
素組成物について記載されている。該酵素組成物
はビリルビンに反応し、反応生成物は510nｍの
最大吸収を有し、450nｍの励起波長により525n
ｍの螢光を発する物質及び過酸化水素である。し
かしながら、直接型、間接型いずれのビリルビン
に作用するのかについては全く記載がない。 本発明者等はこれらの現状に鑑み、鋭意研究を
続けた結果、新規酵素ビリルビンオキシダーゼを
発見（本酵素は国際生化学連合委員会により
EC1.3.3.5と登録された。）するとともに酵素法測
定による生体中、特に血清中のビリルビンの分別
定量法を見出した。すなわち、本発明の方法は、
被検液にミロセシウム属菌の産生するビリルビン
オキシダーゼを作用させることを特徴とする直接
型ビリルビンの定量法及び本ビリルビンオキシダ
ーゼと反応促進物質を作用させるか、又はコプリ
ナス属菌の産生するビリルビンオキシダーゼを作
用させることを特徴とする総ビリルビンの定量法
に関する。間接型ビリルビン量は総ビリルビン量
から直接型ビリルビン量を減ずることにより求め
られる。 以下本発明の定量法及び定量用組成物につき詳
細に説明すると、ビリルビンの生体液中での存在
は、前記のように、グルクロン酸等と結合した直
接型ビリルビン及びアルブミンと結合した間接型
ビリルビンに大別される。 直接型ビリルビンの定量は、ミロセシウム属菌
の産生するビリルビンオキシダーゼの作用によつ
て生ずるビリルビンの減少又は反応生成物である
ビリベルジンの増加を測定することにより可能で
ある。本酵素は間接型ビリルビンには作用しな
い。本酵素の例としては特願昭57−25613号に示
されるミロセシウム・ベルカリアMT−１
（Myrothecium verrucaria MT−１）、FERM−
BP No.653（FERM−Ｐ No.5918）の生産する
ビリルビンオキシダーゼNS−１があげられる。
本ビリルビンオキシダーゼNS−１は下記の性質
をもつ。 (1) 作用：ビリルビンを分子状酸素の存在下に酸
下し、緑色物質、淡緑色物質を経て淡紫色物質
を生成するも過酸化水素を生成しない。 (2) 基質特異性：直接型ビリルビンに反応する。
間接型ビリルビンには反応しない。ビリベルジ
ン、ヘミン、ヘマトポルフイリン、クロロフイ
リンには若干反応する。ヘモグロビン、クロロ
フイル、ビタミンB12には反応しない。 (3) 温度およびPH安定性：PH8.0（0.1Mリン酸緩
衝液）、50℃、15分処理で90％以上残存し、70
℃、15分では失活する。37℃、60分処理におい
てPH５〜PH10.5の間で95％以上残存する。 (4) 至適温度：40℃付近。 (5) 至適PH：６〜７ (6) 分子量：約52000（ゲル瀘過法） (7) 等電点：PI＝4.1 (8) 金属イオンの影響：Ｆ２＋ ｅにより著しく阻害さ
れる。 (9) 阻害剤等の影響：シアン化カリウム、アジ化
ナトリウム、チオ尿素によつて阻害される。 (10) 可視部吸収：375nｍおよび460nｍ付近に吸
収極大がない。 直接型ビリルビンの定量法について、ビリルビ
ンオキシダーゼNS−１を用いた場合を例として
説明する。すなわち、本酵素0.1〜1.0単位を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）３mlと検液100
μを37℃で反応させ、ビリルビンの減少を
440nｍの吸収の減少から、あるいは反応で生じ
たビリベルジンの増加を330nｍ又は380nｍの吸
収の増大から測定する。検液として標準のビリル
ビン溶液（試薬ビリルビンをアルカリ水溶液に溶
解後PH8.4に調整したもの）を使用した場合の反
応前、後の吸収パターンの変化を第１図に示す。
ビリルビンの最大吸収波長は440nｍ付近にあ
り、反応の結果生ずるビリベルジンは330nｍ及
び380nｍ付近に最大吸収波長が存在する。同図
からわかるように、330nｍ又は380nｍの吸収の
変化による測定は、分子吸光係数がビリルビンの
もつ440nｍの吸収の半分以下であり、感度が低
いため、正確な測定には好ましくない。 次に総ビリルビンの定量法について詳細に説明
する。前記のミロセシウム属菌の生産するビリル
ビンオキシダーゼNS−１はアルブミンと結合し
た間接型ビリルビンには作用しない。総ビリルビ
ンを定量するには直接型、間接型などのすべての
ビリルビンを測定する必要がある。本発明者らは
ビリルビンオキシダーゼNS−１による総ビリル
ビンの定量法について研究した結果、意外にも界
面活性剤、芳香族カルボン酸、サルフア剤又はプ
ロテアーゼを反応系に共存させることにより、間
接型ビリルビンに作用して総ビリルビンの定量が
可能となることを見出した。これら添加剤がどの
ような作用をもつているか明らかでないが、いず
れにしてもビリルビンオキシダーゼNS−１と間
接型ビリルビンの反応を促進させる働きがある。
これら反応促進物質の具体的な例としては、界面
活性剤としてシヨ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、
ドデシル硫酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸、セチ
ルピリジニウムクロライド、ノニルフエノールエ
トキシレート系、ポリオキシエチレン−ポリオキ
シプロピレン縮合物系など、芳香族カルボン酸と
してはサリチル酸、スルホサリチル酸など、サル
フア剤としてはスルフアニルアミド、アセトスル
フアミンナトリウムなど、プロテアーゼとしては
プロナーゼＰ（科研化学製）などがあげられる。 これら反応促進物質の効果を第１表に示す。す
なわち、下記組成の反応液を37℃で反応させ、反
応開始後３分間の440nｍの吸収の減少を測定
し、これを１分間当りに補正した値を同表に示し
た。なお基質として用いた間接型ビリルビンはデ
イド社製のビリルビンコントロールである。 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンコントロール（20mg／dl） 20μ ビリルビンオキシダーゼNS−１（15μ／ml）
20μ 反応促進物質（10％水溶液） 50μ （ただしプロナーゼＰは0.1％水溶液）
ビリルビンを酵素的に定量する方法及びその定量
用試薬組成物に関する。具体例としてはミロセシ
ウム属菌の産するビリルビンオキシダーゼによる
直接型ビリルビンを定量する方法、ならびに該菌
株などの産するビリルビンオキシダーゼと界面活
性剤、芳香族カルボン酸、サルフア剤及びプロテ
アーゼよりなる群から選ばれる１種又は２種以上
の反応促進物質（以下単に反応促進物質という）
による総ビリルビンを定量する方法及びそれらの
定量用試薬組成物に関する。 ビリルビンは胆汁中に最も多く存在する色素
で、正常人では血清中に約１mg／dl以下含まれ
る。血清中では主にグルクロン酸と結合した直接
型ビリルビン（抱合型ビリルビン）又はアルブミ
ンと結合した間接型ビリルビン（非抱合型、遊離
型ビリルビン）として存在し、非抱合非結合型の
ビリルビンは生理的PH（PH7.4）では水に不溶性
であるのでほとんど存在しない。尿中では直接型
ビリルビンが主である。 直接型ビリルビン、間接型ビリルビンを分別定
量する意義は、血清、尿など生体液中のビリルビ
ンの増加が何に起因するかを知る上で重要であ
る。すなわち、直接型ビリルビンの増加は肝細胞
障害、肝内胆汁うつ滞、肝外性胆汁うつ滞などが
予想され、間接型ビリルビンの増加はビリルビン
の生成増加、肝処理機能異常などによることが考
えられている。 従来、ビリルビンの分別定量法としては、ビリ
ルビンとジアゾ試薬が反発して生ずるアゾビリル
ビンの紅色を比色定量する方法（金井泉：臨床検
査法提要、第28版、金原出版、ページXII−24、昭
和53年）などの化学的方法が主として用いられて
いる。この方法はジアゾ試薬がビリルビン以外の
血清成分と反応するため正確性に欠けることがあ
る。 又、ビリルビンに反応する酵素の例としては、
ユーロピアジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（Eur.J.Biochem）、第10巻、468〜473ページ
（1969年）に、ギニアピツグのヘモグロビン、チ
トクロームＣ、同じく脳、肝臓、心臓などの組織
中のオキシダーゼ、及びホースラデイシユのパー
オキシダーゼ、牛乳のキサンチンオキシダーゼに
ビリルビン酸化能のあることが記載されている。
これら酵素は、キサンチンオキシダーゼを除いて
過酸化水素の存在により活性化される。反応生成
物に過酸化水素が含まれるか否かは記載がない。
又、特開昭54−151193号公報にはアガリカスビス
ポラス菌の生産するビリルビンに活性を有する酵
素組成物について記載されている。該酵素組成物
はビリルビンに反応し、反応生成物は510nｍの
最大吸収を有し、450nｍの励起波長により525n
ｍの螢光を発する物質及び過酸化水素である。し
かしながら、直接型、間接型いずれのビリルビン
に作用するのかについては全く記載がない。 本発明者等はこれらの現状に鑑み、鋭意研究を
続けた結果、新規酵素ビリルビンオキシダーゼを
発見（本酵素は国際生化学連合委員会により
EC1.3.3.5と登録された。）するとともに酵素法測
定による生体中、特に血清中のビリルビンの分別
定量法を見出した。すなわち、本発明の方法は、
被検液にミロセシウム属菌の産生するビリルビン
オキシダーゼを作用させることを特徴とする直接
型ビリルビンの定量法及び本ビリルビンオキシダ
ーゼと反応促進物質を作用させるか、又はコプリ
ナス属菌の産生するビリルビンオキシダーゼを作
用させることを特徴とする総ビリルビンの定量法
に関する。間接型ビリルビン量は総ビリルビン量
から直接型ビリルビン量を減ずることにより求め
られる。 以下本発明の定量法及び定量用組成物につき詳
細に説明すると、ビリルビンの生体液中での存在
は、前記のように、グルクロン酸等と結合した直
接型ビリルビン及びアルブミンと結合した間接型
ビリルビンに大別される。 直接型ビリルビンの定量は、ミロセシウム属菌
の産生するビリルビンオキシダーゼの作用によつ
て生ずるビリルビンの減少又は反応生成物である
ビリベルジンの増加を測定することにより可能で
ある。本酵素は間接型ビリルビンには作用しな
い。本酵素の例としては特願昭57−25613号に示
されるミロセシウム・ベルカリアMT−１
（Myrothecium verrucaria MT−１）、FERM−
BP No.653（FERM−Ｐ No.5918）の生産する
ビリルビンオキシダーゼNS−１があげられる。
本ビリルビンオキシダーゼNS−１は下記の性質
をもつ。 (1) 作用：ビリルビンを分子状酸素の存在下に酸
下し、緑色物質、淡緑色物質を経て淡紫色物質
を生成するも過酸化水素を生成しない。 (2) 基質特異性：直接型ビリルビンに反応する。
間接型ビリルビンには反応しない。ビリベルジ
ン、ヘミン、ヘマトポルフイリン、クロロフイ
リンには若干反応する。ヘモグロビン、クロロ
フイル、ビタミンB12には反応しない。 (3) 温度およびPH安定性：PH8.0（0.1Mリン酸緩
衝液）、50℃、15分処理で90％以上残存し、70
℃、15分では失活する。37℃、60分処理におい
てPH５〜PH10.5の間で95％以上残存する。 (4) 至適温度：40℃付近。 (5) 至適PH：６〜７ (6) 分子量：約52000（ゲル瀘過法） (7) 等電点：PI＝4.1 (8) 金属イオンの影響：Ｆ２＋ ｅにより著しく阻害さ
れる。 (9) 阻害剤等の影響：シアン化カリウム、アジ化
ナトリウム、チオ尿素によつて阻害される。 (10) 可視部吸収：375nｍおよび460nｍ付近に吸
収極大がない。 直接型ビリルビンの定量法について、ビリルビ
ンオキシダーゼNS−１を用いた場合を例として
説明する。すなわち、本酵素0.1〜1.0単位を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）３mlと検液100
μを37℃で反応させ、ビリルビンの減少を
440nｍの吸収の減少から、あるいは反応で生じ
たビリベルジンの増加を330nｍ又は380nｍの吸
収の増大から測定する。検液として標準のビリル
ビン溶液（試薬ビリルビンをアルカリ水溶液に溶
解後PH8.4に調整したもの）を使用した場合の反
応前、後の吸収パターンの変化を第１図に示す。
ビリルビンの最大吸収波長は440nｍ付近にあ
り、反応の結果生ずるビリベルジンは330nｍ及
び380nｍ付近に最大吸収波長が存在する。同図
からわかるように、330nｍ又は380nｍの吸収の
変化による測定は、分子吸光係数がビリルビンの
もつ440nｍの吸収の半分以下であり、感度が低
いため、正確な測定には好ましくない。 次に総ビリルビンの定量法について詳細に説明
する。前記のミロセシウム属菌の生産するビリル
ビンオキシダーゼNS−１はアルブミンと結合し
た間接型ビリルビンには作用しない。総ビリルビ
ンを定量するには直接型、間接型などのすべての
ビリルビンを測定する必要がある。本発明者らは
ビリルビンオキシダーゼNS−１による総ビリル
ビンの定量法について研究した結果、意外にも界
面活性剤、芳香族カルボン酸、サルフア剤又はプ
ロテアーゼを反応系に共存させることにより、間
接型ビリルビンに作用して総ビリルビンの定量が
可能となることを見出した。これら添加剤がどの
ような作用をもつているか明らかでないが、いず
れにしてもビリルビンオキシダーゼNS−１と間
接型ビリルビンの反応を促進させる働きがある。
これら反応促進物質の具体的な例としては、界面
活性剤としてシヨ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、
ドデシル硫酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸、セチ
ルピリジニウムクロライド、ノニルフエノールエ
トキシレート系、ポリオキシエチレン−ポリオキ
シプロピレン縮合物系など、芳香族カルボン酸と
してはサリチル酸、スルホサリチル酸など、サル
フア剤としてはスルフアニルアミド、アセトスル
フアミンナトリウムなど、プロテアーゼとしては
プロナーゼＰ（科研化学製）などがあげられる。 これら反応促進物質の効果を第１表に示す。す
なわち、下記組成の反応液を37℃で反応させ、反
応開始後３分間の440nｍの吸収の減少を測定
し、これを１分間当りに補正した値を同表に示し
た。なお基質として用いた間接型ビリルビンはデ
イド社製のビリルビンコントロールである。 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンコントロール（20mg／dl） 20μ ビリルビンオキシダーゼNS−１（15μ／ml）
20μ 反応促進物質（10％水溶液） 50μ （ただしプロナーゼＰは0.1％水溶液）
【表】
第１表からわかるように、反応促進物質として
特に好ましいのはコール酸ナトリウム、ドデシル
硫酸ナトリウム、サリチル酸である。これら反応
促進物質の反応液中での好適な濃度は、ドデシル
硫酸ナトリウム及びコール酸ナトリウムを例とし
て説明すると、第２表に示す通りである。なお方
法は前記第１表の方法に準じて行つた。
特に好ましいのはコール酸ナトリウム、ドデシル
硫酸ナトリウム、サリチル酸である。これら反応
促進物質の反応液中での好適な濃度は、ドデシル
硫酸ナトリウム及びコール酸ナトリウムを例とし
て説明すると、第２表に示す通りである。なお方
法は前記第１表の方法に準じて行つた。
【表】
第２表から、ドデシル硫酸ナトリウムの場合は
反応液中で0.05〜0.1％の濃度が、又コール酸ナ
トリウムの場合は0.5〜0.7％の濃度が好適である
ことがわかる。 本発明の方法において総ビリルビンを定量する
方法としては、前記ミロセシウム属菌の産生する
ビリルビンオキシダーゼに反応促進物質を併用す
る方法に加え、コプリナス属菌の生産するビリル
ビンオキシダーゼを利用した方法が提供できる。
コプリナス属菌の生産するビリルビンオキシダー
ゼを用いた総ビリルビンの定量法は反応促進物質
はなくてもよいが、より反応をすみやかに行うた
めに添加するのが望ましい。 本発明の方法に使用するビリルビン定量用試薬
組成物について説明する。試薬組成物に含まれる
酵素量はビリルビンオキシダーゼ活性として0.01
ｍｕ／ml〜20u／mlが使用できる。最も好ましい
のはビリルビンオキシダーゼは反応液中で0.01〜
10u／mlであるが、測定時間に応じて適宜調節す
ればよい。反応促進物質は例えばドデシル硫酸ナ
トリウムの場合は反応液中で0.02％〜0.2％、好
ましくは0.05〜0.1％、コール酸ナトリウムの場
合は同じく0.1〜1.0％、好ましくは0.5〜0.7％で
ある。その他緩衝液、酵素の安定剤などは必要に
応じて加えればよい。 以下、酵素の活性測定法、試験例、並に実施例
を説明する。 ビリルビンオキシダーゼ活性測定法 エチレンジアミン四酢酸１ｍＭを含む0.2M−
トリス塩酸緩衝液（PH8.4）250mlに試薬ビリルビ
ン（和光純薬製）５mgを溶解し、この２mlと酵素
液0.2mlを37℃で反応させ440nｍの吸光度の減少
を測定する。１分間に１マイクロモルのビリルビ
ンを酸化する酵素量を１単位とする。 試験例 １ ビリルビンオキシダーゼNS−１の調製 ミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium
Verrucaria）MT−１、FERM−BP No.653
（FERM−Ｐ No.5918）株をグルコース・ジヤ
ガイモ培地に培養し、ビリルビンオキシダーゼ
NS−１を含む培養液を得た。該培養液を順次硫
安塩析、透析、活性炭処理、QAE−セフアデツ
クスＡ−50カラムクロマトグラフイー、限外瀘過
及びセフアデツクスＧ−100カラムクロマトグラ
フイーを行い精製ビリルビンオキシダーゼNS−
１を得た。本標品はポリアクリルアミドゲルデイ
スク電気泳動的に単一であつた。 試験例 ２ コプリナス属菌の産するビリルビンオキシダー
ゼの調製 コプリナス・シネレウス（Coprinus
cinereus）IFO8371株をポテト・グルコース培地
に培養し、ビリルビンオキシダーゼ活性を含む培
養液を得た。該培養液を順次、硫安塩析、透析、
DEAE−セルロースカラムクロマトグラフイー、
DEAE−セフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、限外瀘過、セフアデツクスＧ−100カラムク
ロマトグラフイーを行い精製ビリルビンオキシダ
ーゼを得た。 本酵素の性質は前述ミロセシウム属菌産生のビ
リルビンオキシダーゼNS−１に似ているが、至
適温度は30℃付近、等電点は3.8であつた。 試験例 ３ ポリポラス属菌の産するラツカーゼの調製 ポリポラス・ベルシカラー（Polyporus
versicolor）IFO9791株をグルコース、Ｌ−アス
パラギン、DL−フエニルアラニン、アデニン、
チアミンおよび無機塩を含有する培地に培養しラ
ツカーゼ活性を含む培養液を得た。該培養液を順
次、硫安塩析、透析、限外瀘過、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムクロマトグラフイー、限外
瀘過、及びセフアデツクスＧ−100カラムクロマ
トグラフイーを行い精製標品を得た。本標品はデ
イスク電気泳動的に単一であつた。 試験例 ４ マツシユルーム起源のチロシナーゼの調製 シグマ社製チロシナーゼ（グレイド）を用
い、これをさらにDEAE−セフアデツクスＡ−50
カラムクロマトグラフイー、ハイドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフイー、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムクロマトグラフイーを行い
精製標品を得た。本標品はデイスク電気泳動的に
約90％の純度であつた。 試験例 ５ ウルシラツカーゼの調製 ウルシの汁液を塩析、透析、限外瀘過後セフア
デツクスＧ−200カラムクロマトグラフイーを行
い部分精製標品を得た。 試験例 ６ 各種酵素の基質特異性 本発明の方法に用いられるビリルビンオキシダ
ーゼと他の類似酵素の差を明確にするため基質特
異性について検討した。酵素は試験例１〜４で調
製したビリルビンオキシダーゼNS−１（Ａと略
称、以下同様）、コプリナス属菌の生産するビリ
ルビンオキシダーゼ(B)、ポリポラス属菌の生産す
るラツカーゼ(C)、マツシユルーム起源のチロシナ
ーゼ(E)ならびにウルシ起源のラツカーゼ(D)及びき
ゆうり起源のアスコルビン酸オキシダーゼ（東洋
紡績製、グレイド）(F)を用いた。第３表に示し
た７ｍＭ濃度の各種基質（ビリルビンは非抱合非
結合型のものを使用）と上記酵素の一定量とを37
℃で反応させ酵素活性を測定した。結果を第３表
に示す。同表には各基質に対する最高の活性を示
す酵素を100とした相対活性で表示した。
反応液中で0.05〜0.1％の濃度が、又コール酸ナ
トリウムの場合は0.5〜0.7％の濃度が好適である
ことがわかる。 本発明の方法において総ビリルビンを定量する
方法としては、前記ミロセシウム属菌の産生する
ビリルビンオキシダーゼに反応促進物質を併用す
る方法に加え、コプリナス属菌の生産するビリル
ビンオキシダーゼを利用した方法が提供できる。
コプリナス属菌の生産するビリルビンオキシダー
ゼを用いた総ビリルビンの定量法は反応促進物質
はなくてもよいが、より反応をすみやかに行うた
めに添加するのが望ましい。 本発明の方法に使用するビリルビン定量用試薬
組成物について説明する。試薬組成物に含まれる
酵素量はビリルビンオキシダーゼ活性として0.01
ｍｕ／ml〜20u／mlが使用できる。最も好ましい
のはビリルビンオキシダーゼは反応液中で0.01〜
10u／mlであるが、測定時間に応じて適宜調節す
ればよい。反応促進物質は例えばドデシル硫酸ナ
トリウムの場合は反応液中で0.02％〜0.2％、好
ましくは0.05〜0.1％、コール酸ナトリウムの場
合は同じく0.1〜1.0％、好ましくは0.5〜0.7％で
ある。その他緩衝液、酵素の安定剤などは必要に
応じて加えればよい。 以下、酵素の活性測定法、試験例、並に実施例
を説明する。 ビリルビンオキシダーゼ活性測定法 エチレンジアミン四酢酸１ｍＭを含む0.2M−
トリス塩酸緩衝液（PH8.4）250mlに試薬ビリルビ
ン（和光純薬製）５mgを溶解し、この２mlと酵素
液0.2mlを37℃で反応させ440nｍの吸光度の減少
を測定する。１分間に１マイクロモルのビリルビ
ンを酸化する酵素量を１単位とする。 試験例 １ ビリルビンオキシダーゼNS−１の調製 ミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium
Verrucaria）MT−１、FERM−BP No.653
（FERM−Ｐ No.5918）株をグルコース・ジヤ
ガイモ培地に培養し、ビリルビンオキシダーゼ
NS−１を含む培養液を得た。該培養液を順次硫
安塩析、透析、活性炭処理、QAE−セフアデツ
クスＡ−50カラムクロマトグラフイー、限外瀘過
及びセフアデツクスＧ−100カラムクロマトグラ
フイーを行い精製ビリルビンオキシダーゼNS−
１を得た。本標品はポリアクリルアミドゲルデイ
スク電気泳動的に単一であつた。 試験例 ２ コプリナス属菌の産するビリルビンオキシダー
ゼの調製 コプリナス・シネレウス（Coprinus
cinereus）IFO8371株をポテト・グルコース培地
に培養し、ビリルビンオキシダーゼ活性を含む培
養液を得た。該培養液を順次、硫安塩析、透析、
DEAE−セルロースカラムクロマトグラフイー、
DEAE−セフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、限外瀘過、セフアデツクスＧ−100カラムク
ロマトグラフイーを行い精製ビリルビンオキシダ
ーゼを得た。 本酵素の性質は前述ミロセシウム属菌産生のビ
リルビンオキシダーゼNS−１に似ているが、至
適温度は30℃付近、等電点は3.8であつた。 試験例 ３ ポリポラス属菌の産するラツカーゼの調製 ポリポラス・ベルシカラー（Polyporus
versicolor）IFO9791株をグルコース、Ｌ−アス
パラギン、DL−フエニルアラニン、アデニン、
チアミンおよび無機塩を含有する培地に培養しラ
ツカーゼ活性を含む培養液を得た。該培養液を順
次、硫安塩析、透析、限外瀘過、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムクロマトグラフイー、限外
瀘過、及びセフアデツクスＧ−100カラムクロマ
トグラフイーを行い精製標品を得た。本標品はデ
イスク電気泳動的に単一であつた。 試験例 ４ マツシユルーム起源のチロシナーゼの調製 シグマ社製チロシナーゼ（グレイド）を用
い、これをさらにDEAE−セフアデツクスＡ−50
カラムクロマトグラフイー、ハイドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフイー、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムクロマトグラフイーを行い
精製標品を得た。本標品はデイスク電気泳動的に
約90％の純度であつた。 試験例 ５ ウルシラツカーゼの調製 ウルシの汁液を塩析、透析、限外瀘過後セフア
デツクスＧ−200カラムクロマトグラフイーを行
い部分精製標品を得た。 試験例 ６ 各種酵素の基質特異性 本発明の方法に用いられるビリルビンオキシダ
ーゼと他の類似酵素の差を明確にするため基質特
異性について検討した。酵素は試験例１〜４で調
製したビリルビンオキシダーゼNS−１（Ａと略
称、以下同様）、コプリナス属菌の生産するビリ
ルビンオキシダーゼ(B)、ポリポラス属菌の生産す
るラツカーゼ(C)、マツシユルーム起源のチロシナ
ーゼ(E)ならびにウルシ起源のラツカーゼ(D)及びき
ゆうり起源のアスコルビン酸オキシダーゼ（東洋
紡績製、グレイド）(F)を用いた。第３表に示し
た７ｍＭ濃度の各種基質（ビリルビンは非抱合非
結合型のものを使用）と上記酵素の一定量とを37
℃で反応させ酵素活性を測定した。結果を第３表
に示す。同表には各基質に対する最高の活性を示
す酵素を100とした相対活性で表示した。
【表】
【表】
第３表に示すように、ビリルビンに対する作用
はビリルビンオキシダーゼが最も強力であつた
が、他の酵素にも弱いながら反応性が認められ
た。 実施例 １ ビリルビンオキシダーゼNS−１による各種ビ
リルビンへの作用をみた。間接型ビリルビンはデ
イド社製のビリルビンコントロールを用いた。抱
合型ビリルビンは本発明者らが以下の方法で調製
したものを使用した。すなわち、イヌの胆汁10ml
を２倍量のクロロホルムで抽出し、水層を濃縮後
セフアデツクスＧ−25ゲル瀘過により精製標品を
得た。本標品についてビリルビンＢテスト「和
光」（和光純薬製）を用いてジアゾ反応を行つた
ところ、間接型ビリルビンは認められなかつた。
ビリルビンオキシダーゼNS−10.3単位、0.1M−
トリス塩酸緩衝液３mlから成る定量用試薬組成物
と各種濃度のビリルビン100μを、37℃、30分
反応させた後、440nｍの吸収の減少を測定し
た。 結果を第２図に示す。同図中で（−○−）は間
接型ビリルビンを、（−▲−）は抱合型ビリルビ
ンをそれぞれ表わす。同図からわかるように、ビ
リルビンオキシダーゼNS−１は間接型のビリル
ビンにはほとんど作用しなかつた。又、抱合型、
ビリルビンには反応し、しかもよい直線性が得ら
れた。 実施例 ２ ビリルビンオキシダーゼNS−１と反応促進物
質を用い、間接型ビリルビン定量の検量線を求め
た。反応促進物質としてはドデシル硫酸ナトリウ
ムを使用した。すなわち、ビリルビンオキシダー
ゼNS−10.3単位、ドデシル硫酸ナトリウム３
mg、0.1M−トリス塩酸緩衝液３mlから成る定量
用試薬組成物に各種濃度のビリルビンコントロー
ル100μを反応させ440nｍの吸収の減少を測定
した。結果を第３図に示す。ビリルビン濃度と吸
光度の間にはよい直線性が得られた。 実施例 ３ 実施例２のビリルビンオキシダーゼNS−１に
代えてコプリナス属菌のビリルビンオキシダーゼ
（0.01単位）を用い実施例２と同様に操作した。
その結果検量線は実施例２と同一であつた。 実施例 ４ ビリルビン定量用試薬組成物中のビリルビンオ
キシダーゼNS−１の必要量を求めた。すなわ
ち、0.075単位、0.15単位、0.2単位又は0.3単位の
ビリルビンオキシダーゼNS−１および20％コー
ル酸ナトリウム100μと0.1M−トリス塩酸緩衝
液（PH8.4）３mlから成る組成物をビリルビンコ
ントロール水溶液（20mg／dl）100μと37℃で
反応させ、440nｍの減少を経時的に測定した。
結果を第４図に示す。30分で反応を完了させるた
めには約0.15単位以上あればよいことがわかつ
た。 実施例 ５ 血清17検体中の総ビリルビン及び直接型ビリル
ビンを定量した。定量用試薬組成物としては次の
もの使用した。 (1) 直接型ビリルビン定量用試薬組成物 下記を含むトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンオキシダーゼNS−１ 0.3単位 (2) 総ビリルビン定量用試薬組成物 下記を含むトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンオキシダーゼNS−１ 0.3単位 コール酸ナトリウム 0.6％ (3) ブランク用 上記(2)から酵素を除いたもの上記キツトに各
種検体100μを添加し、37℃、30分反応後、
440nｍの吸収の減少を測定し、検量線よりビ
リルビンの含量を求めた。なお対照として、和
光純薬製ビリルビン−Ｂテスト和光を使用した
ジアゾ法による定量を実施した。本実施例とジ
アゾ法による測定結果の関係を第５図及び第６
図に示す。第５図は総ビリルビンを、第６図は
直接型ビリルビンの定量結果をそれぞれ示す。
相関係数は総ビリルビンの測定値の場合
0.984、直接型ビリルビンの測定値の場合0.983
であり、両定量法の間には極めて相関性が認め
られた。
はビリルビンオキシダーゼが最も強力であつた
が、他の酵素にも弱いながら反応性が認められ
た。 実施例 １ ビリルビンオキシダーゼNS−１による各種ビ
リルビンへの作用をみた。間接型ビリルビンはデ
イド社製のビリルビンコントロールを用いた。抱
合型ビリルビンは本発明者らが以下の方法で調製
したものを使用した。すなわち、イヌの胆汁10ml
を２倍量のクロロホルムで抽出し、水層を濃縮後
セフアデツクスＧ−25ゲル瀘過により精製標品を
得た。本標品についてビリルビンＢテスト「和
光」（和光純薬製）を用いてジアゾ反応を行つた
ところ、間接型ビリルビンは認められなかつた。
ビリルビンオキシダーゼNS−10.3単位、0.1M−
トリス塩酸緩衝液３mlから成る定量用試薬組成物
と各種濃度のビリルビン100μを、37℃、30分
反応させた後、440nｍの吸収の減少を測定し
た。 結果を第２図に示す。同図中で（−○−）は間
接型ビリルビンを、（−▲−）は抱合型ビリルビ
ンをそれぞれ表わす。同図からわかるように、ビ
リルビンオキシダーゼNS−１は間接型のビリル
ビンにはほとんど作用しなかつた。又、抱合型、
ビリルビンには反応し、しかもよい直線性が得ら
れた。 実施例 ２ ビリルビンオキシダーゼNS−１と反応促進物
質を用い、間接型ビリルビン定量の検量線を求め
た。反応促進物質としてはドデシル硫酸ナトリウ
ムを使用した。すなわち、ビリルビンオキシダー
ゼNS−10.3単位、ドデシル硫酸ナトリウム３
mg、0.1M−トリス塩酸緩衝液３mlから成る定量
用試薬組成物に各種濃度のビリルビンコントロー
ル100μを反応させ440nｍの吸収の減少を測定
した。結果を第３図に示す。ビリルビン濃度と吸
光度の間にはよい直線性が得られた。 実施例 ３ 実施例２のビリルビンオキシダーゼNS−１に
代えてコプリナス属菌のビリルビンオキシダーゼ
（0.01単位）を用い実施例２と同様に操作した。
その結果検量線は実施例２と同一であつた。 実施例 ４ ビリルビン定量用試薬組成物中のビリルビンオ
キシダーゼNS−１の必要量を求めた。すなわ
ち、0.075単位、0.15単位、0.2単位又は0.3単位の
ビリルビンオキシダーゼNS−１および20％コー
ル酸ナトリウム100μと0.1M−トリス塩酸緩衝
液（PH8.4）３mlから成る組成物をビリルビンコ
ントロール水溶液（20mg／dl）100μと37℃で
反応させ、440nｍの減少を経時的に測定した。
結果を第４図に示す。30分で反応を完了させるた
めには約0.15単位以上あればよいことがわかつ
た。 実施例 ５ 血清17検体中の総ビリルビン及び直接型ビリル
ビンを定量した。定量用試薬組成物としては次の
もの使用した。 (1) 直接型ビリルビン定量用試薬組成物 下記を含むトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンオキシダーゼNS−１ 0.3単位 (2) 総ビリルビン定量用試薬組成物 下記を含むトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンオキシダーゼNS−１ 0.3単位 コール酸ナトリウム 0.6％ (3) ブランク用 上記(2)から酵素を除いたもの上記キツトに各
種検体100μを添加し、37℃、30分反応後、
440nｍの吸収の減少を測定し、検量線よりビ
リルビンの含量を求めた。なお対照として、和
光純薬製ビリルビン−Ｂテスト和光を使用した
ジアゾ法による定量を実施した。本実施例とジ
アゾ法による測定結果の関係を第５図及び第６
図に示す。第５図は総ビリルビンを、第６図は
直接型ビリルビンの定量結果をそれぞれ示す。
相関係数は総ビリルビンの測定値の場合
0.984、直接型ビリルビンの測定値の場合0.983
であり、両定量法の間には極めて相関性が認め
られた。
第１図は本発明に使用する酵素をビリルビンに
作用させたときの吸収パターンの変化を表わす図
である。第２図は本発明の方法による各種ビリル
ビンの検量線を表わす図であり、第３図は間接型
ビリルビンの検量線を表わす図である。第４図は
本発明の試薬組成物中のビリルビンオキシダーゼ
NS−１の量と反応速度を表わす図である。第５
図は本発明の方法とジアゾ法による血清中総ビリ
ルビンの定量結果の関係を表わす図であり、第６
図は同じく直接型ビリルビンの定量結果の関係を
表わす図である。
作用させたときの吸収パターンの変化を表わす図
である。第２図は本発明の方法による各種ビリル
ビンの検量線を表わす図であり、第３図は間接型
ビリルビンの検量線を表わす図である。第４図は
本発明の試薬組成物中のビリルビンオキシダーゼ
NS−１の量と反応速度を表わす図である。第５
図は本発明の方法とジアゾ法による血清中総ビリ
ルビンの定量結果の関係を表わす図であり、第６
図は同じく直接型ビリルビンの定量結果の関係を
表わす図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト血清にミロセシウム属に属する菌株の産
生するビリルビンオキシダーゼを作用させて直接
型ビリルビンを酸化し、それにより生ずるビリル
ビンの変化を光学的に測定することによつて直接
型ビリルビンを定量し、かつヒト血清にミロセシ
ウム属に属する菌株の産生するビリルビンオキシ
ダーゼと界面活性剤、芳香族カルボン酸、サルフ
ア剤及びプロテアーゼよりなる群から選ばれる１
種又は２種以上の反応促進物質とを併用して作用
させ直接型及び間接型ビリルビンを酸化すること
により生ずるビリルビンの変化を測定することに
よつて総ビリルビンを定量し、直接型ビリルビン
と間接型ビリルビンとを分別定量することを特徴
とするビリルビンの定量法。 ２ ミロセシウム属に属する菌株の産生するビリ
ルビンオキシダーゼを含んでなる試薬及びミロセ
シウム属に属する菌株の産生するビリルビンオキ
シダーゼと界面活性剤、芳香族カルボン酸、サル
フア剤及びプロテアーゼよりなる群から選ばれる
１種又は２種以上の反応促進物質とを含んで成る
試薬とを組み合わせてなるヒト血清ビリルビン定
量用試薬組成物。
Priority Applications (15)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12763282A JPS5917999A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
| DE19823239236 DE3239236A1 (de) | 1982-02-18 | 1982-10-20 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen |
| DE3249743A DE3249743C2 (ja) | 1982-02-18 | 1982-10-20 | |
| FR8217632A FR2521589B1 (fr) | 1982-02-18 | 1982-10-21 | Procede pour la determination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques |
| US06/436,385 US4554249A (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| CA000414104A CA1185883A (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of bilirubin in biological fluids |
| GB08230397A GB2115926B (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| IT48544/83A IT1203658B (it) | 1982-07-23 | 1983-06-21 | Metodo per la determinazione quantitativa di componenti fisiologici in fluidi biologici |
| ES524270A ES8501444A1 (es) | 1982-07-23 | 1983-07-19 | Un metodo para la determinacion cuantitativa de bilirrubina conjugada en fluidos biologicos. |
| ES534138A ES8601482A1 (es) | 1982-07-23 | 1984-07-09 | Un metodo para la determinacion cuantitativa de componentes fisiologicos en fluidos biologicos. |
| CA000464110A CA1218586A (en) | 1982-02-18 | 1984-09-26 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| IT8422941A IT1213222B (it) | 1982-07-23 | 1984-10-01 | Metodo per la determinazione quantitativa di componenti fisiologici in fluidi biologici. |
| FR8419005A FR2556010B1 (fr) | 1982-02-18 | 1984-12-12 | Procede pour la determination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques |
| GB08431875A GB2152215B (en) | 1982-02-18 | 1984-12-18 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| US06/749,425 US4839279A (en) | 1982-02-18 | 1985-06-27 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12763282A JPS5917999A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9993987A Division JPS62282598A (ja) | 1987-04-24 | 1987-04-24 | 総ビリルビンの定量法及び定量用試薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917999A JPS5917999A (ja) | 1984-01-30 |
| JPS6233880B2 true JPS6233880B2 (ja) | 1987-07-23 |
Family
ID=14964889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12763282A Granted JPS5917999A (ja) | 1982-02-18 | 1982-07-23 | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5917999A (ja) |
| IT (1) | IT1213222B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6450880U (ja) * | 1987-09-26 | 1989-03-29 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60151561A (ja) * | 1984-01-19 | 1985-08-09 | Nitsusui Seiyaku Kk | ビリルビンの定量方法 |
| JPS60154162A (ja) * | 1984-01-24 | 1985-08-13 | Nitsusui Seiyaku Kk | 遊離ビリルビンの定量方法 |
| JPS60178360A (ja) * | 1984-02-24 | 1985-09-12 | Fujimoto Daiagunosuteitsukusu:Kk | 総ビリルビンおよび直接ビリルビンの分別定量法 |
| KR970022316A (ko) * | 1995-10-27 | 1997-05-28 | 후루야 아끼라 | 빌리루빈의 정량 방법 |
| CN111455018B (zh) * | 2020-03-03 | 2023-05-23 | 天津大学 | 含有枯草芽孢杆菌漆酶的直接胆红素检测试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4211844A (en) * | 1978-05-19 | 1980-07-08 | Eastman Kodak Company | Bilirubin-specific fungal enzyme preparation |
| JPS5876100A (ja) * | 1981-10-30 | 1983-05-09 | Ono Pharmaceut Co Ltd | ラツカ−ゼの使用法 |
-
1982
- 1982-07-23 JP JP12763282A patent/JPS5917999A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-01 IT IT8422941A patent/IT1213222B/it active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6450880U (ja) * | 1987-09-26 | 1989-03-29 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1213222B (it) | 1989-12-14 |
| IT8422941A0 (it) | 1984-10-01 |
| JPS5917999A (ja) | 1984-01-30 |
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